CN115747160A

CN115747160A - 一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤t细胞的方法及其应用

Info

Publication number: CN115747160A
Application number: CN202211550740.3A
Authority: CN
Inventors: 王璐; 李孝阳; 唐景玲; 杨�远; 杨毓举
Original assignee: Guizhou Shengnuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guizhou Shengnuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用。提供了一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及淋巴结T细胞在治疗肿瘤中的应用。本发明提供的方法更简单，只需一次扩增培养可达到治疗的有效剂量，细胞增殖倍数更高，培养周期更短；本发明提供的淋巴结T细胞对肿瘤具有更好的治疗效果，具有广阔的应用前景。

Description

一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用。

背景技术

2018年全球恶性肿瘤新发病例数为1810万，死亡960万，成为全球第二大死因，仅次于心脑血管疾病。近年来，我国人民疾病谱发生巨大的变化，恶性肿瘤的发病率和死亡率明显上升，已经超越心脑血管疾病，成为我国第一大死因。

众所周知，肿瘤的发生和发展不仅取决于肿瘤细胞基因突变，还取决于它们与肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)的相互作用，如缺氧、慢性炎症，特别是与免疫系统的相互作用。近年研究发现，免疫检查点抑制剂可以恢复肿瘤微环境中T细胞杀灭肿瘤细胞功能，显著延长患者的生存时间，开创肿瘤治疗的新模式。根据细胞分类来看，包括CAR-T细胞疗法、TIL细胞疗法、TCR-T细胞疗法等，其中研究最广泛的是TIL细胞疗法。

但是未见将淋巴结T细胞应用于治疗肿瘤的报道。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及淋巴结T细胞在治疗肿瘤中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种体外扩增淋巴结抗肿瘤T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)活化淋巴结单细胞；

2)扩增淋巴结单细胞。

进一步，步骤1)包括使淋巴结单细胞与激活剂、生长因子和Feeder cell接触以活化淋巴结单细胞。

进一步，所述激活剂包括CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT和/或它们的功能活性片段。

进一步，所述激活剂包括以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。

进一步，所述激活剂包括CD3激动剂和/或CD28激动剂。

进一步，所述激活剂选自CD3激动剂。

进一步，所述CD3激动剂包括CD3抗体和/或其抗原结合片段。

进一步，所述CD3激动剂选自CD3抗体。

进一步，所述CD3抗体包括OKT3、UHCT1。

进一步，所述CD3抗体选自OKT3。

进一步，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素。

进一步，所述生长因子选自白细胞介素。

进一步，所述白细胞介素包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21。

进一步，所述白细胞介素选自IL-2。

进一步，所述Feeder cell包括PBMC、树突状细胞、抗原呈递细胞。

进一步，所述Feeder cell选自PBMC。

进一步，所述PBMC为经过辐照的PBMC。

进一步，所述Feeder cell的辐照剂量为20-60Gy。

进一步，所述淋巴结单细胞与Feeder cell比例为1：2-1：200。

进一步，所述淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50-1：200。

进一步，步骤1)的细胞密度为1-6×10⁶cells/mL。

进一步，步骤2)包括对活化后的淋巴结单细胞进行补液以扩增淋巴结单细胞。

进一步，所述补液中添加有生长因子。

进一步，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素。

进一步，所述生长因子选自白细胞介素。

进一步，所述白细胞介素包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21。

进一步，所述白细胞介素选自IL-2。

进一步，所述淋巴结单细胞包括冷冻保存的淋巴结单细胞或新鲜的淋巴结单细胞。

进一步，所述淋巴结单细胞选自冷冻保存的淋巴结单细胞。

进一步，所述的扩增的总培养天数达到17天或细胞数大于1×10⁹cells时终止培养。

本发明的第二方面提供了一种淋巴结T细胞冻存液，所述淋巴结T细胞冻存液包括冻存液A、冻存液B或冻存液C。

进一步，所述冻存液A、B包括CS10、生理盐水和人血白蛋白。

进一步，所述冻存液A包括50％CS10、40％生理盐水和10％的人血白蛋白。

进一步，所述冻存液B包括50％CS10、25％生理盐水和25％的人血白蛋白。

进一步，所述冻存液C包括羟乙基淀粉、DMSO和人血白蛋白。

进一步，所述冻存液C包括40％～70％羟乙基淀粉、3％～10％DMSO和20％～40％人血白蛋白。

本发明的第三方面提供了淋巴结T细胞群，所述淋巴结T细胞群由本发明第一方面所述的方法获得。

进一步，所述的淋巴结T细胞群包括具有增加的TCR克隆、增加的T细胞活化表型、降低的T细胞耗竭表型和/或增加的IFN-γ的释放量的T细胞。

进一步，所述的增加的T细胞活化表型包括CD28 T细胞亚群和/或CD69 T细胞亚群。

进一步，所述的降低的T细胞耗竭表型包括TIGIT T细胞亚群和/或LAG3 T细胞亚群。

本发明的第四方面提供了本发明第三方面所述的淋巴结T细胞群在制备治疗肿瘤药物中的应用。

进一步，所述肿瘤包括液体肿瘤、实体瘤。

进一步，所述肿瘤选自实体瘤。

本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第三方面所述的淋巴结T细胞群。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第六方面提供了一种淋巴结T细胞的冻存方法，所述方法包括将淋巴结T细胞加入到本发明第二方面所述的淋巴结T细胞冻存液中。

