CN108192866B - Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用 - Google Patents

Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108192866B
CN108192866B CN201810184849.7A CN201810184849A CN108192866B CN 108192866 B CN108192866 B CN 108192866B CN 201810184849 A CN201810184849 A CN 201810184849A CN 108192866 B CN108192866 B CN 108192866B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
sfn
memory
cell
peripheral blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810184849.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108192866A (zh
Inventor
李红
张震
张毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Zhengzhou University filed Critical First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority to CN201810184849.7A priority Critical patent/CN108192866B/zh
Publication of CN108192866A publication Critical patent/CN108192866A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108192866B publication Critical patent/CN108192866B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及临床免疫细胞技术领域，尤其是一种SFN联合IL‑15和IL‑21制备记忆性T细胞的方法及应用，包括以下步骤：(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL‑15、IL‑21和SFN的培养基中培养；(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。本方法可使记忆性T细胞在体外培养中获得大量扩增，解决目前临床培养技术瓶颈，增强免疫细胞持久高效的抗肿瘤活性力，为细胞免疫治疗进一步临床应用提供可行性治疗手段。

Description

SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应用
技术领域
本发明涉及临床免疫细胞技术领域，具体领域为一种记忆性T细胞的制备方法。
背景技术
T细胞作为参与适应性免疫的主力军，在机体免疫反应中扮演着重要的角色，是目前癌症免疫治疗的研究热点。作为细胞治疗的重要组成部分，过继性免疫细胞治疗是指将体外培养的免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。研究发现：记忆性T细胞在体内的增殖能力和抗肿瘤活性，均优于效应记忆性T细胞和效应性T细胞，此外，记忆性T细胞对维持机体免疫内环境的稳态及重建具有重大意义。这意味着，记忆性T细胞在体内存活的时间越长，其抗肿瘤的临床效果越强。然而细胞的体外培养面临着巨大的挑战即体外培养的免疫细胞处于终末分化状态，这提示T细胞在体内存活时间短、抗肿瘤效果差等问题。基于此点，如何在体外诱导培养并获得更多的分化程度低、抗肿瘤活性强的免疫细胞，是目前免疫治疗研究关注的热点。细胞因子的不同生物学特性及可能对T细胞分化的影响，成为细胞特异性的体外诱导及增强T细胞杀伤活性的突破点。
IL-15由单核-巨噬细胞分泌的细胞因子，具有强大的抗病毒、抗细菌感染作用。其功能和IL-2相似，在免疫反应中起着重要的作用。有文献报道，IL-15对CD8+T细胞的生存和分化有影响，在细胞contraction期与IL-2的协同作用可延长KLRG1hi CD8+T细胞的生存时间，并增强其向记忆性前体细胞的分化。Angela M等报道了CD127影响T细胞分化命运和功能。记忆性前体细胞均高表达CD127，而效应性T细胞及终末分化T细胞表型为CD127-。已有文献报道记忆性前体T细胞表达较高水平的CD127和较低水平的KLRG1。IL-21通过诱导T细胞早期分化的表型对记忆性T细胞的维持和发育起到重要作用。同时，IL-21诱导记忆性T细胞产生的方法，已经应用于临床免疫细胞培养体系中。此外，T细胞的分化受到一些关键信号通路的调控，已有文献报道抑制mTOR及其下游信号通路能够促进记忆T细胞分化。在T细胞分化的研究中我们发现，SFN能够下调哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target ofrapamycin，mTOR)及其下游通路p-S6，促进低分化记忆性T细胞的形成，同时抑制抗凋亡基因BcL2的分泌及降低T细胞表面抑制性标志物PD-1的表达。综上所述，多种细胞因子的组合应用为ACT治疗提供更多的分化低、抗瘤活性强的T细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应用，，获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗，以解决现有技术中临床培养T细胞的技术瓶颈。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，包括以下步骤：
(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；
