MX2010006434A

MX2010006434A - Metodo para producir celulas dendriticas.

Info

Publication number: MX2010006434A
Application number: MX2010006434A
Authority: MX
Inventors: Thomas Felzmann; Alexander Michael Dohnal
Original assignee: Trimed Biotech Gmbh
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2011-05-02
Also published as: KR101590199B1; CA2709209C; EP2222836A1; CN101896601B; NZ585898A; EA201000972A1; AU2008334914B2; JP2011506372A; CA2709209A1; EA023106B1; US9303246B2; EP2222836B1; CN101896601A; KR20100101094A; AU2008334914A1; WO2009074341A1; ZA201003193B; AU2008334914B9; JP5730577B2; BRPI0819936A2

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir células dendríticas y su uso en medicamentos mediante creación por ingeniería genética que tiene como finalidad mejorar funcionalmente su eficiencia terapéutica en el tratamiento de cáncer, infecciones microbianas, alergias, enfermedades autoinmunitarias o rechazo de trasplante de {órganos y células madre.

Description

METODO PARA PRODUCIR CELULAS DENDRÍTICAS Campo de la Invención lia presente invención se refiere a un método para producir y crear por ingeniería genética células dendríticas (DC, por sujs siglas en inglés) y usos de las mismas Antecedentes de la Invención durante los últimos años, se han reconocido a las células dendríticas (DC) como el regulador central de inmunidad . Las DC humanas se generan por diferenciación in vitro a partir de células madre hematopoyéticas o monocitos de sangre periférica en la presencia de factores de crecimiento típicamente interleucina (IL) 4 y el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) . La evidenci a reciente sugiere que las DC tienen la capacidad de responde r de manera flexible a la confrontación de estrés microbiano, traumático o metabólico. De esta manera, las DC no sólo se diferencian en un subtipo que cumple una función particular, por ejemplo, activación o tolerancia, polarización de linfocitos T auxiliares tipo 1 o tipo 2 (Thl, Th2), sino que asumen distintos estados funcionales de una manera cinética temporal, apropiada a los estímulos encontrados en un ambiente determinado (Figura 1.) Los monocitos dejan la corriente sanguínea para entrar varios tejidos y llegan ser lo que convencionalmente se refiere como DC inmaduras (iDC) . Estas iDC son s |eñalizadores que muestrean su ambiente al tomar material del fluido extracelular así como cuerpos apoptóticojs de células fisiológicamente agonizantes, procesan ¾ presentan este material sin co-estimulación en una forma inductora de tolerancia a los linfocitos T. El fenotipo de iDC, inductor de tolerancia, h se puede considerar el estado por omisión de las DC . Este estado se mantiene hasta que las iDC encuentran una señal de peligro que puede :ser un patrón molecular asociado a patógeno (PAMP) transmitido por receptores tipo cuota (TLR) , citocinas inflamaton.as , o señalización derivada de linfocitos T, más predominantemente mediado por interacción CD40/CD40L. Este proceso se refiere como maduración de DC, que coincide con una secuéjncia de cambios funcionales. Estos cambios funcionales toman lugar durante un período de aproximadanjiente 2 días después de lo cual las DC alcanzan un estado que se refiere como DC maduras (mDC) . De manera más prominente, las DC empiezan a favorecer la expresión de moléculas do-estimuladoras tal como los miembros CD80 y CD86 de la fami [Lia B7. Esto permite que las DC distribuyan una señal actiyadora en lugar de supresora a los linfocitos T que ienen un receptor de células T capaz de interactuar con un péptido antigénico en un complejo con moléculas del complejo p!rincipal de histocompatibilidad ( HC) en las membranas de las DC . En esta etapa, también toma lugar la polarización dependiente del estímulo, con las DC que segregan IL-12 así como citocinas de la familia IL-12 que favorecen una respuesta inmunitaria tipo 1 que soporta de manera subsiguiente la inmunidad celular mediada por linfocitos T citotóxicos (CTL) . En general, la secreción de IL-12 se activa por acoplamiento de los TLR con sus ligandos, por ejemplo el acoplamiento de TLR4 con LPS, pero también interacción de moléculas CD40L unidas a membrana celular, solubles, con CD40 en las DC. En contraste, la ausencia liberación de IL-12 activa una polarización tipo 2 que injicia una respuesta inmunitaria humoral por linfocitos ÍB de soporte. El inicio de la maduración de DC sin la secreción de IL-12 se logra por la exposición de las iDC con cócteles de citocinas que contienen típicamente TNF-a y PG-E2 así como varias citocinas inflamatorias que incluyen peio no se limitan a interferones tipo I y II, IL-l o IL-6.

La liberación de IL-12 cesa después aproximadamente 24 horas indicando que necesita tomar lugar el encuentro! entre las DC y los linfocitos T dentro de esa ventana de tiempo para permitir una polarización tipo 1 eficiente y la activación de los CTL. En contraste, la expresión de moléculas co-estimuladoras alcanza su máximo después de 2 días. Puesto que por definición una DC madura que tienen por finalidad la estimulación inmunitaria tal como su uso en terapia inmunitaria contra cáncer o el tratamiento de enfermedades metabólicas.

Es importante distinguir entre DC inmaduras (que mantienen | tolerancia) , DC semi -maduras inmunoestimuladoras ) , y DC maduras ( inmunosupresoras ) (Figura 1) . Una iDC como se resume anteriormente mantiene tolerancia contra autoantígenos . Una smDC que han encontrado uno de los estímulos de maduración descritos anteriormente, se compróme, irreversiblemente a la diferenciación en mDC en el espacio de aproximadamente 2 días. De manera importante, sólo durantíe los primeros de estos dos días es capaz de la liberación de IL-12, del inicio de polarización inmunitaria tipo I y en consecuencia del soporte de una respuesta inmunitaria mediada por los CTL . Una vez que una DC en maduración entra a la segunda fase de diferenciación después de un día, adquiere propiedades inmunosupresoras. Es convencional entre los inmunologos caracterizar una mDC por la expresión de las moléculas de membrana tal como CD80, CD83, o CD85. Sin embargo, en contraste a IL-12 que alcanza la expresión máxima en el espacio de unas pocas horas y se pierde después de 24 horas, estas moléculas de membrana alcanzan su expresión máxima solo después de 48 horas. A fin de distingujir claramente las DC que segregan IL-12 que se describen presente de lo que se entiende a) proporcionar células dendríticas inmaduras o células precursoras de las mismas o células dendríticas parcialmente maduradas obtenibles al poner en contacto células dendríticas inmaduras con al menos un agente de maduración de células dendríticas, para producir células dendríticas parcialmente maduradas (DC semi -maduras , smDC) como se definen por su capacidad para segregar IL-12, b) manipular las células del paso a) , en particular las células dendríticas parcialmente maduradas (DC semi-majduras , smDC) que liberan IL-12 del paso a) , para ( ?) sobreexpresar al menos una molécula inmunitarial capaz de mantener la capacidad estimuladora de linfocitos T, de las células dendríticas, caracteriza por secreción continua de IL-12 durante al menos 24 horas, preferentemente al menos 48 horas y seleccionadas del grupo que consiste de DC40L al introducir moléculas de ácido nucleico que codifican para al menos una molécula; y/o (ii) inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula supresora de linfocitos T que actúa dentro de células dendríticas expuestas a un agente primario de maduración tal como LPS/IFN-? o que se liberen de células dendríticas expuestas a un agente primario de maduración tal como LPS/lFÑ-? y que se liberen del grupo que consiste de interleucina 10 (IL-10) , indolamina-2 , 3 -dioxigenasa (IDO), tal como al menos uno de los genes dados en las tablas 3, 4 y/o 5 al suprimir el gen o un fragmento del mismo que codifica para al menos una molécula supresora de linfocitos al introducir moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ácido ribunucleico, para inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula supresora de linfocitos T que es activa dentro de la célula dendrítica o se deriva de las células dendríticas a células T, y adicionar opcionalmente sustancias para transformas las células precursoras de células dendríticas en células dendríticas .

La preparación farmacéutica de acuerdo a la presente invención comprende células dendríticas obtenibles por los méitodos descritos en la presente. Las células dendríticas que se someten a ingeniería genética tienen como finalidad la sobreexpresion de moléculas que contribuyen a la estimulación inmunitaria tal como CD40L o ingeniería genética que tiene como finalidad el silenciamiento de la expresión de; células inmunosupresoras tal como IL-10 o IDO, y las moléculas recién identificadas listadas en las tablas 3, 4 y 5 posteriores, que muestran una cinética de expresión en DC similar a IL-10 e IDO. La ingeniería genética se puede realizar en cualquier DC o células precursoras, tal como células madrle hematopoyéticas , no importa si estas células dendríticas expongan a un agente de maduración tal como dendrítica¦3 expuestas a un agente primario de maduración tal como LPS/I FN-? y que se selecciona el grupo que consiste de interleucina 10 (IL-10), e indolamina-2 , 3 -dioxigenasa (IDO), tal como uno de los genes dados en las tablas 3 y 4, al suprimir 1 gen o un fragmento del mismo que codifica para al menos una molécula supresora de linfocitos T o al introduci moléculas de ácido nucleico, preferentemente léculas de ácido ribonucleico, para inhibir o prevenir expréssi:ón de al menos una molécula supresora de linfocitos que es activa dentro de las célula dendrítica o se distribuye desde las células dendríticas a células T.