进一步，所述淋巴结T细胞的冻存密度为0.5-5×10⁸cells/mL。

进一步，所述淋巴结T细胞的冻存密度为1-2×10⁸cells/mL。

本发明的第七方面提供了本发明第二方面所述的淋巴结T细胞冻存液在制备淋巴结T细胞冻存试剂盒中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供的方法更简单，只需一次扩增培养可达到治疗的有效剂量，细胞增殖倍数更高，培养周期更短(15-17天)；能够避免或减少在生产过程中直接接触细胞的物料或残留物质(如蛋白酶、动物源物质、磁珠及肿瘤残留等)引入，减少质量控制的难度，更有利于工艺的商业化。

扩增的淋巴结T细胞与TIL细胞相比，增殖倍数更高，TCR的克隆多样性更高，活化比例更高，耗竭比例更低，IFN-γ分泌能力更强，对肿瘤具有更高的治疗效果。

附图说明

图1是扩增步骤图；

图2是淋巴结单细胞活率图；

图3是不同辐照剂量辐照后细胞存活率图；

图4是不同剂量Feeder cell刺激细胞增殖倍数比较图；

图5是不同剂量Feeder cell培养的细胞产品T细胞亚群的比较图；

图6是不同剂量Feeder cell培养的细胞产品T细胞活化及抑制标志物的比较图，其中，6A是CD4+细胞，6B是CD8+细胞；

图7是不同剂量Feeder cell培养的细胞产品T细胞记忆亚群的比较图，其中，7A是CD4+细胞，7B是CD8+细胞；

图8是不同剂量Feeder cell培养的细胞产品CD39和CD69亚群的比较图，其中，8A是CD4+细胞，8B是CD8+细胞；

图9是LN-T与TIL增殖比较图；

图10是LN-T与TIL扩增前后TCR克隆比较图；

图11是CD8+T细胞活化表型的比较图；

图12是CD8+T细胞耗竭表型的比较图；

图13是IFN-γ分泌比较图；

图14是淋巴结T细胞与TIL的记忆亚群图。

具体实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本发明提供了一种体外扩增淋巴结抗肿瘤T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)活化淋巴结单细胞；

2)扩增淋巴结单细胞。

步骤1)包括使淋巴结单细胞与激活剂、生长因子和Feeder cell接触以活化淋巴结单细胞。

在本申请中，扩增通常是指在一段时间内细胞的数量增加若干倍。在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约100倍。

在本发明中，体外扩增通常是指经过培养以产生细胞的数量的变化，经扩增的细胞也可以产生细胞的数量和/或比例变化，分泌能力变化，杀伤能力变化或表达能力的变化或它们的任何组合。

在本发明中，包括或包含是包含性的或者开放式的，并且不排除任何另外的、未列举的要素、方法、步骤或者材料。

在本发明中，所述激活剂指T细胞激活剂，通常是指与T细胞上的相应结合受体结合，并介导T细胞共刺激反应的物质。T细胞激活剂可以是T细胞产生有效免疫应答所需的除抗原受体之外的物质。T细胞激活剂可以是指T细胞共刺激分子。

在本发明中，所述激活剂包括CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT和/或它们的功能活性片段。

在本发明中，激活剂也可以选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。

在本发明的一种实施方案中，所述激活剂包括但不限于CD3激动剂、CD28激动剂。

在本发明的优选的实施方案中，所述激活剂包括CD3激动剂。

在本发明的最优选的实施方案中，所述CD3激动剂包括抗CD3抗体和/或其抗原结合片段。

在本发明的具体实施方案中，所述CD3激动剂选自抗CD3抗体。

CD3抗体指抗体或者它的变体(例如单克隆抗体)，包括但不限于针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体。抗CD3抗体包括但不限于OKT-3，也称为莫罗单抗(muromonab)。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥特昔珠单抗(otelixizuma b)、特普利珠单抗(te plizuma b)和威司利珠单抗(visilizumab)。

在本发明的实施方案中，所述CD3抗体选自OKT3。

OKT3(OKT-3)指单克隆抗体或者其生物仿制药或者变体，包括针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体，还包括市售形式如OKT-3(30ng/mL，纯MACS GMP CD3，Miltenyi Biotech，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)或其变体、保守性氨基酸取代、糖形(glycoform)或生物仿制药。

在本发明中，生长因子指T细胞生长因子，通常是指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物，本申请的T细胞生长因子可以包含其变体、同源物或包含其功能活性片段的任何物质，包括但不限于白细胞介素、γ干扰素。

