JPWO2008143014A1 - がん治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)患者にリンパ球数減少を伴う処置を実施する工程、及び
(B)上記(A)工程に続いて速やかに患者にリンパ球を投与する工程、
に関するものである。本発明の第1の発明において、リンパ球数減少を伴う処置としては、抗がん剤投与及び/又は放射線照射が例示される。また、抗がん剤としては、代謝拮抗剤、抗生物質(抗腫瘍性抗生物質)、微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、白金製剤、アルキル化剤及び副腎皮質ステロイド剤に分類される抗がん剤からなる群より選択される抗がん剤が例示され、好適な態様としてフルオロウラシル、メトトレキセート、ゲムシタビン、フルダラビン、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン及びシクロフォスファミドからなる群より選択される少なくとも1つの抗がん剤が挙げられる。また、本発明の第1の発明においては、(B)工程が(A)工程後1時間〜10日間後に実施される態様が例示される。さらに本発明の第1の発明において、投与されるリンパ球としてはリンパ球を含有する培養物が例示され、特に投与されるリンパ球が抗CD3抗体の存在下での培養により得られたリンパ球培養物が例示される。また、投与されるリンパ球としては、患者から採取されたリンパ球の培養により得られたリンパ球培養物が例示される。また、投与されるリンパ球としては、フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント、もしくはそれらの混合物の存在下での培養により得られたリンパ球培養物が例示される。本発明の第1の発明においては、(B)工程中もしくは(B)工程の後に、さらにがんワクチン及び/又はリンパ球刺激因子を投与する工程を包含する態様が例示される。
(A)患者にリンパ球減少を伴う処置を実施する工程、及び
(B)上記(A)工程に続いて速やかに患者にリンパ球を投与する工程、の両工程を包含するがんの治療方法を提供する。
本発明の別の態様は、癌患者由来の抗がん剤耐性が付与された拡大培養リンパ球の抗がん剤残存下での使用、癌患者由来の抗がん剤耐性が付与された培養リンパ球のがん治療剤製造への使用、及び癌患者由来の抗がん剤耐性が付与された培養リンパ球を用いるがん治療方法である。
実施例1 マウス同系腫瘍モデルを用いた抗がん剤投与後の移入T細胞の効果の検討
マウスメラノーマ細胞株B16F10(東北大学加齢研より分譲)を7週齢の雌のC57BL/6マウス(日本エスエルシー社製)に麻酔下で尾静脈から投与して14日後に肺に転移した腫瘍を回収する。回収した腫瘍を単一細胞にまで分散させてin vitroで培養後、再度マウスに投与するという操作を3回繰り返す。最終的に1×105個の細胞を投与すると14日間で約50−100個の肺転移が認められる高転移性B16F10細胞(以下hB16F10と記載)が得られる。
hB16F10を5×105cells/mLとなるようにダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(バクスター社製、シグマ社製又はインビトロジェン社製、以下DPBSと記載)に懸濁する。この細胞懸濁液0.2mLを7週齢の雌のC57BL/6マウスに麻酔下で尾静脈から投与して肺転移腫瘍を形成させる。14日後、脾臓を摘出しRPMI1640培地(シグマ社製)中でスライドガラスを用いてすりつぶす。RPMI1640培地を用いて10匹分のすりつぶした脾臓をまとめてチューブに回収し45mLとして氷上に5分間静置後、新しいチューブに40μmセルストレーナー(ベクトン・ディッキンソン社製)を通して移す。遠心後上清を除去し、溶血操作として沈殿をACKバッファー(0.15M NH4Cl、0.01M KHCO3、0.01mM Na2EDTA、pH7.4)2mLに懸濁する。この懸濁液にさらにACKバッファー2mLを添加して懸濁後、RPMI1640培地を細胞懸濁液が50mLになるように添加する。遠心後上清を除去し、細胞をRPMI1640培地10mLに懸濁し新しいチューブにセルストレーナーを通して移す。RPMI1640培地を細胞懸濁液が40mLとなるように添加後、遠心し上清を除去後、細胞をRPMI1640培地と8%ヒト血清アルブミン(HSA、製剤名;ブミネート:バクスター社製)を含むCP−1(極東製薬工業社製)とを等量混合したものに懸濁し、使用するまで液体窒素中で保存する。