Las DC creadas por ingeniería genética, que liberan IL-12 del paso b) de los métodos descritos anteriormer.te, sobreexpresan al menos una molécula capaz de extender la ventana de tiempo de estimulación de linfocitos T y/o de prevenir completamente su cierre después de 24 horas, caracterizadas por secreción mantenida durante más de 24 horas al introducir una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula inmunoestimuladora; o muestran una expresión inhibida o reducida de al menos una molécula que está comprendida en el progreso normal de desarrollo de una DC después de la exposición a cualquier estímulo efectivo de maduración del estímulo de linfocitos T en una ventana de tiempo de supresión de linfocitos T que iinniicciiaa llaa abertura 24 horas después de la maduración; y/o inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula que cumple una función en mediar la supresión de linfocitos T por las DCj que se ha desarrollado para asumir un fenotipo inmunosuprésor. Esto se logra al suprimir el gen o un fragmento cjlel mismo que codifica para al menos una molécula y/o al introducir moléculas de ácido nucleico preferentemente moléculas de ácido ribonucleico, para inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula que interfiere con el desarrollo normal de las DC después de la exposición | a un estímulo de maduración de una inmunoestimulación a un fenotipo inmunosuprésor; interferir con las señales que se distribuyen desde las DC a las células T provocando la supresión de la actividad de esta célul?. T y suprimiendo de este modo una respuesta inmunitaria Las células dendríticas de la presente invención aumenta al máximo la estimulación de linfocitos T, particularmente la activación de los CTL al usar ingeniería genética para amplificar la ventana de tiempo de estimulación de aproximadamente 24 horas o impedir completamente el cierre de esta ventana de tiempo de estimulación después de 24 horas. De manera alternativa a IL-10 o IDO, se pueden usar otras moléculas que están comprendidas en la función inmunosupresora de las DC que inicia aproximadamente 24 horas después de la exposición a cualquier estímulo de maduración (tablas 3, 4 y 5) . Serán de las DC y/o al sobreexpresar moléculas que confieren supresión de linfocitos T al crear por ingeniería genética las DC de acuerdo a las estrategias resumidas anteriormente .

El uso de las smDC como una diana u objetivo para manipulación genética es una parte central crítica de la presente invención. Los efectos inmunoestimuladores de las mDC que ¡e publicaron en el pasado son principalmente debidos escenario experimental altamente artificial en el cual se realizaron muchos de estos experimentos, por ejemplo el uso de; péptidos sintéticos, que no existen en la naturaleza , en lugar de las dianas reales de las DC: moléculas de antígeno de proteína nativa o aún células enteras, ambas de las cuales requieren mecanismos completamente diferentes de captación y procesamiento por las DC. Muchos otros investigadores usaron el sistema murino para su estigación y hay diferencias críticas entre los humanos ratones lo que provoca mucha confusión. Sin embargo, ahora se acepta en general que las mDC tienen propiedades inmunosupresoras . De manera sorprendente, resulta que las células dendríticas obtenidas con el método de acuerdo a la presente invención exhiben una ventana estimuladora más amplia (es decir, expresión incrementada y prolongada Cíe IL-12) . Se encontró que la ingeniería genética de una DC semi -madura (sm) - una DC en la cual el proceso de función as¡ociada. El principio general en el desarrollo de medicinas inmunitarias de DC estimuladoras por lo tanto puede ser para amplificar la ventana inmunoestimuladora temprana a fin de activar más efectivamente la inmunoactilación y reducir o cerrar la ventana inmunosuprásora posterior, o viceversa para diseñar una medicina inmunitaria de DC, supresora (Figura 1) .

En general, para producir una medicina de DC, inmunoestimuladora ("medicina inmunitaria de DC" ; "medicina inmunitaria,") para el tratamiento por ejemplo de cáncer o enfermedadqs infecciosas, se necesita aplicar un estímulo inicial de maduración tal como LPS/IFN-? a las DC a fin de iniciar la diferenciación fisiológica desde las iDC a las smDC. Otros ligandos de TLR (tabla 1) pueden servir para el mismo propósito como LPS; las combinaciones de ligandos de TLR pueden dar una señal más fuerte pero no cualitativamente diferente . Si el potencial estimulador de una medicina inmunitaria! de DC, estimuladora de linfocitos T, se basa sólo en la manipulación artificial de la transferencia génica sin la exposición inicial a un estímulo de maduración mediado po:: ligando de TLR (por ejemplo por ingeniería genética directa de las DC inmaduras) , se perderán contribuciones importantes a la función de las DC y no puede alcanzar si. potencial completo la medicina inmunitaria de DC, estimuladora de linfocitos T. Una diferencia crítica de medicina inmunitaria de DC, creada por ingeniería, de acuerdo a a presente invención a una medicina inmunitaria de DC que |se produce sólo por la exposición a un agente de maduración o combinaciones del mismo, por ejemplo LPS/lFN-? (smDC) , es que para esta última es crítica que la medicina inmunitaria de smDC se aplique durante la breve ventana correspondíente de diferenciación de DC. Esta medicina inmunitarial de DC, estimuladora, por lo tanto, se tiene que aplicar de manera temprana después de la exposición al estímulo de maduración, en tanto que la ingeniería genética, por ejemplJo, por sobreexpresión de CD40L tiene como finalidad ampliar la ventana de tiempo inmunoestimuladora de diferenciación de DC que permita una aplicación crítica de menos tiempo pero prevenga de manera más importante desarrollo de las DC de una inmunoestimulacion a un fenotipo inmunosupresor (Figura 1) . Se puede lograr una mejora comparable de la capacidad inmunoestimuladora de las DC al suprimir moléculas sospechosas de estar comprendidas de manera crít:.ca en la inmunosupresión como se indica por un perfil de expresión que es similar a la expresión de las moléculas inmunosupresoras conocidas IL-10 O IDO (listadas en las Figuras 3, 4 y 5); o células que se ha mostrado ya que están comprendidas en la inmunosupresión, puesto que al silenciarlasl en las DC se da por resultado capacidad estimuladoral mejorada de células T de las DC creadas por ingeniería (Figura 9) . También, la ventana de tiempo inmunoestimuladora de la medicina inmunitaria de smDC anterior cierra después de 24 horas, en tanto que la nueva medicina inmunitaria de DC, creada por ingeniería, mantendrá su potenci.al estimulador de linfocitos T durante al menos uno, preferentemente tres, pero hasta cinco días más tarde.

Un concepto comparable se mantiene valido para una medicina inmunitaria de DC, supresora de linfocitos T. Las DC inmaduras se necesitan exponer primero a un estímulo convencional1 de maduración, tal como LPS/IFN-?, a fin de iniciar la diferenciación hacia un fenotipo de mDC que corresponde a la ventana supresora de linfocitos T de diferenciac!ión de DC. La ingeniería genética para sobreexpres ar moléculas supresoras de linfocitos T de la medicina inmunitaria de DC se puede hacer antes de la maduración de las DC inmaduras por un estímulo de maduración tal como LPS/IFN-?, pero también cuando se activan células precursoras de las DC tal como monocitos de la sangre periférica , o células precursoras y madre, hematopoyéticas , especialmente pero no de manera exclusiva cuando se usan métodos de transferencia génica que dan por resultado integración estable en el genoma tal como transferencia génica retroviral . Además de la ingeniería genética antes de la expos ón al estímulo de maduración, la ingeniería genética puede hacer seis horas y hasta 48 horas después del inicicj de la maduración por ejemplo por LPS/IFN-?. Cuando las| DC inmaduras se crean por ingeniería genética para sobreexpresar moléculas inmunosupresoras , se perderán contribucicnes importantes por la capacidad fisiológica supresora q.e linfocitos T de las DC después de 24 horas de exposición a un estímulo de maduración, razón por la cual se preferirá la ingeniería genética de las DC sólo en combinaciónl con la exposición de estas DC antes (a un nivel de células precursoras) o después de la ingeniería genética a un estímulo de maduración tal como LPS/IFN-?. Sin ingeniería genética de una medicina inmunitaria de DC, supresora d'e linfocito T, se tiene que hacer la aplicación de esta medicina inmunitaria de DC, supresora, durante esa ventana de tiempo de diferenciación de DC en tanto que una medicina inmunitaria de DC, supresora de linfocitos T, creada por ingeniería genética para sobreexpresar moléculas que medían | la supresión de la actividad de linfocitos T permite una |administración mucho más flexible al paciente.

Tabla 1 : Liejandos de TLR Receptor que se presenta análogo moléculas de manera natural sintético pequeñas completamente sintéticas ligandos exeejenos TLR1 no determinado triacil- - lipopéptidos TLR2 lipoproteínas/ di- y triacil- lipopéptidos lipopéptidos peptidoglicano ácido lipoteicoico 1ipoarabinomanano atípico lipopolisacárido TLR3 RNA de doble polil :C - hebra TLR4 lipopolisacárido miméticos de lipido A HSP60 (Chlamydia LPS/lipido A, sintético, pneumonie) tal como MLP E5564 TLR5 flagelina péptido de 13 bacteriana aminoácidos discontinuo TLR6 no determinado diacil- - lipopéptidos TLR7 RNA de hebra oligosacáridos iraidazol individual rico quinolinas en (G+U) (sólo ( imiquimod, ratón) resiquimod) guanosina nucleótidos (loxoribina) TLR8 RNA de hebra imidazol individual rico quinolinas en (G+U) (sólo ( imiquimod) humano) TLR9 DNA bacteriano CpG-oligo- DNA viral nucleótidos otro DNA con secuencias CpG no metiladas Ligandos ende >genos TLR2 HSP70 - - TLR4 HSP60 oligosacáridos de ácido hialurónico moléculas supresoras de linfocitos T, la ventana inmunosupresora de diferenciación de DC se puede cerrar o hacer más strecha o mover a un punto posterior de tiempo, La factibílidad de este planteamiento se demuestra al silenciar la expresión de moléculas que interfieren con la activación de linfocitos T por las DC. La mejora de función de los linfocitos T al silenciar las señales supresoras de linfocitos T derivadas de DC, como por ejemplo la enzima I¡DO que metaboliza triptofano, de la cual dependen fuertementel los linfocitos T activados, en cinureninas que tiene efectos pro-apoptóticos en los linfocitos T activados, se muestras en la sección de ejemplo. Como un segundo ejemplo, se buscó como objetivo la expresión de IL-10, que se consider1'a la molécula inmunosupresora prototípica y que ssee eexxpprreessaa por las DC durante la ventana de tiempo de diferenciación inmunosupresora. A fin de silenciar la expresión de moléculas diana, se usa preferentemente la interferencia de RNA, pero otras tecnologías, tal como la expresión ir.tracelular de anticuerpos monoclonales de cadena individual o RNA anti-sentido, pueden servir para el mismo propósito. De manera alternativa, la sobre-expresión de moléculas (por ejemplo, IDO o IL-10) o moléculas similares puede servil' para diseñar una medicina inmunitaria de DC, supresora de linfocitos T, en base a las smDC pre-maduradas . Los resultados en la sección de ejemplos (Figura 9) muestran que el sil1enciamiento de la expresión de las moléculas que tienen una cinética de expresión comparable a IL-10 y/o IDO también da por resultado una capacidad estimuladora mejorada de células T de las DC creadas por ingeniería genética.