在本发明的一种实施方案中，生长因子选自白细胞介素(IL)，白细胞介素包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21。

在本发明的具体实施方案中，白细胞介素选自IL-2(白细胞介素2)。

本发明的IL-2可包含IL-2蛋白或其变体。IL-2蛋白的变体可包括通过插入、缺失或取代氨基酸而氨基酸序列不同但保留IL-2的至少一种生物学活性的肽或多肽。氨基酸序列变体可以是天然不存在的变体，但其他氨基酸序列变体可以是翻译后变体，例如，糖基化变体。只要其保留适当水平的IL-2活性，任何IL-2变体都可使用。IL-2的形式可改变。例如，一种形式可包括野生型人IL-2。另外，也可选择可能对IL-2R n CD8+T细胞具有所需亲和力的IL-2的其它修饰形式。IL-2可来源于哺乳动物，例如人类或老鼠。

在本发明中，Feeder cell与滋养细胞、饲养细胞可互换使用，通常是指体外生长和分泌至少一种因子至培养基并且可以用于支持培养另一种所关注的细胞生长的培养细胞。

Feeder cell包括但不限于PBMC(外周单个核细胞)、树突状细胞、人工抗原呈递细胞。

在本发明的实施方案中，Feeder cell选自PBMC。

PBMC指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。其种类包括辐照的外周血单核细胞(PBMC)、耗尽NK细胞的PBMC。

在本发明的具体实施方案中，PBMC是经过辐照的PBMC。

在本发明中，辐照通常是指通过射线对物质进行的处理。例如，在一种实施方式中，辐照可以是指通过X射线、α射线、β射线或γ射线对物质进行辐照。

在本发明中，接触通常是指两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。在一种实施方案中，所述使淋巴结单细胞与激活剂、生长因子和Feeder cell接触包括：1)将所述激活剂、生长因子和Feeder cell添加到T细胞培养基中；2)将所述激活剂、生长因子和Feeder cell的工程化细胞添加到T细胞培养基中；3)将包括所述激活剂、生长因子和Feeder cell的固相介质添加到T细胞培养基中。

其中，每一种所述的激活剂的初始浓度至少约10ng/mL，每一种所述的生长因子的初始浓度至少约300IU/mL，每一种Feeder cell与淋巴结单细胞的比例至少是2:1。

进一步，每一种所述的激活剂的初始浓度至少约10-40ng/mL，每一种所述的生长因子的初始浓度至少约300-6000IU/mL，每一种Feeder cell与淋巴结单细胞的比例至少是2:1-200:1。

在本发明中，工程化细胞通常是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的细胞。

在本发明中，固相介质或介质通常是指具有结合功能的固相材料。例如，本申请固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用，将一种或一种以上的物质结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以结合一种或一种以上的激活剂。

本发明提供了淋巴结T细胞群，所述淋巴结T细胞群由上述的方法获得。

在本发明中，细胞群指具有共同特征的若干细胞。通常，群的数量大体为1×10⁶至1×10¹⁰，不同的淋巴结T细胞群包含不同的数量。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述淋巴结T细胞群。

在本发明中，组合物或药物组合物通常是指至少一种细胞以及至少一种和任选多于一种的其他药学上可接受的化学组分如载体、盐和/或赋形剂的混合物。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、静脉滴注、阴道给药或通过植入的贮药装置给药，优选静脉滴注。

药物组合物的给药剂量可根据疾病的严重程度、疾病的响应、任何治疗相关的毒性、患者的年龄和健康状态来确定。在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物的淋巴结T细胞可以为约1×10⁶、约2×10⁶、约3×10⁶、约4×10⁶、约5×10⁶、约6×10⁶、约7×10⁶、约8×10⁶、约9×10⁶、约1×10⁷、约2×10⁷、约3×10⁷、约4×10⁷、约5×10⁷、约6×10⁷、约7×10⁷、约8×10⁷、约9×10⁷、约1×10⁸、约2×10⁸、约3×10⁸、约4×10⁸、约5×10⁸、约6×10⁸、约7×10⁸、约8×10⁸、约9×10⁸、约1×10⁹、约2×10⁹、约3×10⁹、约4×10⁹、约5×10⁹、约6×10⁹、约7×10⁹、约8×10⁹、约9×10⁹、约1×10¹⁰、约2×10¹⁰、约3×10¹⁰、约4×10¹⁰、约5×10¹⁰、约6×10¹⁰、约7×10¹⁰、约8×10¹⁰、约9×10¹⁰、约1×10¹¹、约2×10¹¹、约3×10¹¹、约4×10¹¹、约5×10¹¹、约6×10¹¹、约7×10¹¹、约8×10¹¹、约9×10¹¹、约1×10¹²、约2×10¹²、约3×10¹²、约4×10¹²、约5×10¹²、约6×10¹²、约7×10¹²、约8×10¹²、约9×10¹²、约1×10¹³、约2×10¹³、约3×10¹³、约4×10¹³、约5×10¹³、约6×10¹³、约7×10¹³、约8×10¹³，或约9×10¹³。

