JP2010220479A - Ｎｋ細胞の培養方法及びｎｋ細胞の利用 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＮＫ細胞を効率良く増殖・活性化させる方法を提供する。更に、ＡＤＣＣを介したモノクローナル抗体治療薬の効果を高めるための該ＮＫ細胞とモノクローナル抗体治療薬を併用した医薬及び治療方法も提供する。
【解決手段】 末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を培養開始後に添加することで、ＮＫ細胞を選択的に増殖させることができ、高増殖率で大量のＮＫ細胞を得ることが可能である。得られたＮＫ細胞は細胞傷害活性、細胞保存安定性に優れている。また、ＣＤ１６陽性細胞率が高いため、ＡＤＣＣ増強効果が高い。従って、該ＮＫ細胞はＡＤＣＣを介してモノクローナル抗体治療薬の治療効果を増大させることが可能である。
【選択図】 なし

Description

ＮＫ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、選択的かつ効果的に増殖させる培養方法に関する。詳しくはモノクローナル抗体治療薬の作用増強を目的として、ＡＤＣＣを強化するために、ＮＫ細胞をグルココルチコイド及びＩＬ−１８添加により増殖させる培養方法に関する。

日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物（以下、がんという）が挙げられる。がんの治療法として、三大療法と言われる外科療法、化学療法および放射線療法があるが、治療の困難性と副作用といった問題がある。
近年、上記三大療法の他にがんの新しい治療法として免疫細胞療法が行われており、この免疫細胞療法は、上記の三大療法のような治療の困難性や副作用といった問題が少ないため注目されている。

この免疫細胞療法の中に、ナチュラルキラー細胞（以下、本明細書において「ＮＫ細胞」と略す。）を用いる療法がある。ＮＫ細胞には腫瘍細胞を強く傷害する活性を有することから、がん治療に利用する研究が古くからなされていた。
このＮＫ細胞による腫瘍傷害の作用機序の一つとして抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が挙げられる。ＡＤＣＣは標的細胞に結合した抗体がＣＤ１６（ＣＤ；Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；白血球分化抗原）陽性のナチュラルキラー細胞（ＣＤ１６＋ＮＫ細胞）上のＦｃ受容体と結合することで、抗体依存的に誘導される標的細胞傷害活性である。

ＡＤＣＣを利用したモノクローナル抗体治療薬であるトラスツズマブ（製品名ハーセプチン 登録商標、製造販売元：中外製薬株式会社）、リツキシマブ（製品名リツキサン 登録商標、製造販売元：全薬工業株式会社、発売元：中外製薬）、セツキシマブ（製品名エルビタックス 登録商標、製造元イムクローン・システムズ、販売元ブリストル・マイヤーズスクイブ）及びアレムツズマブ（米国内商品名Ｃａｍｐａｔｈ）などはめざましい効果を上げている。
モノクローナル抗体治療薬の効果を上げる方法の一つは、大量且つ高活性のＮＫ細胞を得ることである。

培地にＩＬ−２を添加して細胞を増殖させることは従来から行われてきた方法であり、ＮＫ細胞の培養においても、普通に行われている方法である。しかしながら、この場合では、その他の細胞の増殖率がＮＫ細胞の増殖率を上回ってしまい、所望するほどのＮＫ細胞数を得ることがなかなか難しい。
そこで、この方法以外の培養方法を確立し、抗体との併用によるＡＤＣＣの増強を目指してＮＫ細胞細胞を増殖させるための様々な試みも以前からあった。代表的な方法を以下に示す。

１）リンパ芽球様細胞株、造血幹細胞または末梢血幹細胞を利用してＮＫ細胞を分化させる方法（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３及び非特許文献４）。患者由来ではない細胞や細胞株を用いる場合があり、拒絶反応の危険性がある。リンパ芽球様細胞株、造血幹細胞または末梢血幹細胞を維持する工程が煩雑である。

２）ＩＬ−２や抗ＣＤ−３抗体を用いるＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ；リンフォカイン活性化キラー）療法で末梢血単核球（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、以下、本明細書中でＰＢＭＣと略す。）からＮＫ細胞を増殖させる方法（非特許文献１及び非特許文献５）。ＮＫ細胞以外のリンパ球も増殖するため、ＮＫ細胞を選択的に増殖させることは困難である。またこの方法で二週間以上増殖させたＮＫ細胞は傷害活性が低くなることが知られている。

３）樹状細胞と接触させることにより、ＮＫ細胞の細胞傷害活性能及びＩＦＮ−γの産生能を向上させる方法（非特許文献１及び非特許文献６）、及びＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）Ｂ７０タンパク質を強制発現させた腫瘍細胞とＮＫ細胞を共培養する方法（非特許文献１及び非特許文献７）。高い細胞傷害を誘導させることができるが、増殖率は高くない。後者はＧＭ−ＣＳＦやＢ７０分子を強制発現させるためにウィルスを用いて形質転換しており、培養したＮＫ細胞を患者に投与することは安全面で問題がある。

４）ＨＦＷＴ細胞株をはじめとしたフィーダー細胞株とＮＫ細胞を共培養する方法（非特許文献１並びに特許文献１、特許文献２及び特許文献３）。この方法では患者由来ではない細胞株を用いるため、拒絶反応の危険性がある。また、細胞株の維持や培養等の工程が増えて煩雑である。

例えば、２）の培養方法で得られるＮＫ細胞は、全細胞中わずか５％である。また、１）、３）及び４）の増殖方法は煩雑であり、拒絶反応等の安全性の問題がある。
このように増殖率・ＮＫ細胞の機能性・簡便性・安全性等、臨床応用の必須条件が揃ったＮＫ細胞培養方法の確立が求められている。

Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２００４；１０：２１１９−２１２３ Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎ． Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌ． １９８７；６：１７１−１８８ Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． １９９５；２３：１６７６−１６８１ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２００１；２８：６７３−６８０ Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ． １９９３；４７：７３−７８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１；１６６：１５９０−１６００ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ２００１；１６６：３３−４０ 特開２００６−１１５８２６号公報 特開２００１−１４９０６９号公報 特開２００２−４５１７４号公報

