KR20100101094A - 수지상 세포를 생산하는 방법 - Google Patents
수지상 세포를 생산하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20100101094A KR20100101094A KR1020107011455A KR20107011455A KR20100101094A KR 20100101094 A KR20100101094 A KR 20100101094A KR 1020107011455 A KR1020107011455 A KR 1020107011455A KR 20107011455 A KR20107011455 A KR 20107011455A KR 20100101094 A KR20100101094 A KR 20100101094A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- dendritic cells
- cells
- immune
- mature
- expression
- Prior art date
Links
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 197
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 61
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 9
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 114
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 82
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 79
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 75
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 73
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 73
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 72
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 72
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 69
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 69
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 64
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 64
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 60
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 53
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 38
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims description 37
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 claims description 35
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 claims description 35
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 16
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 4
- RXNTZIJLOZMJTM-UHFFFAOYSA-N 2-(2h-quinolin-1-yl)ethanol Chemical compound C1=CC=C2N(CCO)CC=CC2=C1 RXNTZIJLOZMJTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RHKWIGHJGOEUSM-UHFFFAOYSA-N 3h-imidazo[4,5-h]quinoline Chemical class C1=CN=C2C(N=CN3)=C3C=CC2=C1 RHKWIGHJGOEUSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- STDHLKOFRZEOGS-UHFFFAOYSA-N 5h-imidazo[4,5-h]quinolin-4-amine Chemical class C12=NC=CC=C2CC(N)=C2C1=NC=N2 STDHLKOFRZEOGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- CXYOCSTZCULCAE-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methylpropyl)imidazo[4,5-c]quinoline Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=CN=C21 CXYOCSTZCULCAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 35
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 68
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 59
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 43
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 32
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 27
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 24
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 18
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 18
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 18
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 14
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 14
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 10
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 8
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 7
- -1 IL-I Proteins 0.000 description 7
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 7
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 6
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 6
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 6
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 6
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 6
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 4
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 210000000182 cd11c+cd123- dc Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 3
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 3
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 3
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- KMZHZAAOEWVPSE-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl acetate Chemical compound CC(=O)OCC(O)CO KMZHZAAOEWVPSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 2
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 206010036392 Postmature baby Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 108091069025 single-strand RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BJLRVFDWAOVFCI-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole;quinoline Chemical compound C1=CNC=N1.N1=CC=CC2=CC=CC=C21 BJLRVFDWAOVFCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100034798 CCAAT/enhancer-binding protein beta Human genes 0.000 description 1
- 101100352418 Caenorhabditis elegans plp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000945963 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein beta Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 1
- 101001011393 Homo sapiens Interferon regulatory factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001011441 Homo sapiens Interferon regulatory factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000763579 Homo sapiens Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000669406 Homo sapiens Toll-like receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000800483 Homo sapiens Toll-like receptor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000813738 Homo sapiens Transcription factor ETV6 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 1
- 102100029838 Interferon regulatory factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100030126 Interferon regulatory factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010041955 MAP-kinase-activated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 description 1
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100027010 Toll-like receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100039387 Toll-like receptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100033110 Toll-like receptor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100039580 Transcription factor ETV6 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000002725 brachytherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000315 cryotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 210000005008 immunosuppressive cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 238000003046 intermediate neglect of differential overlap Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001288 lysyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010198 maturation time Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006609 metabolic stress Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007193 modulation by symbiont of host erythrocyte aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N n-[(2s)-3-methyl-1-oxo-1-pyrrolidin-1-ylbutan-2-yl]-3-phenylpropanamide Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCCC1)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000003492 pulmonary vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464416—Receptors for cytokines
- A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464839—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
- C12N5/064—Immunosuppressive dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/05—Adjuvants
- C12N2501/052—Lipopolysaccharides [LPS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 암, 미생물 감염, 알레르기, 자가면역 질환 또는 기관 및 줄기 세포 이식 거부의 치료에 수지상 세포의 치료요법적 효과를 기능적으로 개신시키는 것으로 목적으로 유전자 조작에 의해 수지상 세포를 만드는 방법 및 의약으로 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 수지상 세포 (DC)를 생산하고, 유전공학적으로 조작하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
지난 수년간, 수지상 세포 (DC)는 면역의 중심 조절물질로 인지되어왔다. 사람의 DC는 생장 조절인자, 일반적으로 인터루킨 (IL) 4와 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF)와 같은 생장인자 존재하에 조혈 줄기 세포 또는 말초 혈관 단핵세포로부터 in vitro 분화를 통하여 생성된다. 최근 연구에서, DC는 미생물, 외상 또는 대사적 스트레스에 유연하게 반응하는 능력이 있는 것으로 제시되었다. 따라서, DC는 특정 기능, 가령, 활성 또는 내성, 타입 1 또는 타입 2 T-헬퍼 림프구 (Th1, Th2) 편향(polarisation)와 같은 특정 기능을 실행하는 하나의 서브 타입으로 분화되고 뿐만 아니라, 주어진 환경에서 만나게 되는 도전에 적절한 시간-역학(time-kinetic fashion) 방식으로 독특한 기능적 상태를 취한다(도 1).
단핵세포는 혈류를 떠나 다양한 조직으로 유입되어, 미성숙 DC (iDC)로 통상적으로 지칭하는 것이 된다. 이와 같은 iDC는 세포외 유체 및 생리학적으로 죽어가는 세포의 아팝토시스 몸체로부터 물질을 취하여, 처리하고, 그리고 T-림프구에 내성-유도 형태로 공동 자극없이 이들 물질을 제공하는 파수병이다. 내성-유도된 iDC 표현형은 DC의 의무불이행상태(default status)로 간주될 수 있다. 이 상태는 톨유사 수용체 (TLR), 염증성 사이토킨, 또는 T-림프구 유도된 시그날생성, 대부분 주로 CD40/CD40L 상호작용에 의해 전달되는 병인균 연관된 분자 패턴(PAMP)에 의한 위험 시그날을 iDC가 만날 때 까지 유지된다. 이 과정을 DC의 성숙화라고 칭하는데, 이는 일련의 기능 변화와 일치된다. 이와 같은 기능 변화는 약 2일간에 걸쳐 일어나고, 그 후, DC는 성숙 DC(mDC)로 칭하는 상태에 도달된다. 주로, DC는 B7 패밀리 구성원 CD80과 CD86와 같은 공동-조절 분자의 상향조절을 시작한다. 이는 DC가 DC 막상에 주요조직적합성 복합체(MHC)분자내 항원성 펩티드와 상호작용할 수 있는 T-세초 수용체를 운반하는 T-림프구에 억제 시그날보다는 활성 시그날을 운반하도록 한다. 이 단계에서, IL-12 뿐만 아니라, 세포독성 T-림프구(CTL)에 의해 중개되는 세포 면역을 결과적으로 지원하는 타입 1 면역 반응을 선호하는 IL-12 패밀리 사이토킨를 분비하는 DC와 함께 자극 의존성 편향이 일어난다. IL-12 분비는 TLR이 이의 리간드에 연결, 예를 들면, TLR4와 LPS가 맞물림으로써 일반적으로 촉발되고, 뿐만 아니라, DC 상에서 가용성 또는 세포 막 결합된 CD40L 분자와 CD40의 상호작용에 의해서 촉발된다. 대조적으로, IL-12 방출이 없으면 B 림프구를 지원함으로써 체액 면역 반응을 개시하는 타입 2 편항을 유발한다. TNF-α와 PG-E2 뿐만 아니라 타입 I 및 타입 II 인터페론, IL-I, 또는 IL-6이 포함되나 이에 국한되지 않는 다양한 염증성 사이토킨이 일반적으로 포함되는 사이토킨 칵테일에 iDC를 노출시킴으로써 IL-12 분비 없는 DC 성숙의 개시가 실행된다.
IL-12 방출은 약 24시간 후에 중단되는데, 이는 효과적인 타입 1 편향 및 CTL 활성화를 허용하는 시간내에 DC와 T-림프구의 만남이 일어나야 한다는 것을 의미한다. 대조적으로, 공동-자극 분자 발현은 2일후에 최대가 된다. 정의에 따르면, 성숙 DC는 공동-자극 분자의 최대 발현에 의해 표현형적으로 특징화되나 기능적으로는 특징화되지 않으며, IL-12를 방출시키는 타입 1 편향 DC는 반-성숙(sm) DC라고 한다. 약 2일 후에, DC는 소위 성숙 상태에 도달된다. 분화 2일째, DC는 이의 면역 자극 능력을 상실하고, 음성 조절 피이드백 루프를 중개하는 분자의 상향 조절에 의해 면역 억제성 성질을 획득한다(도 1). 이와 같은 분화 상의 생물학적 중요성은 면역 반응이 엄격한 제어하에 유지되어야 하기 때문이다. 활성화된 면역 세포, 특히, 다른 세포를 죽일 수 있는 CTL은 유기체에 상당히 위협적이다. 이는 이들의 제어를 피하는 병인성 면역 반응 결과: 타입 I 당뇨병 또는 다발성 경색과 같은 자가면역 질환으로 구체화될 수 있다. 따라서, 성숙 시그날을 만난 후 1일 동안 DC는 면역 반응을 준비시키고, 분화 과정의 두 번째 날 동안은 동일한 면역 반응을 억제시킬 것이다. 따라서, 성숙 DC는 고유의 면역 자극성이 아닌 면역 억제성 세포가 되고, 따라서, 암 면역 요법에 이용 또는 미생물 질환 치료에 이용되는 것과 같이 면역 자극을 목적으로 하는 치료적 개입에 부적절하게 된다.
미성숙 DC(내성 유지), 반-성숙 DC (면역 자극성), 그리고 성숙 (면역 억제성) DC 간의 구별이 중요하다(도 1). 상기에서 설명된 iDC는 자가항원에 대해 내성을 유지한다. smDC는 상기에서 설명된 성숙 자극중 하나를 만나고, 그리고 약 2일내에 mDC로의 비가역적 분화에 전념하다. 중요한 것은, 2일중 첫날동안에만 타입 I 면역 편향이 개시되고 결과적으로 CTL 중개된 면역 반응이 가능하다. 첫째날 후 DC 성숙화가 분화의 제2상으로 들어가면, 면역 억제성 성질이 획득된다. CD80, CD83, 또는 CD86와 같은 막 분자의 발현으로 mDC를 특징화시키는 것이 면역학자들사이에서는 관례이다. 그러나, 수시간내에 최대 발현에 도달하고, 24시간 후에 상실되는 IL-12와 대조적으로, 이들 막 분자는 48시간 이후에야 최대 발현에 도달된다. 여기에서 설명되는 IL-12를 방출시키는 DC을 성숙 DC라는 이름으로 통상 이해되는 것과 분명하게 구별하기 위하여, “반-성숙 DC”라는 용어가 선택되었다. 매우 중요한 것은 일종의 기능적 결합을 의미하는 것이 아니라 도 1의 시간 역학 단계에서 특정 분화 단계를 의미하는 것이다. smDC은 iDC 뿐만 아니라 mDC와도 기능적으로 상이하다.
WO 2007/117682는 CD40L를 인코드하는 mRNA 분자로 형질감염된 성숙된 수지상 세포에 관한 것이다.
Koya R. C. et al . (J. Immunoth . 26 (2003): 451-460)는 미성숙 수지상 세포에 CD40L를 코딩하는 바이러스를 형질감염시키는 것을 설명하였다. 이와 같은 수지상 세포를 성숙시키기 위해서 CD40L가 요구된다.
Liu Y. et al . ( Cancer 유전자 Therapy 9 (2002): 202-208)에서, 미성숙 수지상 세포에 CD40L를 인코드하는 바이러스의 형질 감염시키는 것이 설명되어 있다.
본 발명의 목적은 유전공학에 기초하여 수지상 세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 이와 같은 수지상 세포는 약학 조제물을 준비할 때 이용될 수 있다.
본 발명은 다음의 단계로 구성된 방법에 의해 수득될 수 있는 부분적으로 성숙된 수지상 세포를 포함하는 약학 조제물에 관한 것이다:
a) IL-12를 분비하는 능력으로 정의되는, 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)을 만들기 위하여, 미성숙 수지상 세포를 최소 하나의 수지상 세포 성숙물질과 접촉시켜 수득될 수 있는 미성숙 수지상 세포 또는 이의 선구세포 또는 부분적으로 성숙된 수지상 세포를 제공하고,
b) (a) 단계의 세포, 특히 IL-12를 방출하는 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)는 다음의 단계에 의해 조절되고,
(i) 최소 하나의 분자를 인코드하는 핵산 분자를 도입시켜, CD40L로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 최소 24시간, 적절하게는 최소 48시간동안 지속적으로 IL-12 분자를 분비시키는 것을 특징으로 하는 수지상 세포의 T-림프구 자극성 능력을 유지시키는 최소 하나의 면역 분자를 과다-발현시키고; 및/또는
(ii) LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포내에서 작용하는, 또는 LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포로부터 방출된, 그리고 인터루킨 10 (IL-1O), 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(IDO) 그리고 표 3, 4 또는 5에서 제시되는 유전자들중 최소 하나로 구성된 군에서 선택되는, 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현은 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자는 이를 인코드하는 유전자 또는 이의 단편을 녹아웃시키거나 또는 수지상 세포내에서 활성을 가지는 또는 수지상 세포로부터 운반된 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현을 저해 또는 방지시키기 위하여 핵산 분자, 바람직하게는 리보핵산 분자를 T세포로 도입시킴으로써, T-림프구 억제성 분자의 발현이 저해 또는 방지되며, 그리고
c) 수지상 세포의 선구 세포가 수지상 세포로 형질도입되도록 물질을 선택적으로 첨가시키는 단계.
본 발명에 따른 약학 조제물은 여기에서 설명된 방법에 의해 수득가능한 수지상 세포를 포함한다. 수지상 세포는 CD40L과 같은 면역 자극에 기여하는 분자의 과다 발현을 목적으로, 또는 IL-1O 또는 IDO와 같은 면역 억제성 분자, 그리고, IL-10 및 하기 표 3, 4, 5에 열거된 유사한 DC 내에서 발현 역학을 보여주는 새로 확인된 분자의 발현을 녹다운시키는 목적의 유전공학적 조작을 받게 된다. 수지상 세포들이 TLR 리간드, 염증성 사이토킨 칵테일, 또는 T-세포 유도된 시그날, 가령 CD40L 중개된 시그날과 같은 성숙 물질에 노출되거나, 또는 미성숙으로부터 성숙 DC로의 표현형 전환을 촉발시키는 것을 목적으로 하는 과정을 받게 되거나 또는 미성숙 단계에 있건 상관없이, 임의의 DC 또는 선구 세포, 가령, 혈액모세포와 같은 선구세포상에서 유전공학적 조작이 실시될 수 있다. (유전학적) 조작은 성숙 자극에 노출되기 전 또는 후에 실행될 수 있다. 단시간, 24시간내, 12시간, 특히 바람직하게는 6시간 또는 6시간 미만 동안 성숙 자극 (또는 복합된 성숙 자극)을 제공하는 것이 바람직하다. DC에 단시간 (최소 2시간)동안 성숙 자극의 호의적 적용으로, 환자에 접종 후 DC 면역 약물은 T-세포 자극 개시의 고효율 능력을 유지한다. DC의 유전자공학적 조작은 기본적인 면역 자극성 능력을 개선시키는 것을 목적으로 하나 이를 대체하려는 의도는 아니다.
본 발명의 약학 조제물의 수지상 세포 생산에 이용되는 수지상 세포의 선구 세포는 수지상 세포로 형질변환되어야 한다. 이를 위한 수단 및 방법은 당분야에 공지되어 있다.
