CN114073249B - 一种人t淋巴细胞的慢速冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法，其包括以下步骤：(1)将包含人T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于冷却剂中冷却；(2)用经液氮预冷的金属接触所述冻存管的管壁对侧进行置核；(3)将所述冻存管置于所述冷却剂中平衡；(4)将所述冻存管移至低温设备中，以5～50℃/min的速率降温至‑50℃～‑55℃。本发明控制冻存液降温过程中的过冷度，结合降温速率冻存人T淋巴细胞，可达到较好的冻存效果，降低了实际操作中出现质量控制偏差的概率。本发明还解决了细胞冻存液的细胞毒性这一难题，提供了低或无DMSO保护剂组合配方，其渗透压远低于市面上使用的其他细胞冻存液，对细胞或人体伤害更小。

Description

一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法
技术领域
本发明属于细胞领域，具体涉及一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法。
背景技术
癌症是威胁全人类生命安全的恶性疾病之一，其发病率并未随着人们生活条件的改善而下降，反而逐年呈上升趋势。随着基因载体技术、基因编辑技术的发展，细胞治疗已经从科学尝试迅速走向了临床应用。2017年，美国宾夕法尼亚大学和瑞士诺华公司共同研发的首个CAR-T疗法产品Kymriah(用于治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病)正式通过美国食品药物监督管理局(FDA)的上市批准。自此，全球细胞治疗的临床试验数量呈现爆发式增长。未经修饰的人T淋巴细胞对于CAR-T细胞的生产和制备至关重要，其长期保存也成为CAR-T细胞生产制备或者科学研究中的关键技术之一。
低温保存(Cryopreservation)是目前为止最为有效的一种细胞长期保存方法。低温能有效地抑制细胞内部生化反应的速率，从而实现长期的保存。根据储存温度的不同，细胞可以进行短期或长期的保存，理论认为在液氮中储存的细胞可以保持其生物性状经历几个世纪而不改变。细胞在低温保存的过程中会由于温度的改变以及水分子的结晶受到一系列低温损伤。首先在降温至相变温度之前，一些对温度敏感的细胞比如公牛和野猪的精子等会由于膜相变产生不可逆的细胞损伤，这种损伤被称之为冷冲击损伤(Cold shockinjury)。其次随着温度的降低，细胞外部的溶液会出现过冷现象，即溶液在低于相变转换温度下发生结晶的现象。过冷的一个坏处是不利于产品冻存质量的控制，如下图中蓝色的降温曲线显示，降温过程中冻存液的过冷是一个随机行为，即使采用相同的冻存程序，每个样品的降温过程都是随机的，因此控制冻存液的过冷对于细胞药物的冻存质量控制很关键。
过冷的另一个后果是冰晶的快速生长，会使得渗透性较差的细胞受到胞内结晶损伤。随着温度进一步降低，冰晶在细胞外溶液中形成，并且随着降温速率的不同，细胞会受到溶液损伤(Solution effects injury)或胞内冰损伤(Intracellular ice injury)。这种由于降温速率的不同而产生的两种不同类型的低温损伤被美国学者Peter Mazur总结为两因素假说。最佳的降温程序应该在最大程度抑制胞内冰形成的同时，不对细胞造成过多的溶液损伤。此外，细胞在低温保存过程中还会受到各类机械损伤(mechanical damage)。最后，保护剂毒性损伤(Cryoprotective agents toxicity)也是细胞低温损伤的重要来源。低温保护剂的毒性分为高渗毒性和代谢毒性两类，前者是因为低温保护剂通常是在较高的浓度下工作的，而细胞在高渗的环境中会受到损伤，尤其是在玻璃化冻存中，高浓度的低温保护会成为造成细胞损伤的主要因素之一；而代损伤往往是针对渗透性的低温保护剂而言的，渗透性的保护剂会渗透进如胞内影响细胞的正常生理代谢活动，比如影响蛋白质的构象，线粒体等细胞器的正常功能等。
完整的细胞冻存和复苏主要包含六个步骤：冻存前处理、低温保护剂加载、程序降温、深低温储存、细胞复苏和复苏后处理。细胞冻存过程中的每一个环节都有可能对细胞造成潜在的损伤，影响到细胞整体复苏后的状态以及功能。目前报道的免疫细胞冻存的研究中，很少关注细胞的冻存和复苏方法，有少部分的研究提到了使用程序降温仪进行降温以及在36-38℃的水浴中进行复温，其中1℃/min是最常使用的降温速率，但是1℃/min的速率并不一定适合所有的细胞类型。因此，本发明系统地优化了人T淋巴细胞的冻存程序。本发明首先通过置核抑制了冻存的过冷结晶，然后通过改变降温速率优化细胞在降温过程中的脱水程度，使得细胞在降温过程中不形成胞内冰结晶的同时，也不遭受过多的溶液损伤，从而取得较好的低温冻存效果。
发明内容
为了解决上诉缺陷/不足，本发明提供了一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法。本发明为了控制冻存液降温过程中的过冷度，结合15℃/min-30℃/min的降温速率冻存人T淋巴细胞，可达到较好的冻存效果，降低了实际操作中出现质量控制偏差的概率。采用本发明进行细胞冻存更利于细胞冻存标准操作规范的建立。最后，本发明解决了冻存液的细胞毒性这一难题，可使用无DMSO保护剂配方，本发明中使用的冻存液配方渗透压远低于市面上使用的其他冻存液，对细胞或人体伤害更小。
本发明第一方面提供了一种人T淋巴细胞的置核冻存方法，其包括以下步骤：
(1)将包含人T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于-5℃～-10℃冷却剂中冷却；