本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、ＮＫ細胞を効率良く分化・増殖・活性化させる培養方法を提供する。更に、ＡＤＣＣを介したモノクローナル抗体治療薬の効果を高めるための該ＮＫ細胞とモノクローナル抗体治療薬を併用した医薬及び治療方法も提供する。

本発明者らは上記の課題を解決すべくＮＫ細胞を有効に増殖させる方法および条件について鋭意研究を行なった。その結果、培養開始からタイムラグを設けてＩＬ−１８及びヒドロコルチゾンを培養液に添加することにより、既存の方法より高い増殖率でＮＫ細胞を活性化させることに成功した。また、該ＮＫ細胞を用いることで、モノクローナル抗体治療薬の効果を増大させる結果を得た。

すなわち本発明は下記手段を提供するものである。
（１）末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養することを特徴とするＮＫ細胞の培養方法；
（２）前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする（１）に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（３）前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（４）前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（５）前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（６）前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする（１）乃至（５）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（７）ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（８）前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする（１）乃至（７）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（９）前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする（１）乃至（８）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法；
（１０）末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養して得られるＮＫ細胞；
（１１）前記グルココルチコイドの添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする（１０）に記載のＮＫ細胞；
（１２）前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載のＮＫ細胞；
（１３）前記グルココルチコイドがヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞；
（１４）前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする（１０）乃至（１３）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞；
（１５）前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする（１０）乃至（１４）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞；
（１６）ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする（１０）乃至（１５）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞；
（１７）前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする（１０）乃至（１６）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞；
（１８）前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする（１０）乃至（１７）のいずれか一項に記載のＮＫ細胞；
（１９）末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養したＮＫ細胞を含む治療・予防剤；
（２０）前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする（１９）に記載の治療・予防剤；
（２１）前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする（１９）又は（２０）に記載の治療・予防剤；
（２２）前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする（１９）乃至（２１）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２３）前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする（１９）乃至（２２）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２４）前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする（１９）乃至（２３）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２５）ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする（１９）乃至（２４）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２６）前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする（１９）乃至（２５）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２７）前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする（１９）乃至（１６）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２８）前記ＮＫ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする（１９）乃至（２７）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（２９）モノクローナル抗体治療薬を更に含むことを特徴とする（１９）乃至（２８）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（３０）前記モノクローナル抗体治療薬がトラスツズマブであることを特徴とする（１９）乃至（２９）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（３１）前記モノクローナル抗体治療薬がリツキシマブであることを特徴とする（１９）乃至（２９）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（３２）末梢血単核球にグルココルチコイドとＩＬ−１８を添加して増殖させたＮＫ細胞を投与することを特徴とする治療方法；
（３３）前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする（３２）に記載の治療方法；
（３４）前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする（３２）又は（３３）に記載の治療方法；
（３５）前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする（３２）乃至（３４）のいずれか一項に記載の治療方法；
（３６）前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする（３２）乃至（３５）のいずれか一項に記載の治療方法；
（３７）前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする（３２）乃至（３６）のいずれか一項に記載の治療方法；
（３８）ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする（３２）乃至（３７）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（３９）前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする（３２）乃至（３８）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（４０）前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする（３２）乃至（３９）のいずれか一項に記載の治療・予防剤；
（４１）前記ＮＫ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする（３２）乃至（４０）のいずれか一項に記載の治療方法；
（４２）モノクローナル抗体治療薬を更に含むことを特徴とする（３２）乃至（４１）のいずれか一項に記載の治療方法；
（４３）前記モノクローナル抗体治療薬がトラスツズマブであることを特徴とする（３２）乃至（４２）のいずれか一項に記載の治療方法；
（４４）前記モノクローナル抗体治療薬がリツキシマブであることを特徴とする（３２）乃至（４２）のいずれか一項に記載の治療方法；
（４５）グルココルチコイドとＩＬ−１８を添加して増殖させたＮＫ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（４６）前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする（４５）に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（４７）前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする（４５）又は（４６）に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（４８）前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする（４５）乃至（４７）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（４９）前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする（４５）乃至（４８）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５０）前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする（４５）乃至（４９）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５１）ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする（４５）乃至（５０）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５２）前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする（４５）乃至（５１）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５３）前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする（４５）乃至（５２）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５４）前記ＮＫ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする（４５）又は（５３）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５５）モノクローナル抗体治療薬を更に含むことを特徴とする（４５）乃至（５４）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
（５６）前記モノクローナル抗体治療薬がトラスツズマブであることを特徴とする（４５）乃至（５５）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；
（５７）前記モノクローナル抗体治療薬がリツキシマブであることを特徴とする（４５）乃至（５５）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント；

本発明の培養方法によれば、培養開始時の細胞数と比較して概ね１０〜３０００倍以上の増殖率でＮＫ細胞を増殖させることができるため、大量のＮＫ細胞を得ることが可能となる。
また、培養で得られた細胞集団中のＮＫ細胞率も従来よりも高く、その培養効率も向上させることが可能である。

得られたＮＫ細胞の特性としても、従来と比較して高いＩＮＦγ産生性、細胞保存安定性を示し、ＮＫ細胞の機能そのものとしても、従来よりも効果の高いＮＫ細胞を提供することが可能となる。
また、ＮＫ細胞の細胞表面にモノクローナル抗体治療薬を結合させる分子であるＣＤ１６を７０％以上のＮＫ細胞で発現させることができる。得られたＮＫ細胞は増殖率だけでなく、増殖する工程が従来技術より簡便であり、拒絶反応等のおそれも少なく安全性が高い。

このように、本発明のＮＫ細胞を用いた本発明の治療・予防剤及び治療方法によれば、今まで以上に効果の高いＮＫ細胞を用いることになるため、従来よりも薬効・治療効果の高い医薬・治療方法を提供することが可能となる。
更に、このＮＫ細胞を用いることにより効果的にＡＤＣＣにおける細胞傷害能を高めることができ、モノクローナル抗体治療薬により標的化されたがん細胞を特異的且つ効果的に傷害することが可能である。このように、本発明によるＮＫ細胞をモノクローナル抗体治療薬のアジュバントとして用いることで、既存もしくは今後開発されるモノクローナル抗体治療薬の効果も向上させることが可能となる。

以下、本発明の実施形態について説明する。

＜ＮＫ細胞の培養方法＞
まずＮＫ細胞の培養方法について説明する。

本発明のＮＫ細胞の培養方法は、末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養することを特徴とする方法である。
ここで、本明細書でいう「ＮＫ細胞」とは、具体的にはＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞を指す。

グルココルチコイドは免疫抑制作用を有し、一般的に抗炎症剤として使用されるものであればよく、その例として、酢酸ヒドロコルチゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物、酪酸ヒドロコルチゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物、塩酸ヒドロコルチゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物、コハク酸ヒドロコルチゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物、酢酸デキサメタゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物、リン酸デキサメタゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物、吉草酸デキサメタゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物等が挙げられる。この中でも好ましくはコハク酸ヒドロコルチゾン並びにその塩及び／又はそれらの水和物が好ましく用いられる。

グルココルチコイドの調製方法としては、例えばコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム（商品名：サクシゾン、興和創薬株式会社）を生理食塩液に溶解して調製する。

グルココルチコイドの濃度としては、例えばコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウムであれば１×１０^−８Ｍ以上１×１０^−４Ｍ以下となるように培養開始後に添加する。

グルココルチコイドの添加時期は培養開始後１日目から７日目の間ならＮＫ細胞を効率よく増殖させることができるが、好ましくは、培養開始から３日目に添加することが望ましい。通常であれば、グルココルチコイドの免疫抑制作用により、細胞増殖も抑制されるものと考えられるが、上記の通り添加濃度及び添加時期を設定することにより、ＮＫ細胞が細胞死（アポトーシスなど）から回避される効果が得られる。

ＩＬ−１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８）はインターロイキンの一種で、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）及びＮＫ細胞に働いてＩＦＮ−γの産生を促す作用を有する。

ＩＬ−１８の調製方法としては、例えばＩＬ−１８（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８、医学生物学研究所）を生理食塩水等に溶解して調製する。

ＩＬ−１８の添加濃度としては、５０ｎｇ／ｍＬ以上になるように培養開始後に添加する。

ＩＬ−１８の添加時期は培養開始０日目（開始当日）から１４日目の間であればＮＫ細胞を効果的に増殖させることができるが、好ましくは、培養開始から０〜３日目に添加することが望ましい。このような時期に添加することで、より多くのＮＫ細胞が得られる。

ＩＬ−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）はインターロイキンの一種で、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を促す作用を有する。

ＩＬ−２の調製方法としては、例えばＩＬ−２（商品名：ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、Ｃｈｉｒｏｎ）を生理食塩水等に溶解して調製する。

ＩＬ−２の添加濃度としては、１〜３０００ＩＵ／ｍＬになるように培養開始時に添加する。ＮＫ細胞を増殖させるためには、培養開始時に５００ＩＵ／ｍＬの濃度であることが望ましい。培養開始から培養終了までＩＬ−２濃度が一定である必要はなく、適宜濃度を変化させてもよい。

ＩＬ−２の添加時期は培養開始時である。培養開始後はＩＬ−２濃度を変化させても良く、適宜添加しても良い。

本発明によれば、ＰＢＭＣにグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養すると、例えば、培養開始時と比較して概ね１０〜３０００倍程度の増殖率でＮＫ細胞を活性化・増殖させることができる。また、培養で得られた細胞集団中のＮＫ細胞率も概ね６０％以上となり、培養効率も上げることができる。これらの効果はグルココルチコイド及びＩＬ−１８が夫々発揮するよりも高いものである。

次に、本発明のＮＫ細胞の培養方法を、具体的に説明する。
採血により末梢血を得る。採血する方法としては、真空採血管等による全血採取を利用することができる。採血量は患者の末梢血に含まれるＮＫ細胞の割合、ＮＫ細胞の培養可能期間、投与数などを考慮し、患者の負担とならない程度に設定することが好ましい。

例えば、１４日間の培養期間で、投与するＮＫ細胞として１×１０^９個程度のＮＫ細胞を得たい場合には、培養開始時のＰＢＭＣ数を概ね１×１０^７〜５×１０^７個程度確保できるように採血量を設定することが好ましい。

また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接末梢血単核球を取得することが可能である。

例えば密度勾配遠心法により末梢血単核球を得る。末梢血単核球を例えば培養液ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＡｌｙＳ培地（（株）細胞科学研究所）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、ＤＭＥＭ）、イスコフ培地（インビトロジェン、ＩＭＥＭ）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。

また、必要に応じて血清を０．１〜２０％添加してもよい。血清として、例えば、自己血漿等を使用してもよい。次いで、このようにして得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。

フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球にＩＬ−２（商品名：ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、Ｃｈｉｒｏｎ）を濃度が５００〜３０００IＵ／ｍＬ、より好ましくは１０００ＩＵ／ｍＬ以上となるように添加する。また、培養中全期間を通じてＩＬ−２濃度は一定である必要はなく、必要に応じて変化させても良い。ただし、培養開始時に５００ＩＵ／ｍＬの濃度があることが好ましい。

ＩＬ−２を添加した後、温度３４〜３８℃、より好ましくは３７℃で、２〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ_２存在下で静置培養する。この際、培養する細胞数に応じ、ＩＬ−２含有の培養液を適宜添加する。このときのＩＬ−２の含有濃度は０〜３
０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。

培養開始後、上記培養液に濃度が１０^−４Ｍ以下となるようにグルココルチコイドを添加する。ここで、使用されるグルココルチコイドとしては、例えば酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、塩酸ヒドロコルチゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、及び吉草酸デキサメタゾン等並びにそれらの塩及び／又はそれらの水和物が挙げられる。例えばコハク酸ヒドロコルチゾン、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１×１０^−８Ｍ以上１×１０^−４Ｍ以下にすることが好ましい。