"수지상 세포의 선구 세포"에는 단핵세포, 혈액세포등이 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 다음의 단계를 포함하는 수지상 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 미성숙 수지상 세포를 제공하고;
b) IL-12를 분비하는 능력으로 정의되는, 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)을 만들기 위하여 미성숙 수지상 세포에 최소 하나의 수지상 세포 성숙물질을 접촉시켜고;
c) (b) 단계의 IL-12를 방출하는, 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)를 다음과 같이 조절하여,
(i) 최소 하나의 분자를 인코드하는 핵산 분자를 도입시켜, CD40L로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 최소 24시간, 적절하게는 최소 48시간동안 지속적으로 IL-12 분자를 분비시키는 것을 특징으로 하는 수지상 세포의 T-림프구 자극성 능력을 유지시키는 최소 하나의 면역 분자를 과다-발현시키고; 및/또는
(ii) LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포내에서 작용하는, 또는 LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포로부터 방출된, 그리고 인터루킨 10 (IL-1O), 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(IDO), 그리고 표 3, 4 또는 5에서 제시되는 유전자들중 최소 하나로 구성된 군에서 선택되는, 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현은 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자는 이를 인코드하는 유전자 또는 이의 단편을 녹아웃시키거나 또는 수지상 세포내에서 활성을 가지는 또는 수지상 세포로부터 운반된 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현을 저해 또는 방지시키기 위하여 핵산 분자, 바람직하게는 리보핵산 분자를 T세포로 도입시킴으로써, T-림프구 억제성 분자의 발현이 저해 또는 방지된다.
상기에서 설명된 방법의 (b) 단계에서 IL-12를 방출하는 유전공학적으로 조작된 DC는 최소 하나의 면역 자극성 분자를 인코드하는 핵산 분자의 도입에 의해, 24시간 이상으로 IL-12의 분비가 유지되는 특징을 가진, T-림프구 자극성 시간 윈도우를 연장시키거나 또는 24시간후에 시간 윈도우가 닫히는 것을 전체적으로 방해하는 능력을 가진 최소 하나의 분자를 과다-발현시키거나; 또는 T-림프구 자극성으로부터 성숙후 24시간에 개방이 시작되는 T-림프구 억제에 효과적인 임의의 성숙 자극에 노출된 후, DC의 정상적인 발생 과정에 관여하는 최소 하나의 분자의 발현이 저해되거나 또는 하향 조절되는 것을 보여주고; 면역 억제성 표현형을 취하기 위해 발생된 DC에 의한 T-림프구 억제를 중개하는 기능을 이행하는 최소 하나의 분자 발현을 저해 또는 방지한다. 면역 자극성에서 면역 억제성 표현형으로 성숙 자극 노출후 정상적인 DC 발달을 간섭하는 최소 하나의 분자의 발현을 저해 또는 방지하기 위하여, 최소 하나의 분자를 인코드하는 유전자 또는 이의 단편을 녹아웃시키거나 및/또는 핵산 분자, 바람직하게는 리보핵산 분자를 도입시키거나; 그리고/또는 DC로부터 T 세포로 운반되는 시그날을 간섭함으로써 T-세포의 활성이 억제되도록 하고, 따라서 면역반응이 억제된다. 본 발명의 수지상 세포는 약 24시간의 자극성 시간 윈도우를 확장시키는 또는 24시간후 이와 같은 자극성 시간대의 닫힘을 전적으로 차단시키는 유전공학적 조작을 이용함으로써, T-림프구 자극, 특히 CTL 활성화를 최대화시킨다. IL-1O 또는 IDO에 대안으로, 임의 성숙 자극에 노출된 후 약 24시간에 시작되는 DC의 면역 억제 기능에 관계되는 다른 분자(표 3, 4, 5)가 이용될 수도 있다. 유전공학적으로 조작된 면역 자극성 DC의 제조를 목적으로 하는 분자들이 바람직할 것이다. 제공된 DNA 마이크로 어레이 데이터(표 3, 4)에서 2배 이상의 과다 발현을 보이는, 더욱 바람직하게는 최소 6배의 과다 발현을 보이는 분자를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 표 3 & 4에서 제공되는 수는 각 컬럼의 머리 부분에 표시된 과다-발현 배수를 나타낸다. 도 9에서 나타낸 실시예에서 설명된 것과 같이, DC 면역 약물내에서 면역 억제에 관련된 것으로 보이는 분자의 발현을 녹아웃시키는 것이 특히 바람직하다.
상기에서 설명된 전략을 뒤집으면, 알레르기 또는 자가면역 질환 또는 줄기 세포 및 기관 이식과 같은 면역계의 병인성 과다활성을 치료하기 위하여, 유전공학적으로 조작된 T-림프구 억제성 DC 면역 약물을 기획하는 것도 가능하다. 임의의 성숙 자극에 노출후 24시간 이상 동안 분화되는 DC에 의해 면역 억제는 생리학적으로 중개된다. DC 분화시 첫 24시간 동안 T- 림프구 자극성 분자의 발현을 간섭함으로써; 및/또는 상기에서 설명된 전략에 따라 유전공학적으로 DC를 조작함으로써 T-림프구 억제를 협조하는 분자를 과다-발현시킴으로써, DC의 면역 억제성 능력이 강화된다.
유전적 조작의 표적으로 smDC를 이용하는 것이 본 발명의 중심이며 주요 부분이다. 과거에 확립된 mDC의 면역 자극성 효과는 상당히 인위적인 실험적 세팅에 의한 것이며, 이 실험들의 대부분은 DC의 실질적 표적-[고유 단백질 항원 또는 전체세포, 이둘 모두 DC에 의해 취입되고 프로세싱되는 완벽하게 상이한 기전을 요구함-]대신에 자연계 존재하지 않는 합성 펩티드를 이용하여 실시되었다. 많은 다른 연구원들은 그들의 연구에 뮤린 시스템을 이용하였고, 그리고 인간과 생쥐사이에는 상당한 혼란을 일으키는 결정적인 차이들이 있다. 그러나, mDC가 면역 억제성 성질을 보유한다는 것은 현재 일반적으로 수용되는 사실이다. 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 수지상 세포는 더 넓은 자극성 시간 윈도우(가령, IL-12의 증가된 그리고 연장된 발현)를 보인다는 놀라운 사실이 밝혀졌다. CD40L 과다발현시키기 위하여, -DC로부터 IL-12 분비를 촉발시키는 임의의 성숙 자극에 노출된 후 생리학적 분화 과정이 시작되나, 2 내지 12시간후 좀더 적절하게는 6시간 후 제거되는 과정을 가지는 DC- smDC의 유전공학 조작으로 최소 24시간, 적절하게는 48시간, 그리고 최대 5일 또는 10일까지 DC의 T-림프구 자극성 능력이 유지된다는 것이 발견되었다. IFN-γ을 포함하는 배지에서 이와 같은 유전공학적으로 조작된 DC를 배양하는 것도 바람직하다. 이와 같은 DC는 바람직하게는 리포폴리사카라이드(LPS)가 되나 전적으로 이것만은 아닌 톨형(Toll-like) 수용체(TLR) 리간드(표 1 참고)에, 그리고 더욱 바람직하게는 IFN-γ 존재하에 수용체 리간드에 일반적으로 6시간 노출됨으로써, 그리고 CD40L를 과다-발현시키도록 유전적으로 조작됨으로써, scDC가 최소 하루, 바람직하게는 3일, 그리고 최대 5일까지 IL-12를 지속적으로 분비하는 표현형을 가지고, 그리고 동종이계 혼합된 백혈구 반응(alloMLR)에서 면역 자극성 능력이 최소 24시간, 바람직하게는 48시간, 그러나 최대 5일간 유지된다. DC 면역 약물의 기획에 적용시키면, DC 분화의 초기(early) 면역 자극성과 후기 면역 억제성 윈도우 및 관련 기능이 존속되도록 한다. 자극성 DC 면역 약물 개발에 일반적인 원리는 면역 활성화를 좀더 효과적으로 촉발시키고, 후기 면역 억제성 윈도우를 줄이거나 닫기 위하여, 초기 면역 자극성 윈도우를 확장시키는 것이 될 수 있으며, 억제성 DC 면역 약물의 경우에는 반대가 될 것이다(도 1).
일반적으로, 암 또는 감염성 질환의 치료용 면역 자극성 DC 약물 ("DC 면역 약물"; "면역 약물") 생산을 위하여, iDC로부터 smDC로의 생리학적 분화를 개시하도록 LPS/IFN-γ와 같은 초기 성숙 자극을 DC에 적용해야한다. 기타 TLR 리간드(표 1) 또한 LPS와 동일한 목적으로 기능을 할 것이며; TLR 리간드들이 복합되면 더 강력하나 정성학적으로 상이하지 않는 시그날이 제공될 것이다. TLR 리간드 중개된 성숙 자극에 초기 노출없이, T-림프구 자극성 DC 면역 약물의 자극성 능력이 유전자 전달의 인위적 조작에만 근거한다면(예를 들면, 미성숙 DC의 직접적인 유전공학적 조작에 의해), DC 기능에 상당한 기여를 하지 못할 것이며, T-림프구 자극성 DC 면역 약물은 충분한 효과를 가지지 못 할 수도 있다. 성숙 물질 또는 이의 복합물, 예를 들면, LPS/IFN-γ (smDC)에 노출만으로 제조된 DC 면역 약물,과 본 발명에 따른 유전공학적으로 조작된 DC 면역 약물의 주요 차이는 후자의 경우, smDC 면역 약물이 DC 분화의 상응하는 잠깐의 윈도우 동안 적용된다는 것이다. 이와 같은 자극성 DC 면역 약물은 성숙 자극에 노출된 후 초기에만 적용되나, CD40L를 과다-발현시키는 것과 같은 유전공학적 조작은 결정적인 용도를 허용하는 주요 DC 분화의 짧은 면역 자극성 시간 윈도우를 확장시키는 것을 목표로 하나, DC를 면역 자극성에서 면역 억제성 표현형 (도 1)으로 발달되는 것을 저해하는 것이 가장 중요하다. DC의 면역 자극성 능력의 유사한 개선은 공지의 면역 억제성 분자 IL-10 또는 IDO의 발현과 유사한 발현 프로파일을 가지는 면역 억제에 임계적으로 관련된 것으로 의심되는 분자(도 3, 4, 5에 나열된)를 녹다운시켜 실행될 수 있거나; 또는 면역 억제에 관련된 것으로 이미 확인된 분자를 DC에서 녹다운시켜 DC의 T-세포 자극성 능력이 개선된 결과를 가진다(도 9). 또한, 예전 smDC 면역 약물의 면역 자극성 시간 윈도우는 24시간 후에 닫히지만, 새로이 유전공학적으로 조작된 DC 면역 약물은 최소 1일, 바람직하게는 3일, 최대 5일까지 DC의 T-림프구 자극 능력을 유지할 것이다. T-림프구 억제성 DC 면역 약물에 대해서도 비슷한 개념이 유효하다. DC 분화의 T-림프구 억제성 윈도우에 상응하는 mDC 표현형으로 분화가 개시되도록 하기 위하여, 미성숙 DC는 우선 LPS/IFN-γ와 같은 통상적인 성숙 자극에 노출되어야 한다. DC 면역 약물로부터 T-림프구 억제성 분자를 과다-발현시키는 유전적 조작은 LPS/IFN-γ와 같은 성숙 자극에 의해 미성숙 DC가 성숙되기 전에 실행될 수 있지만, 말초 혈관으로부터 단핵세포, 조혈모세포 및 선구세포와 같은 DC의 선구 세포를 표적화할 때 특히, 레트로바이러스 유전자 전달과 같이 게놈내로 안전하게 통합되는 유전자 전달 방법으로 실시될 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 성숙 자극에 노출되기 전에 유전자 조작을 하는 것에 추가적으로, LPS/IFN-γ에 의한 성숙 개시후 6시간내 그리고 최대 48시간내 유전공학적 조작이 실시될 수 있다.
면역-억제성 분자를 과다-발현시키도록 미성숙 DC가 유전공학적으로 조작될때, 성숙 자극에 노출후 24시간 이후에는 DC의 생리학적 T-림프구 억제성 활성에 의한 중요한 공헌이 상실될 것이고, 이와 같은 이유로, 우리는 LPS/IFN-γ와 같은 성숙 자극에 노출과 복합하여, 노출 전(선구 세포 수준에서) 또는 노출후에 DC의 유전공학적 조작을 선호한다. T-림프구 억제성 DC 면역 약물의 유전공학적 조작없이, 이와 같은 억제성 DC 면역 약물의 사용은 DC 분화의 억제성 윈도우 동안에 실시되어야만 하고, 반면에, T-림프구 활성의 억제를 중재하는 분자를 과다-발현시키기 위해 유전공학적으로 조작된 T-림프구 억제성 DC 면역 약물은 환자에게 좀더 유연한 투여를 허용한다.
수용체 | 자연 생성 | 합성 유사체 | 온전한 합성 소분자 |
외생성 리간드 | |||
TLR1 | 결정안됨 | 트리아실 리포펩티드 | - |
TLR2 | 리포프로테인/리포펩티드 리포테콘산 리포아라비노만난 변종 리포폴리사카라이드 |
디-, 트리-아실 리포펩티드 | - |
TLR3 | 이중-가닥 RNA | 폴리 I:C | - |
TLR4 | 리포폴리사카라이드 HSP60 (클라미디아 뉴모니에) |
LPS/지질 A 모방체, 가령 MLP | 합성 리질 A, E5564 |
TLR5 | 세균성 플라게린 | 불연속 13개 아미도산 펩티드 |
- |
TLR6 | 결정안됨 | 디아실 리포펩티드 | - |
TLR7 | (G+U) 풍부한 단일 가닥 RNA (생쥐에서만) |
올리고뉴클레오티드 | 이미다졸 퀴놀린 (이미퀴모드, 제시퀴모드) 구아노신 뉴클레오티드 (로소리빈) |
TLR8 | (G+U) 풍부한 단일 가닥 RNA(사람에서만) |
- | 이미다졸 퀴놀린(이미퀴모드) |
TLR9 | 세균성 DNA 바이러스성 DNA 기타 DNA+비메틸화된 CpG 서열 |
CpG 올리고뉴클레오티드 | - |
내인성 리간드 | |||
TLR | HSP70 | - | - |
TLR | HSP60 히알루론산 올리고사카라이드 |
- | - |
T-림프구 자극성 분자와 면역 자극성 윈도우의 닫힘을 저지시키는 분자의 과다-발현을 위하여, 유전자 조작 전후에 LPS/IFN-γ 또는 유사한 성숙 자극을 수용하도록 DC를 유전자 조작함으로써, DC 분화의 면역 자극성 시간 윈도우를 확장시키는 DC 분화가 가능할 것이다. 본 발명의 가능성을 설명하기 위해 CD40L 유전자 전달을 이용하는 것이 선택되었는데, 그 이유는 DC로부터 발현되는 CD40와 활성화된 T-림프구로부터 발현되는 CD40L의 상호작용으로 가망 활성화 및 성숙 시그날이 DC로 전달되기 때문이다. 이와 같은 실험은 DC의 성숙에 주요한 공인자인 IFN-γ 존재하에 실시하는 것이 바람직하며, 실시예들에서 보고된 CD40L 전이유전자(transgenic) 세포를 이용한 모든 실험은 IFN-γ 존재하에서 실시되었다. DC에 개선된 자극성 능력을 부여하는 다른 분자에도 CD40L 유전자 전달과 동일한 원리가 적용될 수 있을 것이다. 대안으로, CD40 또는 IL- 12 또는 유사 분자의 발현을 녹아웃시킴으로써, 또는 DC 면역 약물로부터 T-림프구 억제를 부여하는 분자를 과다-발현시킴으로써, T- 림프구 억제성 DC 면역 약물이 기획될 수 있다. T-림프구 억제성 분자의 발현 및/또는 기능을 간섭함으로써, DC 분화의 면역 억제성 윈도우는 닫히거나 또는 더 좁게되거나 또는 더 늦은 시간대로 이동될 것이다. DC에 의한 T-림프구 활성화를 간섭하는 분자의 발현을 녹다운시킴으로써 이와 같은 방법의 실행가능성이 설명된다. DC-유도된 T-림프구 억제성 시그날을 녹다운시킴으로써 T-림프구 기능의 개선, 예를 들면, 활성화된 T-림프구상에서 활성화된 T-림프구에 매우 의존적인 방식으로, 트립토판을 프로-아팝토시스 효과를 가지는 키뉴레닌(kynurenines)으로 대사시키는 효소 IDO가 실시예 부분에서 제공된다. 두 번째 실시예로써, 프로토타입(prototypic) 면역 억제성 분자로 간주되며, 면역 억제성 분화 시간 윈도우 동안 DC에 의해 발현되는 IL-10 발현을 표적으로 하였다. 표적 분자의 발현을 녹아웃시키기 위하여, RNA 간섭이 바람직하게 이용되나, 단일 쇄 단클론 항체 또는 안티-센스 RNA의 세포내 발현과 같은 다른 기술들도 동일한 목적으로 이용될 수 있다. 대안으로, 이들 분자(가령, IDO 또는 IL-10) 또는 유사 분자가 사전성숙된(pre-matured) smDC에 기초하여, T-림프구 억제성 DC 면역 약물의 고안에 도움이 될 것이다. 실시예 부분의 결과(도 9)에서 IL-10 및/또는 IDO 에 필적하는 발현 역학을 가지는 분자의 발현을 녹다운시키면, 유전공학적으로 조작된 DC의 T-세포 자극 능력의 개선된다는 것을 보여준다.