(2)用经液氮预冷的金属接触所述冻存管的管壁对侧，接触3～5秒进行置核；
(3)将所述冻存管置于所述冷却剂中平衡；
(4)将所述冻存管移至低温设备中，以5～50℃/min的速率降温至-50℃～-55℃后，将所述冻存管转移至液氮中储存。
在一优选的具体实施例中，
步骤(1)中，所述冷却剂为异丙醇；和/或，
步骤(4)中，以15～35℃/min的速率降温至-50℃。
在一优选的具体实施例中，
步骤(1)中，将包含人T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于-5℃中冷却；和或，步骤(4)中，以25～35℃/min的速率降温至-50℃。
在一优选的具体实施例中，
步骤(1)中，所述细胞冻存液为：4％HSA、1％甘油，以及0.1M海藻糖；或，
4％HSA、1％DMSO，以及0.1M海藻糖；或，
4％HSA以及0.2～0.3M海藻糖。
在一优选的具体实施例中，
步骤(1)中，所述细胞冻存液为：
4％HSA以及0.2M海藻糖；或，
4％HSA以及0.3M海藻糖。
在一优选的具体实施例中，还包括：
步骤(1)中，将所述冻存管置于冷却剂中冷却至同温，所述冷却剂为异丙醇；
步骤(2)中，将所述冻存管移至异丙醇的液面上方1cm处；
步骤(3)中，将所述冻存管移至所述异丙醇中，平衡1分钟；
步骤(4)中，将所述冻存管降温后平衡3分钟，将所述冻存管转移至液氮中储存。
在一优选的具体实施例中，所述低温设备为程序降温仪，例如Thermo FisherScientific 7453；和/或，所述金属为镊子或铜线；和/或，所述冻存管为1.2ml的冻存管、0.5ml的EP管或经打孔优化传热的2.5ml的冻存管。
在一些更优选的具体实施例中，所述冻存管中含由0.5ml细胞冻存液保存的0.5～2×107个T淋巴细胞。
本发明第二方面提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包括4％HSA、1％甘油，以及0.1海藻糖；或，
4％HSA、1％DMSO，以及0.1M海藻糖；或，
4％HSA以及0.2～0.3M海藻糖。
优选地，所述细胞冻存液为4％HSA以及0.2M海藻糖，或4％HSA以及0.3M海藻糖。
如本发明第二方面所述的细胞冻存液在制备免疫细胞置核冻存的试剂中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的积极进步效果在于：本发明控制冻存液降温过程中的过冷度，结合15℃/min-35℃/min的降温速率冻存人T淋巴细胞，可达到较好的冻存效果，降低了实际操作中出现质量控制偏差的概率。采用本发明进行细胞冻存更利于细胞冻存标准操作规范的建立。最后，本发明解决了冻存液的细胞毒性这一难题，可使用低或无DMSO保护剂组合配方进行冻存，本发明中使用的冻存液配方渗透压远低于市面上使用的其他冻存液，对细胞或人体伤害更小。
附图说明
图1为人T淋巴细胞置核冻存的具体步骤。
图2为不同保护剂对人T细胞的毒性作用；图2的a为相对活率(％)效果对比，图2的b为回收率(％)效果对比。
图3为在不同降温速率下保护剂0.2M海藻糖+4％HSA对T细胞的冻存效果；图3的a为相对活率(％)效果对比，图3的b为回收率(％)效果对比。
图4为在不同降温速率下保护剂1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA对T细胞的冻存效果；图4的a为相对活率(％)效果对比，图4的b为回收率(％)效果对比。
图5为在25℃/min降温速率下三种保护剂的保护效果对比；图5的a为相对活率(％)效果对比，图5的b为回收率(％)效果对比。
图6为在30℃/min降温速率下三种保护剂的保护效果对比；图6的a为相对活率(％)效果对比，图6的b为回收率(％)效果对比。
图7为在35℃/min降温速率下三种保护剂的保护效果对比；图7的a为相对活率(％)效果对比，图7的b为回收率(％)效果对比。
图8为无DMSO不同海藻糖浓度对T细胞冻存活率和回收率的影响；图8的a为相对活率(％)效果对比，图8的b为回收率(％)效果对比。
图9为在15度/分钟和20度/分钟降温速率下，冻存结果与商品化保护剂CS10的对比；图9的a为相对活率(％)效果对比，图9的b为回收率(％)效果对比。
图10为保护剂种类对冻存T细胞活率和回收率的影响；图10的a为相对活率(％)效果对比，图10的b为回收率(％)效果对比。
图11为在30度/分钟降温速率下，不同保护剂的冻存效果；图11的a为相对活率(％)效果对比，图11的b为回收率(％)效果对比。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明提供的T淋巴细胞冻存液、以及冻存方法中所用的原料以及试剂均可由市场购得。人T淋巴细胞由人外周血单个核细胞(PBMC)进行体外诱导扩增所得。按照一定的细胞密度，用cryosureedx40(WAK，Cat.0482)冻存液进行冻存细胞，冻存体系为1ml/支，将有细胞和冻存液的冻存管放入程序降温盒，于-80℃冰箱中放置过夜后，细胞转入液氮罐(-196℃)中低温保存。T淋巴细胞由PBMC通过双信号刺激(CD3、CD28)培养得到。
人T淋巴细胞体外扩增培养方法如下：利用CD3、CD28抗体包被培养容器，CD3和CD28的包被浓度均为2μg/ml，包被时间为3h，刺激培养时间为72h，扩增培养时间为12-14天。扩增培养基为X-ViVo+5％FBS+1000IU/ml白介素2。利用扩增培养基将PBMC置于所述包被后的培养容器内进行扩增培养。扩增培养用于冻存的人T淋巴细胞最终存活率需达到90％左右。图1为人T淋巴细胞置核冻存的具体步骤。使用AO/PI荧光染料(NexcelomBioscience，Lawrence，USA)进行对细胞染色，用Cellometer Auto 2000细胞计数仪(Nexcelom Bioscience，Lawrence，USA)进行计数。