在一些实施方式中，本申请的药物组合物中提供的淋巴结T细胞数量的范围可以为约1×10⁶至5×10⁶、约5×10⁶至1×10⁷、约1×10⁷至5×10⁷、约5×10⁷至1×10⁸、约1×10⁸至5×10⁸、约5×10⁸至1×10⁹、约1×10⁹至5×10⁹、约5×10⁹至1×10¹⁰、约1×10¹⁰至5×10¹⁰、约5×10¹⁰至1×10¹¹、约5×10¹¹至1×10¹²、约1×10¹²至5×10¹²，或约5×10¹²至1×10¹³。

在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物的淋巴结T细胞可以为约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约0.0002％，或约0.0001％w/w、w/v或者v/v。

在一些实施方式中，本申请的药物组合物中提供的淋巴结T细胞数量的范围可以为约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。

包含本发明所述的淋巴结T细胞群的药物组合物也可以这些剂量多次给药。包含本发明所述的淋巴结T细胞群的药物组合物可通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg et al，“新的”Eng.J.of Med.319：1676，1988)。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。

所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在本发明中，药学上可接受的是指其用于制备药物组合物，该药物组合物通常是安全、无毒的并且既不在生物学上或其它方面不合乎需要，并且包括其对于人类药物使用是可接受的。

药学上可接受的载体对活性药物成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分(例如其他药物)也可以掺入所述组合物和方法中。

在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于填充剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。填充剂包括淀粉、乳糖、甘露醇、微晶纤维素等；吸收剂包括硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂包括水、乙醇等；粘合剂包括羟丙甲纤维素、聚维酮、微晶纤维素等；崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、低取代羟丙基纤维素等；润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶、滑石粉等。药用辅料还包括着色剂、甜味剂等。

本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的盐。

在本发明中，药学上可接受的盐包括但不限于与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等形成的酸加成盐；或者与有机酸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、庚酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对氯苯磺酸、对甲苯磺酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸等形成的酸加成盐。

本发明提供了上述淋巴结T细胞群在制备治疗肿瘤药物中的应用。

在本发明中，治疗指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应而言，该作用可以是治疗性的。如本发明所用，“治疗”包括哺乳动物，特别是人类中疾病的任何治疗，包括：(a)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中防止疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如，“治疗”包括递送可在没有疾病的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。

在本发明中，肿瘤或肿瘤组织是指由过度细胞分裂引起的异常组织块。肿瘤或肿瘤组织包含“肿瘤细胞”，肿瘤细胞是具有异常生长特性且没有有用的身体功能的赘生细胞。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性的、恶化前的或恶性的，或者可表示没有任何癌性潜能的病变。肿瘤或肿瘤组织还可包含“肿瘤相关的非肿瘤细胞”，例如形成血管以供应肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。非肿瘤细胞可被肿瘤细胞诱导而复制并发育，例如肿瘤或肿瘤组织中血管生成的诱导。

可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品。通常，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，也可以是液体肿瘤，例如，从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。

在本发明的实施方案中，所述肿瘤细胞选自实体瘤。

在本发明中，术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可能是良性的(非癌症)或恶性的(癌症)。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的实例有肉瘤、癌和淋巴瘤。“肉瘤”是由结缔组织或支持组织(例如骨骼或肌肉)引起的癌症。“癌”是由在人体组织中排列的腺细胞和上皮细胞引起的癌症。“淋巴瘤”是淋巴器官(例如淋巴结、脾和胸腺)癌症。由于这些细胞存在于人体的大多数组织中，因此淋巴瘤可能在多种器官中发生。示例性实体瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤(endotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、膀胱癌、上皮癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、多形胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

在本发明中，淋巴结主要由淋巴组织和淋巴窦组成，是呈椭圆形或蚕豆形的淋巴组织小体，本发明中的淋巴结单细胞来源于淋巴结，所述淋巴结包括肿瘤引流淋巴结和非引流淋巴结。

在本发明中，施用是指将一定剂量的化合物或药物组合物给予受试者(例如患者)的方法。施用可以是通过任何合适的手段，包括：静脉内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、透皮的、粘膜的、瘤内的和/或粘膜的。

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1淋巴结抗肿瘤T细胞的培养方法

1.1实验材料

1.1.1实验材料

淋巴细胞分离液、IL-2、CD3抗体、庆大霉素、T细胞培养基、gentle MACS C管。

1.1.2供者信息

1、纳入标准：1)年龄在18岁-60岁之间(含临界值)，男性或非妊娠期女性，不限国籍；

2)全身一般情况好：无心、肺、肝、肾等重要脏器损害，无严重或未控制的感染，无严重的精神障碍史；

3)人类免疫缺陷病毒抗体(HIV-1和HIV-2抗体)阴性；

4)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性；

5)丙型肝炎病毒抗体(HCV抗体)阴性；

6)梅毒阴性。

2、单采血供者信息(表1)