DC의 구조 및 성질은 DC의 발생 단계를 고려하여 역학적 방식으로 설명되어야 한다. 이들 각 단계는 특정 마커 분자의 존부로 특징화될 수 있다. 이는 또한 DC의 분자 특징이 DC의 특정 분화 단계와 DC가 특정 분화 경로를 취하게 만드는 조건들에 따라 달라진다는 것을 나타낸다. DC의 발생학적 가소성은 반-성숙 타입 1 DC (smDCl) (“인터루킨 12의 방출에 의해 특징화된 T 세포 활성화 수지상 세포”)을 이용하면 왜 유익한지 설명된다. 내성 유지 기능으로부터 면역 자극성 단계로의 전환이 시작되도록 하기 위하여, DC는 성숙 자극 (수지상 세포 성숙 물질)에 노출되어야만 한다. 이로써 DC 제조 배양물에 첨가되는 LPS 및 IFN-γ 또는 유사 시약 복합물에 대한 반응으로 DC가 주로 IL-12를 방출하는 동안 면역 자극성 시간 윈도우가 개방된다. IL-12는 헬퍼 T-림프구상에 특정 수용체를 통하여 작용하고, T-림프구가 Th1 표현형을 취하도록 하여, 세포용해성 면역을 지원하게 된다. DC/T-림프구 상호작용과 세포용해성 면역 발생이 허용되도록, 면역 자극성 윈도우 동안 초기 시간대에 유기체로 DC가 접종되는 것이 바람직하다. 상기 DC는 성숙 자극후 6시간에 투여되는 것이 특히 바람직하다. 분명한 것은 접종은 수지상 세포 성숙 물질 (가령, 자극성 분자 LPS 및 IFN-γ)을 함유하는 DC 배양 배지의 제거와 연관된다. 충분히 지속될 수 있는 시그날은 성숙 물질(가령, LPS 및 IFN-γ)에 2시간, 바람직하게는 4시간, 더욱 바람직하게는 6시간의 노출에 의해 DC로 전달되고, 이와 같은 노출후, DC는 비가역적으로 성숙 과정을 완성시키고, 그리고 DC 성숙물질과 같은 리간드의 존부에 더 이상 의존하지 않게 된다. 그러나, 형식적으로 적용시간대, DC는 1-2일이 소요되는 이들의 성숙 과정을 완성시킬 수 없다. smDCl 기획에서 성숙 개시후 그리고 면역 억제성 시간 윈도우 개방전 첫 24시간 동안 면역 자극성 시간 윈도우의 최적의 장점을 취하고, 면역 반응의 하향 조절이 시작된다.
성숙 자극, 가령, LPS/IFN-γ에 노출후 초기 상에서, DC는 강력한 면역 활성화 성질 (활성화 윈도우, 도 1)을 보유하며, 이들 발생 후기 단계에서는 면역 억제성 상(억제성 윈도우, 도 1)으로 진입된다. T-세포 활성화의 분자 기전은 잘 연구되고 그리고 이해되고 있다. 분자의 성질 및 음성 조절 피이드백 루프를 시작하는 사건들에 대한 연구는 훨씬 못 미친다. 따라서, 본 발명에 따른 DC 면역 약물의 기획은 면역 활성화 보강을 위한 면역 자극성 윈도우의 확장 및 면역 억제성 윈도우를 축소시키거나 닫아서, DC에서 음성 조절 피이드백 로프를 차단하는 것을 목적으로 한다. 유전자 조작 전후에, LPS/IFN-γ와 같은 DC 성숙 물질에 DC를 노출시키는 것에 추가하여, 면역 자극성 유전자를 과다-발현시키거나 또는 RNA 간섭을 이용하여 면역-억제성 유전자들을 녹다운시킴으로써, DC를 유전공학적으로 조작하여 이와 같은 목적들이 실행되었다. 동일한 기본 원리에 따라, 면역 자극성 또는 면역 억제성 다중 유전자의 발현이 조절될 수도 있다. 실시예에서는 면역-자극성 CD40L 분자의 과다-발현에 의해 또는 면역- 억제성 분자 IL-10 및 IDO의 녹다운에 의해 이와 같은 방식의 실현 기능성을 나타낸다. 동일한 기본 원리에 따라 과다-발현 및 녹다운이 복합된면, DC 면역 약물의 효능이 강화될 수 있다. LPS/IFN-γ와 같은 성숙 자극에 초기 노출된 DC를 유전공학적으로 조작하고, DC내에서 면역 억제성 분자를 과다-발현시키거나 및/또는 면역 자극성 분자를 녹다운시키기 위하여, 생성된 smDC를 유전공학적으로 조작함으로써, T- 림프구 자극성 DC 면역 약물과 유사하게, 면역계의 병인성 과다-활성을 치료하기 위한 T-림프구 억제성 DC 면역 약물이 고안될 수 있을 것이다.
본 발명에서 설명된 유전공학적 조작에 기초된 신규한 T-림프구 자극성 또는 억제성 DC 면역 약물에 따르면, 최소 하나의 면역 억제성 또는 면역 자극성 분자의 발현이 저해 또는 방지되도록 최소 하나의 면역 자극성 또는 면역 억제성 분자 및/또는 핵산 분자, 바람직하게는 리보핵산 분자 (가령, siRNA)를 인코드하는 핵산 분자를 DC내로 도입시킴으로써 부분적으로 성숙된 smDC가 조작될 수 있다.
DC내에서 면역 자극성 분자 뿐만 아니라 면역 억제성 분자의 발현은 다양한 방법에 의해 영향을 받거나 유도될 수 있어, 상기에서 설명된 것과 같이, 핵산 분자를 도입시켜 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 렌티바이러스 유전자 전달 비이클 뿐만 아니라 리포좀-중개된 형질감염을 통하여, 핵산 분자가 전달될 수 있다. 그러나, 다른 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로 바이러스 또는 아데노 바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터 예를 들면, 유전자 총 또는 폴리-양이온성 기술을 이용하거나 또는 임의의 기타 유전자 전달이 이용되는 경우에도 동일한 원리가 적용될 것이다.
외부 유전자를 세포내로 유입시키는 몇 가지 전략들이 개발되었는데, 플라스미드 또는 DNA 리포좀 복합체의 직접 주사 또는 변형 바이러스를 이용한 감염등이 포함된다. 그러나, 이와 같은 유전자 전달 방법들을 이용하는 치료 프로토콜의 개발에서 안정성 및 효과는 중요한 고려사항이 된다. 예를 들면, 하나의 조직에 치료요법적인 단백질이 다른 조직에서는 유해할 수도 있다. 따라서, 적정 세포에 치료요법적 서열의 발현을 제한시키는 전사에 의해 표적화된 벡터가 특히 바람직하다. 더욱이, 특정 단백질에 대한 치료 윈도우가 있는 일부 경우에, 역치 아래 또는 역치를 상회하는 발현 수준는 각각 효과가 없거나 독성일 수 있다. 따라서, 치료 단백질의 수준이 치료 목적에 따라 상향되거나 하향될 수 있도록, 발현의 외인성 조절을 허용하는 구조 및 장비 방법을 만드는 것도 바람직할 것이다.
본 발명의 DC내로 해당 분자를 인코드하는 핵산을 도입시키기 위해 통상적인 바이러스 및 비-바이러스적인 유전자 전달법이 이용될 수 있으며, 또는 대안으로, 이와 같은 분자의 전사 도는 해독을 저해시키는 핵산, 가령, siRNA 또는 안티센스 RNA가 이용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 운반 시스템에는 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포좀과 같은 운반 비이클과 복합된 핵산이 포함된다. 바이러스 벡터 운반 시스템에는 에피좀 또는 세포로 운반된 후에 게놈에 통합되는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 유전자 운반 과정에 대한 리뷰는 다음을 참고한다: Anderson , Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner , TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey , TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon , TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller , Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt , Biotechnology 6(10) : 1149-1154 (1988); Vigne , Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet , British Medical Bulletin 51(1) : 31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm ( eds ) (1995); and Yu et al ., Gene Therapy 1:13-26 (1994) .
작은 간섭 RNA 분자가 이용될 수도 있다. 포유류 세포내에서, 긴 dsRNA (>30 nt)의 도입으로 인하여, 예를 들면, 단백질 합성 및 RNA 분해의 비특이적 저해로 구체화되는 강력한 항-바이러스 반응이 종종 개시된다. RNA 간섭 현상은 다음에서 설명되고 논의된다: Bass , Nature 411:428-29 (2001); Elbahir et al ., Nature 411:494-98 (2001); and Fire et al ., Nature 391:806-11 (1998), 여기에서는 또한 간섭 RNA를 만드는 방법도 논의된다. 본 발명에 이용된 siRNA 서열은 100개 염기쌍 미만, 일반적으로 30 bps 또는 이보다 짧은 것이 이용되며, 당분야에 공지된 방법에 의해 만들어진다. 예시적으로 본 발명에 따른 siRNA는 최대 29개 bps, 25개 bps, 22개 bps, 21개 bps, 20개 bps, 19개 bps, 15개 bps, 10개 bps, 5개 bps 또는 이 부근 또는 이 범위사이 임의의 정수가 된다.
본 발명의 적절한 구체예에 따르면, 미성숙 DC를 제조하기 위한 선구 세포는 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈로부터 구할 수 있고, 가장 적절하게는 말초혈액으로부터 수득된다. 본 발명에 따른 방법에 이용된 DC는 각 원천으로부터 직접 분리시키거나 또는 선구세포로부터 유도될 수 있다. 당업자는 해당 방법을 알고 있다. 예를 들면, DC 선구세포 및 미성숙 DC는 항-응고된 말초 혈관, 조혈 모세포의 수거에 의해, 백혈구 성분채집에 의해 또는 연막(buffy coats)의 준비, 로제팅(rosetting), 원심분리, 밀도 그라디언트 원심분리(가령, Ficoll의 이용 (FICOLLPAQUE), PERCOLO (콜로이드성 실리카 입자(15-30 nm 직경) 피복된 비-투석성 폴리비닐피롤리돈(PVP), 슈크로즈, 및 유사물질), 세포의 차등 용해, 여과 등으로 분리될 수 있다. 특정 구체예에서, 백혈구 집단은 개체로부터 혈액을 수거하고, 탈섬유화시키고, 혈소판을 제거하고 그리고 적혈 세포를 용해시켜 준비될 수 있다. DC 선구, 단핵세포, 또는 골수 선조세포 또는 줄기 세포를 이용하여 iDC를 분화시킬 수 있다. 말초 혈관으로부터 플라스틱 표면에 흡착되는 능력, 밀도 그라디언트를 통한 원심분리, 단클론 항체 패닝(panning), 맞흐름(counter flow) 원심분리 및 이와 유사한 것을 이용하여 단핵세포를 농축시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 DC를 개체 치료에 이용하는 경우, 치료될 개체로부터 또는 치료될 개체에 HLA-일치되는 건강한 개체로부터 iDC를 수득할 수 있다.
DC 선조세포는 적절한 배양 배지에 배양되고 분화될 수 있다. 적절한 조직 배양 배지에는 가령, RPMI 1640 및 DMEM이 포함된다. 조직 배양 배지에는 인간의 자생성 또는 채취(pooled)된 도너(doner) 혈청(소 원천의 임의의 혈청이 아님), 아미노산, 비타민, GM-CSF, IL-4 또는 IL-13와 같은 사이토킨 또는 IFN-γ, 및 세포 분화를 촉진시키는 이가 양이온이 보충될 수 있다. 선조 세포는 바람직하게는 무혈청의 임상 등급의 배지에서 배양되는 것이 바람직할 수 있다. 수지상 세포 배양 배지와 함께 이용되는 전형적인 사이토킨 복합물은 GM-CSF, IL-4 또는 IL- 13, 또는 IFN-γ을 포함한다.