步骤简述如下：
1.1:1混合细胞悬液与AO/PI荧光染料；
2.吸取20μl细胞悬液+AO/PI荧光染料混合液到配套的计数板孔内；
3.将计数板放置到Cellometer Auto 2000细胞计数仪内，选择相应的程序(根据细胞类型的不同细胞计数会有对应的计数程序)进行计数。
Cellometer Auto 2000细胞计数仪可根据细胞种类编辑特定的计数程序，计数程序的参考依据为细胞的尺寸信息。具体的计数程序如下：
1)AO荧光染料激发波长为470nm，发射波长为535nm；
2)PI荧光染料激发波长为540nm，发射波长为605nm；
3)细胞直径为4～20μm。
实施例1、不同保护剂对人T细胞的毒性作用
人T淋巴细胞冻存液1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA的配制：取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取0.5mlDMSO(Sigma)、5ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
0.2M海藻糖+4％HSA的配制：用移液枪吸取10ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
CS10工作溶液(2:1稀释)的配制：将商业化保护剂CS10(BioLifeSolutions，STEMCELL Technologies)，用含5％HSA的生理盐水稀释(2:1稀释)，工作溶液中含约6.67％DMSO，将工作溶液置于4℃冰箱中保存备用。
生理盐水+4％HSA的配制：用移液枪吸取10ml 20％HSA于50ml离心管中，加入生理盐水至终体积为50ml，配制成含4％HSA的生理盐水溶液。
人T细胞培养基配制：吸取1ml FBS(Australian Origin，Gibco)于50ml离心管中，加入50μl IL-2溶液(江苏金丝利药业，原浓度为2×105IU/瓶，用200μl PBS溶解其浓度为1×106IU/ml，取50μl加入50ml溶液中，终浓度即为1000IU/ml)，加入X-VIVO15无血清培养基(Lonza BioWhittaker)使溶液终体积为50ml。
本次毒性试验将保护剂和T细胞混合，添加至24孔板内，每孔加样1ml，每种保护剂有三孔平行对照，置于37℃恒温培养箱(5％CO2)内培养24h后检测细胞状态。作为对照，培养基组别中T细胞在培养24h后相对活率高达99.2％，部分细胞增殖，回收率为117.3％。结果如图2所示，商业化保护剂CS10对T细胞的毒性作用显著大于0.2M海藻糖+4％HSA组和1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA组，相对活率分别为18.8％，57.6％和40.9％，含4％HSA生理盐水对照组相对活率为43.9％；回收率分别为18.8％，55.1％和39.0％，含4％HSA生理盐水对照组回收率为46.1％。
实施例2、0.2M海藻糖、4％HSA的降温速率摸索
2.1人T淋巴细胞冻存液0.2M海藻糖、4％HSA的配制
取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取10ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
2.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
取50μl扩增培养后的人T淋巴细胞悬液进行计数。根据计数结果调整细胞总数，离心收集，离心力为500g，离心时间为5min，调整冻存液中的细胞密度至1×107个/ml左右。采用规格为1.2ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为1ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。
2.3降温程序
实验根据降温速率的不同分为5组，每组实验中设置空白组与实验组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核，每个条件下设置三个平行实验。取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷的镊子夹住实验组冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪使样品分批按照15℃/min、20℃/min、25℃/min、30℃/min和35℃/min的降温速率进行降温-50℃，平衡3min后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
2.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
将冻存管从液氮中取出，迅速放入已预热至37℃水浴锅中，轻轻摇晃使细胞悬液融化，当液体中仅存在一小块冰晶时停止复温。复温完成后混匀细胞并吸取50μl体积用于计数和活性检测。本发明使用的细胞计数方法为AOPI染色计数法，使用细胞计数仪为Nexcelom Auto 2000。
2.5实验结果
在不同降温速率下保护剂0.2M海藻糖+4％HSA对T细胞的冻存效果(含置核/不置核)如图3所示。