(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；
(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL-15、IL-21和SFN的培养基中培养；
(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。
优选的，步骤(1)中获得人外周血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人外周血，先在1500rpm，10min条件下离心，将血清转移至无菌的离心管中56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，用缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用PBS缓冲液清洗，1500rpm，10min离心，弃上清后采用PBS缓冲液清洗，1500rpm，5min离心，即获得人外周血单个核细胞。
优选的，所述用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。优选的，步骤(2)中用磁分选仪分选CD8+T细胞的方法为，按照每1×107个单个核细胞避光加入20μL humanCD8microbeads和70μL autoMACS Running Buffer，进行磁分选CD8+T细胞。
优选的，步骤(3)中刺激剂CD3/CD28beads与CD8+T细胞比例为1:3，细胞因子IL-7的浓度为10ng/mL，IL-15的浓度为10ng/mL。SFN的浓度为20μM/mL。
优选的，步骤(3)中所述培养基为Takara GT-551培养基，培养条件为37℃、5％CO2环境。
优选的，步骤(3)中所述培养基中还包括5％体积量的自体血清、青霉素和链霉素，培养基中T细胞密度为2×106/mL。
本发明采用上述任一方法获得的人记忆性CD8+T细胞。
本发明所述的人记忆性CD8+T细胞应用于制备治疗肿瘤疾病的制剂中。
与现有技术相比，采用本发明的方法制备人记忆性CD8+T细胞，具有以下优点：
(1)在体外实验中，从外周血中获得CD8+T细胞，加入CD3/CD28beads活化，并采用IL-15、IL-21和SFN处理。发现其促进记忆性前体的产生，同时下调Bcl2基因的表达，增强T细胞的抗凋亡能力。T细胞表面抑制性标志物PD-1分泌显著减低。
(2)通过本方法可以获得大量具有记忆特性且分化状态低的记忆性T细胞，从而获得抗肿瘤活性高、体内存活时间长的T细胞用于临床过继性细胞免疫治疗。
(3)本方法可使记忆性T细胞在体外培养中获得大量扩增，解决目前临床培养技术瓶颈，增强免疫细胞持久高效的抗肿瘤活性力，为细胞免疫治疗进一步临床应用提供可行性治疗手段。
附图说明
图1为对比例1、对比例2和对比例3与实施例1制备的流式检测外周血记忆性T细胞标志物CD127流式图；
图2为对比例1、对比例2和对比例3与实施例1制备的流式检测外周血记忆性T细胞标志物KLRG1流式图；
图3为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞标志物CD127细胞比例统计图；
图4为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞标志物KLRG1细胞比例统计图；
图5为RT-PCR检测外周血记忆性T细胞抗凋亡基因BcL2统计图；
图6对比例与实施例1制备的记忆性T细胞表面抑制性标志物PD-1比例统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞PBMCs，具体步骤如下：先1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9m/s2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:3的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/3。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5m/s2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，即可获得外周血单个核细胞。
将上述分离的PBMCs计数，按照每1×107个细胞避光加入20μL human CD8microbeads和70μL autoMACS Running Buffer，进行磁分选CD8+T细胞。
将分选的CD8+T细胞置于含有刺激剂CD3/CD28beads(3:1)、10ng/mL IL-15、10ng/mL IL-15和20μM SFN的GT551培养基中，同时加入5％自体血清、青霉素和链霉素，调整细胞密度为2×106/mL。在37℃，5％CO2培养箱中培养。每隔2d观察细胞生长状态，半量换液并补加全量的细胞因子IL-15和IL-21。
收集细胞至1.5mL EP管中计数，离心：1500rpm，5min，取1×106细胞，避光加入抗体：CD8-APC-cy7、CD45RA-APC、CD127-Percp、KLRG1-APC、PD-1-FITC。上机检测。
收集SFN处理的CD8+T细胞。采用TRizol法提取细胞总RNA，并反转录成CDNA。qPT-PCR检测SFN对抗凋亡基因Bcl2表达的影响
以上所用试剂中，所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，GT-551培养基选自Takara公司，IL-15和IL-21为德国美天旎公司生产，SFN购自sigma公司，CD3/CD28beads为Life technology公司生产，human CD8microbeads购自德国美天旎公司。Bcl2的引物合成是生工合成生工生物工程(上海)有限公司，流式抗体均购自美国Biologend公司。
实施例2