본 발명의 DC 면역 약물에 바람직한 상태가 되는 DC를 smDC 분화 상태로 유도시키는 성숙 자극을 DC에 제공하기 위하여(유전자 조작 전후 또는 단세포 또는 조혈모세포 또는 선구세포와 같은 DC 선구 세포 단계에서), 최소 하나의 DC 성숙 물질의 효과량을 iDC에 접촉시킨다. 최소 하나의 DC 성숙 물질은 열에 의해 비활성화된 또는 포르말린-처리된 바실러스 칼메트-게린(BCG), 바람직하게는 BCG의 세포벽 구성분들, BCG-유도된 리포아라비도만난 또는 BCG 성분들, 대장균으로부터 유도된 리포폴리사카라이드(LPS), 또는 비활성화된 그람 양성 또는 그람 음성 미생물, 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 특히, 4-아미노-2-에톡시메틸-x-디메틸-lH-이미다졸 [4,5-c] 퀴놀린-1-에탄올 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조 [4,5-c] 퀴놀린-4-아민 또는 이의 유도체(가령, WO00/47719 참고), 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리I:C, 천연 이중 가닥 RNA 또는 RNA 바이러스 또는 RNA의 단편들, 또는 합성 유사체 또는 비-메틸화된 CpG를 포함하는 합성 또는 천연 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이들 화합물의 주성분은 TLR 항진물질이다(비교를 위해 표 1 참고). 본 발명에서, 수지상 세포 성숙 물질로 LPS를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 원리에 따르면, 임의의 TLR 항진제 단독 이용이나 또는 IFN-γ와 복합하여 이용하는 것도 가능하다. 원칙적으로, 성숙시키기 위하여, 종양 괴사 인자 α (TNF-α), IL-I, IL-6, 및 프로스타글라딘 E6 또는 이들의 일부 복합물을 포함하나 이에 국한되지 않는사이토킨 칵테일에 iDC를 노출시키는 것도 가능하다. 더욱이, CD40/CD40L 시그날생성 경로를 촉발시키는 것도 가능하다. iDC에 재조합 CD40L 분자 또는 CD40L 도메인과, 가용성 형태 또는 배양접시 또는 나노 입자와 같은 표면에 고정된 IgG-Fc와 같은 또 다른 단백질로 구성된 융합 단백질을 접촉시켜 실행될 수 있거나 또는 CD40L를 발현시키도록 유전공학적으로 조작된 1차 세포 또는 세포주를 접촉시키거나 또는 CD40L의 발현을 생리학적으로 상향 조절시키는 활성화된 T-림프구에 접촉시켜 실행될 수 있다. CD40/CD40L 시그날은 TLR 항진제, 염증성 사이토킨와의 복합물에 적용될 수도 있다. 물론 이들 성숙 물질중 최소 2개의 복합물이 이용될 수도 있다. 최소 하나의 (바람직하게는 최소 2개, 3개, 5개, 10)개 수지상 세포 성숙 물질이 I FN-γ 존재하에 수지상 세포와 접촉된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, c)의 유전자 조작 단계 전에 iDC는 최소 2시간, 바람직하게는 최소 6시간, 특히 최소 12시간, 최대 24시간 동안 최소 하나의 수지상 세포 성숙 물질의 효과량과 접촉된다. 성숙 시간은 다양한 변수(가령, DC 성숙 물질)들에 따라 달라진다. 당분야에 공지된 방법을 이용하여 iDC가 부분적으로 smDC로 성숙되도록 접촉 시간 및 기타 변수들이 선택된다. 유동 혈구계산 및 면역조직화학과 같은 당분야에 친숙한 분석을 통하여 세포 표면 마커들이 감지될 수 있다. 세포는 또한 사이토킨 생산에 대해 모니터될 수 있다(가령, ELISA, 또 다른 면역 분석을 통하여 또는 올리고뉴클레오티드 어레이 또는 단백질 어레이의 이용을 통하여).
개선된 성질을 가지는 새로운 T-림프구 자극성 또는 억제성 DC 면역 약물의 제조를 위해 유전자 조작 단계에 사용될 DC의 준비를 위하여, iDC를 IL-12를 방출하는 smDC로 성숙되는 것을 중개할 수 있는 최소 하나의 분자는 IFN-γ존재하에 LPS로 구성된 군에서 바람직하게 선택된다. 약 24시간의 생리학적 면역 자극 윈도우를 넘어서 IL-12를 분비하는 것으로 특징화된 면역 자극성 표현형을 DC가 유지할 수 있도록 하여, smDC와 비교하여 DC에 우수한 성질을 부여하게 만드는 최소 하나의 분자는 CD40L이며, 일반적으로, 그러나 반드시 필수적인 것은 아니지만, IFN-γ존재하에 CD40L이 DC에 우수한 성질을 부여하는 분자가 된다. 정상적인 상태에서는 CD40L를 발현시키지 않지만, 상기에서 설명된 유전자 조작 방법을 이용하여 본 발명에서는 인위적으로 CD40L을 발현시키도록 smDC를 만드는 것에 기초된 방법을 사용한다. 그러나, DC자체가 CD40L를 발현시키는 것이 아니라 보조 1차 세포 또는 세포주로부터 CD40L를 발현시키는 것도 생각할 수 있으며 또는 가용성 또는 면역고정된 재조합 CD40L 분자 또는 융합 단백질을 이용하는 것도 고려할 수 있다. 본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, T-림프구 억제성 활성을 중재하는 DC 분자의 발현을 간섭하는 최소 하나의 분자는 인터루킨 10 (IL-10) 및 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(IDO)로 구성된 군으로부터 선택된다. T-림프구 억제성 활성을 중재하는 분자는 실시예 부분의 표 2와 3에 열거된 분자들로부터 선택될 수도 있고, 이때 DNA 마이크로 어레이 발현 프로파일에서 2배이상의 과다-발현을 보이는 분자가 바람직하나 6배 또는 그 이상의 과다-발현을 보이는 분자가 특히 바람직하다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 최소 하나의 항원은 a) 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 임의의 기타 인간 미생물 또는 기생충 병인균으로 구성된 군; 또는 b) 알레르기의 원인이 되는 환경 항원, 질병의 원인이 되는 면역 반응의 개시에 대항하는 자가-항원 또는 이식 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다.
smDC에 기초하여, 개선된 성질을 가지며, 개체에서 항원에 대항하여 강화된 특이적 면역 반응 또는 강화된 특이적 면역 억제를 유도할 수 있는 신규한 T-림프구 자극성 또는 억제성 DC 면역 약물을 생산하기 위하여, smDC를 제조하고, 이어서 유전자 조작을 하기 위하여, 바람직한 LPS/IFN-γ 자극에 iDC를 노출시키기 전에 최소 하나의 항원을 iDC에 적하시키는 것이 바람직하다. T- 림프구가 활성화될 필요가 있는 항원에는 대항하도록 하고, 어떤 항원에는 T-림프구가 내성을 유지해야만 하는 지를 T-림프구에 지시하도록 하기 위하여 항원 로딩은 필수적이다. 종양 항원과 같은 질병이 있는 조직 또는 바이러스 감염된 세포로부터 유래된 바이러스 항원으로부터 유도될 수 있다. 완전히 죽은 또는 살아있는 미생물 또는 죽은 또는 살아있는 원핵 인간 또는 동물 세포 가령, 인간 또는 동물 종양 세포의 단편이 될 수도 있다. 항원은 재조합 단백질 또는 합성 펩티드, DNA계 바이러스 또는 비-바이러스 재조합 발현 벡터 또는 항원을 코딩하는 자연 또는 합성 RNA가 될 수 있다. 대안으로, 항원은 면역 이상을 촉발하는 알레르기와 같은 환경적 항원, 병인성 자가 면역 반응으로 질환의 원인이 되는 자가-항원 또는 기관 또는 줄기 세포 이식 거부를 결정하는 MHC 분자와 같은 항원이 될 수 있다. 동종 이식에 대해 내성 유도를 목적으로 하는 T-림프구 억제성 DC 면역 약물의 경우, 로딩이 필요하지 않을 수 있는데, 그 이유는 기관 또는 줄기 세포 도너 DC는 이식물과 동일한 MHC 분자를 가지고 있기 때문이다. 명백한 것은 후자의 상황에서, 알레로겐, 이식 항원 또는 자가-항원에 대항하는 면역이 억제되는 방식으로 DC 면역 약물이 기획되어야 할 것이다. 항원을 DC로 운반하기 위해서, DC가 단백질 또는 펩티드 항원 또는 항원 단백질 복합체, 세포 또는 항원, 항원성 펩티드를 발현시키는 세포 또는 세포막, 텍소좀, 항원 또는 항원성 펩티드를 포함하는 리포좀, 항원 또는 항원성 펩티드를 인코드하는 핵산(가능하면 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 결합된 형태)를 식균작용(phagocytose)하도록 하는 수동적 노출과 같은 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 이와 같은 방법들은 예를 들면, W099/03499에 설명되어 있다. 이와 같은 비이클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원이며 또는 나노 입자가 될 수도 있다. 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 등이 되며, 좀더 일반적으로, 임의의 이에 대응하는 면역 반응 또는 반응이 일으나게 하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 된다. 이에 대하여, 당분야에 공지된 다양한 기술에 따라 하나 또는 몇 가지 항원에 대해 DC는 감작화될 수 있다. 감작화("sensitized")는 항원 또는 항원의 일부분이 DC의 표면에 노출되어, 적절하게는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 복합하게 된다는 것을 말한다. 원칙적으로, DC는 항원으로 사전 로딩없이 환자에 접종되어, 가령, 종양안으로 직접 주사하거나 또는 종양 주변, 전이 부분으로 주사하거나, 또는 림프절 및 1차 및/2차 림프구 조직을 포함하는 배농 림프계(draining lymphaytic system)로 직접 주사하여, in vivo에서 항원을 취하게 만들 수 있다. 기본적으로, 항원 존재 및 T-림프구로의 제공으로 DC 면역 약물이 결정되지만 항원이 DC에 도달하는 경로가 결정되지는 않는다. DC 로딩 기술은 RM Steinman & J Banchereau (Nature, Volume 449/27 September 2007, page 419-426) 및 이의 참고문헌들에서 제공된다.
본 발명에 따른, 항원-로딩된 그리고 유전공학적으로 조작된 DC를 이용하여, 세포에 로딩된 항원 및 DC의 기능적 상태에 의존적인 다양한 면역학적 기능이상에서 면역 반응이 치료요법적으로 조절될 수 있는데, DC 성숙 물질과 같은 다양한 시그날 생성 분자를 이용하거나 또는 DC의 유전공학적 조작에 의해 조절될 수 있을 것이다. 이와 같은 기능이상에는 형질변환된 그리고 돌연변이된 세포를 거부하는 면역 시스템의 부전으로 그려질 수 있는 암; 심각한 그리고 치료불가능한 감염 또는 면역-절충된 개체내 기관 또는 줄기 세포 이식이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 이와 같은 DC 면역 약물에 의해 치료될 수 있는 면역 기능이상은 면역학적 과다-활성, 예를 들면 알레르기를 일으키는 환경 항원에 대항하거나 또는 면역 시스템이 이의 숙주를 공격하는 자가 면역 질환의 원인이 되는 것들이 된다. 마지막으로, 다른 세포의 유전자 공학에의해 생성된 유도된 선조 세포(iPS)를 포함한 기관 또는 줄기/선구 세포 이식물의 거부를 간섭하여, 숙주가 이식편을 수용하도록 만드는 본 발명의 방법에 기초하여 DC 면역 약물이 계획될 수 있다. 본 발명의 적절한 구체예에 따르면, 최소 하나의 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 그리고 박테리아 항원으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 유전공학적으로 조작된 DC에는 개체에서 면역 반응이 유도되거나, 억제되거나 또는 저지되게 만드는 임의의 항원이 로딩될 수 있다. 특히 종양 항원이 바람직하다.
본 발명에 따른 개선된 T-림프구 자극성 또는 억제성 능력을 가진, 유전공학적으로 조작된 신규한 DC 면역 약물은 성숙전 iDC상태로, 부분적으로 성숙된 smDC상태로, 유전공학적 조작 전후 환자에 투여전 개선된 DC 상태로 냉동보존에 의해 보존될 수 있다. 사용될 수 있는 냉동보존 물질에는 디메틸 술폭시드(DMSO), 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 슈크로즈, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토즈, 염화 콜린, 아미노산, 메탄올, 글리세롤 모노아세테이트 및 무기염이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따라 개선된 T-림프구 자극성 또는 억제성 능력을 가진 유전적으로 조작된 신규한 DC 면역 약물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 당분야에 공지된 방법 및 조성물을 이용하여 본 발명의 DC는 생리학적으로 수용가능한 캐리어, 부형제, 완충액 및/또는 희석제와 함께 조제될 수 있다.
T-림프구의 개선된 자극성 또는 억제성 능력을 가진 유전적으로 조작된 신규한 DC 면역 약물은 면역 조절이 필요한 개체에 바로 투여될 수 있다. 일반적으로 약학적으로 수용가능한 캐리어에 약 102 내지 약 1010 세포가 현탁된다. 암 환자를 치료하는 경우, 질병이 있는 자유 림프구, 바람직하게는 서혜부로 주사될 수 있지만, 임의의 종양 없는 또는 종양을 가진(전이성) 림프절도 이 목적에 사용될 수 있고, 종양으로 직접 또는 종양 또는 종양상과 접촉된 임파 부분, 부근, 인접 또는 주변조직으로 또는 전이성 질환 부분으로 주사될 수 있다. DC 면역 약물은 피하 또는 경피를 통하여 피부로 제공되어 림프절로 이동이 허용될 수도 있다. 원칙적으로, DC 면역 약물은 혈류로 1회 주사 또는 장시간에 걸쳐 주입을 통하여 말초혈관으로 또는 카테테르를 경유하여 질병이 있는 조직 또는 부분으로 공급되는 혈류(동맥 또는 정맥)로 또는 문맥 또는 폐정맥 또는 동맥으로 주사되는 것도 가능하다. 종양, 전이, 림프절, 혈류 또는 피부로 DC 약물이 지속적으로 제공되도록 이식된 방출 장치가 이용될 수도 있다.
본 발명의 개선된 T-림프구 자극성 또는 억제성 능력을 가진 유전적으로 조작된 신규한 DC 면역 약물은 조제형 및 투여 방식에 적절한 임의 수단으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 세포는 약학적으로 수용가능한 캐리어와 복합되어, 주사기, 카테테르, 캐뉼라 등으로 투여될 수 있다. 상기에서와 같이, 세포는 지연 방출 매트릭스로 조제될 수 있다. 이와 같은 방식으로 투여되면, 조제물은 이용되는 매트릭스에 적절한 수단을 통하여 투여될 수 있다. 본 발명에 적용할 수 있는 기타 투여 방법등은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 개체 치료에 단독으로 또는 종양을 치료하는 임의의 다른 방법과 복합되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 종양의 외과적 제거; 방사능 요법 및/또는 화학요법(세포독성 약물, 아팝토시스 물질, 항체 및 기타)전, 동시에 또는 후속적으로; 냉각요법(cryo-therapy); 국소방사선요법(brachy-therapy); 다른 형태의 면역 요법(ex vivo 확장된 종양 항원 특이적 T- 림프구, NK 세포, 사이토킨 및 생장 인자, 종양 항원에 특이적 항체, 또는 종양 세포 생존에 중요한 종양 조직, 가령 혈관의 구조를 표적화시키는); 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 이용하는 유전자 요법 등과 복합하여 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 DC 면역 약물은 또 다른 물질과 공동-투여될 수 있는데, 이때 이 물질은 수지상 세포의 성숙용 어주번트로 작용하거나 종양내 또는 중양 근접 또는 인접 부위에 항원 프로세싱의 어주번트로 작용한다. 이들 모든 방법 및 임의의 방법이 복합될 수도 있다. 복합 치료는 동시에 또는 치료의사가 결정한 임의의 순서에 따라 연속적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 암의 치료 및/또는 예방; 미생물 또는 기생충 감염의 치료 및/또는 예방; 알레르기의 치료 및/또는 예방; 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방 또는 줄기 세포 또는 기관 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 약물 제조에 이용되는 본 발명의 수지상 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 부분적으로 성숙된 수지상 세포가 암 예방 및/또는 암 치료에 바람직하게 이용될 수 있다. 이 경우에, 수지상 세포에 최소 하나의 종양 항원이 로딩된다. 예를 들면, 세포는 종양으로 투여되고, 종양의 외과적 제거 또는 절제후 종양 상(bed)로 투여되고, 종양 사이, 종양과 바로 접한 림프절, 혈관 또는 종양으로 연결된 또는 영양을 공급하는 림프관 또는 종양에 영향을 받은 기관, 가령, 문맥, 폐정맥 또는 정맥 등으로 바로 투여될 수 있다.