上記グルココルチコイドの添加時期は培養開始３日目から７日目の間であれば、概ね１０〜３０００倍程度の増殖率でＮＫ細胞が得られ、十分な効果が期待できる。好ましくは、培養開始から３日目に添加することで、高増殖率でＮＫ細胞を得ることができる。

培養開始後、上記培養液に濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上となるようにＩＬ−１８（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８、医学生物学研究所）を添加する。

上記ＩＬ−１８の添加時期は培養開始０日目から１４日目の間であれば、十分な効果が期待できる。好ましくは、培養開始から３日目に添加することで、１４〜２９００倍のＮＫ細胞が得られる。ＩＬ−２のみを添加する従来の方法だと、得られるＮＫ細胞は２〜９０倍であり、本発明のＮＫ培養は従来の方法と比較して概ね１８倍ほどのＮＫ細胞が得られる。

培養期間としては７日間以上であれば高純度でＮＫ細胞を含む細胞群が得られるが、ＮＫ細胞の細胞数を増やすには、１４〜２８日間程度培養することが好ましい。

上記培養により得られた細胞を遠心分離法等により培地を取り除き、回収する。回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。洗浄後に得られた細胞を遠心分離法等で回収する。

上述の通り、本発明の培養方法によれば、グルココルチコイド及びＩＬ−１８を培養開始後に添加することにより、大量のＮＫ細胞を得ることが可能である。また細胞集団中のＮＫ細胞率は従来の方法では６〜７０％であるが、本発明の培養方法では安定的に６５％以上の細胞率となり、従来の方法と比べてＮＫ細胞率をおよそ２倍に上昇させることが可能となり、効率良くＮＫ細胞を増殖させることができる。

次に、本発明のＮＫ細胞について説明する。

＜ＮＫ細胞＞

本発明のＮＫ細胞は、末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養して得られるものである。具体的には、本発明の培養方法により得られるＮＫ細胞である。

本発明の培養方法により培養されたＮＫ細胞は、従来の培養方法で得られたＮＫ細胞と比較して細胞傷害活性、細胞保存安定性に優れている。また、本発明のＮＫ細胞は、得られるＮＫ細胞数中の細胞表面マーカーＣＤ１６陽性ＮＫ細胞の割合が７０％以上の割合で含む細胞集団であるため、高いＡＤＣＣ活性を有する。

上記本発明のＮＫ細胞の特性は、サイトカイン産生細胞率、生細胞率及び細胞表面マーカーの発現等を測定することにより、判定することが可能である。

ＩＦＮγは、Ｔ細胞やＮＫ細胞等が産生するサイトカインである。ＮＫ細胞が腫瘍細胞やウィルス感染症を認識すると分泌され、近傍細胞の増殖抑制や貪食機能促進、ＮＫ細胞自身の活性増強等の機能を持つ。従って、培養細胞中ＩＦＮγ産生細胞率を測定した値が、上記に示すような機能を持った細胞集団の割合である。

本発明のＮＫ細胞は、ＩＬ−１８を添加して培養することによりＩＦＮγ産生が増強されるため、従来の手法で得られるＮＫ細胞と比較してＩＦＮγ産生率の高い細胞集団となり、細胞傷害活性に優れている。

本発明における細胞保存安定性は、例えば、上記ＮＫ細胞を含む培養細胞を保存後、一定時間ごとに培養液中のＬＡＫｒｅｇｉｏｎ内細胞率（フローサイト解析画面で細胞の大きさを示すプロットにおける死細胞を除くゲート）及び生細胞率を測定することで示すことができる。

該ＮＫ細胞は、保存後の生細胞率の高い細胞集団であり、細胞保存安定性に優れている。これは、ヒドロコルチゾン存在下でＮＫ細胞が培養されることによりＢｉｍなどのアポトーシスを誘導する分子が抑制されるためと考えられる。

ＮＫ細胞における、ＡＤＣＣ活性を判定する方法として、例えば、細胞表面マーカーであるＣＤ１６陽性細胞率を測定することが挙げられる。ＣＤ１６分子は、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域に結合する、Ｆｃ受容体である。ＣＤ１６を発現しているＮＫ細胞は、標的細胞を覆った抗体に結合し、且つ傷害することができるため、有効にＡＤＣＣを誘導することが可能である。また、細胞表面マーカーＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）の細胞集団をＮＫ細胞とみなすことができるので、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞ＣＤ１６陽性細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋）がＡＤＣＣに有効な細胞傷害能を持つＮＫ細胞であるといえる。

本発明のＮＫ細胞は、上述したＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞ＣＤ１６陽性細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋）が、得られたＮＫ細胞数中概ね７０％以上となるため、ＡＤＣＣ活性が高いＮＫ細胞集団であると言える。

以上、説明した通り、本発明のＮＫ細胞は、高効率な増殖性及び高ＮＫ細胞率であることに加えて、高細胞傷害活性能及び高細胞保存安定性等の特性を示す。また、ＮＫ細胞中のＣＤ１６陽性細胞率が非常に高く、ＡＤＣＣ活性が高い細胞集団である。該ＮＫ細胞はＡＤＣＣを介してモノクローナル抗体治療薬の効果を増強する働きを持つため、治療・予防剤及び治療方法に用いることで、高い治療効果をあげることが可能となる。

次に、本発明の培養方法によって得られたＮＫ細胞を含む治療・予防剤及び治療方法（以下、本発明の治療・予防剤、本発明の治療方法とも言う）について説明する。

＜本発明の治療・予防剤、治療方法＞
本発明の治療・予防剤及び治療方法は、末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養したＮＫ細胞を含むものである。

該ＮＫ細胞はＡＤＣＣを作用機序とするモノクローナル抗体治療薬の効果を増強するような特性を持つため、モノクローナル抗体治療薬と併用することにより、高い治療効果をあげることが可能となる。