表1单采血供者信息

1.2实验方法

1.2.1滋养细胞(Feeder cell)的制备

1.2.1.1单采血采集

根据《供者单采血采集标准操作规程》对供者实施单采血采集。

1.2.1.2单采血接收

单采血接收、检查，记录单采血信息。

1.2.1.3PBMC分离、辐照及冻存

用无菌接管机将采血袋连接在Sepax上的细胞分离套装CT90.1上，套装连接淋巴细胞分离液、清洗重悬液，采用NeatCell程序进行PBMC的分离。单采血体积若不足35mL，加PBMC清洗重悬液补充到35mL；单采血体积35mL-120mL，Sepax程序设置初始体积选择实际体积；单采血体积若大于120mL，Sepax程序设置初始体积选择120mL。

分离后每个供者的PBMC细胞密度调整为2-80×10⁶cells/mL，体积为45mL，X射线辐照20-60Gy。将辐照后PBMC用生理盐水清洗，添加冻存液，调整冻存密度为1-10×10⁶cells/mL，冻存体积为10mL/袋，程序降温后，液氮保存。

1.2.2淋巴结单细胞(LN)的制备

1.2.2.1淋巴结采集、接收

根据《供者手术组织样本采集与接收标准操作规程》对供者实施淋巴结采集及接收。

1.2.2.2淋巴结解离

将组织样本消毒后转移至生物安全柜内，使用外科剪刀或手术刀、镊子将淋巴结周围的脂肪组织及结缔组织剔除，将淋巴结剪至2-6块，转移入gentle MACS C管，添加5mL的T细胞培养基，用gentle MACS全自动组织处理器解离，将细胞悬液过滤(70μm)、清洗(400g，10min，22℃)，添加适量T细胞培养基，调整细胞密度为1-10×10⁶cells/mL，转移入合适的细胞培养瓶，置于二氧化碳培养箱内培养过夜。镜下观察细胞状态，取样计数、做无菌检测，收集培养基中的细胞，离心(400g，10min，22℃)，添加冻存液，调整冻存密度为1-20×10⁶cells/mL，冻存体积为不超过2mL/管，程序降温后，液氮保存。

1.2.3淋巴结单细胞活化

将冻存的淋巴结单细胞出库复苏，转移至生物安全柜内，将细胞悬液转移至50mL离心管，取样计数，添加T细胞培养基至40mL，离心(400g，10min，22℃)，倒弃离心管中的上清，添加适量的T细胞培养基，调整密度为1-6×10⁶cells/mL，转移入合适的细胞培养瓶，置于二氧化碳培养箱内培养6-48h。

取0.25-20×10⁶cells的淋巴结单细胞，使用T细胞培养基，添加复苏清洗后的Feeder cell(淋巴结单细胞与Feeder cell比例为1：2-1：200)，调整细胞密度为1-6×10⁶cells/mL，添加CD3抗体，例如OKT3约10-40ng/mL，添加IL-2约为300-6000IU/mL。转移至细胞培养瓶、透气培养袋或G-rex，置于二氧化碳培养箱内培养1-5天。此阶段获得的细胞为已活化的淋巴结细胞(LN-a)。

1.2.4淋巴单细胞的扩增培养

使用T细胞培养基，添加IL-2约为300-6000IU/mL，给活化后的淋巴结细胞补充培养基，每1-3天，取样计数，根据细胞状态补液或者等体积补液，当培养体积1000mL时，将细胞液转移至G-rex、透气培养袋或者Xuri设备，培养至细胞数大于1×10⁹cells或者总培养天数达17天终止培养。

1.2.5淋巴结抗肿瘤T细胞的收获

通过Sefia将细胞悬液浓缩并置换到收获清洗缓冲液中，取样检测。添加冻存液，调整细胞密度为0.5-5×10⁸cells/mL，按50mL/袋进行分装。将所有样品转移至程序降温仪进行冻存。降温程序结束后，将冻存袋转移至气相液氮罐中，在温度≤-130℃的气相中保存。

相关实验步骤见图1。

1.2.6淋巴结抗肿瘤T细胞的应用

可以将复苏后的治疗性淋巴结抗肿瘤T细胞给予受试者静脉滴注。

实施例2淋巴结保存稳定性实验

2.1实验材料

同实施例1

2.2实验方法

在实施例1的1.2.2的淋巴结采集至淋巴结解离阶段，将采集的淋巴结在生物安全柜中按最长直径剪成2半，分别置于2支含组织保存液(含50 -300μg/mL庆大霉素的培养基)的离心管中，在4-8℃下，分别保存24h和48h后解离淋巴结，并进行细胞计数的对比试验。

2.3实验结果

采集后的淋巴结(LIYF-SN、WAZB-SN、DALS-SN)在组织保存液中在4-8℃保存24h和48h后解离的细胞活率如图2所示。源自同一供者的同一枚淋巴结在组织保存液中在4-8℃保存24h和48h后解离，获得的淋巴结单细胞悬液的细胞活率相差不大，且在清洗后细胞活率在80％以上。3名供者来源的淋巴结单细胞悬液的细胞活率显示，淋巴结在组织保存液中在4～8℃保存48h左右，解离制备出淋巴结单细胞悬液满足工艺要求。

实施例3Feeder Cell辐照剂量优化实验

3.1实验材料

RPMI 1640培养基、AIM-V培养基、胎牛血清、CCK8试剂盒、96孔U型板、DMSO、人血白蛋白、羟乙基淀粉、生理盐水、细胞梯度分离液。

3.2实验方法

在实施例1的1.2.1的PBMC辐照阶段，将3个供者的PBMC均分为4份，其中一份用冻存液直接冻存，其余3份进行辐照，辐照剂量分别为20Gy、40Gy和60Gy，辐照结束后将3份PBMC冻存。将上述冻存的4份PBMC复苏，用生理盐水离心清洗(400g，10min，22℃)，用培养基(AIM-V培养基+1640培养基+5％FBS+IL-2+OKT-3)重悬，将细胞液加入4块96孔U型板(体积为200μL/孔，细胞数为1×10⁵cells/孔)，布板方式如表2，4块板置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)分别至第3天、第5天、第7天、第9天，每孔加20μl CCK8检测液。培养2h后用酶标仪450nm波长进行读板，对比辐照不同剂量的PBMC的存活率。

表2布板方式

1

2

3

4

5

6

7

8

A

Sample1-0

Sample1-20

Sample1-40

Sample1-60

Sample3-0

Sample3-20

Sample3-40

Sample3-60

B

Sample1-0

Sample1-20

Sample1-40

Sample1-60

Sample3-0

Sample3-20

Sample3-40

Sample3-60

C

Sample1-0

Sample1-20

Sample1-40

Sample1-60

Sample3-0

Sample3-20

Sample3-40

Sample3-60

D

E

Sample2-0

Sample2-20

Sample2-40

Sample2-60

F

Sample2-0

Sample2-20

Sample2-40

Sample2-60

G

Sample2-0

Sample2-20

Sample2-40

Sample2-60

H

Blank

注：Blank添加相同的体积的培养基。

3.3实验结果

将辐照不同剂量的PBMC冻存后复苏培养不同时间的细胞存活率如图3所示。相对于没有辐照的PBMC，3个辐照剂量PBMC的存活率都在下降，且下降的趋势相似。培养至13天三个辐照剂量辐照的PBMC都会全部死亡，不会在终产品中残留，可以选择20-60Gy的辐照剂量来处理PBMC。

实施例4Feeder Cell剂量优化实验

4.1实验材料

4.1.1实验材料

AO/PI染液、T细胞培养基、IL-2、CD3抗体、细胞培养瓶、透气培养袋或G-rex、流式检测抗体(如CD3 ECD、CD8 APC-CY7、CCR7 PE、CD45RAPacific Blue等)。

4.1.2淋巴结及肿瘤供者信息

1、纳入标准

1)年龄在18-75岁之间(包括边界值，性别不限)；

2)术前经病理确诊为结直肠癌；

3)无手术禁忌拟行手术的患者；

4)人类免疫缺陷病毒抗体(HIV-1和HIV-2抗体)阴性；

5)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性；

6)丙型肝炎病毒抗体(HCV抗体)阴性；

7)梅毒阴性。

2、供者信息(表3)

表3淋巴结及肿瘤供者信息

4.2实验方法

在实施例1的1.2.3淋巴结细胞活化阶段，复苏1-6名供者的Feeder cell，混合后，将Feeder cell(按照淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50、1：100、1：200的比例)加入细胞培养瓶、透气培养袋或G-rex，比较淋巴结细胞的增殖情况，并进行流式检测对比实验。

4.3实验结果

加入不同剂量的Feeder cell刺激3个供者(LISZ、HUDQ、XIGA)的淋巴结单细胞增殖情况如图4所示。按照淋巴结单细胞与Feeder cell为1：200的比例加入的淋巴结细胞的增殖倍数优于1：50和1：100。

加入不同剂量的Feeder cell培养3个供者(LISZ、HUDQ、XIGA)的淋巴结细胞产品的T细胞亚群比较如图5所示，按照淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50、1：100和1：200的比例加入所培养的3组细胞产品，T细胞亚群并无明显差异；T细胞活化(CD28、CD69)及抑制标志物(TIGIT、LAG3)比较如图6所示，3组细胞产品的T细胞活化及抑制标志物并无明显差异；T细胞记忆亚群(TSCM&Tnaive、TCM、TEM、TENRA)的比较如图7所示，3组细胞产品的T细胞记忆亚群无明显差异，细胞产品CD39和CD69亚群的比较如图8所示，3组细胞产品的CD39和CD69亚群无明显差异。综上，Feeder cell的加入可以按照淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50-1：200加入。

实施例5冻存液冻存效果实验

5.1实验材料

CS10、AO/PI染液、生理盐水、人血白蛋白、羟乙基淀粉。

5.2实验方法

在实施例1的1.2.5的细胞产品冻存阶段，将收获的细胞产品用3种冻存液，按照不同密度(1×10⁸cells/mL，2×10⁸cells/mL)进行混合，常温放置0h、2h、3h、4h和5h，并取样计数，对比细胞活率。将常温放置2h后的细胞程序降温后，转入液氮冻存，分别冻存1周、2周、1.5个月和4个月后，复苏取样计数，对比细胞活率。

冻存液A(含50％CS10、40％生理盐水和10％的人血白蛋白)，冻存液B(含50％CS10、25％生理盐水和25％的人血白蛋白)，冻存液C(含40％～70％羟乙基淀粉、3％～10％DMSO和20％～40％人血白蛋白)。

5.3实验结果

表4细胞产品在冻存液中常温放置稳定性及冻存稳定性数据

细胞产品在冻存液中常温放置0-5h的细胞活率比较如表4所示，不同密度(1×10⁸cells/mL，2×10⁸cells/mL)细胞产品在冻存液(冻存液A、冻存液B、冻存液C)里，常温放置4h内，细胞数及活率(＞90％)变化在可接受范围。

表5细胞产品冻存稳定性数据

细胞产品在冻存液中常温放置2h后，程序降温后液氮冻存的细胞活率比较如表5所示，不同密度(1×10⁸cells/mL，2×10⁸cells/mL)细胞产品在冻存液(冻存液A、冻存液B、冻存液C)里，室温放置2h后，经程序降温后转入液氮冻存4个月，细胞活率＞80％。

综上，冻存液A、冻存B和冻存液C均可用于收获的淋巴结T细胞冻存。实施例6淋巴结细胞对肿瘤的治疗效果

6.1实验材料

庆大霉素、T细胞培养基、CD3抗体、IL-2、胎牛血清、流式检测抗体(如CD3 ECD、CD8APC-CY7、CCR7 PE、CD45RAPacific Blue等)。

6.2实验方法

在实施例1中，将淋巴结替换成结直肠癌组织，并在1.2.2.2阶段制备初始TIL，制备方法为：将组织样本消毒后转移至生物安全柜内，使用外科剪刀或手术刀、镊子将肿瘤组织周围的脂肪组织、带血组织及腐烂组织剔除，用组织保存液清洗2-3遍，将肿瘤组织剪成1～3mm³的小块，转移入12孔细胞培养板，每孔植入3-4块肿瘤组织，每孔加入适量培养基(培养基需含氨基酸、抗生素，并添加5-10％的胎牛血清和2000-8000IU/mL的IL-2)，将细胞培养板放入二氧化碳培养箱进行培养，每隔1-2天半量换液，培养14-21天，收集TIL，添加冻存液，调整冻存密度为1-20×10⁶cells/mL，冻存体积为不超过2mL/管，程序降温后，液氮保存，获得初级TIL。

将来自同一患者的LN和初级TIL，通过实施例1中的1.2.3和1.2.4阶段，获得终产品淋巴结T细胞和TIL，对比两者的增殖情况，对比扩增前后两者TCR克隆情况，对比扩增后两者活化表型，对比扩增后两者的抑制表型，对比扩增后两者IFN-γ的释放情况。

6.3实验结果

用相同的扩增方案扩增培养3例患者(LIQI、TIHU、GAYJ)的淋巴结细胞和初始TIL细胞，对比两者之间的增殖情况，结果如图9显示，扩增培养相同的时间，LN-T的增殖倍数明显高于TIL，以淋巴结为原始材料更容易获取高剂量的T细胞产品，现有研究显示，输注细胞越多，疗效越好。

用相同的扩增方案扩增培养1例患者(TIHU)的淋巴结细胞(LN)和初始TIL细胞，将扩增培养14天的淋巴结T细胞(LN-T)和TIL，以及未经扩增培养的淋巴结细胞和初始TIL细胞，做TCR(T细胞受体)测序。结果如图10显示，LN的CDR3数比初始TIL的高(146391vs10836)，扩增培养14天后，LN-T的CDR3数也是高于TIL的(30631vs4964)。CDR3是决定TCR识别抗原特异性的最关键序列，TCR多样性集中体现在CDR3区的高可变性中。TCR多样性与抗肿瘤作用相关，TCR可以特异性的识别肿瘤抗原，由于肿瘤的异质性，TCR的多样性也高，抗肿瘤效果越好。

用相同的扩增方案扩增培养3例患者(LIQI、TIHU、GAYJ)的淋巴结细胞和初始TIL细胞，将扩增培养后细胞做流式检测活化标志物，结果如图11显示，在CD8+T细胞中，LN-T的CD28亚群比例明显高于TIL，CD28属于T细胞的活化标志物，经过同样的扩增培养后，LN-T的活化比例高于TIL的。

用相同的扩增方案扩增培养3例患者(LIQI、TIHU、GAYJ)的淋巴结细胞和初始TIL细胞，将扩增培养后细胞做流式检测耗竭标志物，结果如图12显示，在CD8+T细胞中，LN-T的TIGIT亚群比例明显低于TIL，TIGIT属于T细胞的耗竭标志物，经过同样的扩增培养后，LN-T的耗竭比例明显低于TIL的。

用相同的扩增方案扩增培养3例患者(LIQI、TIHU、GAYJ)的淋巴结细胞和初始TIL细胞，将扩增培养后细胞用CD3CD28 beads刺激培养，检测上清中IFN-γ含量，结果如图13所示，LN-T的IFN-γ的释放量明显高于TIL。

用相同的扩增方案扩增培养多对淋巴结细胞和初始TIL细胞，对收获的T细胞产品进行流式检测记忆亚群，结果如图14所示，TIL和LN-T在CD4+T细胞中以效应性T细胞(TEM亚群)为主，在CD8+T细胞中以中央记忆T细胞(TCM亚群)为主。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种体外扩增淋巴结抗肿瘤T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)活化淋巴结单细胞；

2)扩增淋巴结单细胞；

优选的，步骤1)包括使淋巴结单细胞与激活剂、生长因子和Feeder cell接触以活化淋巴结单细胞；

优选的，所述激活剂包括CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT和/或它们的功能活性片段；

优选的，所述激活剂包括以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB；

优选的，所述激活剂包括CD3激动剂和/或CD28激动剂；

优选的，所述激活剂选自CD3激动剂；

优选的，所述CD3激动剂包括CD3抗体和/或其抗原结合片段；

优选的，所述CD3激动剂选自CD3抗体；

优选的，所述CD3抗体包括OKT3、UHCT1；

优选的，所述CD3抗体选自OKT3；

优选的，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素；

优选的，所述生长因子选自白细胞介素；

优选的，所述白细胞介素包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21；

优选的，所述白细胞介素选自IL-2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Feeder cell包括PBMC、树突状细胞、抗原呈递细胞；

优选的，所述Feeder cell选自PBMC；

优选的，所述PBMC为经过辐照的PBMC；

优选的，所述Feeder cell的辐照剂量为20-60Gy；

优选的，所述淋巴结单细胞与Feeder cell比例为1：2-1：200；

优选的，所述淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50-1：200。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)的细胞密度为1-6×10⁶cells/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括对活化后的淋巴结单细胞进行补液以扩增淋巴结单细胞；

优选的，所述补液中添加有生长因子；

优选的，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素；

优选的，所述生长因子选自白细胞介素；

优选的，所述白细胞介素包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21；

优选的，所述白细胞介素选自IL-2；

优选的，所述淋巴结单细胞包括冷冻保存的淋巴结单细胞或新鲜的淋巴结单细胞；

优选的，所述淋巴结单细胞选自冷冻保存的淋巴结单细胞；

优选的，所述的扩增的总培养天数达到17天或细胞数大于1×10⁹cells时终止培养。

5.一种淋巴结T细胞冻存液，其特征在于，所述淋巴结T细胞冻存液包括冻存液A、冻存液B或冻存液C；

优选的，所述冻存液A、B包括CS10、生理盐水和人血白蛋白；

优选的，所述冻存液A包括50％CS10、40％生理盐水和10％的人血白蛋白；

优选的，所述冻存液B包括50％CS10、25％生理盐水和25％的人血白蛋白；

优选的，所述冻存液C包括羟乙基淀粉、DMSO和人血白蛋白；

优选的，所述冻存液C包括40％～70％羟乙基淀粉、3％～10％DMSO和20％～40％人血白蛋白。

6.淋巴结T细胞群，其特征在于，所述淋巴结T细胞群由权利要求1-4任一项所述的方法获得；

优选的，所述的淋巴结T细胞群包括具有增加的TCR克隆、增加的T细胞活化表型、降低的T细胞耗竭表型和/或增加的IFN-γ的释放量的T细胞；

优选的，所述的增加的T细胞活化表型包括CD28 T细胞亚群和/或CD69 T细胞亚群；

优选的，所述的降低的T细胞耗竭表型包括TIGIT T细胞亚群和/或LAG3 T细胞亚群。

7.权利要求6所述的淋巴结T细胞群在制备治疗肿瘤药物中的应用；

优选的，所述肿瘤包括液体肿瘤、实体瘤；

优选的，所述肿瘤选自实体瘤。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求6所述的淋巴结T细胞群；

优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

9.一种淋巴结T细胞的冻存方法，其特征在于，所述方法包括将淋巴结T细胞加入到权利要求5所述的淋巴结T细胞冻存液中；

优选的，所述淋巴结T细胞的冻存密度为0.5-5×10⁸cells/mL；

优选的，所述淋巴结T细胞的冻存密度为1-2×10⁸cells/mL。

10.权利要求5所述的淋巴结T细胞冻存液在制备淋巴结T细胞冻存试剂盒中的应用。