본 발명의 부분적으로 성숙된 수지상 세포의 투여는 화학요법 또는 방사능 요법과 같은 종양을 치료하는 다른 치료와 동시에 또는 후속적으로 적용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 부분적으로 성숙된 수지상 세포는 수지상 세포의 성숙에 어주번트로 작용하는 물질 또는 종양내 또는 종양 부근 또는 인접 부위의 항원 프로세싱에 어주번트로 작용하는 물질과 함께 공동-투여될 수 있다. 추가적으로, 수지상 세포는 종양내 또는 종양 주변 부위 또는 종양상(bed)에 이식될 수 있는 지연 방출 매트릭스로 조제 또는 포함될 수 있어, 세포가 종양 항원과 접촉을 위하여 종양 또는 종양상(bed)으로 서서히 방출된다.
본 발명의 적절한 구체예에 따르면, 방사능요법 및/또는 항종양 또는 항균 요법 또는 알레르기, 자가면역 질환 또는 줄기세포 또는 기관 이식 거부의 치료를 목적으로 하는 다른 요법 전에, 동시에 또는 후속적으로 개체에 약물이 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 수지상 세포는 좀더 유익한 효과를 얻기 위하여 다른 암요법과 복합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 알레르겐과 같은 환경 항원, 자가면역 질환 과정에 자가항원에 대항하는 면역 시스템의 병인성 과다 반응을 원인으로 하는 면역 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물 제조에 본 발명에 따른 수지상 세포를 이용하는 것에 관계한다.
이와 같은 약물은 알레르기 또는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 기타 방법전, 동시에 또는 후속적으로 개체에 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가 측면은 동종이계 줄기세포 이식의 면역 거부의 치료 또는 예방을 위한 약물 제조에 본 발명에 따른 수지상 세포를 사용하는 것에 관계하는데, 바람직하게는 혈액학적 악성을 치료하는데 이용되거나 또는 동종이계 기관 이식의 거부를 치료 및/또는 저지시키는데 이용된다.
이와 같은 약물은 동종이계 줄기세포 또는 기관 이식의 거부을 치료 또는 예방하기 위한 기타 방법전, 동시에 또는 후속적으로 개체에 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명은 다음의 도면과 실시예를 통하여 더 설명되나 이에 한정되지 않는다.
도 1는 DC 분화 프로세스의 역학의 개략적 설명에서 DC의 발생학적 가소성을 보여준다.
도 2는 smDC1의 기초 설계의 품질 조절을 나타낸다.
도 3은 CD40L 유전자 전달의 결과를 보여준다.
도 4는 IL-12 및 IL- 10 분비량을 보여준다.
도 5는 세포용해 활성 능력을 보여준다(■, CD40L 전이유전자 DC; ◆, GFP 전이유전자 DC; ▲, 대조군 DC) .
도 6는 IL-10 발현을 차단시킨 LPS-활성화된 DC의 면역 자극성 능력을 보여준다.
도 7은 IDO의 침묵 발현을 가진 LPS-활성화된 DC의 면역 자극성 능력을 보여준다.
도 8은 DC 발현 프로파일 실험의 실험 계획을 보여준다.
도 9a는 RNA 간섭을 이용하여 발현 프로파일 실험에서 확인된 DC내 표적 분자의 발현을 녹다운 시킨 후에 개선된 증식 반응에 대한 예를 보여준다. 도 9b는 siRNA로 DC내 이들 발현을 녹다운시킨 후에 대조군 siRNA 형질감염 또는 형질감염 안된 DC와 비교하였을 때, 동종이계 림프구에 대해 유전적으로 조작된 DC가 자극성 능력이 개선됨을 보여주는 유전자의 추가 예를 보여준다.
도 2는 smDC1의 기초 설계의 품질 조절을 나타낸다.
도 3은 CD40L 유전자 전달의 결과를 보여준다.
도 4는 IL-12 및 IL- 10 분비량을 보여준다.
도 5는 세포용해 활성 능력을 보여준다(■, CD40L 전이유전자 DC; ◆, GFP 전이유전자 DC; ▲, 대조군 DC) .
도 6는 IL-10 발현을 차단시킨 LPS-활성화된 DC의 면역 자극성 능력을 보여준다.
도 7은 IDO의 침묵 발현을 가진 LPS-활성화된 DC의 면역 자극성 능력을 보여준다.
도 8은 DC 발현 프로파일 실험의 실험 계획을 보여준다.
도 9a는 RNA 간섭을 이용하여 발현 프로파일 실험에서 확인된 DC내 표적 분자의 발현을 녹다운 시킨 후에 개선된 증식 반응에 대한 예를 보여준다. 도 9b는 siRNA로 DC내 이들 발현을 녹다운시킨 후에 대조군 siRNA 형질감염 또는 형질감염 안된 DC와 비교하였을 때, 동종이계 림프구에 대해 유전적으로 조작된 DC가 자극성 능력이 개선됨을 보여주는 유전자의 추가 예를 보여준다.
실시예
: 유전공학적 조작에 의해 T-림프구 자극성 또는
억제성
DC
면역 약물의 제조 방법.
백혈구 성분채집술(
apheresis
)
Amicus 백혈구 성분채집 장치를 이용하여 건강한 지원자들과 책임 기관의 승인을 받은 임상실험의 내용에서 치료될 다양한 신형성을 앓고 있는 환자들로부터 백혈구를 수거하였다. 모든 피검자는 World Medical Association Declaration of Helsinki의 연구에 대해 정보에 근거한 동의를 받았다. Sysmex 세포 카운터 (Sysmex, Bornbarch, Germany) 및/또는 유동 혈구계산기에서 세포 수와 서브셋이 결정되었다.
단핵세포
집적(
enrichment
)
단핵세포는 AIM-V (Invitrogen, Carlsbad, CA)+ 인간 AB 혈장 1%(Octaplas, Octapharma, Vienna, Austria) 또는 CellGro 배지(CellGenix, Freiburg, Germany)를 이용하여 기존에 설명된 것과 같이 플라스틱 흡착을 통하여 단핵 세포를 집적시켰다. 처리되는 과정에서 우리는 제조업자가 제시하는 지시에 따랐다. Elutra 세포 분리기(Gambro BCT, Lakewood, CO)를 이용하여, 원심분리 속도를 2400rpm에 유지시키면서 백혈구 성분채집산물을 세정(elutriation)실에 로딩하여 이로부터 단핵세포를 집적시켰다. 그에 따라, 세정 배지(PBS/HSA Baxter, New Jersey, NJ)의 흐름 및 원심분리 속도는 세포 분획(cell fractionation)을 위하여 일정하게 유지되었다. 대안으로, 자성 컬럼내 단핵세포를 유지시키기 위하여 CD14-피복된 자장 비드를 이용하는 CliniMACS 세포 선별 시스템 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)으로 단핵세포의 선별이 실시되었다. 단핵세포 집적을 위한 또 다른 선택은 T와 B 림프구의 고갈(depletion)인데, 이는 Isolex 30Oi Magnetic Cell Selector (Nexell, Irvine, CA)을 이용하여 실시되었다. 림프구는 CD2 및 CD19 피복된 자장 비드에 림프구를 연결시켜 자장 컬럼에 유지되었고, 유체-통과로 수거되었다. 모든 채집 과정의 최종 산물은 유동 혈구계산을 통하여 특징화된다.
유동혈구계산
전체 백혈구, T-림프구, B- 림프구, 단핵세포, 그리고 과립구에 대해 백혈구 성분채집술과 단핵세포 집적 산물은 Trucount 시스템 (Becton Dickinson, New Jersey, NJ)을 이용하여 각각 항-CD45-FITC, 항-CD3-PerCP, 항-CD19-APC, 항-CD14- APC, 및 항-CD15-FITC (BD Pharmingen San Diego, CA)으로 항체 라벨링을 통하여 분석되었다. 라벨된 세포는 FACSCalibur 유동 혈구계산기(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 분석되었다. 적절한 이소타입 대조 항체도 이 분석에 포함되었다.
DC
제조
상기에서 설명된 해당 집적 과정에 의해 분리된 단핵세포는 6일간 가습 배양기내에서 37℃, 2% 사람 AB 혈장(pooled)이 보충된 AIM-V 배지 도는 CellGro 배지에서 1x106 단핵세포/㎠ 밀도로 배양되었다. 배양 배지에는 1000 U/ml 인간 GM-CSF 및 300 U/ml 인간 IL-4 (둘다 CellGenix, Freiburg, Germany의 것을 이용)이 보충되었고, 3일째 동량의 AIM-V/2%OP 또는 CellGro + GM-CSF 및 IL-4으로 대체되었다. on day 3. 반-성숙(sm) DC를 생성하기 위하여, 50 ng/ml IFN-γ (Boehringer Ingelheim, Vienna, Austria) 및 1-1000 ng/ml의 리포폴리사카라이드 (LPS, E. coli strain O111:B4, Calbiochem, San Diego, CA, USA)를 배양물에 6시간 동안 첨가하여 성숙을 실행하였고, 연속적으로 냉동시켰다; 환자의 DC 백신은 임상용 등급의 LPS(US Pharmacopeia, Bethesda, MD)로 제조하였다.
DC
면역 표현형조사(
phenotyping
)
다음의 항체를 이용하여 DC의 성숙 상태가 결정되었다: 항-CD86-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA), 항-CD80-PE (Immunotech, Beckman Coulter, Fullerton, CA), 항-CD83-APC (세가지 모두 BD Pharmingen, San Diego, CA의 것임), 항-MHC I-PE, 항-MHC II-FITC (두 가지 모두 Dako Cytomation, Carpinteria, CA의 것임), 그리고 항-CD45-PerCP (BD Pharmingen, San Diego, CA). DC의 생존능은 프로피디움 요오드 착색으로 측정되었다(Sigma, St. Louis, MO). FACS Calibur 유동 혈구계산기를 이용하여 세포가 분석되었다. 적절한 이소타입 대조 항체들이 분석에 포함되었다.
ELISA
에 의한
IL
-12 감지
DC 배양물 상청액에 IL-12의 농도는 기존에 설명된 것과 같이 측정되었다.
동종이계
혼합된 백혈구 반응
동종이계 반응자(responder) PBMC는 말초혈관으로부터 그라디언트 원심분리에 의해 분리되었다. DC 자극(10000, 2000, 또는 400)은 96 웰 밑둥근 플레이트 상에서 2% 인간 혈장(pooled)이 보충된 200 ㎕ AIM-V 배지내에서 105 개 반응자 세포를 사용하여 3중으로 배치되었다. 양성 기준으로, 105 개 반응자 세포는 100 ng/ml 스타필로코커스 엔테로톡신 A/B (SEA/SEB, Toxin Technologies Inc., Sarasota, FL)로 자극받았다. 4일째, 공동-배양물은 추가 18시간 동안 1 μCi의 트리티움 티미딘 용액(NEN Life Science Products, Boston, MA)으로 항온처리되었다. 마지막으로, 세포는 Skatron (Lier, Norway) 수득기로 회수되었다. Trilux-플레이트 판독기(Wallac Oy, Turku, Finland)를 이용하여 결합된 트리티움 티미딘이 카운트되었다. 대안으로, 동종이계 PBMC는 CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR)으로 라벨되고, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 및 1/80의 비율로 DC와 혼합되었다. 대조군의 경우, DC 또는 SEA/SEB의 첨가는 없었다. 마지막으로, PBMC는 항-CD3-PerCP으로 라벨되고, FACS Calibur 유동 혈구계산기를 이용하여 분석되었다. CD3 양성 CFSE 음성 T-림프구의 비율이 결정되었다.
smDC
내로
렌티바이러스
유전자 전달
ViraPower™ 렌티바이러스 발현 시스템 (Invitrogen)을 이용하여, 바이러스 구조 단백질, 폴리메라제 그리고 역 전사효소 (pLP/VSVG, pLP-1, pLP-2)를 인코드하는 pLP-플라스미드와 GFP 또는 CD40L을 포함하는 플라스미드를 293FT 생산자 세포주에 공동-형질감염시킴으로써 렌티바이러스 입자들이 생성되었다. 공동-형질감염 후 72시간에, 전체 상청액을 회수하여 한외-원심분리를 이용하여 100x 농축시켰다. 상기에서 제시된 조건들 하에서 DC가 배양되었고, 성숙되었다. DC는 성숙 시작후 48시간 또는 6시간에 회수되었다. 그 다음, 6 μg/ml Polybrene (Sigma-Aldrich) + IL-4, GM-CSF, IFN-γ(표준 농도)와 복합하여 렌티바이러스 입자들(250 ㎕ 10Ox 농축된 렌티바이러스 상청액(lxlO6 DC)로 사전-성숙화된 smDC는 형질유도되었다. IL-12 품질 대조를 위해, 24시간 후에 상청액을 취하였고, 다음의 과정에 따라 48시간 후에 GFP/CD40L 발현이 측정되었다.
DC
내에서
RNA
간섭
상기에서 설명된 표준 과정에 따라 DC가 만들어진다. 6일째, 제조업자의 지시에 따라 형징 감염 시약(Dharmacon)을 이용하여, 106 개 DC는 100 pmol 유전자-특이적 siRNA로 형질 감염된다. 형질감염 후 24시간에, 6시간 동안 DC는 PS/IFN-γ로 자극받는다. 상기에서 제시된 방법에 대해 모든 용도는 유사하다.
결과
현재 사용되는 DC 면역 약물은 도입부에서 설명된 것과 같이, 임의의 성질을 가진 항원이 부과되고, DC로부터 IL-12 방출을 촉발시키는 능력을 보유한 성숙 자극에 노출된 단세포-유도된 DC를 이용한다. IL-12 분비 능력으로 특징화된 DC 표현형은 세포 용해성 면역을 지원하는 면역 시스템의 타입 1 편향을 유도하는 능력을 보유한다. 이것은 IL-12 존재 하에 DC로부터 항원이 T-림프구로의 제공을 허용하기 위하여 자극성 DC 면역 약물이 IL-12 분비의 12시간 윈도우 동안 환자에 제공될 필요가 있다는 것을 암시하는 것이다(도 1). DC의 유전적 조작으로 더 긴 시간 동안 면역 자극성 윈도우가 개방된 상태로 유지되도록 하기 때문에 개선된 T-림프구 자극성 또는 억제성 능력을 가진 유전적으로 조작된 신규한 DC 면역 약물은 이와 같은 한계를 극복한다.
다음의 실시예에서, 유전공학적으로 조작된 DC 면역 약물들이 제조되고 연구되었다. DC내로 DNA 또는 RNA를 전달하기 위하여 렌티바이러스 유전자 전달 또는 리포좀-이용된 형질감염이 이용되었지만, 임의의 핵산 운반 기술도 이와 같은 능력 범위에서 사용될 수 있다. DC 면역 약물내에 면역 자극성 유전자의 과다-발현의 예로써, DC가 CD40L 분자를 발현시키기 위하여 렌티바이러스 유전자 전달을 이용하여 유전적으로 조작되었다. 기능 연구에서 이와 같이 조작된 DC 면역 약물은 면역 반응을 자극하는 강화된 능력을 보유한다는 것이 확인되었다. 더욱이, 면역 억제성 분자 IL-10 및 IDO의 녹다운으로 IL-10 및 IDO의 RNA 간섭을 위해 계획된 siRNA로 DC를 조작함으로써 자극성 능력도 강화된다는 것이 설명되었다. 면역 억제성 피이드백 루프에 연관된 DC 분자를 추가 동정하기 위하여, DNA 마이크로 어레이를 이용하여 전체 게놈 DNA 발현 프로파일링이 실시되었다. IL-10 또는 IDO과 유사한 발현 프로파일을 가진 유전자 집단의 클러스트 분석에 근거하여, 면역 반응을 음성적으로 조절하는 능력을 보유하는 일련의 유전자가 발견되었다. DC 면역 약물에서 이들 유전자를 녹다운시키면 유전자의 면역 자극 능력이 개선될 것이다. 따라서, 정의된 면역 시스템 성분들의 특이적 조절을 허용하도록 DC를 면역 약물 유전공학적으로 조작시키면 관련 면역 시스템의 기능이상을 치료할 수 있다. RNA 간섭을 이용하여 DC 발현 프로파일링 실험에서 IL-10 또는 IDO에 유사한 역학을 가진 발현된 표적 유전자의 녹다운의 기능상 결과의 최종 실시예들을 나타내었다. 동종이계 T-림프구와 공동-배양에서, T-림프구 자극의 강화를 나타내는 증식을 촉발시키는 이와 같이 유전공학적으로 조작된 DC의 개선된 능력이 관찰되었다.
도 2에서는 유전자 조작에 이용되는 smDCl 기초적인 계획의 품질 조절을 보여준다. DC 면역 약물은 정의된 품질 조절 기준에 맞아야만 한다. 패널 A는 말초 혈관 단핵세포로부터 제조된 DC의 순도, 생존능 및 산출을 보여준다. 이와 같은 단핵세포는 백혈구 성분채집에 의해 수거되고, 단핵세포는 역류 원심분리 (elutriation)에 의해 집적된다. IL-4 및 GM-CSF 존재시에, 단핵세포는 6일 이내에 in vitro에서 iDC로 분화된다. iDC에 항원을 부과하고, 연속하여 LPS 및 IFN-γ으로 구성된 성숙 자극에 6시간 동안 노출되고, 그리고 냉동된다. 이 단계에서, 이를 반(semi)-성숙이라고 말하며, 성숙을 지속하기 위해 비가역적으로 진행되지만, mDC의 전형적인 표현형 및 기능적 특징을 보이지는 않는다. 가장 중요한 것은, 이 단계에서(성숙 시작후 약 0-24시간, 면역 자극성 윈도우 도 1), DC는 면역을 촉발하고, 후기 단계에서(성숙 시작후 약 24-28시간, 면역 억제성 윈도우, 도 1). 그러나, 임상적 응용에서, 성숙이 완료되고, 면역 반응을 촉발하는(24시간 전), 그러나 연속적으로(약 24시간) -성숙 자극에 의해 촉발되는 생리학적 발생 프로그램에 따라-면역 억제성 단계 [우리의 목적은 DC 면역 약물의 유전자 조작에 의해 이를 차단하는 것이다]로 진입되는 이 분화 단계에서 환자에게 주사된다.
품질 조절을 위하여, DC 면역 약물 한 방울을 해동시키고, DC가 성숙 과정을 완료할 수 있도록 2일간 재배양되었다. 2일 동안, DC는 사이토킨, 가장 중요하게는 IL-12 (성숙후 초기) 및 IL-10 (성숙후 후기)를 방출한다(패널 B; 세명의 개체로부터 평균 ± SEM으로 나타냄). 또한, 중요한 DC 막 분자의 발현 패턴에 변화도 보인다(패널 C). 마지막으로, DC는 CFSE 희석과 형광 변형과 연관하여 세포 분할을 촉발시키는 CFSE-라벨된 동종이계 PBMC로 공동-배양(지정된 비율로)에 의해 alloMLR 효능 테스트를 받게 된다. 막대 그래프는 세 개체로부터 세포 증식의 평균 ± SEM 비율을 보여준다.
면역 억제성 피이드백 루프의 개시를 위해 초기 자극 또한 필수적이다. 일반적으로, 특정 자극에 대한 반응으로 활성화가 강할수록, 면역 활성화를 기저수준으로 하향 조절하여, 자가-면역 질환의 원인이 되는 통제 불능의 면역 반응을 방지하기 위하여 피이드백 시그날생성이 더 강해질 것이다. 따라서, 성숙 자극 LPS/IFN-γ으로 최대량의 IL-12 방출과 뿐만 아니라, IL-10 방출도 최대가 된다는 것이 밝혀졌다.
테스트 | 명세 | 테스트 | 명세 |
순도 | 70-100% | IL-12 | >100pg/㎖ |
생존능 | 70-100% | alloMLR | |
표현형 | DC:MNC=1:5 | >30% | |
CD80 | 60-100% | DC:MNC=1:10 | >30% |
CD86 | 60-100% | DC:MNC=1:20 | >15% |
MHC I | 60-100% | 음성 기준 | <10% |
MHC II | 60-100% | BACTEC | NEG |
CD83 | 60-100% | 폐렴 | NEG |
CD14 | 0-40% | HIV 1/HIV 2 | NEG |
IgG 기준 | <1% | HBV/HCV | NEG |
CD40L
분자의 과다-발현을 통하여 강화된 자극성
DC
면역 약물의 설명.
IL-12 의 분비를 특징으로 하는 DC의 면역 자극성 윈도우를 확장하기 위하여(도 1), DC는 CD40L를 과다-발현시키도록 유전공학적으로 조작되었다. 이 분자는 활성화된 T-림프구로부터 정상적으로 발현되고, DC로 주요 활성화 시그날을 전달하는 DC 상에서 CD40과 상호작용한다. 이 실험은 DC 면역 약물내로 활성화된 분자의 전달의 예시로 계획되었다. 그러나, 원칙적으로, 다른 자극성 분자에도 동일한 과정이 이용될 수 있고, 또는 억제성 DC 면역 약물을 계획하기 위하여, DC로부터 면역 억제성 분자가 과다-발현될 수도 있다. 특히, DC 내로 CD40L 유전자 전달 원리는 CD40L 유전자 이유는 (i) DC로 CD40L 시그날을 운반하기 위해 DC가 T-림프구 활성화와 DC가 무관하도록 하며; (ii) 본 실험에서 구성적으로 활성 프로모터로부터 발현에 의해 DC 자체에 CD40L가 지속적으로 존재하기 때문에, DC가 LPS/IFN-γ와 같은 통상의 성숙 자극을 받았을 때와 비교하였을 때 훨씬 긴 시간동안 IL-12를 방출할 수 있었다고 가설하였고, 이것이 본 실험에서 확인되었으며; (iii) LPS/IFN-γ 또는 CD40L/IFN-γ 자극 단독과 비교하였을 때, DC로부터 방출되는 전체 IL-12 양이 훨씬 많았고, 그리고 자극후 IL-12 분비 역학은 정량학적으로 더 빨리 시작되어 DC 분화의 면역 자극성 윈도우가 확장되었고; (iv) LPS/IFN-γ에 노출후 48시간에도 DC는 IL-12를 분비하는 능력을 소진하여, CD40L 유전자 전달로 인하여 DC가 IL-12 분비의 두 번째 상을 개시하도록 만들었다(도 3).
도 3에서는 CD40L 유전자 전달을 보여준다. 패널 A에서, 6시간 smDC와 48시간 mDC에서 렌티바이러스 유전자 전달후 GFP 또는 CD40L의 발현을 나타낸다. 여기에 나타낸 모든 측정은 렌티바이러스 벡터에 사전-성숙된 DC 노출후 48시간에 실시된 것들이다. iDC, LPS/IFN-γ에만 노출된 DC 또는 GFP 조작된 6시간 smDC와 48 시간 mDC (패널 B)와 비교하였을 때, DC로부터 CD40L의 발현으로 IL-12 분비가 강화되었다. GFP 유전자 전달시 IL-12 방출의 강화는 아마도 6 시간-smDC에서 발현되는 TLR(표 1)를 통하여 시그날을 보내는 바이러스 이중 가닥 RNA 때문일 것이며48 시간-LPS/IFN-γ mDC에서는 강화된 방출이 없다. 기능적으로 중요한 DC 막 분자의 발현 프로파일(패널 C)은 렌티바이러스 유전자 전달에 의해 변경되지 않았다(검정 그래프, 미성숙 DC; 흰 그래프, mDC) .
LPS/IFN-γ, CD40L/IFN-γ, 또는 이의 복합물에 노출된 DC에서 사이토킨 IL-12 및 IL-10의 분비는 정량적으로 그리고 정성적으로 상이하였다(도 4). CD40L/IFN-γ 단독 자극과 비교하였을 때 복합 자극이 제공된 경우, IL-12 분비가 거의 두배였고, LPS/IFN-γ 단독 자극과 비교하여도 훨씬 높았다. 또한, LPS/IFN-γ/CD40L 복합 자극에 노출된 DC로부터 IL-12 분비는 12시간 후에도 상당한 양으로 분명히 감지가능하였고, 반면 LPS/IFN-γ와 CD40L/IFN-γ는 처음 성숙 시그날에 노출후 12 내지 24시간 사이에만 생물학적으로 의미있는 수준의 IL-12 분비를 촉발시켰다. 이와 같은 관찰은 DC 면역 약물의 자극성 능력을 개선시키기 위하여 DC 분화의 면역 자극성 윈도우를 확장시키는 본 발명의 목적과 일맥상통한다. L-10의 최대 발현은 LPS/IFN-γ/CD40L 또는 CD40L/IFN-γ 단독에 노출된 경우와 유사하였으나, DC 성숙의 경우 LPS/IFN-γ만을 이용하였을 때는 발현이 훨씬 낮았다. 그러나, CD40L/IFN-γ 시그날생성 후 12시간 후에도 면역 억제성 사이토킨 IL-10은 생물학적으로 유의적인 수준에서 이미 감지가능하였고, 반면에 복합 자극 LPS/IFN-γ/CD40L은 LPS/IFN-γ 성숙된 DC에서만 유사한 역학을 보여주었다. CD40L/IFN-γ 자극후 IL-10의 초기 방출은 DC 분화의 면역 자극성 윈도우를 음성적으로 간섭하여 DC의 면역 자극성 DC 약물을 계획할 때는 이를 피해야만 한다. IL-12와 IL-10의 분비 패턴을 고려하면, LPS/IFN-γ/CD40L 복합 자극의 면역 자극성과 면역 억제성 능력 사이의 전체 균형 효과는 LPS/IFN-γ 또는 CD40L/IFN-γ 단독으로 제공될 경우와 비교하여 면역 자극성 능력이 개선되는 쪽으로 간다는 것이 명백하다는 결론이다. 초기 공개된 것과 반대로, 여기에서 이용된 DC는 복합 성숙 자극을 수용할 것이다. 생리학적으로, DC가 T-림프구 를 활성화시키는 상(IL-12 분비로 특징화되는)과 DC가 T-림프구의 활성을 억제하는 제 2 상(IL-10 분비의 분비 및 효소 IDO의 활성에 의한 트립토판 고갈로 특징화되는)은 적절한 성숙 자극, 가령, LPS/IFN-γ에 iDC를 접촉시키면 촉발될 것이다(도 1). 여기에서는 LPS/IFN-γ(또는 IFN-γ 존재하에 또 다른 TLR 항진물질)에 처음 노출후, CD40L와 같은 분자를 과다-발현시키기 위하여 DC를 유전자 조작하면, T-림프구 활성화시키는 DC 표현형은 유지시키고, DC가 억제성 표현형을 취하는 것을 저지시킨다(도 4). IFN-γ 존재하에 TLR 시그날생성 경로를 통하여 초기 성숙후 6시간 또는 48시간내에 유전자 조작이 실행된 경우, IL-12 분비는 20-24시간의 생리학적 시간 윈도우보다 더 오래 유지된다.
도 4에서는 IL-12 및 IL- 10 분비의 양과 질을 보여준다. IFN-γ 존재하에 지정된 성숙 자극에 DC가 노출되었다. 배양 상청액에서 IL-12 및 IL-10의 농도는 지정된 시간대에서 측정되었다.
유전공학적으로 조작된 T-림프구 자극성 DC 면역 약물의 계획시, IL-12-방출하는 DC는 면역 반응의 타입 1으로 편향되어 세포용해성 면역을 촉발하는 능력을 보유하는 것이 특히 중요하다. 따라서, CD8 양성 CTL에서 그란자임(granzyme) B 내용물을 분석함으로써 세포용해성 면역 반응을 촉발시키기 위하여 CD40L 유전자 전이된 DC에 노출된 T-림프구의 능력에 대해 추가 조사되었다(도 5). 실제로, 기준 GFP 전이유전자 DC 또는 형질유도안된 mDC와 비교하였을 때, CTL와 CD40L 전이유전자 DC의 공동-배양으로 그란자임 B의 발현이 명백하게 강화되었다는 것이 확인되었다. 이는 이와 같은 CTL의 개선된 세포용해성 능력의 강력한 지표이며, 따라서 DC 면역 약물로부터 CD40L 발현으로 인하여 면역 자극성 능력이 개선된다는 증거를 제공한다.
도 5는 세포용해성 활성의 효과를 보여준다. PBMC가 CD40L 전이유전자 DC (좌측 패널, ■)와 공동 배양되었을 때, 기준 GFP 전이유전자 DC (◆) 및 형질유도안된 mDC (▲)와 비교하였면 CTL의 전체 비율은 단지 근소하게 증가되었다. CD40L 전이유전자 DC와 공동 배양된 CTL에서 그란자임 B 발현을 분석하였을 때, GFP 전이유전자 DC (◆) 및 형질유도안된 mDC (▲)과 비교하면, 명백하게 증가(우측 패널, ■)되었다.
면역
억제성
사이토킨
IL
-10의 발현을 녹다운시키기 위한 조작에 의해 T-림프구의 개선된 자극성 능력을 가진
DC
면역 약물의 설명
면역 억제를 중재하는 분자의 발현이 녹다운된 DC 면역 약물의 가설에 근거하여, 4가지 표적 특이적 siRNA 풀(pool)을 이용한 RNA 간섭에 의해 IL-10 유전자의 발현을 차단시키기 위한 실험이 고안되었다(도 6). 이는 LPS/IFN-γ 활성화된 DC에서 IL-10이 한결같이 그리고 반복적인 녹다운을 초래하였고, 이는 기준이 되는 침묵 mDC와 비교하였을 때 더 많은 IL-12 분비를 유도하였다. 이와 같은 관찰은 동일한 DC상에 IL-10 수용체에 DC에서 분비된 IL-10의 결합에 기초되는 오토크린 경로에서 IL-12 생산의 하향 조절을 초래한다는 것을 암시한다. 이를 제외하고, CD80, CD86, MHC class I, 및 II 발현으로 평가된 결과, 유전공학적으로 조작된 DC와 정상 DC사이에 면역 표현형의 차이는 없었다. 가장 중요한 것은 alloMLR에서, 대조 실험과 비교하였을 때, T-림프구를 활성화시키는 IL-10 분비를 억제하기 위해 조작된 DC 면역 약물의 훨씬 더 큰 능력이 관찰되었다.
추가적으로, CD4+ T-세포 집단, 아마도 면역 반응을 억제하는 조절성 T-세포 (Tregs) 집단에서 LPS/IFN-γ 활성화된 DC에서 IL-10의 침묵으로 인하여, CD25+FoxP3+ 세포의 비율이 감소되었다.