无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞PBMCs，具体步骤如下：先1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9m/s2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:2的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5m/s2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，即可获得外周血单个核细胞。
将上述分离的PBMCs计数，按照每1×107细胞避光加入20μL humanCD8microbeads和70μL autoMACS Running Buffer，进行磁分选CD8+T细胞。
将分选的CD8+T细胞置于含有刺激剂CD3/CD28beads(3:1)、20ng/mL IL-15、20ng/mL IL-21和10μM SFN的GT551培养基中，同时加入5％自体血清、青霉素和链霉素，调整细胞密度为2×106/mL。在37℃，5％CO2培养箱中培养。每隔2d观察细胞生长状态，半量换液并补加全量的细胞因子IL-15和IL-21。
收集细胞至1.5mL EP管中计数，离心：1500rpm，5min，取1×106细胞，避光加入抗体：CD8-APC-cy7、CD45RA-APC、CD127-Percp、KLRG1-APC、PD-1-FITC。上机检测。
收集SFN处理的CD8+T细胞。采用TRizol法提取细胞总RNA，并反转录成CDNA。qPT-PCR检测SFN对抗凋亡基因Bcl2表达的影响
以上所用试剂中，所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，GT-551培养基选自Takara公司，IL-15和IL-21为德国美天旎公司生产，SFN购自sigma公司，CD3/CD28beads为Life technology公司生产，human CD8microbeads购自德国美天旎公司。Bcl2的引物由生工合成生工生物工程(上海)有限公司合成，流式抗体均购自美国Biologend公司。
实施例3
无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞PBMCs，具体步骤如下：先1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9m/s2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:4的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/4。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5m/s2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，即可获得外周血单个核细胞。
将上述分离的PBMCs计数，按照每1×107个细胞避光加入20μL human CD8microbeads和70μL autoMACS Running Buffer，进行磁分选CD8+T细胞。
将分选的CD8+T细胞置于含有刺激剂CD3/CD28beads(3:1)、15ng/mL IL-15、15ng/mL IL-21和5μM SFN的GT551培养基中，同时加入5％自体血清、青霉素和链霉素，调整细胞密度为2×106/mL。在37℃，5％CO2培养箱中培养。每隔2d观察细胞生长状态，半量换液并补加全量的细胞因子IL-15和IL-21。
收集细胞至1.5mL EP管中计数，离心：1500rpm，5min，取1×106细胞，避光加入抗体：CD8-APC-cy7、CD45RA-APC、CD127-Percp、KLRG1-APC、PD-1-FITC。上机检测。
收集SFN处理的CD8+T细胞。采用TRizol法提取细胞总RNA，并反转录成CDNA。qPT-PCR检测SFN对抗凋亡基因Bcl2表达的影响。
以上所用试剂中，所述淋巴细胞分离液选自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，GT-551培养基选自Takara公司，IL-15和IL-21为德国美天旎公司生产，SFN购自sigma公司，CD3/CD28 beads为Life technology公司生产，human CD8 microbeads购自德国美天旎公司。Bcl2的引物合成是生工合成生工生物工程(上海)有限公司，流式抗体均购自美国Biologend公司。
为突出本发明的有益效果，还进行了以下对比例试验。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，不添加细胞因子IL-15、IL-21及小分子化合物SFN，其他培养条件一致。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，不添加细胞因子SFN，其他培养条件一致。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，不添加IL-15、IL-21，其他培养条件一致。
检测及结果：
IL-15、IL-21联合SFN对记忆性T细胞的表型、凋亡蛋白Bcl2、T细胞表面抑制性标志物PD-1的表达进行检测，以实施例1中的试样为研究对象。具体操作步骤如下：
(1)记忆性T细胞表型检测：收集培养至第7d细胞1×106个，重悬于200μL含1％FBS(胎牛血清)的PBS中，避光加入流式抗体：CD8-APC-cy7、CD45RA-APC、CD127-Percp、KLRG1-APC 4℃避光孵育15min，流式检测记忆性T细胞的表型。采用Diva软件分析培养获得的细胞表型结果显示CD127表达达到80.1％，KLRG1表达低至到6％。
(2)记忆性T细胞抑制性标记物检测：收集培养至第7d细胞,，流式细胞术检测T细胞的抑制性表面标志物。收集1×106个细胞，重悬于200μL含1％FBS(胎牛血清)的PBS中，避光加入流式抗体：CD8-APC-cy7、PD-1-FITC，4℃避光孵育15min。采用Diva软件分析培养获得的T细胞PD-1的表达水平，结果显示CD8+T细胞PD-1表达水平5.6％，较对照组诱导培养获得的CD8+T细胞PD-1比例降低15％以上。