Ji¡a estructura y propiedades de una DC, se necesitan describir de manera dinámica, que tome en consideración las etapas de desarrollo de una DC. Cada una de estas etapas se puede caracterizar por ausencia o presencia |de ciertas moléculas marcadoras. Esto también indica que las características moleculares de una DC dependen de la etapa específica de diferenciación de esta DC y las condiciones que provocan que una DC asuma una cierta ruta de dif¡erenciación. La plasticidad de desarrollo de una DC también explica porque es ventajoso usar lo que se llama una DC tipo 1 semimadura (smDCl) ("células dendríticas activadorasi de células T caracterizadas por la liberación de ! interleucina 12") . Para iniciar el cambio de la función de mantenimiento de tolerancia a la etapa inmunoestimuladora , la DC necesita ser expuesta a un estímulo de maduración (agente de maduración de célula dendrítica) . Este abre la ventana de tiempo inmunoestimuladora durante la cual la DC libera más importantemente IL-12 como respuesta a la combinación de LPS e IFN-? o reactivos similares que se adicionan ajL cultivo de producción de DC. La IL-12 actúa mediante un receptor específico en linfocitos T auxiliares y hace que asuman un fenotipo Thl , que da por resultado soporte de inmunidad citolítica. A fin de permitir que esta interacción de DC/linfocito T y el desarrollo de inmunidad citolíticaj las DC se inoculan preferentemente en el organismo (por ejemplo, humano) en un punto de tiempo anterior dilirante la ventana inmunoestimuladora . Se prefiere de manera particular que las DC se inyecten 6 horas después del estímujLo de maduración. Obviamente, la inoculación se asocia con la remoción del medio de cultivo DC que contiene el agente de maduración de células dendríticas (por ejemplo, moléculas estimuladoras LPS e IFN-?) . Se transmite una señal suficientemente sostenible en la DC por unas exposición de 2, preferentemente 4, más preferentemente 6 horas a los agentes de maduración (por ejemplo, LPS e IFN-?) de modo que después de esta exposición la DC se consigna irreversiblemente a completar el proceso de maduración y no dependen por más tiempo de la presencia de los ligandos, es decir, de los agentes de maduración de DC. Sin embargo, oficialmente, en el momento de la aplicación, las DC no han completado su proceso de maduración, lo que toma 1-2 días El diseño dle las smDCl toma ventaja óptima de la ventana de tiempo esti|muladora durante las primeras 24 horas después del inicio de la maduración y antes de que se abra la ventana de tiempo inmunosupresora e inicie la modulación descendente de la respuesta inmunitaria.

En una fase temprana después de la exposición a un estímulo de maduración, tal como LPS/IFN-?, las DC poseen fuertes propiedades inmunoactivadoras (la ventana de activación J Figura 1) , en tanto que en etapas posteriores de su desarrollo entran a una fase inmunosupresora (la ventana supresora, Figura 1) . Están bien estudiados y entendidos los mecanismos moleculares de activación de células T. esta mucho meno¿ estudiada la naturaleza molecular y los eventos que inician los circuitos de retroalimentación, reguladores, negativos De esta manera, el diseño de la medicina inmunitari de DC de acuerdo a la presente invención tiene como final dad ampliar la ventana inmunoestimuladora para la mejora de la activación inmunitaria y el descenso en escala o cierre le la ventana inmunosupresora, bloqueando de este modo los circuitos de retroalimentación, reguladores, negativos en las DC. Esto se logró al crear por ingeniería genética DC ya sobre-expresar genes inmunoestimuladores además de exponerlos a agentes maduración de DC antes o después de la ingeniería genética, tal como LPS/IFN-?, o al silenciar genes inmunosupresores usando interferencia de RNA. La expresión de una multitud de genes inmunoestimuladores o inmunosupresores se puede modular siguiendo el mismo principio básico. La factibilidad de este planteamiento al sobre-expresar la molécula inmunoestimuladora CD40L o al silenciar las moléculas inducida por varios métodos, por lo que se prefiere modular estas expresiones al introducir moléculas de ácido nucleico como se resume anteriormente. Por ejemplo, la transferencia de la mol|¡écula de ácido nucleico se puede lograr con vehículos lentivirales de transferencia génica así como transíección mediada por liposomas. Sin embargo, el mismo principio 'será válido cuando se empleen otros vectores virales, tal como retrovirus o adenovirus, o vectores no virales, tal como pistola génica o tecnologías policatiónicas , o cuando se emplee cualquier otra transferencia génica.

Se han desarrollado varias estrategias para introducir genes extraños en células, incluyendo inyección directa de plásmidos o complejos de DNA-liposoma e infección con virus modificados. Sin embargo, la seguridad y eficiencia †on consideraciones importantes en el desarrollo de protocolos de terapia que usen estos métodos de transíerencia génica. Por ejemplo, las proteínas que son terapéuticas en el contexto de un tejido pueden ser peligrosas en otro. Por consiguiente, son particularmente deseabl os vectores transcripcionalmente dirigidos a dianas , pueden restringir la expresión de una secuencia terapéutica a células apropiadas. Adicionalmente , en algunos casos, puede haber una ventana terapéutica para ciertas proteínas, tal que los niveles de expresión por abajo o por arriba de ¿iertos umbrales pueden ser inefectivos o tóxicos, respectivamente. Por lo tanto, también sería deseable crear construcciones y diseñar métodos que permitan el control exógeno de la expresión, de modo que se pueda aumentar o disminuir los niveles de una proteína terapéutica de acuerdo a la necesidad terapéutica. e pueden usar métodos convencionales de transíerenqia génica con base viral y no viral para introducir ácidos nucleicos que codifican para las moléculas respectivas en las DC de la presente invención, o de manera alternativa|, ácidos nucleicos que inhiben la transcripción o traducción de estas moléculas, tal como siRNA o RNA anti-sentido. Lo|s sistemas de distribución de vectores no virales incluyen plásmidos de DNA, ácido nucleico desnudo, y ácido nucleico vuelto complejo con un vehículo de distribución tal como un liposoma. Los sistemas de distribución de vectores virales incluyen virus de DNA y RNA, que tienen ya sea genomas epi,¡omáticos o integrados después de la distribución a la célula. Para una revisión de los procedimientos de distribución, ver Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11 162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnologjy 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudeti , British Medical Bulletin 51(l):31-44 (1995); Haddada etj al . , in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bohm (eds) (1995); and Yu et al . , Gene Therapy 1 : iJ3-26 (1994) .

Ijambién se pueden usar moléculas de RNA de interferenqia pequeña. En células mamíferas, la introducción de dsRNA 1 argo (>30 nt) inicia frecuentemente una potente respuesta antiviral, ejemplificada por inhibición no específica de síntesis de proteína y degradación RNA. El fenómeno de interferencia de RNA se describe y analiza, por ejemplo, en\, Bass, Nature 411:428-29 (2001); Elbahir et al., Nature 411: 494-98 (2001); y Fire et al., Nature 391:806-11 (1998) , donde también se analizan métodos para producir RNA de interferencia. Las secuencias de siRNA usadas en la presente intención son preferentemente de menos de 100 pares de base, típicamente de 30 bp o más cortas, y se producen por métodos conocidos en la técnica. Los siRNA de ejemplo de acuerdo a la invención pueden tener hasta 29 pb, 25 pb, 22 pb , 21 pb, 20 pb, 19 pb, 15 pb, 10 pb, 5 pb o cualquier número enterra alrededor de estos o entre estos De acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, los precursores para la producción de DC inmaduras se| obtienen de la piel, bazo, médula ósea, timo, nodulos linf¡áticos, sangre de cordón umbilical, o de manera más preferente, de la sangre periférica. Las DC usadas en método de acuerdo a la presente invención se pueden aislar directamentte de una fuente respectiva o derivar de células progenitores . El experto en la técnica conoce los métodos respectivos Por ejemplo, se pueden aislar precursores de DC inmaduras al recolectar sangre periférica anti coagulada , células madre hematopoyéticas , por aféresis de leucocitos , o por preparación de capas leucocitarias , rosetas, centrifugación, centrifugación por gradiente de densidad por ejemplo, usando Ficoll) (tal como FICOLLPAQUE , PERCOLO (partículas de sílice coloidal (de 15-30 nm de diámetro) revestidas con polivinilpirrolidona (PVP) no dializable, sacarosa, y similares), lisis diferencial de células, fi ltración, etc. En ciertas modalidades, se puede preparar una población de leucocitos, tal como por ejemplo, al recolectar sangre de un sujeto, desfibrándola, removiendo las plaquetas, y lisando las células sanguíneas rojas. Se pueden usar precursores de DC, monocitos o progenitor mieloide o células madre para diferenciar las iDC. Los monocitos se pueden enriquecer opcionalmente de la sangre periférica , por ejemplo, aprovechando su capacidad para adherirse a superficies plásticas, centrifugación a través de un gra¡fíente de densidad, adsorción o lavado de anticuerpos monoclonales , centrifugación en contraflujo y similares, si las DC obtenibles por el método de acuerdo a la presente invención se usan para tratar individuos, las DC se selecciona de manera preferente del grupo que consiste del Bacilo Calmette-Guerin (BCG) inactivado con calor o tratado con formalina, preferentemente los constituyent pared cejlular de BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG componentes de BCG, lipopolisacárido (LPS) derivado de E. coli, o microorganismos Gram-positivos o Gram-negativos inactivados y un compuesto de imidazoquinolina, preferentemente un compuesto de imidazoquinolina-4-amina, en particular 4-amino-2-etoximetil-x-dimetil-lH-imidazol [4,5-c] quinolin- -etanol o 1- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina, o derivados de la misma (ver por ejemplo, WCfOO/47719) , un poliribonucleótido sintético de doble hebra preferentemente poliI:C, RNA natural de doble hebra o vi[rus de RNA o fragmentos de RNA, o análogos sintéticos , o una molécula de ácido nucleico sintética o natural que comprenda motivos CpG no metilados. La mayoría de estos compuestos son agonistas de TLR (ver tabla 1 para comparación) En la presente invención, se prefiere manera partijcular usar LPS como el agente de maduración células dendríticas. Sin embargo, en principio, también es factible usar cualquier agonista de TLR solo en combinación con IFN-?. En principio, también es posible exponer las iDC a cócteles de citocinas para maduración e incluyen típicamente pero no se limitan a factor a. de necrosis tumoral (TNF-1a), IL-l, IL-6 y prostaglandina ES, o partes de maduración de DC) . El tiempo de contacto y los otros parámetros tienen que ser elegidos de modo que las iDC maduren só o parcialmente en smDC usando métodos conocidos en la técn ca . Se pueden detectar marcadores de superficie celular en! ensayos familiares a la técnica, tal como citometría de flujo e inmunohistoquímica . Las células también se pueden monitorizar para producción de citocinas (por ejempl¡o, por ELISA, otro inmunoensayo, o por el uso de arreglos de oligonucleótidos o arreglos de proteína) .