도 6에서는 유전자 조작에 의해 IL-10 발현이 차단된 LPS/IFN-γ-활성화된 DC의 면역 자극 능력을 보여준다. LPS/IFN-γ로 활성 전 12시간에, DC는 4가지 IL-10 특이적 siRNA 풀(pool) 또는 비특이적 기준 siRNA로 형질감염되었다. 그 다음 분리된 동종이계 CD3+ T-세포에 1:3 = DC:T-세포 비율로 6 시간-LPS-성숙 DC (mDC) IL-10 (검정 막대) 또는 기준-침묵(흰 막대)으로 자극되었다. CD4+, CD8+, (패널 A) 및 CD4+CD25+FoxP3+ T-세포 (패널 B)이 공동 배양 6일째 Trucount 시스템 및 FACS LSRII 유동 혈구분석기로 분석되었다. 면역 표현형 뿐만 아니라 IL-10 및IL-12 분비의 분비는 LPS/IFN-γ 활성화후 48시간에 각각 유동 혈구분석 및 ELISA를 이용하여 측정되었다(패널 C). 면역 표현형 분석에서 IL-10-침묵 DC (패널 D) 또는 기준-침묵 DC (패널 E)에서 LPS/IFN-γ- 활성화된 DC (흰 막대)와 iDC (검정 막대)가 비교되었다.
면역
억제성
효소
IDO
의 발현을 녹다운시키도록 조작된 T-림프구 자극성
DC
면역 약물의 설명
공지의 면역 억제성 효과 분자 IDO의 발현을 녹다운시키기 위하여 siRNA가 이용되었다(도 7). siRNA의 형질 감염 및 IDO 녹다운 효과를 최적화시키기 위하여, IFN-γ로 활성화된 HeLa 세포가 이용되었다. 후속적으로 DC는 최적화된 조건하에서 형질감염되었다. HeLa 세포 및 DC 모두에서, 웨스턴 블랏 실험에서 설명된 것과 같이, IDO 발현은 침묵되어야 한다. alloMLR 효능 분석에서 IDO 침묵된 DC, 스크램블된(scrambled) 기준 siRNA로 형질감염된 DC 그리고 iDC이 자극물질로 사용되었다. 스크램블된(scrambled) 기준 siRNA로 형질감염된 DC 그리고 iDC와 비교할 때, IDO 침묵된 DC의 자극성 효능이 상당히 더 큰 것으로 관찰되었다. 이는 CD8+ CTLs 뿐만 아니라 CD4+ Th-세포에서도 유효하였다.
도 7에서는 IDO 발현 침묵된 LPS/IFN-γ-활성화된 DC의 면역 자극성 능력을 보여준다. 우선, 웨스턴 블랏팅 실험으로 HeLa 세포 (패널 A) 뿐만 아니라 DC (패널 B)내에서 효과적인 IDO 녹다운이 설명되었다. CD8+ CTLs (패널 C) 및 CD4+ Th 림프구 (패널 D)상에서 IDO 침묵 DC의 자극성 효능을 조사하기 위하여, PBMC는 IDO-침묵된 DC (■), 기준 침묵 DC (◆, sera = 스크램블된 서열), 또는 iDC (▲)로 공동-배양되었다. 모든 경우에, IDO-침묵 DC가 기준보다 우수하였다.
면역
억제성
분자
성숙 자극 LPS/IFN-γ, CD40L/IFN-γ 시그날생성 또는 LPS/IFN-γ/CD40L 시그날생성의 복합 뿐만 아니라 적정 기준에 노출된 DC의 발현 프로파일을 만들기 위하여 전체 게놈 DNA 마이크로 어레이가 이용되었다(도 8).
도 8에서는 DC 발현 프로파일링을 보여준다. DC는 지정된 성숙 자극에 노출되거나 미성숙 상태로 남겨둔다. 지정된 시간대에 RNA가 추출되고, 전체 게놈 DNA 마이크로 어레이를 이용한 발현 프로파일링이 실시되었다. 발현 프로파일링의 결과는 CarmaWeb (Comprehensive R based Microarray Analysis, Bioinformatics Graz and the Tyrolean Cancer Research Institute, Austria)을 이용하여 분석되었다. 모든 데이터는 CarmaWeb 소프트웨어 플랫포옴의 기초 알고리즘을 이용하는 20개 클러스트로 통합하여, IDO 및 IL-10를 포함하는 클러스트를 확인하였다. 이들 클러스터내 유전자는 공지된 두 가지 면역 억제성 DC 분자의 것과 유사한 발현 프로파일을 가지며, 이는 면역 억제성인 DC의 면역 조절에 기능을 보유한다는 결론에 도달된다(표 3 과 4).
현재 DNA 마이크로 어레이에서, 유전자 IL-10, TSLP, INDO, IL2RA, CSF-2 및 CSF-3-모두 면역 억제 효과를 가지는 것으로 공지된-의 조절에 관련된 LPS/IFN-γ 또는 CD40L/IFN-γ 시그날생성시에 DC내에서 유도된 유전자들이 확인되었다. 면역 조절의 능력을 가진 잠재적 마스터 스위치를 동정하기 위하여, Resnet 5 (version 1.2 1월, 2007)일 이용한 Pathway Studio 소프트웨어, PubMed 및 44 오픈 어세스 저널로부터 유도된 포유류 경로 및 분자 상호작용 데이터 베이스로 이들 유전자의 조절물질 네트워크를 만들었다. 차등적으로 활성화된 DC의 마이크로 어레이 데이터를 고절 네트워크에 업로딩하여, 성숙 DC에서 유도된 잠재적 마스터 조절물질이 선택될 것이다(표 5).
도 9에서는 RNA 간섭을 이용한 발현 프로파일링에서 확인된 DC내에서 표적 분자의 발현을 녹다운시킨 후에 증식 반응이 개선된 예들을 보여준다. IL-10, IDO에 유사한 DC 발현을 보이는 또는 면역 조절의 마스터 스위치 클러스터에 속하는 유전자는 음성 조절 면역 억제성 피이드백 로프에 연관된다. RNA 간섭을 이용하여 IL-10 또는 IDO의 발현이 녹다운된 것과 유사한 실험이 고안되었다. 표 3, 4, 또는 5에 있는 siRNA 특정 유전자로 DC에 형질감염시켰다. 도 9에서는 유전자 MAPKAPK2, IRF2, PHFIl, IRF4, JAKl, CEBPB, ETV6를 나타내었다. LPS/IFN-g에 6시간 노출후 성숙이 개시된 후, 유전공학적으로 조작된 DC는 6일간 동종이계 T-림프구로 공동-배양되었다. 동종이계 T-림프구는 세포에 유입되어 단백질에 결합되고, 세포 내부에서 유지되는 CFSE로 라벨되었고, 과량의 CFSE는 씻겨나갔다. 각 세포 분할시, T-림프구의 형광 강도는 반감되었고, 이는 공동 배양 6일째 T-림프구 증식의 평가가 허용되었다. 형질감염안된 DC 또는 기준 siRNA로 형질감염된 DC를 대조군으로 이용하였다. 동종이계 T- 림프구를 자극하는 유전공학적으로 조작된 DC의 능력의 개선은 음성 조절 피이드백 루프내에서 siRNA-표적화된 유전자가 관련있다는 증거이다. 더욱이 이는 이와 같은 유전자를 녹다운시키기 위해 유전자 조작된 DC 면역 약물이 통상의 면역 요법과 비교하였을 때 개선된 치료요법적 효과를 가질 것이라는 것을 말한다.
결론
본 발명의 DC 면역 약물의 특징들은 유전자 조작에 의해 조절될 수 있다는 증거를 제시한다. DC에서 면역 자극성 분자의 과다-발현 및 면역 억제성 분자의 녹다운으로 면역 자극성 능력의 강화를 초래한다는 것이 설명되었다. DC 암 백신 또는 항-감염성 DC 면역 약물과 같은 용도를 찾을 것이며, 이때 DC는 종양 유도된 항원 또는 미생물로부터 유도된 항원이 부과되며, 성숙 자극에 노출되고, 설명된 것과 같이 조작된다. 추가적으로, 여기에서 제시된 데이터는 면역 자극성 분자를 녹다운시키고, 면역 억제성 분자를 과다-발현시켜 면역 억제성 DC 약물을 고안할 수도 있다는 것을 암시한다. 이와 같은 억제성 DC 면역 약물은 알레르기 또는 자가면역 뿐만 아니라 이식된 조직에 대해 이식물 수용개체의 면역 시스템이 내성을 가질 수 있도록 이식 약물에 용도를 가질 수 있을 것이다.
Claims (20)
- 다음의 단계로 구성된 방법에 의해 수득될 수 있는 부분적으로 성숙된 수지상 세포를 포함하는 약학 조제물:
a) IL-12를 분비하는 능력으로 정의되는, 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)을 만들기 위하여, 미성숙 수지상 세포를 최소 하나의 수지상 세포 성숙물질과 접촉시켜 수득될 수 있는 미성숙 수지상 세포 또는 이의 선구세포 또는 부분적으로 성숙된 수지상 세포를 제공하고,
b) (a) 단계의 세포, 특히 IL-12를 방출하는 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)는 T-림프구 억제성 분자의 발현이 저해 또는 방지되도록 조작되되는데, 여기서 조작은 LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포내에서 작용하는, 또는 LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포로부터 방출된, 그리고 인터루킨 10 (IL-1O), 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(IDO) 그리고 표 3, 4 또는 5에서 제시되는 유전자들중 최소 하나로 구성된 군에서 선택되는, 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현은 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자는 이를 인코드하는 유전자 또는 이의 단편을 녹아웃시키거나 또는 수지상 세포내에서 활성을 가지는 또는 수지상 세포로부터 운반된 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현을 저해 또는 방지시키기 위하여 핵산 분자, 바람직하게는 리보핵산 분자를 T세포로 도입시켜 이루어지고, 그리고
c) 수지상 세포의 선구 세포가 수지상 세포로 형질도입되도록 물질을 선택적으로 첨가시키는 단계. - 제 1 항에 있어서, 미성숙 수지상 세포의 선구세포, 특히, 단핵세포 또는 조혈모세포 또는 미성숙 수지상 세포는 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈 또는 말초 혈관으로부터 수득된, 약학 조제물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 최소 하나의 DC 성숙 물질은 열에 의해 비활성화된 또는 포르말린-처리된 바실러스 칼메트-게린(BCG), 바람직하게는 BCG의 세포벽 구성분들, BCG-유도된 리포아라비도만난 또는 BCG 성분들, 대장균으로부터 유도된 리포폴리사카라이드(LPS), 또는 비활성화된 그람 양성 또는 그람 음성 미생물, 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 특히, 4-아미노-2-에톡시메틸-x-디메틸-lH-이미다졸 [4,5-c] 퀴놀린-1-에탄올 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조 [4,5-c] 퀴놀린-4-아민 또는 이의 유도체, 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리I:C, 천연 이중 가닥 RNA 또는 RNA 바이러스 또는 RNA의 단편들, 또는 합성 유사체 또는 비-메틸화된 CpG 모티프를 포함하는 합성 또는 천연 핵산 분자, 사이토킨 복합물, 바람직하게는 종양 괴사 인자 α(TNF-α), IL-1, IL-6 또는 프로스타글라딘 E6, DC40L, 바람직하게는 재조합 CD40L 또는 CD40L 도메인을 포함하는 융합 단백질, 또는 CD40L를 발현시키기 위해 유전적으로 조작된 1차 세포 또는 세포 주 또는 T-림프구와 같은 CD40L의 발현을 생리학적으로 상향 조절하는 활성화된 T-림프구로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조제물.
- 제 1 항 내지 제 3 항중 임의의 한 항에 있어서, 조절 단계 (b) 전에, 미성숙 수지상 세포에 최소 2시간, 바람직하게는 최소 4시간, 더욱 바람직하게는 최소 6시간, 특히 최소 12시간, 최대 24시간 동안 최소 하나의 수지상 세포 성숙 물질과 접촉시켜, 부분적으로 성숙된 수지상 세포가 제공되는, 약학 조제물.
- 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 미성숙 또는 부분적으로 성숙된 수지상 세포에 최소 하나의 항원을 로딩시키는, 약학 조제물.
- 제 5 항에 있어서, 최소 하나의 항원은 a) 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 임의의 기타 인간 미생물 또는 기생충 병인균으로 구성된 군 ; 또는 b) 알레르기, 발병의 원인이 되는 면역 반응의 개시에 대응하는 자가-항원 또는 이식 항원으로 구성된 군에서 선택되는, 약학 조제물.
- 다음의 단계를 포함하는 수지상 세포를 생산하는 방법;
a) 미성숙 수지상 세포를 제공하고;
b) IL-12를 분비하는 능력으로 정의되는, 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)을 만들기 위하여 미성숙 수지상 세포에 최소 하나의 수지상 세포 성숙물질을 접촉시켜고;
c) (b) 단계의 세포, 특히 IL-12를 방출하는 부분적으로 성숙된 수지상 세포 (반-성숙 DC, smDC)는 T-림프구 억제성 분자의 발현이 저해 또는 방지되도록 조작되되는데, 여기서 조작은 LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포내에서 작용하는, 또는 LPS/IFN-γ와 같은 1차 성숙물질에 노출된 수지상 세포로부터 방출된, 그리고 인터루킨 10 (IL-1O), 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(IDO) 그리고 표 3, 4 또는 5에서 제시되는 유전자들중 최소 하나로 구성된 군에서 선택되는, 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현은 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자는 이를 인코드하는 유전자 또는 이의 단편을 녹아웃시키거나 또는 수지상 세포내에서 활성을 가지는 또는 수지상 세포로부터 운반된 최소 하나의 T-림프구 억제성 분자의 발현을 저해 또는 방지시키기 위하여 핵산 분자, 바람직하게는 리보핵산 분자를 T세포로 도입시켜 이루어진다. - 제 7 항에 있어서, 미성숙 수지상 세포의 선구세포 또는 미성숙 수지상 세포 또는 부분적으로 성숙된 수지상 세포는 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈 또는 말초 혈관으로부터 수득된, 방법.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 최소 하나의 DC 성숙 물질은 열에 의해 비활성화된 또는 포르말린-처리된 바실러스 칼메트-게린(BCG), 바람직하게는 BCG의 세포벽 구성분들, BCG-유도된 리포아라비도만난 또는 BCG 성분들, 대장균으로부터 유도된 리포폴리사카라이드(LPS), 또는 비활성화된 그람 양성 또는 그람 음성 미생물, 이미다조퀴놀린 화합물, 바람직하게는 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 특히, 4-아미노-2-에톡시메틸-x-디메틸-lH-이미다졸 [4,5-c] 퀴놀린-1-에탄올 또는 1-(2-메틸프로필)-lH-이미다조 [4,5-c] 퀴놀린-4-아민 또는 이의 유도체, 합성 이중 가닥 폴리리보뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리I:C, 천연 이중 가닥 RNA 또는 RNA 바이러스 또는 RNA의 단편들, 또는 합성 유사체 또는 비-메틸화된 CpG 모티프를 포함하는 합성 또는 천연 핵산 분자, 사이토킨 복합물, 바람직하게는 종양 괴사 인자 α(TNF-α), IL-1, IL-6 또는 프로스타글라딘 E6, DC40L, 바람직하게는 재조합 CD40L 또는 CD40L 도메인을 포함하는 융합 단백질, 또는 CD40L를 발현시키기 위해 유전적으로 조작된 1차 세포 또는 세포 주 또는 T-림프구와 같은 CD40L의 발현을 생리학적으로 상향 조절하는 활성화된 T-림프구로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제 7 항 내지 제 9 항중 임의의 한 항에 있어서, 조절 단계 (b) 전에, 미성숙 수지상 세포에 최소 2시간, 바람직하게는 최소 4시간, 더욱 바람직하게는 최소 6시간, 특히 최소 12시간, 최대 24시간 동안 최소 하나의 수지상 세포 성숙 물질과 접촉시켜, 부분적으로 성숙된 수지상 세포가 제공되는, 방법.