本発明の治療・予防剤に用いられるＮＫ細胞は、上記のとおり得られたＮＫ細胞を遠心分離等により回収して用いる。

本発明の薬剤に用いるＮＫ細胞数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、一回の投与あたり概ね１０^６〜１０^１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０^８個／人以上である。投与間隔としては、週一回投与や隔週投与、あるいは複数週間に一回投与などが可能であるが、これら投与量、投与間隔などは患者の状態、疾病の種類に応じて適宜調整することができる。

回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水等を利用することが好ましい。

生理食塩水に懸濁してＮＫ細胞を含む薬剤を得る。

本薬剤を投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下、リンパ節等へ注射することができる。また、病変部に直接注入してもよく、例えば内視鏡的または経皮的に直接穿針して投与することもできる。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよく、例えばがん栄養血管に選択的に挿入された動脈カテーテルを経由して投与することができる。

ＮＫ細胞は自己由来であれば、投与した際に患者の免疫系に排除されることなく、その機能を発揮することが可能である。

次にモノクローナル抗体治療薬を含む薬剤について説明する。モノクローナル抗体治療薬としては様々なものを用いることができ、例えばトラスツズマブ（製品名ハーセプチン 登録商標、製造販売元：中外製薬株式会社）、リツキシマブ（製品名リツキサン 登録商標、製造販売元：全薬工業株式会社、発売元：中外製薬）、セツキシマブ（製品名エルビタックス 登録商標、製造元イムクローン・システムズ、販売元ブリストル・マイヤーズスクイブ）及びアレムツズマブ（米国内商品名
ａｍｐａｔｈ）等が挙げられる。

モノクローナル抗体の特徴としては、がん細胞表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持ったヒト抗体およびマウス・ヒトキメラ抗体である。具体的には、ＣＤ２０を標的としたリツキシマブ、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ ２、ヒト上皮増殖因子受容体２型）を標的としたトラスツマブ、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、上皮増殖因子受容体）を標的としたセツキシマブ、ＣＤ５２を標的としたアレムツズマブなどを用いることができるが、ここではリツキシマブ、トラスツズマブを例として説明する。

リツキシマブはヒトＢリンパ球表面に発現するＣＤ２０抗原に結合するモノクローナル抗体であり、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫を対象としたモノクローナル抗体治療薬である。また、ＣＤ２０陽性慢性リンパ性白血病の治療薬として用いられることもある。

リツキシマブは例えばリツキサン（登録商標、製造販売元：中外製薬株式会社）等として入手することができる。瓶内のリツキシマブ溶液を生理的に許容可能な溶液、例えば生理食塩水等により希釈して調製する。

リツキシマブの投与量は０．０００１〜３０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。特に、臨床におけるリツキシマブの投与量は１回３７５ｍｇ／ｍ^２であるが、患者の状態に応じて減量することもできる。

トラスツズマブはＨＥＲ２に結合するモノクローナル抗体で、ＨＥＲ２過剰発現が確認された転移性乳がんを対象としたモノクローナル抗体治療薬である。また、ＨＥＲ２を過剰に発現したその他の癌の治療薬として用いられることもある。

トラスツズマブは例えばハーセプチン（登録商標、製造販売元：中外製薬株式会社）等として入手することができる。バイアル内のトラスツズマブを生理食塩水に溶解して、必要量抜き取り、生理的に許容可能な溶液、例えば生理食塩水等に溶解して調製する。

トラスツズマブの投与量は０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。
特に、臨床におけるトラスツズマブの投与量は初回投与時は４ｍｇ／ｋｇ、２回目以降は２ｍｇ／ｋｇであるが、患者の状態に応じて減量することもできる。

本発明のＮＫ細胞をがんの治療・予防剤として使用する場合には、様々なサイトカイン及びインターフェロン等を組み合わせることも可能である。

本発明のＮＫ細胞とモノクローナル抗体治療薬を個別に投与しても、一つの溶液としても良く、例えば一つの溶液にすることで１度に２種の薬剤を投与することができ、患者への負担や作業の軽減を図ることができる。

投与頻度としては、同時投与を行う場合は例えば、リツキシマブまたはトラスツズマブの投与頻度と同じとし、適時本発明のＮＫ細胞を単独で追加投与することも可能である。

本薬剤を投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下、リンパ節等へ注射することができる。また、病変部に直接注入してもよく、例えば内視鏡的または経皮的に直接穿針して投与することもできる。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよく、例えばがん栄養血管に選択的に挿入された動脈カテーテルを経由して投与することができる。

この際、リツキシマブを添加した場合には投与開始時にはリツキシマブが２５ｍｇ／時の速度となるようにし、患者の状態を観察しながら１００ｍｇ／時、２００ｍｇ／時まで速度を上げることができる。

トラスツズマブを添加した場合には９０分以上かけて投与するようにする。

該ＮＫ細胞を含む薬剤とモノクローナル抗体治療薬を含む薬剤を投与する順序としては、
１） ＮＫ細胞を含む薬剤とモノクローナル抗体治療薬を同時に別剤として投与する場合、
２） モノクローナル抗体治療薬を含む薬剤を投与した後に、適宜時間を経てからＮＫ細胞を含む薬剤を別剤として投与する場合、
３） ＮＫ細胞とモノクローナル抗体治療薬とを混合した薬剤を投与する場合
が考えられ、いずれの順序でも良いが、患者の症状に応じて適宜調整される。

また、本発明ＮＫ細胞は、モノクローナル抗体治療薬の効果を増強するような特性を持つため、モノクローナル抗体治療薬アジュバントとして用いることが可能である。

本発明ＮＫ細胞をモノクローナル抗体治療薬アジュバントとして使用し、がん及びウィルス感染症等の難治性疾患の治療・予防剤と併用する場合には、様々なサイトカイン及びインターフェロン等を組み合わせることも可能である。

本発明ＮＫ細胞は様々なモノクローナル抗体治療薬に対するアジュバントとして用いることが可能であり、例えばトラスツズマブ（製品名ハーセプチン 登録商標、製造販売元：中外製薬株式会社）、リツキシマブ（製品名リツキサン 登録商標、製造販売元：全薬工業株式会社、発売元：中外製薬）、セツキシマブ（製品名エルビタックス 登録商標、製造元イムクローン・システムズ、販売元ブリストル・マイヤーズスクイブ）及びアレムツズマブ（米国内商品名Ｃａｍｐａｔｈ）等が挙げられる。

トラスツズマブをはじめとしたモノクローナル抗体治療薬を用いた治療において、モノクローナル抗体治療薬、及び本発明ＮＫ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバントを投与する順序としては
１） モノクローナル抗体治療薬を同時に別剤として投与する場合、
２） モノクローナル抗体治療薬を含む薬剤を投与した後に、適宜時間を経て別剤として投与する場合、
３） モノクローナル抗体治療薬と混合した薬剤を投与する場合
等が挙げられ、いずれの順序でも良いが、患者の症状に応じて適宜調整される。

本発明ＮＫ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバントは既存のモノクローナル抗体治療薬のみならず、今後開発されるモノクローナル抗体治療薬の効果をも向上させることが可能である。

以上、本発明のＮＫ細胞を用いた治療・予防剤及び治療方法は、モノクローナル抗体治療薬の効果を増強し、高い効果をあげることが可能となる。該治療・予防剤、治療方法は、従来技術のような煩雑な工程を含まず簡便であり、拒絶反応等のおそれが少なく安全性が高い。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。

＜ＩＬ−１８、ヒドロコルチゾン添加時期の決定のための試験＞
１−１：ＮＫ細胞の培養
健常人ドナーから末梢血を４８ｍｌ採血し、血球分離用比重液充填済み採血管を用いて末梢血単核球を分離した。
得られた末梢血単核球を、ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所製）に懸濁し、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１．０×１０^６／１ｍＬの末梢血単核球を播種した。
この時、ＩＬ−１８（登録商標、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８、医学生物学研究所）を１００ｎｇ／ｍＬ添加したウェルと、ＩＬ−１８およびコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム（商品名：サクシゾン、興和創薬株式会社）を濃度が１０^−４Ｍとなるように添加したウェルと、ＩＬ−１８およびヒドロコルチゾンを添加しないウェルを作成し、３７℃、５％ＣＯ_２濃度条件下で培養を開始した。

培養開始時にＩＬ−１８を添加したウェルにおいては、細胞の増殖に応じて培養液ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所製）を添加して１４日間培養を行った。この場合、添加培地量に対してＩＬ−１８を開始から３，５，７，１０，及び１２日目まで、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度で継続添加した。また、更に各々３，５，７，１０，１２日目において、すなわちそれぞれのＩＬ−１８添加最終日に、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウムを培養液量に対して濃度が１０^−４Ｍとなるように添加した（これらをそれぞれｄａｙ３ＩＬ−１８＋ｄａｙ３ＨＣ，ｄａｙ５ＩＬ−１８＋ｄａｙ５ＨＣ，ｄａｙ７ＩＬ−１８＋ｄａｙ７ＨＣ，ｄａｙ１０ＩＬ−１８＋ｄａｙ１０ＨＣ，ｄａｙ１２ＩＬ−１８＋ｄａｙ１２ＨＣとする）。
また、培養開始時にＩＬ−１８とヒドロコルチゾンを添加したウェルにおいては、細胞の増殖に応じて培養液ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所製）を添加しながら１４日間培養を行い、その際に培養を開始してから３，５，７日目まで、ＩＬ−１８を添加培地量に対して１００ｎｇ／ｍＬの濃度で継続添加した（これらをそれぞれｄａｙ３ＩＬ−１８＋ｄａｙ０ＨＣ，ｄａｙ５ＩＬ−１８＋ｄａｙ０ＨＣ，ｄａｙ７ＩＬ−１８＋ｄａｙ０ＨＣとする）。
培養開始時にＩＬ−１８とヒドロコルチゾンを添加しないウェルにおいては、細胞の増殖に応じて培養液ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所製）を添加し１４日間培養を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。

１−２：培養１４日間でのＮＫ細胞増殖率
上述の試験培養開始時および培養１４日目において、血球計算盤にて各条件の細胞数を測定した。また、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、ＰＥ標識された抗ＣＤ５６抗体（ベックマン・コールター）、ＥＣＤ標識された抗ＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター）をＰＢＳで洗浄した細胞に添加し、遮光の状態で、４℃で３０分染色した。細胞の測定はＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００を用い、測定結果の解析にはＣｙｔｏｍｉｃｓ ＣＸＰ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。
上記の計測によって得られた総細胞数とＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞率を掛けてＮＫ細胞数とし、培養開始時から培養１４日目までに増殖したＮＫ細胞の倍率をＮＫ細胞増殖率とし、図１に示す。

図１に示すように、培養開始時にＩＬ−１８とヒドロコルチゾンを添加した条件では、培養開始時にＩＬ−１８を添加し、ヒドロコルチゾンを途中添加した条件よりも、ＮＫ細胞増殖が低いことが確認された。また、培養開始時にＩＬ−１８を添加しヒドロコルチゾンを途中添加した条件においては、ヒドロコルチゾン添加時期が早い方が高いＮＫ細胞増殖率を示していた。
以上の結果から、特に培養開始３〜７日目にヒドロコルチゾンを添加することが好ましいことがわかった。

＜ＮＫ細胞の調製＞
２−１：本発明のＮＫ細胞の調製
健常人ドナー４名から末梢血を４８ｍＬ採血し、血球分離用比重液充填済み採血管を用いて末梢血単核球を分離した。
得られた末梢血単核球を、ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所）に懸濁した。
Ｔ７５−ｆｌａｓｋ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１．７×１０⁷／１７ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ−２を１０００ＩＵ／ｍＬ、ＩＬ−１８（登録商標、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８、医学生物学研究所）を１００ｎｇ／ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２濃度条件下で培養を開始した。
培養を開始してから３日後にコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム（商品名：サクシゾン、興和創薬株式会社）を濃度が１０^−４Ｍとなるように添加した。更に細胞の増殖に応じて培養液ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有）を添加し、１４日間培養を行った。

２−２：比較例となるコントロールＮＫ細胞の調製
健常人ドナー４名（上記検体と同一）から末梢血を４８ｍＬ採血し、血球分離用比重液充填済み採血管を用いて末梢血単核球を分離した。
得られた末梢血単核球を、ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所製）に懸濁した。
Ｔ７５−ｆｌａｓｋ（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト）に、１．７×１０⁷ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ−２を１０００ＩＵ／ｍＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２濃度条件下で培養を開始した。
細胞の増殖に応じて培養液ＡｌｙＳ２０３（ＩＬ−２ １０００ＩＵ／ｍＬ含有。（株）細胞科学研究所製）を添加し、１４日間培養を行った。

２−３：細胞数の測定
細胞培養液から１０μＬの細胞懸濁液を分取し、血球計算盤にて細胞数を測定した。
上記測定の結果を図２に示す。図２に示すように、本発明の培養方法によれば、従来のＮＫ細胞の培養方法（ＩＬ−２のみ）より多くの細胞を得ることが可能となる。

＜細胞表面マーカーの測定＞
ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、ＰＥ標識された抗ＣＤ５６抗体（ベックマン・コールター）、ＥＣＤ標識された抗ＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター）を培養後ＰＢＳで洗浄した細胞に添加した。遮光の状態で、4℃で30分染色した。細胞の測定はＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００を用い、測定結果の解析にはＣｙｔｏｍｉｃｓ ＣＸＰ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。
その結果を図３に示す。

図３に示すように、本発明の培養方法によれば、従来のＮＫ細胞の培養方法（ＩＬ−２のみ）よりＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞率の割合が高い細胞集団を得ることが可能となる。

ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、ＰＥ標識された抗ＣＤ５６抗体（ベックマン・コールター）、ＥＣＤ標識された抗ＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター）、ＰＣ５標識された抗ＣＤ１６抗体（ベックマン・コールター）を培養後ＰＢＳで洗浄した細胞に添加した。遮光の状態で、４℃で３０分染色した。細胞の測定はＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００を用い、測定結果の解析にはＣｙｔｏｍｉｃｓ ＣＸＰ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。その結果を図４および図５に示す。

図４および図５に示すように、本発明の培養方法によれば、従来のＮＫ細胞の培養方法（ＩＬ−２のみ）より、細胞集団全体のＣＤ１６発現率およびＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞集団のＣＤ１６発現率が高くなることが確認された。

＜ＩＦＮγ産生細胞の比率＞
２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト）に、２０ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および２μｇ／ｍＬ ｌｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）および２０μｇ／ｍＬ Ｂｒｅｆｅｒｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を含有したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ）（１０％ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）１ｍＬを添加し、培養後ＰＢＳで洗浄した細胞を３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。３７℃、５％ＣＯ_２濃度条件下で４時間培養した。培養後細胞を回収、ＰＢＳで洗浄し、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ細胞内染色キット（ベックマン・コールター）を使用し、細胞の調製を行った。その際の細胞内サイトカインは、ＦＩＴＣ標識された抗ＩＦＮγ抗体（ベックマン・コールター）で染色した。細胞の測定はＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００を用い、測定結果の解析にはＣｙｔｏｍｉｃｓ ＣＸＰ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。

その結果を図６に示す。図６に示すように、本発明の培養方法によれば、従来のＮＫ細胞の培養方法（ＩＬ−２のみ）より、培養細胞集団全体のＩＦＮγ産生細胞率が高くなることが確認された。

＜細胞保存安定性の測定＞
培養後ＰＢＳで洗浄した細胞を５×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、１％ブミネート２５（商品名）および７％ラクトリンゲルを含有する生理食塩液に懸濁し、６℃で保存した。０，６，２４，３０，４８時間保存後の細胞を１×１０^６ｃｅｌｌｓ程度分取し、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ２０μｇ/ｍLで染色直後にＦＣＭにて測定した。

その結果を図７に示す。図７に示すように、本発明の培養方法（ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ヒドロコルチゾン添加）によれば、従来のＮＫ細胞の培養方法ＩＬ−２のみ）より、保存後の生細胞率が高くなることが確認された（ｎ＝４平均）。

＜ＡＤＣＣ効果の測定＞
ターゲット細胞として、高ＨＥＲ２発現乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３細胞を調製した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）で１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（同仁科学）１０μｇ／ｍＬで３７℃、３０分染色後洗浄し、トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン、中外製薬）１０μｇ／ｍＬを添加したものと添加しないものを準備した。ハーセプチン処理したＳＫ−ＢＲ−３細胞とハーセプチン処理していないＳＫ−ＢＲ−３細胞それぞれを９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔｅｒ）に１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。
実施例１および２で調整した、培養後の本発明のＮＫ細胞およびコントロールのＮＫ細胞をエフェクター細胞とし、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔｅｒ）にハーセプチン処理有無のターゲット細胞に対して２５：１、５：１となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４時間混合培養を行った。
次いで１時間ごとのターゲット細胞の蛍光強度を測定、０時間測定時の蛍光強度からの残存率を算出し、下記の式により細胞傷害活性を求めた。

細胞傷害活性（％）＝{（エフェクター細胞と混合培養したターゲット細胞の平均蛍光強度残存率）−（ターゲット細胞の自然遊離平均蛍光強度残存率）}/{（ターゲット細胞の最大遊離蛍光強度残存率）-（ターゲット細胞の自然遊離平均蛍光強度残存率）}×１００

結果を図８に示す。従来のＮＫ細胞の培養方法（ＩＬ−２のみ）では、ハーセプチン処理をしたＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する細胞傷害活性が６０％であった（ｎ＝４平均）が、本発明の培養方法によれば、ハーセプチン処理をしたＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する細胞傷害活性が９０％まで増加した（同一検体ｎ＝４平均）。また、本発明の培養方法にてハーセプチン処理をしないＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する細胞傷害活性が４０％程度であったことから、ハーセプチン処理によりＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性が上昇することが確認された。