La por lo menos una molécula capaz de mediar la maduración de las iDC en smDC liberadoras de IL-12 se selecciona de manera preferente del grupo que consiste de LPS en la resencia de IFN-? a fin de alistar a las DC para el paso de creación por ingeniería genética a fin de producir una nueva medicina inmunitaria de DC, estimuladora o supresora de linfocitos T, con características mejoradas. La por lo menos una molécula capaz de permitir que las DC mantengan sif fenotipo inmunoestimulador , caracterizadas por ejemplo por la secreción de IL-12 más allá de la ventana inmunoestimuladora fisiológica de aproximadamente 24 horas, confiriéndol 2S de este modo características superiores en comparación con la smDC, es la CD40L, pero típicamente no necesariamente en la presencia de IFN-?. Se ha elegido usar un planteamiento que se basa en permitir que las smDC expresen de manera artificial CD40L, que normalmente no lo provocan alergia, autoantígenos contra los cuales se inició una respuesta inmunitaria que provoca enfermedad, o antígenos de trasplante. fin de producir nuevas medicinas inmunitarias de DC, estimuladora o supresora de linfocitos con característ|icas mejoradas basadas en smDC, dizque son capaces de inducir una inmunorespuesta mejorada específica o inmunosupre|sión mejorada contra un antígeno en un individuo, las iDC se cargan preferentemente con al menos un antígeno antes de pcbnerlas en contacto con el estímulo de LPS/IFN-? preferido para producir smDC seguido por la creación por ingenien genética. La carga del antígeno es necesaria para instruir los linfocitos T contra ese antígeno necesitando llegar a activas o antígeno que se supone que va a ttoolleerraarr.. i_qs antígenos para la carga de las DC se pueden derivar tejido enfermos, tal como antígeno tumoral o antígenos virales de células viralmente infectadas. Pueden ser un fragmento de o un microorganismo muerto o vivo completo o una célula animal o humana procariótica, muerta o viva, por ejemplo, una célula tumoral humana o animal. Un antígeno puede ser una proteína recombinante , o un péptido sintético, un vector de expresión recombinante viral o no viral basadc en DNA o RNA natural o sintético que codifica para un anjtígeno. De manera alternativa, los antígenos pueden ser ¿ntígenos ambientales que tienen que activar una disfunción inmunitaria tal como una alergia, un autoantígeno contra el cual ha provocado enfermedad una respuesta autoinmunitiaria patológica, o un antígeno que determina el rechazo de trasplante de órganos o células madre, tal como moléculas de MHC. Es de valor señalar que, en el caso de una medicina inmunitaria de DC, supresora de linfocitos T, para inducción <Jie tolerancia contra un trasplante alogeneico, puede no sjer necesaria la carga, puesto que las DC del donador del órgano o de las células madre tienen las mismas moléculas de MHC como el trasplante. Obviamente, en estas últimas situaciones, se diseñara una medicina inmunitaria de DC de una manera que suprima la inmunidad contra el alérgeno, ajitígeno de trasplante, o autoantígeno. A fin de distribuir el antígeno a las DC, se pueden usar varios métodos te como exposición pasiva que permita que las DC fagociten † proteína o antígeno peptídico, un complejo de proteína antigénica, células o membranas celulares que expresan a tígenos o péptidos antigénicos, texosomas, liposomas que contiene antígenos o péptidos antigénicos, ácidos nucleicos que codifican para antígenos o péptidos antigénicos (posiblemente incorporados en plásmidos o vectores vi ales) , o RNA total para una célula tumoral . Estos métodos se han descrito, por ejemplo, en la WO99/03499. Estos vehículos pueden ser de origen viral o no viral o pueden ser nanopartículas . Los antígenos pueden ser antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos bacterianos:, etc., de manera más general, cualquier péptido o polipéptido contra el cual se busque una respuesta o reacción i amunitaria. A este respecto, las DC se pueden sensibilizar a uno o varios antígenos de acuerdo a varia técnicas conocidas. El término "sensibilizar" indica que el antígeno o una porción del mismo, se expone en la superficie de las DC, preferentemente en complejo con moléculas del complejo Ide histocompatibilidad principal (MHC) . En principio, las DC se pueden inocular en un paciente sin la carga anterior con un antígeno y permitir que tomen in vivo un antígenc , por ejemplo, por inyección directamente en un tumor o en su medio circundante, en una metástasis, o en el sistema li|nfático de desagüe que incluye los nodulos linfáticos y el tejido linfoide primario y/o secundario. Esencialmente, únicamente la presencia del antígeno y su presentación a un linfocito T determina la medicina inmunitaria de DC pero de ninguna manera el antígeno alcanza la DC. Una ¡vista general de las técnicas de carga de DC se da en RM 3teinman & J Banchereau (Nature, Volume 449/27 Sep iembre ¿007, páginas 419-426) y las referencias en el mismo .

Las DC cargadas con antígeno y creadas por ingeniería «¿enética de la presente invención se pueden usar para modular de manera terapéutica respuesta inmunitarias en lo menos un antígeno se selecciona del grupo que consiste de antígenos tumorales, antígenos virales, y antígenos bacterianos. Las DC creadas por ingeniería genética, de acuerdo a la presente invención, se pueden cargar con cualquier antígeno contra el cual se deba inducir, suprimir o prevenir una respuesta inmunitaria en un individuo. Particularmente preferidos son los antígenos tumorales .

La nueva medicina inmunitaria de DC, creada por ingeniería genética, con capacidad estimuladora o supresora mejorada de linfocitos T, de acuerdo a la presente invención, se puede conservar, por ejemplo, por crio-conservación ya sea antes de la maduración como iDC, después de la maduración parcial como smDC, antes o después de la creación por ingeniería genética como DC mejoradas antes de la administración a un paciente. Los agentes de crio-conservación que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a dimetil-sulfóxido (DMSO) , glicerol polivinilpirrolidona, polietilengl.icol , albúmina, dextrano, sacarosa, etilenglicoj. , i-eritritol, D-ribitol, D-mannitol, D-ssoorrbbiittooll ,, li-inositol, D-lactosa, cloruro de colina, aminoácidos , metanol, acetamida, monoacetato de glicerol y sales inorga.nicas .

Ur. aspecto adicional de la presente invención se refiere a jjna composición farmacéutica que comprende la mmuueevvaa mmeeddiice!ina inmunitaria de DC creada por ingeniería de la pres|ente invención se pueden usar en combinación con resección (Quirúrgica de un tumor; antes de, simultáneo con, o subsigui)ente a terapia de radiación y/o quimioterapia ( fármacos bitotóxicos, agentes apoptóticos, anticuerpos, y similares crio- terapia; braqui-terapia; otras formas de terapia inijriunitaria (linfocitos T específicos de antígeno tumoral expandido ex vivo, células NK, citocinas y factores de crecimlento, anticuerpos específicos para antígenos tumorales , o estructuras de selección como diana del tejido tumoral quje don críticas para supervivencia de células tumorales , tal como vasos sanguíneo, etc.); terapia génica usando veatores virales o no virales, y similares.

Adicionalmente , la medicina inmunitaria de DC de la presente invención ae puede co-administrar con otro agente, agente que actúa como un adyuvante a la maduración de la célula dendrítica ly/o el procesamiento del antígeno dentro del tumor o región cerca o adyacente al tumor. También se puede usar cualquiera y todos estos métodos en cualquier combinación Los tratamientos de combinación pueden ser concurrentes o secuenciales y se pueden administrar en cualquier ojrden como se determina por el facultativo que trate .

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de ün célula dendrítica de acuerdo a la presente invención para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer y/o infecciones microbianas o parásitas; o para tratar y/o prevenir alergias, enfermedad autoinmunit.aria , o rechazo de trasplante de células madre u órganos. L s células dendríticas parcialmente maduradas de acuerdo a la presente invención se pueden emplear de manera preferente en prevención de cáncer y/o tratamiento de cáncer. En este caso, las células dendríticas se cargan con menos ?? antígeno tumoral . Por ejemplo, pero no por limitación, células se pueden administrar directamente en un tumoir, en el lecho tumoral subsiguiente a la remoción quirúrgica o resección del tumor, de manera peritumoral en un nodulo linfático de desagüe en contacto directo con el tumor, en un vaso sanguíneo o conducto linfático que conduce a, o que al imenta a un tumor u órgano afligido por el tumor, por ejemplo la vena portal o una vena o arteria pulmonar, y similares .

La administración de las células dendríticas parcialmente: maduras de la invención se puede aplicar ya sea de manera simultánea con o subsiguiente a otros tratamientos para el tumor, tal como quimioterapia o terapia de radiación . Además, las células dendríticas parcialmente maduras de la invención se pueden co-administrar con otro agente, agente que actúa como un adyuvante a la maduración de la célul a dendrítica y/o el procesamiento del antígeno dentro del tumor o región cerca de o adyacente al tumor.

Además, las células dendríticas también se pueden formular o combinar en una matriz de liberación lenta para implante en una región en o alrededor del tumor o lecho tumoral tal que las célula!s se liberen lentamente en el tumor, o lecho tumoral, para el contacto con los antígenos tumorales. e acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, el medicamento se administra a un individuo antes de, simultáneo con, o subsiguiente a terapia de radiac:.ón y/o quimioterapia anti- tumoral o anti-microbiana, o cualquier terapia que tenga como finalidad tratar alergias, enfermedades autoinmunitaria, o rechazo de trasplante de órganos o células madre. Las células dendríticas de acuerdo a la presente invención se pueden emplear en fcombinación con otras terapias de cáncer a fin de lograr un efecto aún más benéfico.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de ana célula dendrítica de acuerdo a la presente invención para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir enfermedad inmunológica provocada por una sobre-reacción patológica del sistema inmunitario contra antígenos Ambientales, tal como alérgenos, o contra autoantígenos en el transcurso de una enfermedad autoinmunitaria Este medicamento se administra de manera preferente un individuo antes de, simultáneo con, o subsiguiente a otras modalidades que tiene como finalidad tratar o prevenir alergias o enfermedad autoinmunitaria.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una célula dendrítica de acuerdo a la presente invención para la elaboración de un medicamento para tratajr y/o prevenir el rechazo inmunológico de un trasplante alogeneico de células madre. Preferentemente usado en d1 tratamiento de malignidades hematológicas , o para tratajr y/o prevenir el rechazo de un trasplante alogeneico de órganos .