结论：在15、20、25、30和35度/分钟下置核能显著改善T细胞的冻存效果，置核和不置核的相对活率分别为98.3％和96.5％，96.5％和94.1％，97.7％和96.1％，96.3％和92.0％，95.9％和92.2％。
实施例3、1％DMSO+0.1M海藻糖、4％HSA的降温速率摸索
3.1人T淋巴细胞冻存液1％DMSO、0.1M海藻糖、4％HSA的配制
取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取0.5ml DMSO(Sigma)、5ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
3.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
取50μl扩增培养后的人T淋巴细胞悬液进行计数。根据计数结果调整细胞总数，离心收集，离心力为500g，离心时间为5min，调整冻存液中的细胞密度至1×107个/ml左右。采用规格为1.2ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为1ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。
3.3降温程序
实验根据降温速率的不同分为三组，每组实验中设置空白组与实验组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核，每个条件下设置三个平行实验。取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷的镊子夹住实验组冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪使样品分批按照25℃/min、30℃/min和35℃/min的降温速率降温至-50℃，平衡3min后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
3.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
同实施例2.4。
3.5实验结果
在不同降温速率下保护剂1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA对T细胞的冻存效果(含置核/不置核)如图4所示。
结论：在25、30和35度/分钟下置核能显著改善T细胞的相对活率和回收率，置核和不置核的相对活率分别为94.8％和89.5％，94.1％和88.6％，90.2％和83.5％；回收率分别为94.4％和86.0％，93.4％和84.3％，89.7％和79.3％。
实施例4、不同降温速率下三种保护剂的保护效果
4.1三种保护剂的配制
人T淋巴细胞冻存液1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA的配制：取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取0.5mlDMSO(Sigma)、5ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
0.2M海藻糖+4％HSA的配制：用移液枪吸取10ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
CS10工作溶液(2:1稀释)的配制：同实施例1。
4.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
取50μl扩增培养后的人T淋巴细胞悬液进行计数。根据计数结果调整细胞总数，离心收集，离心力为500g，离心时间为5min，调整冻存液中的细胞密度至1×107个/ml左右。采用规格为1.2ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为1ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。
4.3降温程序
实验根据降温速率的不同分为三组，将以上两种保护剂在每个降温速率下的置核结果与商业化冻存结果进行对比。取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷的镊子夹住实验组冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪使样品分批按照25℃/min，30℃/min，35℃/min的降温速率降温至-50℃，平衡3min后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。商品化冻存方案在加载保护剂后将样本放入程序降温盒内，转移至-80℃冰箱(Haier)，放置过夜后，第二天转至液氮储存罐内。
4.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
同实施例2.4。
4.5实验结果
(a)在25℃/min下三种保护剂的保护效果对比如图5所示。
结论：在25℃/min下，0.2M海藻糖+4％HSA的保护效果与商品化保护剂CS10相比无显著性差异，优于1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA，相对活率分别为97.6％、98％和94.8％。
(b)在30℃/min下三种保护剂的保护效果对比如图6所示。
结论：在30℃/min下，0.2M海藻糖+4％HSA的保护效果略低于商品化保护剂CS10，分别为96.3％和98.0％，显著优于1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA(94.1％)。