以下の実験で使用する培養器材に抗マウスCD3抗体及びヒトCH−296フラグメント〔配列表の配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、レトロネクチン(登録商標):タカラバイオ社製:以下、単にCH−296と記載〕を固定化する。すなわち、12穴細胞培養プレート(コーニング社製)に抗マウスCD3抗体(R&D Systems社製)(終濃度7μg/mL)を含むACD−A液(テルモ社製)を800μL/ウェルずつ添加し、4℃で終夜インキュベートする。その後、CH−296刺激群ではヒトCH−296を終濃度25μg/mLとなるように添加し、さらに5時間室温でインキュベートする。使用直前に培養器材から抗体・CH−296を含むACD−A液を吸引除去後、各ウェルをDPBSで2回、RPMI1640培地で1回洗浄し実験に供する。
実施例1−(2)で調製した脾臓リンパ球についてリンパ球の純度を上げるためにナイロンファイバーを用いて精製を行う。10mLのシリンジ(テルモ社製)に0.6gのナイロンファイバー(和光純薬社製)を充填し、DPBSで平衡化した後、121℃で20分滅菌する。このカラムを10%ウシ胎児血清(MPバイオメディカルズ社製、以下FBSと記載)含有RPMI1640培地で平衡化させ、5%CO2インキュベーターで37℃で1時間インキュベートする。実施例1−(2)で調製した脾臓リンパ球を2×108cellsを超えないように10%FBS含有RPMI1640培地2〜3mLに懸濁し、カラムにアプライ後、5%CO2インキュベーターで37℃で1時間インキュベートする。予め37℃に保温しておいた10%FBS含有RPMI1640培地15mLをカラムに添加し溶出された細胞を回収する。
10%FBS、0.1mM NEAA mixture(Cambrex社製)、1mM Sodium pyruvate(Cambrex社製)、50μM 2−mercaptoethanol(ナカライテスク社製)、0.2% HSA含有GT−T503培地(タカラバイオ社製)(以下、培養用培地と記載)に1.5×106cells/mLとなるように実施例1−(4)で調製したリンパ球を懸濁する。実施例1−(3)で調製した抗マウスCD3抗体あるいは抗マウスCD3抗体及びヒトCH−296固定化プレートに培養用培地を1.4mL/ウェルで添加しておき、上記細胞懸濁液を1mL/ウェルずつ添加し、5%CO2インキュベーター中で37℃で培養する(培養0日目)。培養3日目に細胞懸濁液を1.5×105cells/mLとなるように培養用培地を用いて希釈し、何も固定化していない新しい175cm2細胞培養フラスコ(コーニング社製)に全量を移す。この際、終濃度100U/mLとなるようにマウスIL−2(R&D Systems社製)を、また終濃度10ng/mLとなるようにマウスIL−7(R&D Systems社製)を添加した。培養7日目に細胞を回収し、以下の同系腫瘍モデルでの試験に供与する。
7週齢の雌のC57BL/6マウスに麻酔下でhB16F10を実施例1−(2)と同様に尾静脈より投与する。3日後に抗がん剤としてシスプラチン(日医工社製)投与群においては、5mg/kgの用量で、またマイトマイシンC(協和メディクス社製、以下MMCと記載)投与群においては、2mg/kgの用量でそれぞれ腹腔内に投与する。さらに2日後に、実施例1−(4)で調製した細胞あるいは実施例1−(5)で調製した細胞をそれぞれ2.5×108cells/mLとなるようにDPBSに懸濁し、尾静脈より0.2mL投与する。対照として細胞を投与しない群を設定する。末梢血中のリンパ球数は細胞投与後14日まで定期的に測定する。また、肺転移数は最終日(細胞投与後14日目)に麻酔後放血死させ、肺を摘出して転移したコロニー数を計測する。その結果、細胞投与群においてはいずれも末梢血中のリンパ球数が多く、抗がん剤投与によるリンパ球数減少に伴う感染症に対して、予防効果を示すものと考えられる。また、細胞投与群においては、いずれも肺転移数が抗がん剤のみ投与群と比較して少なく、抗がん剤との併用効果が確認できる。
(1)PBMC及び非働化済み血漿の分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト癌患者ドナーより50〜58mL分のへパリン加採血を実施後、得られた血液を700×gで20分間遠心した。遠心後の上清である血漿画分とPBMCを含む細胞画分をそれぞれ回収した。血漿画分は、56℃30分非働化処理を行った後、900×gで30分間遠心した。遠心後の上清を非働化済み血漿として回収し、各実験に供した。PBMCを含む細胞画分はDPBSで希釈し、Ficoll−paque(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)上に重層して700×gで20分間遠心した。中間層のPBMCをピペットで回収、洗浄し、自動血球計測装置(ヌクレオカウンター Chemometec社製)を用いて生細胞数を算出し、各実験に供した。
以下の実験で使用する培養器材にOKT3及びCH−296を固定化した。すなわち、OKT3(終濃度5μg/mL)及びCH−296(終濃度25μg/mL)を含むACD−A液をガス透過性培養バッグCultiLife215(タカラバイオ社製)に10.4mL/バッグ(培養開始面積86cm2の場合)又は26.0mL/バッグ(培養開始面積215cm2の場合)ずつ添加し、5%CO2中37℃で5時間インキュベートした。また、上記のバッグは使用前にRPMI1640培地で3回洗浄した後各実験に供した。
実施例2−(1)で分離したPBMC0.7〜1.2×107cellsを0.6〜1.0%非働化済み血漿を含むKBM551(タカラバイオ社製、以下血漿含有KBM551と記載)120mLに懸濁(培養開始面積86cm2の場合)、又は2.1〜4.2×107cellsを0.6〜1.0%の非働化済み血漿を含む血漿含有KBM551 300mLに懸濁(培養開始面積215cm2の場合)し、実施例2−(2)で作製したOKT3及びCH−296固定化CultiLife215に添加した。終濃度200U/mLとなるようにIL−2(製剤名;Proleukin、カイロン社製)を添加し、5%CO2中37℃で培養した(培養0日目)。培養開始4日目に、各CultiLife215内の細胞液を懸濁し、一部を希釈して何も固定化していないガス透過性培養バッグCultiLifeEva(タカラバイオ社製)に移した。この際、細胞液を培養面積100cm2当たり9.4mL添加し、血漿含有KBM551を培養面積100cm2当たり68.8mL添加した。終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、5%CO2中37℃で培養した。培養を継続し、培養開始7日目には各CultiLifeEvaに細胞液と等量の血漿を含まないKBM551(以下、無血漿KBM551と記載)を添加し2倍希釈した後、いずれも終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始後10日目には、各CultiLifeEva内の細胞液を懸濁後、半量除去し細胞液と等量の無血漿KBM551を添加し2倍希釈した後、いずれも終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始10日目、及び14日目に自動血球計測装置を用いて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表1に示す。
実施例2−(3)で調製した培養10日目及び14日目の細胞を1%牛血清アルブミン(BSA、シグマ社製)を含むDPBS(以下1%BSA/DPBSと記載)又はDPBSで洗浄後、1%BSA/DPBS中に細胞を懸濁し、ネガティブコントロールとしてFITC標識マウスIgG1/RD1標識マウスIgG1/PC5標識マウスIgG1(ベックマンコールター社製)を添加した。同様に、RD1標識マウス抗ヒトCD45RA抗体(ベックマンコールター社製)/FITC標識マウス抗ヒトCCR7抗体(R&D Systems社製)を添加した細胞、RD1標識マウス抗ヒトCD45RA抗体/FITC標識マウス抗ヒトCD28抗体(eBioscience社製)/PC5標識マウス抗ヒトCD27抗体(ベックマンコールター社製)を添加した細胞及びRD1標識マウス抗ヒトCD45RA抗体/FITC標識マウス抗ヒトCCR7抗体/PC5標識マウス抗ヒトCD62L抗体(ベックマンコールター社製)を添加した細胞を用意した。各々の抗体を添加後、氷上で30分間インキュベートした。インキュベート後、0.1%BSAを含むDPBS(以下0.1%BSA/DPBSと記載)で細胞を洗浄し、再度DPBSに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリー(Cytomics FC500:ベックマンコールター社製)に供し、各々の細胞集団について、CCR7+CD45RA+細胞、CD27+CD45RA+細胞、CD28+CD45RA+細胞、CD62L+CD45RA+細胞、 CCR7+CD62L+CD45RA+細胞の割合を算出した。結果を表2、表3、表4、表5、表6に示す。
実施例2−(3)で調製した培養開始後10日目及び14日目の細胞の細胞傷害活性は、Calcein−AMを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ R.ら(Lichtenfels R. et al.)、J. Immunol. Methods、第172巻、第2号、第227〜239頁(1994)〕にて評価した。K562細胞(ATCC CCL−243、以下K562と記載)及びDaudi細胞(ATCC CCL−213、以下Daudiと記載)を1×106cells/mLとなるよう5%FBSを含むRPMI1640培地に懸濁後、終濃度25μMとなるようにCalcein−AM(同仁化学研究所社製)を添加し、37℃で1時間培養した。細胞をCalcein−AMを含まない培地にて洗浄後、Calcein標識標的細胞とした。
式1:細胞傷害活性(%)=
{(各ウェルの測定値−最小放出量)/(最大放出量−最小放出量)}×100
上式において最小放出量はCalcein標識標的細胞のみ含有するウェルのCalcein放出量であり、Calcein標識標的細胞からのCalcein自然放出量を示す。また、最大放出量はCalcein標識標的細胞に界面活性剤として0.1%Triton X−100(ナカライテスク社製)を加えて細胞を完全破壊した際のCalcein放出量を示している。測定結果を表7に示す。
(1)OKT3及びCH−296の固定化
以下の実験で使用する培養器材に実施例2−(2)と同様の方法で、OKT3及びCH−296を固定化した。
実施例2−(3)と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養時の基本培地は0.2%ヒトHSAを含むGT−T503(以下0.2%HSA/GT−T503と記載)を使用し、培養開始時及び培養開始4日目に使用する培地は、0.6%の癌患者由来自己血漿を含む0.2%HSA/GT−T503、培養開始7日目、10日目に使用する培地は血漿を含有しない0.2%HSA/GT−T503とした。培養開始10日目に自動血球計測装置を用いて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表8に示す。
実施例3−(2)で調製した培養10日目の細胞について、実施例2−(4)と同様の方法でCCR7+CD45RA+細胞、CD27+CD45RA+細胞、CD28+CD45RA+細胞の解析を行った。結果を表9、表10、表11に示す。
(1)OKT3及びCH−296の固定化
以下の実験で使用する培養器材に実施例2−(2)と同様の方法で、OKT3及びCH−296を固定化した。
実施例2−(3)と同様の方法で、癌患者番号PT006由来のリンパ球の拡大培養を行った。ただし培養開始時及び4日目に使用する血漿含有KBM551の自己血漿濃度は0.6%又は1.2%とし、培養開始7日目には無血漿KBM551又は0.6%血漿含有KBM551を使用し、表12に示す血漿終濃度とした。培養開始後10日目には、細胞液を希釈せずにIL−2を終濃度200U/mLで添加した。結果を表12に示す。
実施例4−(2)で調製した培養10日目及び14日目の細胞について、実施例2−(4)と同様の方法でCCR7+CD45RA+細胞、CD27+CD45RA+細胞、CD28+CD45RA+細胞の解析を行った。結果を表13、表14、表15に示す。
(1)OKT3及びCH−296の固定化
以下の実験で使用する培養器材にOKT3及びCH−296を固定化した。すなわち、OKT3(終濃度5μg/mL)及びCH−296(終濃度25μg/mL)を含むACD−A液を12穴細胞培養プレート(コーニング社製)に0.45mL/ウェルずつ添加し、5%CO2中37℃で5時間インキュベートした。この際、OKT3のみを固定化する群も設定した。使用直前にはこれらの培養器材からOKT3又はOKT3及びCH−296を含むACD−A液を吸引除去後DPBSで2回、RPMI1640培地で1回洗浄した後各実験に供した。
実施例2−(1)で分離したヒト癌患者由来のPBMC 0.53×106cellsを0.6%血漿含有KBM551又は0.2%HSA/GT−T503 5.3mLに懸濁し、実施例5−(1)で作製したOKT3固定化プレート又はOKT3及びCH−296固定化プレートに添加した。終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、5%CO2中37℃で培養した(培養0日目)。培養開始4日目に、各ウェル内の細胞液を懸濁し、一部を0.6%血漿含有KBM551又は0.2%HSA/GT−T503を用いて8.3倍希釈して希釈液7.8mLを何も固定化していない25cm2細胞培養フラスコ(コーニング社製)に移し、いずれも終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養を継続し、7日目には各群の培養液に等量の無血漿KBM551又は0.2%HSA/GT−T503を添加して2倍希釈し、いずれも終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始後10日目には、無血漿KBM551又は0.2%HSA/GT−T503を用いて各群の細胞培養液を2倍希釈し、何も固定化していない新しい25cm2細胞培養フラスコを立てたものに希釈液15.6mLをそれぞれ移した。各群において終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始後10日目及び14日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表16に示す。
実施例5−(2)で調製した培養10日目及び14日目の細胞を実施例2−(4)と同様の方法でCCR7+CD45RA+細胞、CD62L+CD45RA+細胞、CCR7+CD62L+CD45RA+細胞の解析を行った。結果を表17、表18、表19に示す。
(1)使用リンパ球の凍結保存と融解
実施例2−(3)で拡大培養した癌患者番号PT007由来の培養開始10日目の細胞をRPMI1640培地に懸濁し、細胞凍害保護液CP−1(極東製薬社製)と25%HSAを17:8の割合で混合した保存液を等量加えて懸濁後、液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存培養細胞を37℃水浴中にて急速融解し、10μg/mL DNase(カルビオケム社製)を含むRPMI1640培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
インフォームドコンセントの得られたヒト健常人ドナーより血球の成分採血を実施後、採血液をDPBSで2倍希釈し、Ficoll−paque上に重層後、700×gで20分間遠心した。遠心後、中間層のPBMCをピペットで回収、洗浄した。採取したドナー由来PBMCは5×107cells/mLになるようにRPMI1640培地に懸濁した後、実施例6−(1)と同様の方法で液体窒素中に保存及び融解後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
実施例6−(1)及び6−(2)で調製した細胞を用いてAllogeneic MLRを行った。
実施例6−(1)で融解した培養細胞を5HRPMIを用いて2×106cells/mLに調整し、Responder 細胞として使用した。一方、実施例6−(2)で調製したAllogeneic donor(非自己ドナー:実施例6−(1)の患者とは異なる健常人ドナー)由来のPBMCをX線照射装置(HITEX社製260型)を用いてX線照射(0.88C/kg)し、5HRPMIで洗浄後、2×106cells/mLに調整し、Stimulator 細胞として使用した。
24穴細胞培養用プレート(コーニング社製)に、Responder細胞:Stimulator細胞比が1:1になるよう、調製した各細胞液を0.5mL/wellずつ添加した。この際、Responder細胞のみを添加する群も設定した。IL−2を終濃度500U/mLになるよう各ウェルに添加し、5%CO2中37℃で培養を開始した(培養0日目)。なお、リンパ球培養培地中の患者自己血漿濃度は、表20に示す通りとした。
実施例6−(2)で調製した非自己健常人ドナー由来のPBMCを5HRPMIで1×106cells/mLに調製し、6穴細胞培養用プレート(コーニング社製)に3mLずつ播種した。IL−2を終濃度100U/mLとなるように、Phytohemaaglutinin(シグマ社製、以下PHAと記載)を終濃度2μg/mLとなるように添加し、5%CO2中37℃で培養した。培養4日目には、培養細胞液に5HRPMIを12mL添加し、IL−2を終濃度100U/mLとなるように添加後5mL/wellとなるよう6穴細胞培養用プレートに細胞液を分配した。培養開始7日目まで培養を継続し、PHA Blast(幼若化)細胞を調製した。
実施例6−(3)で調製した培養7日目の細胞を用い、実施例2−(5)と同様の方法で非自己特異的細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞として実施例6−(4)で幼若化させたPHA 幼若化細胞を使用し、Calcein-AMを添加後37℃で2時間培養した。このCalcein標識標的細胞は、さらに30倍量のK562細胞と混合し細胞傷害活性測定用標的細胞として細胞傷害活性を測定した。なお、K562細胞は実施例6−(1)で調製したresponder細胞中に混入するNK細胞による非特異的細胞傷害活性を排除するために用いた。測定結果を表21に示す。
(1)使用リンパ球の凍結保存と融解
実施例2−(3)で培養した癌患者番号PT012由来の培養開始10日目及び14日目の細胞を用いて実施例6−(1)と同様の方法で行った。ただし、リンパ球拡大培養時には、OKT3のみを培養器材に固定化する群も設定した。
実施例7−(1)で調製した癌患者由来自己リンパ球及び実施例6−(2)と同様の方法で調製したヒト健常人由来非自己PBMCを用いて、実施例6−(3)と同様の方法でAllogeneic MLRを行った。結果を表22に示す。
実施例6−(2)で調製したAllogeneic donor由来のPBMCを用いて、実施例6−(4)と同様の方法で行った。
実施例7−(2)で調製した培養7日目の細胞を用い、実施例6−(5)と同様の方法で非自己特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表23に示す。
(1)使用リンパ球
実施例2−(3)で調製した癌患者番号PT009由来の培養開始10日目の細胞を実施例6−(1)と同様の方法で凍結保存及び融解洗浄し、IL−2(終濃度 222U/mL)を含む5HRPMI(以下IL−2/5HRPMIと記載)に懸濁し、40μmセルストレーナーに通した後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
96穴細胞培養プレート(コーニング社製)にIL−2/5HRPMIを130μL/ウェルずつ添加し、5HRPMIで段階的に希釈したカルボプラチン(製剤名;パラプラチン注射液、ブリストル・マイヤーズ社製)、フルオロウラシル注射液(製剤名;5−FU注250協和、協和発酵工業社製)、シスプラチン(製剤名;シスプラチン注「日医工」、日医工社製)、硫酸ビンクリスチン(製剤名;オンコビン注射用、日本化薬社製)、ドキソルビシン塩酸塩(製剤名;アドリアシン注用10、協和発酵工業社製)、リン酸デキサメタゾンナトリウム(製剤名;デカドロン注射液、万有製薬社製)を使用し、段階希釈した試験薬剤をそれぞれ20μL/ウェルずつ添加した。試験細胞添加群には、実施例8−(1)で調製した細胞をIL−2/5HRPMIで細胞濃度4×106cells/mLに調整し、50μL/ウェル(ウェルあたり2×104cells)ずつ添加した。一方、対照群にはIL−2/5HRPMIを50μL/ウェルずつ添加した。
(1)使用リンパ球の拡大培養
実施例2−(3)と同様の方法で、健常人リンパ球の拡大培養を行い、実施例8−(1)と同様の方法で、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。ただし、リンパ球拡大培養時には、OKT3のみを培養器材に固定化する群も設定した。
実施例8−(2)と同様の方法で、抗がん剤耐性試験を実施した。ただし、試験薬剤としてカルボプラチン、フルオロウラシル注射液、硫酸ビンクリスチン、ドキソルビシン塩酸塩、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パクリタキセル注射液(製剤名;タキソール注、ブリストル・マイヤーズ社製)を使用し、段階希釈した試験薬剤をそれぞれ20μL/ウェルずつ添加した。ただし、パクリタキセルは希釈溶媒としてヒトAB型血清、それ以外の薬剤は5HRPMIを使用した。結果を表25に示す。
(1)マウスT細胞集団の拡大培養
実施例1−(5)と同様の方法でマウスT細胞集団の拡大培養を行った。ただしヒトCH−296は使用せず、また培養6日目に細胞を回収し、以下の実験に供与した。
実施例10−(1)で得られた細胞を回収し、必要量分取した後、500×g室温5分間遠心して上清を除去した。その後、0.5%BSA、及び2mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含むDPBS(以下、0.5%BSA/DPBSと記載)に1.11×108cells/mLとなるように懸濁した。その細胞液に細胞数1×107cellsあたり10μLのCD62L(L−セレクチン)マイクロビーズ(マウス)(MACS社製)を添加し、暗所4℃にて時々攪拌しながら15分間インキュベートした。次に当該細胞液に1×107cellsあたり1mLの0.5%BSA/DPBSを加え、500×g室温5分間遠心して上清を除いた後、1×108cellsあたり0.5mLの0.5%BSA/DPBSを加え、十分懸濁して氷上に静置し、CD62Lマイクロビーズ標識細胞液とした。続いて、VarioMACSTM separator(MACS社製、以下分離装置と記載)にLSカラム(MACS社製、以下分離カラムと記載)を設置し、3mLの0.5%BSA/DPBSでリンスした。カラムにCD62Lマイクロビーズ標識細胞液を添加して溶出させた後、さらに9mLの0.5%BSA/DPBSでリンスし、溶出画分を回収して得られたCD62L−細胞をエフェクターT様細胞とした。分離装置からカラムを外し、5mLのバッファーを添加して分離カラム付属のプランジャーで押し出し回収して得られたCD62L+細胞をナイーブT様細胞とした。
7週齢の雌のC57BL/6マウスを麻酔下で右鼠蹊部を9平方センチメントール程剃毛し、その皮下にRPMI1640培地に4×106cells/mLとなるように懸濁したhB16F10を0.1mL投与した。その後、以下のとおりに群設定を行った。A群を無処置群、B群をMMC単独投与群、C群をMMC及びナイーブT様細胞併用投与群、D群をMMC及びエフェクターT様細胞併用投与群とした。腫瘍接種3日後と4日後にA群には、0.2mLの生理食塩水(大塚製薬社製)を、その他の群にはMMCを2mg/kgの用量で腹腔内に投与した。腫瘍接種6日目に実施例10−(2)で調製した各マウスT細胞をRPMI1640培地で5×108cells/mLに調製し、C群、D群の各個体にそれぞれナイーブT様細胞、エフェクターT様細胞を0.2mLずつ尾静脈から投与した。またA群、B群の各個体にはRPMI1640培地を0.2mLずつ尾静脈から投与した。
リンパ球数の評価は尾静脈から採取した血液サンプルに含まれる白血球数とT細胞数とを測定することにより行った。マウス1匹あたりヘパリンナトリウム(三菱ウェルファーマ社製)が3μL入った0.5mLチューブに22μL採血した。その血液サンプルから15μL分取してFlow−Count(ベックマンコールター社製)14μLとHamster anti−mouse CD3e FITC(eBioscience社製)0.5μLを混合させた液に添加し、15分処理したのち低張液で赤血球を溶血させて、フローサイトメトリーに供し、CD3e+細胞をT細胞として、T細胞率及びT細胞の回復率を算出した。測定日は細胞投与する直前、及び細胞投与4日後とした。なお、T細胞率はA群(無処置群)のT細胞数を100%とした時の比率を示す。また、T細胞の回復率は細胞投与直前のT細胞数に対する細胞投与4日後のT細胞数の比率とした。結果を表26及び表27に示す。
実施例10−(3)で実施した評価系における抗腫瘍活性を測定するため、各個体における腫瘍接種後14日目の腫瘍サイズを、電子ノギスを用いて測定した。その結果を表28に示す(腫瘍サイズは腫瘍の長径と短径の積として示した)。
(1)マウスT細胞集団の拡大培養
実施例1−(5)と同様の方法でマウスT細胞集団の拡大培養を行った。
実施例11−(1)で拡大培養したマウスT細胞を用いて、実施例10−(2)と同様にナイーブT様細胞とエフェクターT様細胞の分離を行った。
本検討においては抗がん剤として、シクロフォスファミド(製剤名;エンドキサン、塩野義製薬社製、以下CPAと記載)を使用した。実施例10−(3)と同様の方法でhB16F10をマウスに皮下投与した。その後、以下のとおりに群設定を行った。A群を無処置群、B群をCPA単独投与群、C群をCPA及びナイーブT様細胞併用投与群、D群をCPA及びエフェクターT様細胞併用投与群とした。腫瘍接種後4日目にA群に、0.2mLの生理食塩水を、その他の群にはCPAを100mg/kgの用量で腹腔内に投与した。その翌日に実施例11−(2)で調製した各マウスT細胞をRPMI1640培地で3.75×108cells/mLに調製し、C群、D群の各個体にそれぞれナイーブT様細胞、エフェクターT様細胞を0.2mLずつ尾静脈から投与した。またA群、B群の各個体にはRPMI1640培地を0.2mLずつ尾静脈から投与した。
リンパ球数の評価は、実施例10−(4)と同様に行った。ただし、測定日は細胞投与6日後とした。結果を表29に示す。
実施例11−(3)で実施した評価系における抗腫瘍活性を実施例10−(5)と同様の方法で実施した。ただし、腫瘍サイズの測定日は、腫瘍細胞接種後11日目、及び13日目とした。結果を表30に示す。
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named CH-296Na.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:21 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:22 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:23 ; Fibronectin fragment named H105-H105.
Claims (24)
- 下記(A)工程及び(B)工程を包含することを特徴とするがんの治療方法:
(A)患者にリンパ球数減少を伴う処置を実施する工程、及び
(B)上記(A)工程に続いて速やかに患者にリンパ球を投与する工程。 - リンパ球数減少を伴う処置が抗がん剤投与及び/又は放射線照射である請求項1記載の治療方法。
- 抗がん剤が代謝拮抗剤、抗生物質(抗腫瘍性抗生物質)、微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、白金製剤、アルキル化剤及び副腎皮質ステロイド剤に分類される抗がん剤からなる群より選択される少なくとも1つの抗がん剤である請求項2記載の治療方法。
- (B)工程が(A)工程後1時間〜10日間後に実施される請求項1記載の治療方法。
- 投与されるリンパ球が培養物である請求項1〜4いずれか1項に記載の治療方法。
- 投与されるリンパ球が患者から採取されたリンパ球の培養により得られたリンパ球培養物である請求項5記載の治療方法。
- 投与されるリンパ球が抗CD3抗体の存在下での培養により得られたリンパ球培養物である請求項5記載の治療方法。
- 投与されるリンパ球がフィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント、もしくはそれらの混合物の存在下での培養により得られたリンパ球培養物である請求項5記載の治療方法。
- (B)工程中もしくは(B)工程の後に、さらにがんワクチン及び/又はリンパ球刺激因子を投与する工程を包含する請求項1記載の治療方法。
- リンパ球数減少を伴う処置を実施された患者に、前記の処置に続いて速やかに投与されるための、リンパ球を含有するがん治療剤。
- リンパ球数減少を伴う処置が抗がん剤投与及び/又は放射線照射である請求項10記載の治療剤。
- リンパ球数減少を伴う処置を実施された患者に、前記の処置の1時間〜10日間後に投与されるための、請求項10記載の治療剤。
- リンパ球が培養物である請求項10記載の治療剤。
- リンパ球が患者から採取されたリンパ球の培養により得られたリンパ球培養物である請求項13記載の治療剤。
- リンパ球が抗CD3抗体の存在下での培養により得られたリンパ球培養物である請求項13記載の治療剤。
- リンパ球がフィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント、もしくはそれらの混合物の存在下での培養により得られたリンパ球培養物である、請求項13記載の治療剤。
- リンパ球数の減少を引き起こす抗がん剤と請求項10に記載の治療剤とを別々に含有するがん治療用キット。
- 抗がん剤が代謝拮抗剤、抗生物質(抗腫瘍性抗生物質)、微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、白金製剤、アルキル化剤及び副腎皮質ステロイド剤に分類される抗がん剤からなる群より選択される少なくとも1つの抗がん剤である請求項17記載のがん治療用キット。
- 請求項10〜16いずれか1項に記載の治療剤と、がんワクチン及び/又はリンパ球刺激因子とを別々に含有するがん治療用キット。
- 請求項17又は18に記載のがん治療用キットと、がんワクチン及び/又はリンパ球刺激因子とを別々に含有するがん治療用キット。
- 請求項10〜16いずれか1項に記載の治療剤の製造におけるリンパ球の使用。
- 請求項17又は18記載のがん治療用キットの製造における、リンパ球数減少を引き起こす抗がん剤及びリンパ球の使用。
- 請求項19記載のがん治療用キットの製造における、リンパ球、及びがんワクチン及び/又はリンパ球刺激因子の使用。
- 請求項20記載のがん治療用キットの製造における、リンパ球数の減少を引き起こす抗がん剤、リンパ球、及びがんワクチン及び/又はリンパ球刺激因子の使用。
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