Epte medicamento se administra de manera preferente a un individuo antes de, simultáneo con, o subsiguienté a otras modalidades que tienen como finalidad tratar o provenir el rechazo de un trasplante alogeneico de células madre u órganos La presente invención se ilustra además por las siguientes ¡figuras y ejemplos, sin embargo, sin que se restringa a lestos .

La1 Figura 1 muestra la plasticidad de desarrollo de una DC eh una representación esquemática de la cinética de un proceso de diferenciación de DC .

La Figura 2 muestras un control de calidad del diseño básico de smDCl .

La Figura 3 muestra los resultados de una transferencia génica de CD40L, ta Figura 4 muestra la cantidad y calidad de secreción de IL-12 e IL-10.

La FIGURA 5 muestra el potencial para actividad citolítica (cuadrado, DC transgénicas de CD40L; diamante, DC transgénicás de GFP; triángulo, DC de control) .

La Figura 6 muestra la capacidad inmunoestimuladora de las DC activadas por LPS bloqueadas pata la expresión de IL-10.

La Figura 7 muestra la capacidad inmunoestimuladora de las DC activadas por LPS con expresión silenciada de IDO.

La Figura 8 muestra el diseño experimental de los experimentos de perfilado de expresión de DC.

La Figura 9a muestra ejemplos de respuestas proliferati as mejoradas después del silenciamiento de la expresión de moléculas diana en las CD identificadas en los experimentos de perfilado de expresión usando interferencia de RNA . La Figura 9 muestra ejemplos adicionales de genes que después del silenciamiento de su expresión en las DC con SiRNA da por resultado una capacidad estimuladora mejorada de estas DCj creadas por ingeniería genética para linfocitos alogeneicos como se indica en comparación a la transfección con siRNA de control o DC no transíectadas como se indica .

Ejemplo: Método para producir por ingeniería genética una medicina ¾nmunitaria de PC, estimuladora o supresora de linfocitos T, Aféresis de leucocitos Je recolectaron leucocitos usando un dispositivo de aféresis de leucocitos Amicus de voluntarios saludables y los pacientes que padecen de varias neoplasias se trataron en el contexto de los ensayos clínicos que se aprobaron por la junta responsable de revisión de la institución. A todos los individuos se les dio su consentimiento informado a estos estudios de acuerdo a la declaración de la asociación médica mundial de Helsinki. Se determinaron los subconjuntos y números en un contador de células Sysmex (Sysmex, Bombaren, Alemania) y/o por citometría de flujo.

Enriquecimi=nto de monocitos SE enriquecieron monocitos por adherencia plástica como se déscribe anteriormente usando AIM-V (Invitrogen, Carlsbad, CA ) complementado con plasma AB mezclado, humano al 1% (Oc aplas, Octapharma, Vienna, Austria) o medio CellGro (ZellGenix, Freiburg, Alemania) . Para los procedimientos en línea se siguieron las instrucciones proporcionadas por los fabricantes . Usando el separador de células Elutra (Gambro BCT, Lakewood, CO) , se enriquecieron monocitos del producto de aféresis de leucocitos al cargar en la cámara de sedimentación en tanto que se mantiene la velocidad de la centrífuga 2400 rmp. Posteriormente, la velocidad de la centrífuga y el flujo del medio de sedimentación (PBS/HSA Baxter, New Jersey, NJ) se mantuvieron constantes para el fraccionamiento celular. De manera alternativa, se hizo la selección de monocitos con el sistema de selección celular CliniMACS (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) que usa perlas magnéticas revestidas con CD14 para retener los monocitos en una columna magnética.

Otra opción para el enriquecimiento de monocitos es el agotamiento linfocitos T y B para el enriquecimiento monocitos usando el Selector de Células, Magnético (Nexell, Irvine, CA) Los linfocitos se retuvieron en una columna magnética a1 conectarlos a perlas magnéticas revestidas con CD2 y CD19, y al recolectar el flujo de paso. Los productos finales de todos los procedimientos de enriquecimiento se caracteriza†on por citometría de flujo.

Citometría de flujo Se analizaron los productos de aféresis de leucocitos y del enriquecimiento de monocitos para leucocitos totales, linfocitos T, linfocitos B, monocitos, y granulocitos por marcación de anticuerpos con anti-CD45-FITC, anti- D3-PerCP, anti-CD19-APC, anti-CD14 -APC, y anti-CD15-FITC (BD Pharmingen San Diego, CA) , respectivamente, usando el sjistema Trucount (Becton Dickinson, New Jersey, NJ) . Las células marcadas se analizaron en un citómetro de Pharmingen 1 San Diego, CA) , anti-CD80-PE (Immunotech, Beckman Coulter, Fullerton, CA) , anti-CD83-APC (los tres de BD Pharmingen, San Diego, CA) , anti-MHC I-PE, anti-MHC II- FITC (ambo 3 de Dako Cytomation, Carpintería, CA) , y anti-CD45-PerCP BD Pharmingen, San Diego, CA) . La viabilidad de las DC se midió por tinción con yoduro de propidio (Sigma, S . Louis, MO) Las células se analizaron usando un citómetro de flujo FACS Calibur. Los anticuerpos de control de isotipo apropiados se incluyeron en el análisis Detección de IL-12 por ELISA sjs midieron, como se describe anteriormente, las concentraciones de IL-12 en el sobrenadante de los cultivos de DC.

Reacciones cjie leucocitos mezclados alogeneicos Se aislaron PBMC respondedoras alogeneicas por centrifugac LÓn gradiente de la sangre periférica. Se colocaron .as DC estimuladoras (10000, 2000, o 400) en triplicado con 105 células respondedoras en 200 µ? de medio AIM-V complementado con plasma humano mezclado al 2% en una placa de fondo redondo de 96 concavidades. Para una referencia positiva, se estimularon 10- células respondedoras con 100 ng/ml de enterotoxina A/B de estafilococo (SEA/SEB, Toxin Technologies Inc., Sarasota, FL) . En el día 4, el co-cultivo se incubó durante otras 18 horas con 1 MCÍ de solución de timidina de tritio (NEN Life Science Products, Boston, MA) . Finalmente, las células se recolectaron con un recolector Skatron (Lier, Noruega) . La timidina de tritio incorporada se contó usando un lector de places Trilux ( allac Oy, Turku, Finlandia) . De manera alternativa, las PBMC alogeneicas se marcaron con CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR) y se mezclaron con las DC a una relación de 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, y 1/80. Para los controles, no se adicionaron DC o SEA/SEB. Finalmente, las PBMC se marcaron con anti-CD3-PerCP y se analizaron usando un citómetlro de flujo FACS Calibur. Se determinó el porcentaj e de linfocitos T negativos de CFSE positivos a CD3.

Transferenc ia génica lentiviral en las smDC uiando el Sistema de Expresión Lentiviral ViraPower MR (de Invitrogen) se generaron partículas lentivirales por co- transfección de la línea de células productoras 293FT con plásmidos pLP que codifican para proteínas estructurales virales, polimerasa y transcriptasa inversa (pLP/VSVG, pLP-1, pLP-2) y plásmidos que contienen GFP o CD40L. 72 horas después de la co- transfección, el sobrenadante completo se recolectó y se concentró lOOx por ultracentrifugación . Las DC se cultivaron y maduraron bajo las condiciones resumidas anteriormente. Las DC se recolect ron 48 horas o 6 horas después del inicio de la maduración, respectivamente. Las smDC pre-maduradas entonces se transdujeron con partículas lentivirales (250 µ? de sobrenadante lentiviral concentrado 100x/lxl06 DC) en combinación con 6 µg/ml de Polibreno (de Sigma-Aldrich) más IL-4, GM-CSF, e lFN-? en concentraciones normales. Para control de calidad de IL-12, se tomó el sobrenandante después 24 horas, y se midió la expresión de GFP/CD40L después 48 horas siguiendo procedimientos normales.

Interferencia de R A en las DC produjeron DC de acuerdo a los procedimientos normales esumidos anteriormente. En el día 6, se transfectarpn 105 DC con 100 p ol de siRNA específico del gen usando| un reactivo de transfección (Dharmacon) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Doce horas después de la transfección, las DC se estimularon con LPS/IFN-? durante 6 horas. Todos los usos son en analogía a los métodos resumidos anteriormente, Resultados Lás medicinas inmunitarias de DC, actualmente en uso, emplean. DC derivadas de monocitos que se cargan con un antígeno de cualquier naturaleza, como se resume en la introducciór. y se exponen a un estímulo de maduración que tiene la ca†acidad de activar la liberación de IL-12 de las DC. Un fenotipo de DC caracterizado por la secreción de IL-12 tiene la Icapacidad de inducir una polarización tipo 1 del sistema inmiinitario que soporta inmunidad citolítica. Esto implica q e una medicina inmunitaria de DC, estimuladora, necesita er aplicada al paciente durante la ventana de tiempo de secreción de IL-12 para permitir la presentación de los aritígenos de las DC a los linfocitos T en la presencia de IL-12 (Figura 1) . La nueva medicina inmunitaria de DC, ctreada por ingeniería genética, con capacidad estimuladora o supresora mejorada de linfocitos T supera esta limitación, puesto que las manipulaciones genéticas de las DC permiten que la ventana inmunoestimuladora permanezca abierta durante un periodo más prolongado de tiempo.