- 제 7 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 미성숙 또는 부분적으로 성숙된 수지상 세포에 최소 하나의 항원을 로딩시키는, 방법.
- 제 11 항에 있어서, 최소 하나의 항원은 a) 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 임의의 기타 인간 미생물 또는 기생충 병인균으로 구성된 군 ; 또는 b) 알레르기, 발병의 원인이 되는 면역 반응의 개시에 대응하는 자가-항원 또는 이식 항원으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
- 제 7 항 내지 제 12 항중 임의의 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 수지상 세포.
- 제 13 항에 따른 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물.
- 제 13 항에 따른 수지상 세포, 또는 제 1 항 내지 제 6항중 임의의 한 항에 따른 조제물을 암 및/또는 미생물 또는 기생충 감염 치료 또는 방지; 또는 알레르기, 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방 또는 줄기 세포 또는 기관 이식 거부 치료 및/또는 예방을 위한 약물 제조에 사용되는 용도.
- 제 15 항에 있어서, 방사능요법 및/또는 항-종양 또는 항균 화학요법 또는 알레르기, 자가면역 질환 또는 줄기세포 또는 기관 이식 거부를 치료 목적으로 하는 임의의 요법 전에, 또는 이들 요법과 동시에 또는 이들 요법에 후속적으로 개체에 투여되는, 용도.
- 제 13 항에 따른 수지상 세포 또는 제 1 항 내지 제 6 항중 임의의 한 항에 따른 조제물은 알레르겐과 같은 환경 항원에 대항하여 또는 자가면역 질환의 과정에서 자가 항원에 대항하여 면역 시스템의 병인성 과다 반응으로 인한 면역학적 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물 제조에 사용되는 용도.
- 제 17 항에 있어서, 약물은 알레르기 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 기타 요법 전, 이와 동시에 또는 후속적으로 개체에 투여되는, 용도.
- 제 13 항에 따른 수지상 세포 또는 제 1 항 내지 제 6 항중 임의의 한 항에 따른 조제물은 동종이계 줄기 세포 이식물의 면역학적 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 약물에 이용되는 용도, 적절하게는 혈액 종양의 치료에 이용되는 용도 또는 동종이계 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는 용도.
- 제 19 항에 있어서, 이 약물은 동종이계 줄기 세포 또는 기관 이식물의 거부를 치료 또는 예방하는 것을 목적으로 하는 다른 요법 전에, 동시에 또는 후속적으로 개체에 투여되는, 용도.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP07450233.7 | 2007-12-12 | ||
EP07450233A EP2072617A1 (en) | 2007-12-12 | 2007-12-12 | Method for producing dendritic cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20100101094A true KR20100101094A (ko) | 2010-09-16 |
KR101590199B1 KR101590199B1 (ko) | 2016-01-29 |
Family
ID=39325869
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020107011455A KR101590199B1 (ko) | 2007-12-12 | 2008-12-12 | 수지상 세포를 생산하는 방법 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9303246B2 (ko) |
EP (2) | EP2072617A1 (ko) |
JP (1) | JP5730577B2 (ko) |
KR (1) | KR101590199B1 (ko) |
CN (1) | CN101896601B (ko) |
AU (1) | AU2008334914B9 (ko) |
BR (1) | BRPI0819936A2 (ko) |
CA (1) | CA2709209C (ko) |
EA (1) | EA023106B1 (ko) |
MX (1) | MX2010006434A (ko) |
NZ (1) | NZ585898A (ko) |
WO (1) | WO2009074341A1 (ko) |
ZA (1) | ZA201003193B (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016010228A1 (ko) * | 2014-07-14 | 2016-01-21 | 동아대학교 산학협력단 | 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법 |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2347774B1 (en) | 2005-12-13 | 2017-07-26 | The President and Fellows of Harvard College | Scaffolds for cell transplantation |
WO2009002401A2 (en) | 2007-06-21 | 2008-12-31 | President And Fellows Of Harvard College | Scaffolds for cell collection or elimination |
EP2072617A1 (en) * | 2007-12-12 | 2009-06-24 | Trimed Biotech GmbH | Method for producing dendritic cells |
US10328133B2 (en) | 2008-02-13 | 2019-06-25 | President And Fellows Of Harvard College | Continuous cell programming devices |
US9370558B2 (en) | 2008-02-13 | 2016-06-21 | President And Fellows Of Harvard College | Controlled delivery of TLR agonists in structural polymeric devices |
WO2011063336A2 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | President And Fellows Of Harvard College | Secondary site of antigen stimulation for therapeutic vaccination |
US9012399B2 (en) | 2008-05-30 | 2015-04-21 | President And Fellows Of Harvard College | Controlled release of growth factors and signaling molecules for promoting angiogenesis |
WO2010120749A2 (en) | 2009-04-13 | 2010-10-21 | President And Fellow Of Harvard College | Harnessing cell dynamics to engineer materials |
WO2011014871A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | President And Fellows Of Harvard College | Programming of cells for tolerogenic therapies |
US9610328B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-04-04 | President And Fellows Of Harvard College | Enhancement of skeletal muscle stem cell engraftment by dual delivery of VEGF and IGF-1 |
EP2547360A4 (en) * | 2010-03-15 | 2013-11-20 | Univ Pennsylvania | SYSTEM AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND STORAGE OF ACTIVATED TIRES OF DENDRITIC CELLS |
US9693954B2 (en) | 2010-06-25 | 2017-07-04 | President And Fellows Of Harvard College | Co-delivery of stimulatory and inhibitory factors to create temporally stable and spatially restricted zones |
JP6104806B2 (ja) | 2010-10-06 | 2017-03-29 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 材料に基づく細胞治療のための注射可能孔形成性ハイドロゲル |
WO2012064697A2 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | President And Fellows Of Harvard College | Materials presenting notch signaling molecules to control cell behavior |
WO2012148684A1 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | President And Fellows Of Harvard College | Cell-friendly inverse opal hydrogels for cell encapsulation, drug and protein delivery, and functional nanoparticle encapsulation |
US9675561B2 (en) | 2011-04-28 | 2017-06-13 | President And Fellows Of Harvard College | Injectable cryogel vaccine devices and methods of use thereof |
US10045947B2 (en) | 2011-04-28 | 2018-08-14 | President And Fellows Of Harvard College | Injectable preformed macroscopic 3-dimensional scaffolds for minimally invasive administration |
US9486512B2 (en) | 2011-06-03 | 2016-11-08 | President And Fellows Of Harvard College | In situ antigen-generating cancer vaccine |
EP2838515B1 (en) | 2012-04-16 | 2019-11-20 | President and Fellows of Harvard College | Mesoporous silica compositions for modulating immune responses |
EP2787005A1 (en) | 2013-04-02 | 2014-10-08 | Activartis Biotech GmbH | Targeted cancer immune therapy |
JP7348708B2 (ja) | 2014-04-30 | 2023-09-21 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 組み合わせワクチン装置および癌細胞を殺滅する方法 |
US10350279B2 (en) * | 2014-06-23 | 2019-07-16 | Jw Creagene Inc. | Method for preparing dendritic cells with increased specific gene expression, and composition for treating or preventing autoimmune diseases, containing dendritic cells prepared using same |
JP7012432B2 (ja) | 2014-07-14 | 2022-01-28 | 中外製薬株式会社 | タンパク質のエピトープを同定するための方法 |
CN105821029A (zh) * | 2015-01-04 | 2016-08-03 | 彭霞 | 异源融合基因修饰的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法 |
CN105821030A (zh) * | 2015-01-04 | 2016-08-03 | 彭霞 | 表达α1,3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法 |
CN104630145A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-20 | 杨世成 | 一种抗肿瘤t细胞、其制备方法和抗肿瘤药物 |
EP3250250A4 (en) | 2015-01-30 | 2019-05-22 | President and Fellows of Harvard College | PERITUMORAL AND INTRATUMORAL MATERIALS FOR CANCER THERAPY |
JP7094533B2 (ja) | 2015-04-10 | 2022-07-04 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 免疫細胞捕捉デバイスおよびその製造および使用方法 |
CN114774356A (zh) | 2015-06-30 | 2022-07-22 | 西北生物治疗药物公司 | 诱发改善的或增加的抗肿瘤免疫应答的经最佳活化的树突细胞 |
CN108291204A (zh) * | 2015-09-15 | 2018-07-17 | 西北生物治疗药物公司 | 涉及用于患有晚期癌症的受试者的经活化树突状细胞组合物和免疫治疗处理的方法 |
CN105219721A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-01-06 | 上海隆耀生物科技有限公司 | 一种用于激活胰腺癌特异性免疫反应的试剂盒 |
CN105219720A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-01-06 | 上海隆耀生物科技有限公司 | 一种用于激活肝癌特异性免疫反应的试剂盒 |
CN105219714A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-01-06 | 上海隆耀生物科技有限公司 | 一种用于激活肺癌特异性免疫反应的试剂盒 |
CN105219715A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-01-06 | 上海隆耀生物科技有限公司 | 一种用于激活食管癌特异性免疫反应的试剂盒 |
JP7171433B2 (ja) * | 2015-10-30 | 2022-11-15 | ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ, アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー, デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | Her-2発現固形腫瘍の処置のための組成物および方法 |
JP7138864B2 (ja) | 2016-02-06 | 2022-09-20 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 免疫を再構成するための造血ニッチの再現 |
CN109789092A (zh) | 2016-07-13 | 2019-05-21 | 哈佛学院院长等 | 抗原呈递细胞模拟支架及其制备和使用方法 |
AU2017431122B2 (en) * | 2017-09-05 | 2021-09-02 | Medigene Immunotherapies Gmbh | Dendritic cell potency assay |
CN109468275B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-01-08 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与应用 |
CN114032212B (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-19 | 北京荟科柘生物科技有限公司 | 一种提高抗原呈递t细胞并提高t细胞杀伤效率的dc细胞制备方法及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060177420A1 (en) * | 2002-09-13 | 2006-08-10 | Forschungsinstitut Fur Krebskranke Kinder | Use of dendritic cells (dcs) expressing interleukin 12 (il-12) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2766205B1 (fr) | 1997-07-16 | 2002-08-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede |
EP1551983A2 (en) * | 2002-10-18 | 2005-07-13 | CropDesign N.V. | Identification of e2f target genes and uses thereof |
CN102600461B (zh) * | 2002-12-06 | 2017-07-14 | 西北生物治疗药物公司 | 给予体外部分成熟的树突细胞治疗肿瘤 |
US8513008B2 (en) * | 2004-10-07 | 2013-08-20 | Argos Therapeutics, Inc. | Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same |
TWI382843B (zh) * | 2004-10-07 | 2013-01-21 | Argos Therapeutics Inc | 成熟樹突細胞組合物及培養彼等之方法 |
US8440610B2 (en) * | 2004-11-12 | 2013-05-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Mapkap kinase-2 as a specific target for blocking proliferation of P53-defective cells |
EP2072617A1 (en) * | 2007-12-12 | 2009-06-24 | Trimed Biotech GmbH | Method for producing dendritic cells |
-
2007
- 2007-12-12 EP EP07450233A patent/EP2072617A1/en not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-12-12 EP EP08859543.4A patent/EP2222836B1/en active Active
- 2008-12-12 US US12/747,759 patent/US9303246B2/en active Active
- 2008-12-12 MX MX2010006434A patent/MX2010006434A/es active IP Right Grant
- 2008-12-12 JP JP2010537327A patent/JP5730577B2/ja active Active
- 2008-12-12 EA EA201000972A patent/EA023106B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-12-12 CN CN200880120431.4A patent/CN101896601B/zh active Active
- 2008-12-12 WO PCT/EP2008/010606 patent/WO2009074341A1/en active Application Filing
- 2008-12-12 NZ NZ585898A patent/NZ585898A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-12-12 KR KR1020107011455A patent/KR101590199B1/ko active IP Right Grant
- 2008-12-12 AU AU2008334914A patent/AU2008334914B9/en active Active
- 2008-12-12 BR BRPI0819936-1A patent/BRPI0819936A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-12-12 CA CA2709209A patent/CA2709209C/en active Active
-
2010
- 2010-05-06 ZA ZA2010/03193A patent/ZA201003193B/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060177420A1 (en) * | 2002-09-13 | 2006-08-10 | Forschungsinstitut Fur Krebskranke Kinder | Use of dendritic cells (dcs) expressing interleukin 12 (il-12) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016010228A1 (ko) * | 2014-07-14 | 2016-01-21 | 동아대학교 산학협력단 | 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2222836B1 (en) | 2017-02-22 |
BRPI0819936A2 (pt) | 2015-05-26 |
NZ585898A (en) | 2012-01-12 |
EA023106B1 (ru) | 2016-04-29 |
KR101590199B1 (ko) | 2016-01-29 |
CN101896601B (zh) | 2014-09-03 |
WO2009074341A1 (en) | 2009-06-18 |
US9303246B2 (en) | 2016-04-05 |
JP5730577B2 (ja) | 2015-06-10 |
AU2008334914A1 (en) | 2009-06-18 |
EP2072617A1 (en) | 2009-06-24 |
EP2222836A1 (en) | 2010-09-01 |
ZA201003193B (en) | 2011-10-26 |
MX2010006434A (es) | 2011-05-02 |
AU2008334914B9 (en) | 2013-09-26 |
EA201000972A1 (ru) | 2010-12-30 |
CN101896601A (zh) | 2010-11-24 |
CA2709209A1 (en) | 2009-06-18 |
JP2011506372A (ja) | 2011-03-03 |
CA2709209C (en) | 2019-05-21 |
AU2008334914B2 (en) | 2013-08-01 |
US20100285072A1 (en) | 2010-11-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101590199B1 (ko) | 수지상 세포를 생산하는 방법 | |
KR101408565B1 (ko) | T 세포 집단의 제조 방법 | |
JP2020110172A (ja) | 免疫賦活抗原提示細胞を得るためのデバイスおよび方法 | |
US20090297541A1 (en) | Maturation of dendritic cells | |
KR20140052991A (ko) | 항원-특이적 t 세포의 증식 방법 | |
WO2009045308A2 (en) | Enhanced generation of cytotoxic t-lymphocytes by il-21 mediated foxp3 suppression | |
US20190381158A1 (en) | Cell-based vaccine compositions and methods of use | |
US20120082687A1 (en) | Use of cell adhesion inhibitor for the mobilization of antigen presenting cells and immune cells in a cell mixture (AIM) from the peripheral blood and methods of use | |
US20230151384A1 (en) | Nf-kb signalign pathway-manipulated dendritic cells | |
JP2022062074A (ja) | Her2/Neu (ERBB2)受容体タンパク質に由来する369~377位エピトープに特異的な完全ヒトT細胞受容体 | |
WO2009119874A1 (ja) | 単球から樹状細胞様分化を誘導し、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物 | |
KR20180022949A (ko) | 향상되거나 증가된 항-종양 면역 반응을 유도하는 최적으로 활성화된 수지상 세포 | |
KR101506426B1 (ko) | 화학적 고정화를 통해 안정화된 미세 막상 t 세포 백신 제조방법 | |
WO2016135286A1 (en) | Method for stimulating dendritic cells (dcs) | |
RU2420307C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИРУЮЩИХ TGF-бета1 ПЕПТИДОВ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МОДУЛИРУЮЩЕГО ИММУННЫЙ ОТВЕТ АГЕНТА | |
Schumak | Regulation of innate and adaptive immune responses by Toll-like receptor ligands | |
Liebig | Assessment of the Antigen-presenting Function of murine B cells in vivo: Induction of anti-Tumour-Immunity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190118 Year of fee payment: 4 |