(3)记忆性T细胞抗凋亡基因Bcl2表达的检测：收集培养至第7d细胞,qRT-PCR检测凋亡基因Bcl2的表达。收集SFN处理的CD8+T细胞。采用TRizol法提取细胞总RNA，并反转录成cDNA。将2μL DNA和10μL SYBER Green、10uM的上游和下游引物各0.8μL及无酶水加入到荧光定量板中，每孔20μL体系。
设置程序：95℃10min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40个循环；溶解曲线；以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值。以Folds＝2-ΔΔCt公式计算基因相对倍比关系。
(4)流式检测实施例1制备的记忆性T细胞与对比例1、2和3制备的记忆性T细胞比例，结果如图1-4所示，其中图1为对比例1、对比例2和对比例3制备的记忆性T细胞表达CD127比例的流式图，图2为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞表达KLRG1比例的流式图，图3为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞CD127比例的统计图，图4为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞KLRG1比例的统计图。由结果可知，采用实施例1方法制备记忆性T细胞比例高，利于记忆性T细胞的诱导及分化。
(5)流式检测实施例1制备的T细胞与对比例制备的T细胞抗凋亡基因Bcl2的表达。结果如图5所示，实施例制备T细胞中抗凋亡能力显著优于对比例1、2和3中T细胞抗凋亡能力。结果表明了实施例1制备的T细胞更加有利于维持记忆性T细胞的生存。
(6)流式检测实施例1制备的T细胞与对比例制备的T细胞表面抑制性表面标志物PD-1的表达水平。结果如图6所示，实施例1制备T细胞PD-1的表达水平低于对比例1、2和3中PD-1的表达水平。结果表明了实施例1制备的T细胞具有维持记忆性T细胞的活性。
对于实施例2-3制备的记忆性T细胞，在做上述检测后其结果与实施例1的检测结果相似，在此不做赘述。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于，所述SFN为萝卜硫素，包括以下步骤：
(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；
(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；
(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28 beads、细胞因子IL-15、IL-21和SFN的培养基中培养；
(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。
2.根据权利要求1所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中获得人外周血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人外周血，先在1500rpm，10min条件下离心，将血清转移至无菌的离心管中56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用PBS缓冲液清洗，1500rpm，10min离心，弃上清后采用PBS缓冲液清洗，1500rpm，5min离心，即获得人外周血单个核细胞。
3.根据权利要求2所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。
4.根据权利要求3所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中用磁分选仪分选CD8+T细胞的方法为，按照每1×107个单个核细胞避光加入20μL human CD8 microbeads和70μL autoMACS Running Buffer，进行磁分选CD8+T细胞。
5.根据权利要求4所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中刺激剂CD3/CD28 beads与CD8+T细胞比例为1:3，细胞因子IL-7的浓度为10ng/mL，IL-15的浓度为10ng/mL；SFN的浓度为20μM/mL。
6.根据权利要求5所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的培养基为Takara GT-551培养基，培养条件为37℃、5％CO2环境。
7.根据权利要求6所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的培养基中还包括5％体积量的自体血清、青霉素和链霉素，培养基中T细胞密度为2×106/mL。
CN201810184849.7A 2018-03-07 2018-03-07 Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用 Active CN108192866B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810184849.7A CN108192866B (zh) 2018-03-07 2018-03-07 Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810184849.7A CN108192866B (zh) 2018-03-07 2018-03-07 Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108192866A CN108192866A (zh) 2018-06-22
CN108192866B true CN108192866B (zh) 2021-05-11

Family