En los siguientes ejemplos, se han producido y estudiado medicinas inmunitarias de DC, creadas por ingeniería genética. Se usó transferencia génica lentiviral transíección basada en liposomas para distribuir DNA R A, pero asume que cualquier terminología distribución de ácidos nucleicos puede servir para esa capacidad, Como un e emplo de sobre-expresión de un gen inmunoestim¬piador en una medicina inmunitaria de DC, se crearon po¡¡r ingeniería DC usando transferencia génica lentiviral para expresar la molécula CD40L. los estudios funcionales confirmaron que esta medicina inmunitaria de DC, creada por ingeniería, tiene un potencial mejorado para estimular respuestas inmunitarias. Adicionalmente, se demues ra que el silenciamiento de moléculas inmunosupresoras IL-10 e IDO también mejora la capacidad estimulatoria al crear por ingeniería DC con moléculas de siRNA disef.adas para interferencia de RNA para IL-10 e IDO. A fin de identificar moléculas adicionales de DC comprendida \s en los circuitos de retroalimentación inmunosupre|sores, se llevó a cabo el perfilado de expresión de DNA de genoma usando microarreglos de DNA. En base al análisis de agrupación que agrupó genes con un perfil de expresión similar a aquel de IL-10 o IDO, se encontró una lista de genes que tiene el potencial de regular de manera negativa lajs respuestas inmunitarias . El silenciamiento de estos genesl en una medicina inmunitaria de DC mejorará de esta manera, su capacidad inmunoestimuladora . Por lo tanto, una mediciha inmunitaria de DC creada por ingeniería genética p¡ara permitir la modulación específica de componentes definidos del sistema inmunitario permite el tratamiento de disfunciones asociadas del sistema inmunitario Finalmente se muestran ejemplos de las consecuencias funcionales del silenciamiento de genes diana expresados con cinética similar a IL-10 o IDO en los experimentos de perfilado de expresión usando interferencia de RNA. En co-cultivos con linfocitos T alogeneicos, se observó una capacidad mejorada de estas DC creadas por ingeniería genética para activar la proliferación indicativa de estimulac?.?? mejorada de linfocitos TY.

La Figura 2 muestra el control de calidad del diseño básico de smDCl que se usa para ingeniería genética. La mediciná inmunitaria de DC tiene que cumplir criterios definidos de control de calidad. El panel A muestra la pureza, viabilidad y rendimiento de las DC producidas de monocitos de sangre periférica. Estos monocitos se recolectan por aféresis de leucocitos, y se enriquecen los monocitos por centrifugación en contraflujo (sedimentación) En la pre¡sencia de IL-4 y GM-CSF, los monocitos se diferencian in vitro en el espacio de seis días en las iDC. Las ÍDC s!e cargan con antígeno y exponen de manera subsiguiente a un estímulo de maduración comprendido de LPS e IFN-? durante 6 horas y se congelan. En esta etapa, se llaman semi|i-maduras , puesto que, aunque se comprometen de manera irreversible a continuar su maduración, aún no muestran 1 s características fenotípicas y funcionales típicas de as mDC. De manera más importante, en esa etapa (la ventana inmunoestimuladora, aproximadamente 0-24 horas después del inicio de la maduración, Figura 1) , las DC activan la inmunidad en tanto que están en etapas posteriores (la ventana inmunosupresora, aproximadamente 24- 48 horas después del inicio de la maduración, Figura 1) . Sin embargo, en aplicación clínica, se inyectan en los pacientes en esta tapa de diferenciación donde completan su maduración activan respuestas inmunitarias (antes de 24 horas) , pero de manera subsiguiente (a aproximadamente 24 horas) tanjibién entran, de acuerdo a su programa desarrollo fisiológico activado por el estimulo de maduración , a una etapa inmunosupresora , que tiene como finalidad impedir la creación por ingeniería genética de la medicina inmunitaria de DC.

Para el control de calidad, se descongela una alícuota de la medicina inmunitaria de DC y se re-cultiva durante dos días a fin de dejar a las DC que completen su proceso de maduración. Durante estos dos días, segregan citocinas, íjnás importante IL-12 (de manera temprana después de la maduración) e IL-10 (tarde después de la maduración) (panel B; se muestra media ± SEM de tres individuos) . También, miiestran cambios en el patrón de expresión de moléculas críticas de membranas de DC (panel C) . Finalmente, las DC se someten a una prueba de potencia alloMLR (panel D) por co-cultdvo con PB C alogeneicas marcadas con CFSE a las relaciones indicadas, que activa la división celular que se asocia con una dilución del CFSE y una reducción de fluorescenci|a . Las gráficas de barra muestran la media ± porcentaj e de SEM de células proliferantes de tres individuos El estímulo inicial también es necesario para el inicio del los circuitos de retroalimentación inmunosuprespres . En general, entre más fuerte sea la activación en respuesta a un estímulo específico, más fuerte será la se alización de retroalimentación a fin de modular de manera descendente la inmunoactivación a su nivel de línea base impidiendo de este modo que una respuesta inmunitaria se salga de control y que provoque enfermedades autoinmunit¡arias. De esta manera, se encontró que el estímulo de maduración LPS/IFN-? da por resultado las cantidades ¡más altas de liberación de IL-12, pero también en las cantidaties más altas de liberación de IL-10.

Tabla 2: Especificaciones del diseño básico de smDCl para vacunación de cáncer Prueba Especificación Prueba Especificación Pureza 70-100% IL-12 >100 pg/ml Viabilidad 70-100% aloMLR Fenotipo DC:MNC = 1:5 >30% CD80 60-100% DC:MNC = 1:10 >30% CD86 60-100% DC:M C = 1:20 >15% MHC I 60-100% Control <10% negativo MHC II 60-100% BACTEC NEG CD83 60-100% Micoplasma NEG CD14 0-40% HIV 1/HIV 2 NEG IgG control <1% HBV/HCV NEG maduración |tal como LPS/lFN-?; ( iii) la cantidad total de IL-12 segregada de las DC fue considerablemente mayor en comparación al estímulo de LPS/IFN-Y c el estímulo de CD40L/IFN-Y, solo, y la cinética de la secreción de IL-12 ha sido cuantitativamente diferente iniciando rrás pronto después de que se aplicó el estímulo, ampliando de este modo la ventana inmunoestimuladora de diferenciac ??? de DC; Lv) aún 48 horas después de la exposición a LPS/IFN-y, cuando las DC han agotado su capacidad para segregar II)- 12, la transferencia génica de CD40L permitió que las DC iniciaran una segunda fase de secreción de IL-12 (Figura 3 ) .

L Figura 3 muestra una transferencia génica de CD40L. En el panel A, se muestra la expresión de GFP o CD40L después de }.a transferencia génica lentiviral en las smDC de 6 horas y las mDC de 48 horas. Todas las mediciones mostradas aquí se realizaron 48 horas después de la exposición de las DC pre-maduradas al vector lentiviral. La expresión d<= CD40L de las DC provocó secreción mejorada de IL-2 en comparación a iDC, las DC expuestas a LPS/IFN-? solos, o smDc de 6 horas creadas por ingeniería con GFP y mDC de 48 horas (panel B) . La liberación mejorada de IL-12 en la transferencia génica de GFP se provoca probablemente por el RNA de doble hebra viral que señala mediante TLR (ver tabla 1) que se expresan en smDC de 6 horas pero no más en mDC de 48 horas-LPS/lFN-?. El perfil de expresión de las moléculas de membrana de DC funcionalmente importantes (panel C) estuvo sin alterar por la transferencia génica lentiviral en las DC (histogramas negros, DC inmaduras; histogramas blancos , mDC) .

Lla secreción de las citocinas IL-12 e IL-10 fue cualitativa y cuantitativamente diferente en las DC que se expusieron a LPS/lFN-?, CD40L/IFN-Y, o una combinación de ambos (Figura 4) . La secreción de IL-12 fue casi dos veces tan alta cuando se aplicó el estímulo de combinación, en comparación| al estímulo solo de CD40L/IFN-y, y también fue considerablemente mayor en comparación al estímulo solo de LPS/lFN-?. Además, la secreción de IL-12 de las DC expuestas a el estímulo combinado de LPS/lFN-y/CD40L fue ya claramente detectable a cantidades considerables después de 12 horas, en tanto que LPS/IFN-? y CD40L/IFN-Y activó niveles biológicamente pertinentes de secreción de IL-12 solo entre 12 y 24 horas después de la exposición a la señal de maduración inicial. Esta observación está en línea con el objetivo de la presente invención de ampliar la ventana inmunoestimuladora de diferenciación de DC a fin de mejorar la capacidad estimuladora de una medicina inmunitaria de DC. La expresión máxima de IL-10 fue similar cuando se expusieron |las DC a LPS/IFN-Y/CD40L o CD40L/IFN-y solos, fue menor cuando sólo se usó LPS/IFN-? para maduración de DC. Sin embargo, la citocina inmunosupresora IL-10 fue ya detectable después de 12 horas a niveles biológicamente pertinentes después de la señalización de CD40L/IFN-y, en tanto que 1 estímulo de combinación LPS/IFN-y/CD40L mostró cinética similar a aquella de las DC sólo maduradas con LPS/IFN-?. La liberación temprana de IL-10 como después de la estimullación con CD40L/IFN-? interfiere de manera negativa con la ventana inmunoestimuladora de diferenciación de DC y se |sebe evitar, en el caso de diseñar una medicina inmunoes imuladora de DC. Se concluye que el efecto neto en el equilib::io entre la capacidad inmunoestimuladora e inmunosupresora del estímulo de combinación LPS/IFN-Y/CD40L, considerando el patrón de secreción de IL-12 e IL-10, es ccllaarraammeennttee hacia capacidad inmunoestimuladora mejorada en comparación a aplicar LPS/lFN-? o CD40L/IFN-Y solo. Como lo opuesto a publicaciones anteriores, las DC usadas aquí recibirán una combinación de estímulos de maduración. De manera fisiológica. Una fase en la cual las DC pueden activar linfocitos T (caracterizada por secreción de IL-12) y una seguida fase, en la cual las DC suprimirán la actividad de linfocitos T (caracterizada por secreción de IL-10 y agotamiento de triptófano por la actividad de la enzima IDO) , se activará al poner en contacto las iDC con un estímulo adecuado de maduración, tal como LPS/IFN-? (figura 1) . Aquí se: demuestra que la exposición inicial a LPS/IFN-? (u otro agonista de TLR en la presencia de IFN-?) , seguido por creación por ingeniería genética de las DC para sobre-expresar moléculas, tal como CD40L mantiene un fenotipo de DC capaz de: la activación de linfocitos T e impide que las DC asuman el fenotipo supresor (figura 4) . La secreción de IL-12 se mantiene por más tiempo que la ventana de tiempo fisiológica de 20-24 horas cuando la ingeniería genética se hace 6 horás o 48 horas después de la maduración inicial mediante la ruta de señalización de TLR en la presencia de IFN-?.

La Figura 4 muestra la cantidad y calidad de secreción de IL-12 e IL-10. Se expusieron DC al estímulo indicado de maduración en la presencia de IFN-?. Las concentraciones de IL-12 e IL-10 en el sobrenadante de cultivo se nidieron en los puntos de tiempo indicados.

Dé importancia particular en el presente diseño de medicina inmunitaria de DC, estimuladora de linfocitos T, eada por ingeniería genética, es que las DC secretoras de IL-12 tienen la capacidad, mediante la polarización tipo 1 de una respuesta inmunitaria, de activar inmunidad citolítica . De esta manera, el potencial de los linfocitos T expuestos a DC transgénicas de CD40L para activar respuestas inmunitarias! citolíticas al analizar el contenido de la qgrraannzziimmaa BB |en CTL positivas a CD8 se investigó de manera adicional Figura 5) . En realidad, se encontró que el cultivo del CTL con DC transgénicas de CD40L dio resultado expresión claramente mejorada de la granzima B en comparación a las DC transgénicas de GFP de control o las mDC no transducidas. Este es un fuerte indicador del potencial qitololítico mejorado de estos CTL y proporciona de esta manera evidencia que la expresión de CD40L de una medicina | inmunitaria de DC tiene capacidad inmunoestimuladora mejorada Figura 5 muestra el potencial de actividad citolítica . El porcentaje total de los CTL se incrementó sólo ligeramente cuando se co-cultivaron PBMC con DC transgénicas de CD40L (panel izquierdo, cuadrado) en comparación a DC transgénicas de GFO (diamante) y mDC no transducidas (triángulos) . Cuando se analizó la expresión de la granzima B en los CTL co-cultivados con DC transgénicas de CD40L, áe encontró un claro incremento (panel derecho, cuadrado) en comparación a las DC transgénicas de GFP (diamante) ¾j mDC no transducidas (triángulos Descripción de una medicina inmunitaria de estimuladora mejorada para linfocitos T al crear por ingeniería para el silenciamiento de la expresión de la citocina intnunosupresora IL-10 ErJ base a la hipótesis que una medicina inmunitaria de DC en la cual se silencia la expresión de moléculas que medían supresión inmunitaria, se crearon experimentojs para bloquear la expresión del gen de IL-10 en las DC por interferencia de RNA usando una mezcla de 4 siRNA específicos de la diana (Figura 6) . Esto dio por resultado silenciamiepto muy consistente y reproducible de la expresión ie IL-10 en DC activadas con LPS/IFN-y, que conduce a ,na mayor secreción de IL-12 en comparación a las mDC silenciadas de control . Esta observación alude indirectamente una ruta autocrina en base a la IL-10 segregada de una DC que se une a los receptores de IL-10 en la misma DC que da por resultado producción modulada descendentemente de IL-12. Diferente de eso, no se encontraron diferencias inmunofenotípicas entre las DC creadas por ingeniería genética y las normales, como se valora por La expresión de CD80, CD86, MHC clase I, y II. De manera mas Importante, en un aloMLR, se observó una potencia considerablemente mayor de una medicina inmunitaria de DC creada por ingeniería para la supresión de la secreción de IL-10 pare. activar linfocitos T en comparación a experimentos de control Adicionalmente, el porcentaje de células CD25+FoxP3+ I en la población de células T CD4+, supuestamente una población de células T reguladoras (Tregs) que suprime respuestas inmunitarias , se redujo, probablemente debido al silenciamieríto de IL-10 en las DC activadas con LPS/IFN-y.

Ja Figura 6 muestra la capacidad inmunoestimjuladora de las DC activadas con LPS/lFN-?, bloqueadas para la expresión de IL-10 por ingeniería genética. Doce horas antes de la activación con LPS/IFN-?, las DC se transfectaron con una mezcla de cuatro siRNA específicos de IL-10 o un siRNA de control no específico, Las célula' s T CD3+ alogeneicas aisladas entonces se estimularon con DC maduradas con LPS de 6 horas (mDC) ya sea IL-10 (barras negras) o silenciadas de control (barras blancas) eri una relación de DC: célula T 1:3. Se analizaron células T CD4+, CD8+, (panel A) y CD4+CD25+FoxP3+ (panel B) en el día de co-cultivo usando el sistema Trucount y un citómetro de flujo FACS LSRII. El fenotipo inmunitario así como la secreción de IL-10 e IL-12 se midieron 48 horas después de la activación con LPS/IFN-? por citometría de flujo y E!JISA, respectivamente (panel C) . El análisis inmunofenotüpico compara las C activadas con LPS/lFN-? (histograma blanco) con las iDC (histograma negro) en las DC silenciadas de IL-10 (panel D) o DC silenciadas de control (panel E) .

Descripción de una medicina inmunitaria de DC, estimuladora de linfocitos T, creada por ingeniería para el silenciamierito de la expresión de la enzima inmunosupresora IDO Se! usó siRNA para silenciar la expresión de la molécula efl ora inmunosupresora conocida, IDO (figura A fin de optimizar la transfección de siRNA y la eficiencia del silenciamiento de IDO, se usaron primero células HeLa, activadas con IFN-?. De manera subsiguiente, las DC se transíectaron bajo condiciones optimizadas. Tanto las células HeLa como DC, se puede silenciar la expresión de IDO como se demuestra en experimentos de transferencia Western.

Las DC silenciadas de IDO, las DC transfectadas con un siRNA de ¿ontrol mezclado, y las iDC se usaron como estimuladores en un ensayo de potencia alloMLR. Se observó que la potencia estimuladora de las DC silenciadas de IDO fue considerablemente mayor en comparación a las DC transfectadas con siRNA mezclado o iDC. Esto se mantiene válido parta los CTL CD8+ así como células Th CD4+. jL_,aa Figura 7 muestra la capacidad inmunoestimuladora de las DC activadas con LPS/IFN-? con expresión silenciada de IDO. Primero, se demostró el silenciamienjto eficiente de IDO en células HeLa (panel A) así como DC (panel B) usando experimentos de transferencia Western. A fin de investigar la potencia estimuladora de las DC silenciadas de IDO en los CTL CD8+ (panel C) y linfocitos Th CD4+ (panel D) se co-cultivaron PBMC con DC silenciadas de IDO (cuadrados) , DC silenciadas de control (diamantes, sera = secuencia mezclada) , o iDC (triángulos) . En todos los casos, la capacidad estimuladora de las DC silenciadas de IDO fue superior con respecto a los controles Moléculas ipmunosupresoras 5e usaron microarreglos de DNA de genoma entero para generar perfiles de expresión de las DCX expuestas al estímulo dp maduración LPS/lFN-?, a la señalización de CD40L/IFN-Y o a una combinación de LPS/IFN-?/señalización de CD40L, aisí como los controles apropiados (Figura 8) .

La Figura 8 muestra el perfilado de expresión de DC. Se expusieron las DC al estimulo indicado de maduración o se dejaron inmaduras. Se extrajo el RNA en los puntos indicados di; tiempo y se sometió al perfilado de expresión usando microarreglos de DNA de genoma entero. Los resultados del perfilado de expresión se analizan usando CarmaWeb (Comprehensive R based Microarray Analysis, Bioinformatics Graz and ths Tyrolean Cáncer Research Institute, Austria) . Todos los datos se agruparon en 20 agrupaciones que usaron el algoritmo' básico de la plataforma de software CarmaWeb y se identificaron las agrupaciones que contuvieron IDO e IL-10. Los genes en estas agrupaciones tienen un perfil de expresión similar a aquel de las dos moléculas de DC inmunosupresoras, conocidas, que llegan a la conclusión que tienen una ::unción en la inmunorregulación de una DC que también es inmunosupresora (tablas 3 y 4) .

Tabla 3: Agrupación de expresión de IDO. De acuerdo al algoritmo de Carma eb, los genes listados tienen un perfil de expresión que se asemeja a aquel de IDO (nombre del gen INDO) que sugieren una función similar a aquella de IDO (los números son logaritmos con base 2 con relación a las PC inmaduras ) .