以上説明したように、本発明のＮＫ細胞の培養方法は、従来行われてきた培養方法（ＩＬ−２のみ）と比較して、ＮＫ細胞数が多く（平均１８倍増加）、細胞集団中のＮＫ細胞率が高く（平均２倍増加）、ＩＦＮγ産生細胞率も多い（平均１．５倍増加）培養方法である。また、細胞傷害活性が高く、特にＡＤＣＣ活性が高い（平均１．５倍増加）。したがって、本発明はがん治療のための免疫細胞療法等の医療分野等に有用であり、特に抗体医薬との併用療法に有用である。

図１は、グルココルチコイドとＩＬ−１８の添加時期を変えて培養したときのＮＫ細胞の増殖率の違いを示すグラフである。 図２は、本発明の培養方法及び従来の培養方法で得られた全細胞数の比較を示すグラフである。 図３は、本発明の培養方法及び従来の培養方法で得られたＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞率の割合の比較を示すグラフである。 図４は、本発明の培養方法及び従来の培養方法で得られた全細胞集団中のＣＤ１６陽性細胞発現率の比較を示すグラフである。 図５は、本発明の培養方法及び従来の培養方法で得られたＮＫ細胞集団中のＣＤ１６陽性細胞率の比較を示すグラフである。 図６は、本発明のＮＫ細胞と従来の培養方法によるＮＫ細胞との、ＩＦＮγの産生量の差を示すグラフである。 図７は、本発明のＮＫ細胞と従来の培養方法によるＮＫ細胞との、保存後の生細胞率の割合を示すグラフである。 図８は、本発明のＮＫ細胞と従来の培養方法によるＮＫ細胞との、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する細胞傷害活性の度合いを示すグラフである。

Claims (57)

1. 末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養することを特徴とするＮＫ細胞の培養方法。
2. 前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の培養方法。
3. 前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＮＫ細胞の培養方法。
4. 前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法。
5. 前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法。
6. 前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法。
7. ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法。
8. 前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法。
9. 前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする請求項１乃至
   ８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の培養方法。
10. 末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養して得られるＮＫ細胞。
11. 前記グルココルチコイドの添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする請求項１０に記載のＮＫ細胞。
12. 前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のＮＫ細胞。
13. 前記グルココルチコイドがヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
14. 前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
15. 前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
16. ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
17. 前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
18. 前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
19. 末梢血単核球にグルココルチコイド及びＩＬ−１８を添加して培養したＮＫ細胞を含む治療・予防剤。
20. 前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする請求項１９に記載の治療・予防剤。
21. 前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする請求項１９又は２０に記載の治療・予防剤。
22. 前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする請求項１９乃至２１のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
23. 前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１９乃至２２のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
24. 前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする請求項１９乃至２３のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
25. ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする請求項１９乃至２４のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
26. 前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする請求項１９乃至２５のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
27. 前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする請求項１９乃至２６のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
28. 前記ＮＫ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする請求項１９乃至２７のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
29. モノクローナル抗体治療薬を更に含むことを特徴とする請求項１９乃至２８のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
30. 前記モノクローナル抗体治療薬がトラスツズマブであることを特徴とする請求項１９乃至２９のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
31. 前記モノクローナル抗体治療薬がリツキシマブであることを特徴とする請求項１９乃至請求項２９のいずれか一項に記載の治療・予防剤。
32. 末梢血単核球にグルココルチコイドとＩＬ−１８を添加して増殖させたＮＫ細胞を投与することを特徴とする治療方法。
33. 前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする請求項３２に記載の治療方法。
34. 前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする請求項３２又は３３に記載の治療方法。
35. 前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする請求項３２乃至３４のいずれか一項に記載の治療方法。
36. 前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項３２乃至３５のいずれか一項に記載の治療方法。
37. 前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする
    請求項３２乃至３６のいずれか一項に記載の治療方法。
38. ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする請求項３２乃至３７のいずれか一項に記載の治療方法。
39. 前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする請求項３２乃至３８のいずれか一項に記載の治療方法。
40. 前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする請求項３２乃至３９のいずれか一項に記載の治療方法。
41. 前記ＮＫ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする請求項３２乃至４０のいずれか一項に記載の治療方法。
42. モノクローナル抗体治療薬を更に含むことを特徴とする請求項３２乃至請求項４１のいずれか一項に記載の治療方法。
43. 前記モノクローナル抗体治療薬がトラスツズマブであることを特徴とする請求項３２乃至４２のいずれか一項に記載の治療方法。
44. 前記モノクローナル抗体治療薬がリツキシマブであることを特徴とする請求項３２乃至４２のいずれか一項に記載の治療方法。
45. グルココルチコイドとＩＬ−１８を添加して増殖させたＮＫ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
46. 前記グルココルチコイド添加濃度が１０^−８Ｍ以上１０^−４Ｍ以下であることを特徴とする請求項４５に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
47. 前記グルココルチコイドの添加時期が培養開始後１〜７日目であることを特徴とする請求項４５又は４６に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
48. 前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾン又はデキサメタゾンであることを特徴とする請求項４５乃至４７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
49. 前記ＩＬ−１８の添加濃度が５０ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項４５乃至４８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
50. 前記ＩＬ−１８の添加時期が培養開始後０〜３日目であることを特徴とする請求項４５乃至４９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
51. ＩＬ−２を更に含むことを特徴とする請求項４５乃至５０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
52. 前記ＩＬ−２の添加濃度が１〜３０００ＩＵ／ｍＬであることを特徴とする請求項４５乃至５１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
53. 前記ＩＬ−２の添加時期が培養開始時であることを特徴とする請求項４５乃至５２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
54. 前記ＮＫ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする請求項４５又は５３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
55. モノクローナル抗体治療薬を更に含むことを特徴とする請求項４５乃至５４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
56. 前記モノクローナル抗体治療薬がトラスツズマブであることを特徴とする請求項４５乃至５５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
57. 前記モノクローナル抗体治療薬がリツキシマブであることを特徴とする請求項４５乃至５５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。

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