ID=62594704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810184849.7A Active CN108192866B (zh) 2018-03-07 2018-03-07 Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108192866B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628396B (zh) * 2019-01-24 2021-03-26 清华大学 记忆性淋巴细胞群在肝癌治疗中的应用
CN113416696B (zh) * 2021-06-25 2022-04-19 北京大学人民医院 一种免疫调节性γδT细胞及其体外扩增方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2007138961A1 (ja) * 2006-05-29 2009-10-08 レドックス・バイオサイエンス株式会社 マクロファージ遊走阻止因子阻害剤
NZ562237A (en) * 2007-10-05 2011-02-25 Pacific Edge Biotechnology Ltd Proliferation signature and prognosis for gastrointestinal cancer
AU2012323952A1 (en) * 2011-10-13 2014-04-24 Thomas Gadek Topical formulations of chemerin C15 peptides for the treatment of dermatological conditions
EP2968260B1 (en) * 2013-03-14 2020-12-16 University of Florida Research Foundation, Inc. Regulation of cancer using natural compounds and/or diet
ITUA20163269A1 (it) * 2016-05-09 2017-11-09 Graal S R L Composizione ad assorbimento orobuccale per la neuro-protezione

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
肿瘤免疫中的记忆性T细胞;徐林;《中国癌症杂志》;20071231;第17卷(第1期);第90页第4节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108192866A (zh) 2018-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101133185B1 (ko) 자연살해세포의 증식방법
US20180223257A1 (en) Method for the induction and expansion of natural killer cells derived from peripheral blood mononuclear cells
KR101971323B1 (ko) 면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법
CN110713978B (zh) 一种肿瘤抗原特异性肿瘤浸润性t细胞的分离方法
CN108588022B (zh) 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法
KR20140051263A (ko) Nk 세포의 증폭 방법
CN108192866B (zh) Sfn联合il-15和il-21制备记忆性t细胞的方法及应用
KR102236011B1 (ko) Nk 세포의 대량증식 배양방법
CN110643574A (zh) 用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法
CN108251369B (zh) 一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途
CN111394308B (zh) 一种脐带血淋巴细胞cik的培养方法
CN112852728B (zh) 基于外周血的lcl-nk细胞联合培养方法、细胞及产品
JP2007297291A (ja) リンパ球の活性・増殖に係る培養方法
CN108192865B (zh) Nk细胞体外扩增方法及用于该方法的试剂盒
CN110540960A (zh) 结合有免疫检查点阻断剂的t淋巴细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN113249321A (zh) 一种外周血nk细胞的培养方法
CN105969731B (zh) 一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法
EP3936611A1 (en) Composition, culture medium and method for inducing and/or amplifying tscm in vitro
CN113943710B (zh) 一种car-t细胞培养用的培养基及其应用
CN110862962A (zh) 一种没食子酸在体外培养扩增nk细胞的方法
CN113684180B (zh) 一种提高骨髓瘤杀伤活性的nk细胞制备方法
CN108148805B (zh) 一种人Tscm细胞及其制备方法和应用
CN115322968A (zh) 一种car-t细胞的培养体系及应用和培养方法
CN112300992B (zh) 一种nk细胞培养液及多级激活nk细胞的培养方法
CN110585427B (zh) 提高机体免疫力的组合物及在抗成人t细胞白血病或鼻咽癌中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant