CN115975942B - 一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用，属于生物医药领域。所述胰腺癌免疫治疗耐药细胞系已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月8日，保藏编号为CCTCCNO:C202310。通过细胞功能学实验，发现该耐药细胞系的体外增殖、迁移能力不变，能显著抵抗T细胞的杀伤毒性；C57BL/6小鼠荷瘤实验发现，该耐药细胞系对PD‑1抗体治疗的耐受性显著增加，可用于深入研究胰腺癌PD‑1抗体治疗耐药的分子机制及开发相关抗肿瘤药物，为筛选胰腺癌PD‑1抗体治疗耐药的分子标志物、设计和评估新型抗肿瘤药物以及开发新的肿瘤治疗方案等提供新材料。

Description

一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，胰腺癌的发病率在国内外均呈明显的上升趋势。胰腺癌是恶性程度很高的消化道肿瘤之一，死亡率高，预后较差。胰腺癌患者的5年总生存率不超过5％。

目前手术切除是胰腺癌患者获得治愈机会和长期生存的唯一有效方式。但由于胰腺癌进展迅速，且早期症状不典型，临床就诊时大部分患者已属中晚期。因此在诊断时可手术切除的肿瘤不超过20％，且大多数患者出现手术后复发的情况。新辅助治疗能够提高胰腺癌的可切除率并延长患者的总生存期。但即使是局部可切除的胰腺癌患者，5年总生存率也仅约为25％。基于吉西他滨的化疗是胰腺癌的标准内科治疗方法，吉西他滨与奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶的联合使用可以降低胰腺癌死亡率，但会增加药物引起的毒性副作用。因此，胰腺癌急需新的更有效的治疗方式。

近年来，以免疫检查点抑制剂PD-L1/PD-1抗体为代表的免疫治疗方法在多种癌症治疗中取得了显著的效果，但在胰腺癌的治疗中并没有展现出明显的临床获益。胰腺癌对免疫治疗呈现显著的原发耐药性，极大限制了免疫治疗的应用。研究胰腺癌免疫治疗耐药的分子机制，鉴别关键生物标志物，从而选取更加合适的免疫治疗方案，有利于提高患者生存率；同时筛选新的药物靶点，继而开发免疫治疗与靶向治疗的联合疗法，能够为胰腺癌的治疗提供新的选择。而目前尚无对PD-1抗体耐药的胰腺癌细胞株。因此，构建PD-1抗体耐药的胰腺癌细胞株显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明获得的耐药细胞系具有稳定的PD-1抗体耐药性，为后期研究胰腺癌免疫治疗耐药机制，发现新的胰腺癌治疗靶点以及开发新的胰腺癌治疗手段提供基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R，所述耐药细胞系PAN02-R已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月8日，保藏编号为CCTCCNO:C202310，地址为中国武汉武汉大学，分类命名小鼠胰腺癌细胞PAN02-R。

进一步地，所述耐药细胞系PAN02-R的构建方法包括以下步骤：

(1)利用胰腺癌细胞系PAN02构建C57BL/6小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点PD-1抗体治疗，筛选治疗后体积最大的肿瘤；

(2)无菌条件下分离筛选得到的体积最大的肿瘤组织，提取肿瘤原代细胞，对肿瘤原代细胞进行体外培养并传代，利用所述肿瘤原代细胞继续构建小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点PD-1抗体治疗，筛选治疗后体积最大的肿瘤；

(3)重复步骤(2)直至免疫检查点PD-1抗体治疗组的肿瘤体积与对照组相比无显著差异，筛选治疗组体积最大的肿瘤；

(4)无菌条件下分离步骤(3)中获得的肿瘤组织，提取肿瘤原代细胞，对肿瘤原代细胞进行体外培养并传代，即获得胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R。

进一步地，在步骤(1)中，所述胰腺癌细胞系为鼠源性胰腺癌细胞系。

进一步地，在步骤(2)中，所述培养基为含有10％胎牛血清的DMEM培养基。

进一步地，在步骤(4)中，所述培养的条件为37℃，CO₂体积浓度为5％。

本发明还提供一种所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在筛选抗肿瘤药物靶点中的应用。

本发明还提供一种所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在筛选抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供一种所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供一种所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在筛选评估抗肿瘤效果的检测试剂中的应用。

本发明还提供一种所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在制备评估抗肿瘤效果的检测试剂中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明使用鼠源性胰腺癌细胞系PAN02及C57BL/6小鼠构建皮下瘤模型，给予PD-1抗体治疗，从PD-1抗体治疗耐药的小鼠肿瘤中分离肿瘤原代细胞进行培养和传代，最终获得胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R。通过细胞功能学实验，发现胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R的体外增殖、迁移能力不变；经靶细胞杀伤实验测定发现，耐药细胞株PAN02-R在体外具有显著抵抗T淋巴细胞杀伤毒性的能力；C57BL/6小鼠荷瘤实验发现，耐药细胞株PAN02-R对PD-1抗体治疗的耐受性显著增加。获得的胰腺癌PD-1抗体耐药细胞株PAN02-R为深入研究胰腺癌PD-1抗体治疗耐药的分子机制、发现新的胰腺癌治疗靶点以及开发新的胰腺癌治疗手段提供基础，具有较高的科研和临床应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系构建过程中获得的相关实验图，其中图A为利用PAN02细胞和C57BL/6小鼠构建皮下瘤模型筛选胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系的实验设计流程图；图B为对照组小鼠用同型对照IgG治疗后的肿瘤生长曲线，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm³)；图C为实验组小鼠用PD-1抗体治疗后的肿瘤生长曲线，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm³)，其中9只小鼠肿瘤完全缓解，1只小鼠肿瘤部分缓解，选取肿瘤部分缓解的小鼠即虚线所示2号小鼠进行下一步操作；

图2为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R的细胞形态及体外增殖、迁移、抵抗T细胞杀伤的相关实验图，其中图A为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R的形态图；图B为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R的克隆形成实验图；图C为细胞克隆数量的统计分析图；图D为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R的迁移能力显微镜图；图E为发生迁移的肿瘤细胞数目的统计分析图；图F为不同效靶比下T淋巴细胞对胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R杀伤毒性的统计分析图；

图3为验证胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R耐药效果的相关实验图，其中图A为利用C57BL/6小鼠皮下瘤模型验证胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R耐药效果的实验设计流程图；图B为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R荷瘤小鼠的皮下肿瘤图，实验分四组，对照细胞组PAN02+IgG,对照细胞治疗组PAN02+anti-PD-1，耐药细胞组PAN02-R+IgG，耐药细胞治疗组PAN02-R+anti-PD-1；图C为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R荷瘤小鼠皮下肿瘤的增殖曲线图，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm³)；图D为胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R皮下荷瘤小鼠的生存时间分析图，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为剩余生存百分数。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明使用鼠源性胰腺癌细胞系PAN02及C57BL/6小鼠构建皮下瘤模型，从PD-1抗体治疗耐药的小鼠肿瘤中分离肿瘤原代细胞进行培养和传代，获得胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系(如图1中的A)。具体如下：

①无菌条件下培养胰腺癌PAN02细胞，按照细胞传代的方法收集对数生长期的肿瘤细胞，用无菌1×PBS重悬细胞并计数，将细胞浓度调整至2×10⁷/ml。②使用1ml注射器将100μl细胞悬液接种至C57BL/6小鼠后背部皮下，构建皮下瘤模型。③荷瘤6天后使用游标卡尺测量肿瘤长径a及短径b，按照体积V＝1/2ab²计算肿瘤体积。选取体积在100±20mm³范围内的小鼠随机分成2组，以腹腔注射方式分别给予PD-1单抗或同型对照IgG处理，每次200μg/只，每3天给药1次，共给药6次。④每3天测量并计算小鼠肿瘤体积，荷瘤36天后，绘制小鼠肿瘤增殖曲线。PD-1单抗治疗组中体积最大的小鼠肿瘤被认为具有PD-1治疗耐药潜能。⑤在无菌操作台中分离该小鼠肿瘤组织并用无菌1×PBS清洗3遍，将肿瘤组织转移至6孔细胞培养板中，加入1mlDMEM培养基后用无菌剪刀将肿瘤组织剪为体积约1mm³的小块，然后每孔加入1ml组织消化液(组织消化液为含2mg/ml胶原酶Ⅳ与2mg/mlDNaseI的DMEM培养基)，置于37℃培养箱内消化30min，每10分钟晃动混匀一次，补充2ml含10％胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化。⑥用70μm孔径的无菌滤膜将上步得到的肿瘤组织悬液过滤到50ml无菌离心管中，用研磨棒轻轻研磨遗留在滤网上的组织块，加DMEM完全培养基冲洗即可得到肿瘤细胞悬液。⑦将⑥得到的肿瘤细胞悬液在4℃，400×g条件下离心5分钟，弃上清，用无菌1×PBS清洗细胞沉淀2遍，弃上清，用10ml含10％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬细胞，加入青霉素/链霉素，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。⑧按照细胞传代的方法收集上述得到的肿瘤原代细胞，用无菌1×PBS重悬细胞并计数，将细胞浓度调整至2×10⁷/ml。使用1ml注射器将100μl细胞悬液接种至C57BL/6小鼠后背部皮下，再次构建C57BL/6小鼠皮下瘤模型。重复上述筛选流程4次。直至PD-1抗体治疗组的肿瘤大小与IgG对照组相比无显著性差异。⑨取上步得到的PD-1抗体治疗组肿瘤体积最大的小鼠，按⑤至⑦步操作分离肿瘤原代细胞并进行培养和传代。即得到稳定PD-1耐药细胞系PAN02-R。⑩利用胰腺癌细胞PAN02和胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R分别构建小鼠皮下瘤模型，进行PD-1抗体治疗并检测肿瘤体积变化。胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R荷瘤小鼠用药后肿瘤仍能快速生长，与IgG处理组无显著性差异，说明该小鼠胰腺癌细胞具有PD-1抗体耐药性。

实施例1胰腺癌PAN02细胞的C57BL/6小鼠皮下瘤模型

1.PAN02细胞的培养

取出在液氮中冻存的PAN02细胞(购自北京协和细胞资源中心)，迅速置于37℃恒温水浴箱中，使其快速溶解，在无菌超净工作台内将液体转移至15ml离心管中，加入2mlDMEM培养基，室温1000rpm离心5min，弃上清，用10ml含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞并转移至细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养并传代。

2.构建小鼠皮下瘤模型

取对数生长期的PAN02细胞用胰酶消化并离心，使用无菌1×PBS重悬肿瘤细胞，对细胞进行计数，用无菌1×PBS将细胞浓度调整至2×10⁷/ml。选取6周龄的C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，用剃毛器将小鼠后背部毛发剃净，然后用无菌1ml注射器将100μl细胞悬液接种至小鼠后背部皮下，构建小鼠皮下瘤模型。

实施例2胰腺癌皮下瘤模型筛选PD-1抗体治疗耐药小鼠肿瘤

C57BL/6小鼠荷瘤后第6天，用游标卡尺测量肿瘤长径a及短径b，按照体积V＝1/2ab²计算肿瘤体积。选取体积在100±20mm³范围内的小鼠随机分成2组，每组10只。实验组给予免疫检查点PD-1抗体治疗，对照组给予同型对照IgG抗体。腹腔注射给药，每3天给药1次，每次200μg/只，共给药6次。每3天测量并计算肿瘤体积，荷瘤36天后，绘制小鼠肿瘤增殖曲线(如图1中的B)。其中，PD-1抗体治疗组中体积最大的小鼠肿瘤被认为具有PD-1治疗耐药潜能。颈椎脱位法处死该小鼠待用。

实施例3胰腺癌PD-1抗体治疗耐药小鼠肿瘤原代细胞的获取

将处死的小鼠用75％酒精浸泡5分钟，在无菌操作台中用无菌剪刀和镊子分离该小鼠肿瘤组织，将剥离出的完整肿瘤组织置于10cm细胞培养皿中，用无菌1×PBS清洗3遍。随后将肿瘤组织转移至6孔细胞培养板中，加入1mlDMEM培养基，用无菌剪刀将肿瘤组织剪为体积约1mm³的小块，每孔加入1ml组织消化液(组织消化液为含2mg/ml胶原酶Ⅳ与2mg/mlDNaseI的DMEM培养基)，置于37℃培养箱内消化30min，每10分钟晃动混匀一次，补充2ml含10％胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化。用70μm孔径的无菌滤膜将肿瘤组织悬液过滤到50ml无菌离心管中，对于遗留在滤网上的组织块，用研磨棒轻轻研磨并加DMEM完全培养基冲洗，即可得到细胞悬液。将细胞悬液在4℃，400×g条件下离心5分钟，弃上清，用无菌1×PBS清洗细胞沉淀2遍，弃上清，用10ml含10％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬细胞，加入青霉素/链霉素双抗，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时(如图1中的C)。弃上清，用无菌1×PBS清洗3遍，加入10ml含10％胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养，直至细胞传代、冻存，获得胰腺癌PD-1抗体治疗耐药小鼠的肿瘤原代细胞。

实施例4胰腺癌PD-1抗体稳定耐药细胞系的获取

收集实施例3获得的胰腺癌PD-1抗体耐药肿瘤原代细胞，按照实施例1的方法接种至C57BL/6小鼠后背部皮下，再次构建C57BL/6小鼠皮下瘤模型，重复实施例2和实施例3的筛选流程，直至PD-1抗体治疗组的肿瘤大小与IgG对照组相比无显著性差异。分离PD-1抗体治疗组体积最大的肿瘤组织，按照实施例3的方法获得肿瘤原代细胞并传代培养，即得到稳定的胰腺癌PD-1耐药细胞系PAN02-R。

该稳定耐药细胞系命名为小鼠胰腺癌细胞PAN02-R，于2023年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO：C202310。

实施例5胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系的体外增殖、迁移能力的检测

分别取对数生长期的胰腺癌细胞系PAN02和实施例4获得的胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R(细胞形态图见图2的A)，胰酶消化后离心收集细胞，用无菌1×PBS清洗细胞沉淀2次，离心后加入2mlDMEM培养基(无血清)重悬细胞沉淀，并对细胞进行计数。

对于克隆形成实验，用DMEM培养基(无血清)将细胞浓度调整至5×10²/ml。取1ml细胞悬液接入6孔板，补加800μlDMEM培养基和200μl胎牛血清，轻轻晃动培养板使细胞分布均匀，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养7天。用无菌1×PBS清洗细胞2遍，弃上清，加入1ml4％多聚甲醛固定30分钟，弃上清，加入1ml1％结晶紫染色30分钟，弃上清，用清水小心清洗残留的结晶紫染料。用显微镜拍照并进行克隆计数及统计分析。

对于细胞迁移实验，用DMEM培养基(无血清)将细胞浓度调整至1×10⁵/ml，取200μl细胞悬液接入Transwell小室上层，下层加入800ul含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。取出小室，弃上清，用1×PBS清洗小室2遍，弃上清，将小室置于4％多聚甲醛中固定30分钟，弃上清，将小室置于1％结晶紫中染色30分钟，弃上清，用棉签小心擦拭小室内部残留的未迁移细胞。用显微镜拍照并进行细胞计数及统计分析。

根据图2可知，胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R的体外增殖能力与对照细胞PAN02无差别(图2的B和C；p>0.05)。同时，胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R的体外迁移能力与对照细胞PAN02无差别(图2的D和E；p>0.05)。

实施例6胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系体外抵抗T淋巴细胞杀伤毒性的能力

以胰腺癌细胞系PAN02和实施例4获得的PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R作为靶细胞，以小鼠脾脏来源T细胞作为效应细胞，利用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性。按照细胞传代的方法收集对数生长期的PAN02和PAN02-R细胞，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后将细胞浓度调整到1×10⁵/ml。将肿瘤细胞悬液按每孔100μl接种至96孔培养板中，每组设定三个复孔，然后每孔加入100μl体积的T细胞悬液，效靶比(效应细胞与靶细胞的数量比)设置为5：1、10:1和20:1。靶细胞自然释放孔作为阴性对照，即只加100μl肿瘤细胞悬液不加T细胞。将96孔培养板放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养6小时，随后利用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(购自碧云天生物技术公司)和多功能酶标仪检测LDH数值并计算T细胞杀伤毒性。

根据图2的F可知，与对照细胞PAN02相比，胰腺癌PD-1抗体耐药细胞PAN02-R能够显著抵抗T淋巴细胞的杀伤毒性(p<0.05)。

实施例7验证胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系的耐药效果

利用鼠源性胰腺癌细胞系PAN02和实施例4获得的胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R分别构建C57BL/6小鼠皮下瘤，构建方法同实施例1；进行PD-1抗体治疗并检测肿瘤体积变化，验证胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R的耐药效果，实验流程图如图3的A所示。实验分四组，耐药细胞组PAN02-R+IgG，耐药细胞治疗组PAN02-R+anti-PD-1，对照细胞组PAN02+IgG，对照细胞治疗组PAN02+anti-PD-1，每组6只小鼠，具体治疗方法和肿瘤体积检测方法同实施例2。荷瘤36天后分离各组小鼠皮下肿瘤组织并测量体积(图3的B)；从第6天起，每3天使用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤的长径a及短径b，按照公式体积V＝1/2ab²计算肿瘤体积，绘制小鼠肿瘤增殖曲线(图3的C)。记录各组皮下荷瘤小鼠的生存时间并做统计分析(图3的D)。

根据图3结果可知，胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R荷瘤小鼠用PD-1抗体治疗后肿瘤仍能快速生长，与同型对照IgG处理组无显著性差异，说明该耐药细胞系具有PD-1抗体耐药性(图3的B和C；p>0.05)，且耐药细胞系PAN02-R荷瘤小鼠用PD-1抗体治疗后的生存期与同型对照IgG处理组无显著性差异(图3的D；p>0.05)。

综上可知，本发明对胰腺癌细胞系PAN02采用小鼠体内模型筛选法可获得对应的胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R。通过细胞功能学实验，发现胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R的体外增殖、迁移能力不变；经靶细胞杀伤实验测定，所述胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R在体外显著抵抗T淋巴细胞的杀伤毒性；C57BL/6小鼠荷瘤实验发现，胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R对PD-1抗体治疗的耐受性显著增加。成功获得胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系PAN02-R。

根据本发明方法，经过多次试验，均能制备得到胰腺癌PD-1抗体耐药细胞系，因此，所属技术领域的技术人员可以重复本发明提供的技术方案，并能够解决本发明所要解决的技术问题，达到该技术方案的效果。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R，其特征在于，所述耐药细胞系PAN02-R已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月8日，保藏编号为CCTCC NO:C202310。

2.根据权利要求1所述的耐药细胞系PAN02-R，其特征在于，构建方法包括以下步骤：

（1）利用胰腺癌细胞系PAN02构建C57BL/6小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点PD-1抗体治疗，筛选治疗后体积最大的肿瘤；

（2）无菌条件下分离筛选得到的体积最大的肿瘤组织，提取肿瘤原代细胞，对肿瘤原代细胞进行体外培养并传代，利用所述肿瘤原代细胞继续构建小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点PD-1抗体治疗，筛选治疗后体积最大的肿瘤；

（3）重复步骤（2）直至免疫检查点PD-1抗体治疗组的肿瘤体积与对照组相比无显著差异，筛选治疗组体积最大的肿瘤；

（4）无菌条件下分离步骤（3）中获得的肿瘤组织，提取肿瘤原代细胞，对肿瘤原代细胞进行体外培养并稳定传代，即获得胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R。

3.根据权利要求2所述的耐药细胞系PAN02-R，其特征在于，在步骤（1）中，所述胰腺癌细胞系为鼠源性胰腺癌细胞系。

4.根据权利要求2所述的耐药细胞系PAN02-R，其特征在于，在步骤（2）中，所述体外培养的培养基为含有10%胎牛血清的DMEM培养基。

5.根据权利要求2所述的耐药细胞系PAN02-R，其特征在于，在步骤（4）中，所述培养的条件为37℃，CO₂体积浓度为5%。

6.一种如权利要求1所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在筛选抗胰腺癌药物靶点中的应用。

7.一种如权利要求1所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在筛选抗胰腺癌药物中的应用。

8.一种如权利要求1所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在筛选评估抗胰腺癌效果的检测试剂中的应用。

9.一种如权利要求1所述的胰腺癌免疫治疗耐药细胞系PAN02-R在制备评估抗胰腺癌效果的检测试剂中的应用。