(c)在35℃/min下三种保护剂的保护效果对比如图7所示。
结论：在35℃/min下，0.2M海藻糖+4％HSA的保护效果与商品化保护剂CS10相比无显著性差异，优于1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA，相对活率分别为95.9％、98％和90.2％。
实施例5、降温速率为30℃/分钟时，海藻糖的浓度范围的研究
5.1人T淋巴细胞无DMSO冻存液的配制
海藻糖是天然双糖化合物，来源丰富，价格低廉，对细胞没有毒性。本实施例只以海藻糖(Sigma)和人血白蛋白(购自GRIFOLS)作为低温保护剂。海藻糖的浓度范围为0.1-0.3 M，具体的配方组合见表1：
表1无DMSO无毒性保护剂配方
No. 海藻糖浓度 HSA
1 0.1 M 4％(V/V)
2 0.2 M 4％(V/V)
3 0.3 M 4％(V/V)
取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪分别吸取5、10、15ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
5.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
同实施例4.2。
每批样品9支，将三支冻存管作为置核组，三支作为不置核组，另外三支作为程序降温盒组。
5.3人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将冻存管置于预冷的异丙醇中，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷1min的镊子夹住冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪以30℃/min的速率将样本降温至-50℃，并平衡3min。降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。程序降温盒组在加载保护剂后，将样本置于程序降温盒内，转移至-80℃冰箱(Haier)内，过夜后将样本转移至液氮储存罐内。
5.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
同实施例2.4。
5.5实验结果
在-5℃进行置核后，以30℃/min降温速率冻存人T淋巴细胞，不同保护剂组合的结果显示(图8)，所有的保护剂配方相对活率在83％以上，而且回收率在83％以上。当海藻糖浓度在0.2M-0.3M的范围时(4％HSA)相对活率在92％以上，而且回收率92％以上。由此可见，本发明能够提供无DMSO的无毒性保护剂配方，在优化的置核降温程序下实现高质量冻存。
实施例6、在15℃/分钟和20℃/分钟下，保护剂0.2M海藻糖+4％HSA与商品化保护剂CS10进行对比
6.1两种保护剂的配制
人T淋巴细胞冻存液0.2M海藻糖+4％HSA的配制：取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取10ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
CS10工作溶液(2:1稀释)的配制：同实施例1。
6.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
同实施例4.2。
6.3降温程序
实验根据降温速率的不同分为两组，另设置商品化冻存方案组，每个条件下设置三个平行实验。取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷的镊子夹住实验组冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪使样品分批按照15℃/min和20℃/min的降温速率降温至-50℃，平衡3min后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。商品化冻存方案在加载商品化保护剂后将样本放入程序降温盒内，转移至-80℃冰箱(Haier)，放置过夜后，第二天转至液氮储存罐内。
6.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
同实施例2.4。
6.5实验结果
在15度/分钟和20度/分钟下，在保护剂0.2M海藻糖+4％HSA中置核对T细胞也具有显著的保护效果，现将其冻存结果与商品化保护剂CS10进行对比。结果如图9所示。
结论：经过置核处理，15度/分钟条件下0.2M海藻糖+4％HSA的保护效果(相对活率98.2％、回收率96.6％)显著优于CS10(相对活率98.0％、回收率93.0％)，而20度/分钟下0.2M海藻糖+4％HSA的保护效果(相对活率96.5％、回收率96.7％)与CS10(相对活率98.0％、回收率93.0％)相当。
对比例1、其他不同保护剂种类效果
1.1人T淋巴细胞冻存液的配制
实验设计以等体积浓度的甘油和乙二醇来替代DMSO作为渗透性低温保护剂，以等物质的量浓度的蔗糖和乳糖来替代海藻糖作为非渗透性保护剂。具体的配方组合见表2：
表2同类型低温保护剂替代配方
No. 渗透性保护剂 非渗透性保护剂 HSA
1 1％Ethylene glycol 0.1M Trehalose 4％(V/V)
2 1％Glycerin 0.1M Trehalose 4％(V/V)
3 1％DMSO 0.1M Sucrose 4％(V/V)
4 1％DMSO 0.1M Lactose 4％(V/V)
取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。取17.115g蔗糖(Damas-beta)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的蔗糖母液。用移液枪分别吸取0.5ml乙二醇(Sigma，表2中1号保护剂成分)、0.5ml甘油(Sigma，表2中2号保护剂成分)或0.5ml DMSO(Sigma，表2中3、4号保护剂成分)于50ml离心管中，用移液枪吸取5ml海藻糖母液或蔗糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
1.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
同实施例4.2。
根据不同保护剂配方分为5组，每组6支，设置3支冻存管作为实验组，另外3支作为对照组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核。
1.3人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将冻存管置于预冷的异丙醇中，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷1min的镊子夹住冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪以30℃/min的速率将样本降温至-50℃，并平衡3min。降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
1.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
同实施例2.4。
1.5实验结果
在-5℃进行置核后，以30℃/min降温速率冻存人T淋巴细胞，不同保护剂组合的结果显示(图10)，表格2中所有保护剂配方都达到了相对活率79％以上，而且回收率89％以上；表格2中方案2～4的保护剂配方相对活率89％以上，而且回收率90％以上。方案2的保护剂配方相对活率89.4％，回收率为92.0％。这些方案的保护剂保护效果均不如上述实施例中的保护剂。
对比例2、在30℃/min降温速率下，不同保护剂的冻存效果
2.1保护剂的配制
0.2M海藻糖+4％HSA的配制：取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配成1M海藻糖母液。用移液枪吸取10ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml生理盐水，再加10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积50ml，置于4℃冰箱保存备用。
2％DMSO+0.2M海藻糖+4％HSA的配制：取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取10ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入1ml DMSO，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
1％DMSO+0.1M海藻糖+4％HSA的配制：取17.115g海藻糖(Sigma)，用生理盐水溶解至终体积50ml，配置成1M的海藻糖母液。用移液枪吸取0.5ml DMSO(Sigma)、5ml海藻糖母液于50ml离心管中，加入20ml左右生理盐水，再加入10ml 20％HSA(购自GRIFOLS)，混匀后加入生理盐水至终体积为50ml，置于4℃冰箱中保存备用。
2.2人T淋巴细胞收集与保护剂加载
同实施例4.2。
2.3降温程序
实验根据不同保护剂配方分为三组，每组设置三个平行实验。取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷的镊子夹住实验组冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡1min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪使样品分批按照30℃/min的降温速率降温至-50℃，平衡3min后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
2.4人T淋巴细胞的复苏与活性检测
同实施例2.4。
2.5实验结果
根据图11可以看出，0.2M海藻糖+4％HSA的冻存效果与2％DMSO+0.2M海藻糖+4％HSA无显著性差异，相对活率分别为96.3％和96.6％，回收率分别为94.3％和92.2％，显著优于1％DMSO、0.1M海藻糖、4％HSA的冻存效果(活率94.1％，回收率93.4％)。表明对于0.2M海藻糖+4％HSA而言在本发明的实验条件下足以对T细胞发挥足够的保护效果，即使再加入2％DMSO也无法进一步提高冻存效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种人T淋巴细胞的置核冻存方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）将包含人T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于-5℃~-10℃冷却剂中冷却至同温，所述冷却剂为异丙醇；所述细胞冻存液为：
4% HSA以及0.2~0.3M海藻糖；
（2）将所述冻存管移至异丙醇的液面上方1cm处，用经液氮预冷的金属接触所述冻存管的管壁对侧，接触3~5秒进行置核；
（3）将所述冻存管置于所述异丙醇中平衡1分钟；
（4）将所述冻存管移至低温设备中，以25~35℃/min的速率降温至-50℃~-55℃后，平衡3分钟，将所述冻存管转移至液氮中储存。
2.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
步骤（1）中，将包含人T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于-5℃中冷却。
3.如权利要求2所述的置核冻存方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细胞冻存液为：
4% HSA以及0.2M海藻糖；或，
4% HSA以及0.3M海藻糖。
4.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
所述低温设备为程序降温仪；和/或，所述金属为镊子或铜线；和/或，所述冻存管为1.2ml的冻存管、0.5ml的EP管或经打孔优化传热的2.5ml的冻存管。
5. 如权利要求4所述的置核冻存方法，其特征在于，所述低温设备为Thermo FisherScientific 7453。
6.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，所述冻存管中含由0.5ml细胞冻存液保存的0.5~2×107个T淋巴细胞。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747160A (zh) * 2022-12-05 2023-03-07 贵州生诺生物科技有限公司 一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤t细胞的方法及其应用
CN115943948A (zh) * 2022-12-15 2023-04-11 上海原天生物科技有限公司 一种高效优化细胞冻存工艺的方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105076116A (zh) * 2015-09-17 2015-11-25 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法
CN108849854A (zh) * 2018-07-13 2018-11-23 深圳市润科生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞冻存方法
CN109843052A (zh) * 2016-10-04 2019-06-04 全崴生技股份有限公司 用于细胞冷冻保存的组合物和方法
CN109892319A (zh) * 2019-03-14 2019-06-18 湖南赛诺生物科技股份有限公司 一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液
CN109907036A (zh) * 2019-02-27 2019-06-21 北京益华生物科技有限公司 细胞冻存液、细胞冻存液制备方法和细胞冻存方法
CN112674078A (zh) * 2021-01-09 2021-04-20 上海理工大学 一种肝细胞超声波植冰冻存装置及其冻存方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3040396A1 (fr) * 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
US10314302B2 (en) * 2015-12-16 2019-06-11 Regents Of The University Of Minnesota Cryopreservative compositions and methods

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105076116A (zh) * 2015-09-17 2015-11-25 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法
CN109843052A (zh) * 2016-10-04 2019-06-04 全崴生技股份有限公司 用于细胞冷冻保存的组合物和方法
CN108849854A (zh) * 2018-07-13 2018-11-23 深圳市润科生物科技有限公司 一种外周血单个核细胞冻存方法
CN109907036A (zh) * 2019-02-27 2019-06-21 北京益华生物科技有限公司 细胞冻存液、细胞冻存液制备方法和细胞冻存方法
CN109892319A (zh) * 2019-03-14 2019-06-18 湖南赛诺生物科技股份有限公司 一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液
CN112674078A (zh) * 2021-01-09 2021-04-20 上海理工大学 一种肝细胞超声波植冰冻存装置及其冻存方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李广武等.溶液的冻结特性与细胞损伤.《低温生物学》.湖南科学技术出版社,1998,第48-49页. *

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