LPS CD40L LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 210118 s at II JIA 12.5712385 12.656363 11.625489 9.828246 1405 i at a :L5 9.775104 10.949544 12.230392 11.143438 1552995 at I .27 10.449822 10.585213 10.862312 8.519849 1554997 a at P rGS2 11.7640085 9.820589 11.614364 11.624819 1555759 a at o :L5 12.916491 12.965171 12.63708 12.723415 1556378 a at L< DC401530 5.897853 10.2600975 12.640888 13.004906 1570388 a at LC IC401530 3.8191023 9.072843 11.445329 11.711242 202269 x at GI 1P1 8.517265 8.2832775 8.787927 8.968534 202411 at II 127 9.403024 9.560578 9.054876 8.233445 203828 s at II 32 9.310799 8.968001 10.09564 9.038413 203915 at 5CL9 13.417887 13.097824 12.633152 11.7289915 204439 at II "I44L 11.743961 9.8876705 7.0858197 6.4474745 204470 at C5 ÍCL1 10.931133 8.087279 8.933327 5.9426484 204533 at CJ ÍCL10 9.392692 10.44239 10.786983 11.601183 2046S5 at CC ::L5 9.542912 11.558153 11.215681 11.169104 LPS CD40L LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 204698 at [SG20 12.59375 10.52378 9.431844 8.965937 204748 at ?TGS2 12.489249 7.144587 7.9113717 8.436964 205013 s at ADORA2A 10.245063 8.496423 10.054197 9.867236 205067 at ::LIB 12.89035 7.7892747 11.259029 11.700619 205207 at ::L6 7.463433 7.6129217 8.461436 8.870339 205476 at CCL20 12.470199 12.587071 13.649405 12.875935 205569 at LAMP3 6.9127846 9.671546 9.207934 10.519818 205599 at TRAF1 8.448494 9.332896 9.679705 11.050019 205680 at M P10 6.9289026 9.5307 11.131636 11.908984 205681 at HCL2A1 12.63274 12.276044 12.321126 12.00514 205692 s at CD38 11.776373 10.918448 8.890723 6.572375 205890 s at UBD 11.738066 11.718061 12.080868 11.735866 206025 s at T¡ FAIP6 12.46147 9.442592 10.791083 10.010692 206026 s at TNFAIP6 8.55364 8.492605 8.934455 8.366126 206337 at C:R7 8.625213 10.63397 11.733897 11.844164 206341 at I.2RA 7.962748 9.035077 10.360973 8.479506 206765 at KCNJ2 4.7675686 9.681816 10.2331705 9.70106 206881 s at LILRA3 9.8311825 9.066225 9.314402 5.396609 207113 s at T F 12.704884 13.268166 11.278352 8.395802 207160 at l{,12A 9.43968 13.149242 13.380418 8.626079 207176 s at CD80 8.31917 7.76368 8.680011 8.573913 207375 s at II|,15RA 9.771918 10.090428 10.584916 10.606205 LPS CD40L LPS CD4QL LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 235229 at 8.6328745 8.228744 8.894646 8.620824 238439 at AN RD22 7.496807 7.9435267 8.688104 10.303036 238581 at GBP5 9.960986 9.9203 7.430702 7.571562 238725 at 5.625349 7.5093164 9.704128 10.179434 240287 at LOC341720 10.947632 11.357612 9.703499 4.2557507 242814 at SERPINB9 9.147152 9.357069 9.150615 9.138746 33304 at ISG20 11.309338 7.729137 8.4003 6.2511134 39402 at IL1B 12.057478 6.510902 10.422022 11.546757 228439 at ¡4GC20410 6.443625 4.5576925 5.1437 2.8559468 232078 at PVRL2 6.135475 4.746409 3.8879604 4.522022 1561908 a at HS3ST3B1 7.0928926 4.458722 3.670319 3.8414023 204141 at TUBB2 5.3551335 4.7444496 4.0537806 5.1056914 207275 S at ACSL1 5.8632264 5.869882 4.1483216 4.095168 210563 x at (pFLAR 5.100706 5.0670333 5.419278 4.1996965 210564 x at CFLAR 5.380331 4.9984617 5.3778234 4.160804 218400 at ¿AS 3 6.8762517 6.1737237 4.410526 2.8219512 220132 s at CLEC2D 4.4514236 6.669927 5.78131 1.7744006 222303 at BTS2 .60927 5.654717 5.4186363 3.4308143 229221 at GD44 7.1867433 5.771355 3.1319969 4.7465234 230499 at EIRC3 4.71687 4.9918036 5.3390183 5.366412 232682 at rsu 4.6348085 5.7252564 5.5562453 3.688244 243296 at PBEF1 6.237873 4.170852 4.781295 5.1768007 LPS CD40L LPS CD'IOL LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 243894 at 3LC41A2 7.1203766 4.7231464 4.238267 4.4368286 1554539 a at ¾HOF 5.002441 4.1752563 5.4232445 5.0010266 1563357 at 3ERPIMB9 6.368476 5.3010783 3.9647322 5.4146433 202509 s at TNFAIP2 5.195548 .5.9835477 4.9414105 3.823941 203287 at jADl 4.5966916 6.1679506 5.8620677 3.8349202 204715 at PANX1 6.0651593 .6488233 5.01669 4.461601 204794 at :)USP2 5.4158106 3.7610755 4.858317 6.9610953 207389 at GP1BA 6.946879 6.472854 5.3776803 2.2710993 209039 x at I.HD1 5.992218 4.9087305 4.788946 5.520831 209928 s at MSC 4.9872894 5.956739 4.365724 5.714541 215078 at ¡;OD2 6.952513 7.3351035 3.1302252 3.7524989 216336 x at !|1T1M 4.864737 4.9637637 6.200034 5.143623 219716 at APOL6 7.687471 5.4070616 4.6342998 3.8593137 221779 at MICAL-L1 5.128767 5.6324835 6.08239 4.3245826 226189 at 7.0649176 5.7119026 5.3064666 3.6578546 227014 at IÜOC57168 7.947885 4.03786 4.678014 4.4947524 232304 at I'ELIl 6.7769756 5.062101 4.4606757 5.45498 234985 at LOC143458 5.5271115 4.7101035 5.720184 4.8197145 242649 x at CI15orf21 6.9237723 5.3964243 4.532885 4.963293 1559391 s at E4GALT5 .598228 7.0806437 5.126474 4.786352 200629 at ViARS 6.951068 5.0352116 4.546803 4.863137 202688 at 1NFSF10 6.8965373 5.708206 4.570576 5.1128407 LPS CD40L LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 202748 at 3BP2 5.793167 6.4275317 4.901077 4.8227687 203685 at 3CL2 7.285017 5.9438853 4.1533656 4.8756795 204015 S at 3USP4 8.879749 6.673204 3.3034465 4.2480526 204926 at ::NHBA 5.6395097 7.8953505 4.531301 3.1433787 206157 at PTX3 7.3603053 5.5506916 5.1639824 4.220827 209803 s at PHLDA2 5.2155585 4.638463 6.690672 5.015275 209939 x at (TFLAR 5.3425546 5.3650227 6.3261905 4.451903 211302 s at PDE4B 9.388175 4.2461367 4.496878 4.7590027 215671 at EDE4B 6.8900924 4.9770446 4.6578245 5.777932 216705 s at ÍDA 6.1992345 4.8220434 5.4637165 5.23145 218943 s at CDX58 7.6221895 6.2795057 4.79867 4.15005 219014 at PILAC8 4.8591843 4.901381 8.194876 3.2458937 221087 s at APOL3 6.84244 5.7354436 4.5675263 5.530723 221185 s at IDCG 6.629468 3.8091857 6.4129505 5.9112988 222812 s at RHOF 5.2598224 5.562695 5.265753 5.8453097 239876 at NFKB1 6.668459 5.936471 4.785418 5.0308824 240013 at 5.927128 5.32223 5.1699376 5.818874 242234 at BIRC4BP 5.92746 5.946681 4.6361747 6.306454 35150 at CID40 5.5139947 5.5919642 6.1309977 5.227399 1553713 a at RHEBL1 5.2900615 5.984809 5.9541264 5.9824634 1570253 a at RlfEBLl 5.2768035 6.012619 5.687341 5.871174 202687 s at TtyFSFlO 7.8631916 5.812222 4.413325 5.5924144 LPS CD40L LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 204415 at 31P3 4.8981137 6.400349 6.9897156 3.8297942 205483 at 31 P2 6.6436443 6.099025 5.6568613 4.5633087 206975 at -TA 7.6997614 8.081627 5.2525034 2.2437675 214228 x at NFRSF4 8.910944 6.6099143 3.4565573 5.0546947 215346 at :D40 5.0572295 5.593753 6.163759 5.6992526 219211 at JSP18 8.285303 7.0497055 5.0085244 3.340998 223887 at 3PR132 6.7607636 4.543277 5.509192 7.0652533 226702 at -OC129607 7.0691476 5.9127674 5.569863 5.045494 227816 at : jOC400572 5.9134483 6.345112 6.439589 5.0362144 231578 at ( 5BP1 7.4657335 6.917391 3.8039267 6.1784716 232213 at I >ELI1 7.4485292 5.587166 5.212285 6.0972896 200628 s at V 1ARS 9.368469 5.516358 4.64247 5.419954 202800 at ILC1A3 6.087409 6.9154663 7.895211 3.3894732 204014 at I 1USP4 8.585252 6.8769712 4.5652914 4.590569 204070 at I ARRES 3 5.2620735 6.591536 6.2708507 5.70036 204747 at ] FIT3 8.602514 7.492393 5.6343427 3.3676317 212458 at 3PRED2 5.5534644 7.490529 6.08654 4.736595 212641 at 1IVEP2 6.433779 5.7410865 6.5065494 6.1581783 231779 at ] [RAK2 8.596796 4.4581327 5.576258 6.910897 1559777 at 5.605326 8.543147 6.0953383 4.9331293 200986 at 5ERPING1 9.492846 8.300841 4.229471 3.6452117 203708 at í >¡DE4B 11.223041 4.007264 .071895 4.2633905 LPS CD40L LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-? 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 204286 S at I WAIP1 9.400938 5.3456664 4.7092376 6.7266498 205153 3 at :D40 6.071054 6.5306187 6.4112535 6.4513636 222934 s at c :LEC4E 8.080958 8.404435 6.981838 2.577743 224225 S at ]TV7 7.935058 6.064494 6.699362 5.50029 226474 at 1 IOD27 5.9191046 7.2645817 5.1934004 7.0305643 227262 at I IAPLN3 .1910353 6.615262 5.1981425 7.5915074 230127 at 7.3191285 7.9864817 5.3266 6.0064306 244780 at GPP2 8.127058 5.944443 6.879924 5.023631 1569095 at 7.318123 8.3700075 6.2253203 4.625397 201601 x at I FIT 1 7.6313257 7.573814 6.0775313 4.9257803 202643 s at ? NFAIP3 6.250073 5.1900063 6.5136204 7.95266 202760 s at E ALM2 -A AP2 9.142822 7.253937 5.7028017 5.2498336 204285 s at E MAIP1 10.275632 5.124492 4.698287 7.937848 204363 at ? 3 5.9613805 7.1758485 7.078458 5.787101 208747 s at C J1S 6.224019 6.8833885 6.2983246 6.745276 209723 at ERPINB9 10.339775 5.989251 4.825143 6.5091825 214329 x at 1 ÍJFSF10 6.1703367 6.8099036 6.2552257 7.0860806 216598 s at c L2 7.959111 5.9420986 7.541988 5.4770517 218656 s at I HFP 5.799256 5.6268 7.0819764 6.887301 221680 s at E V7 7.4525156 6.8642745 6.899107 6.077394 227677 at J ??3 5.4577355 5.5538926 6.847657 6.6245513 229450 at I ?IT3 7.4833083 7.133669 7.3032265 5.366725 LPS CD40L LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 IFN-? 12 IFN-? 24 IFN-y 48 horas versus horas versus horas versus horas versus iDC 6 horas iDC 12 iDC 24 iDC 48 horas ID único Nombre M horas M horas M M 209037 s at HD1 6.202972 6.62678 6.968862 8.198914 222802 at 9.193985 9.879644 6.7598433 5.578077 234306 s at S LAMF7 11.054989 9.386422 7.5571413 4.0329967 219584 at I LA1A 7.8830075 8.5753975 7.899431 6.5355268 232593 at I INCR 7.426831 7.1173863 7.508543 8.483282 235175 at G BP4 8.098684 8.014557 6.7604356 8.305143 238567 at £ GPP2 9.60297 7.9624267 8.190959 5.9755754 202270 at G BP1 7.857806 7.5784187 7.864753 7.7254214 206058 at S LC6A12 7.0730734 7.6346216 7.868434 7.8353267 209270 at L ¾MB3 6.3819847 7.637574 8.068874 8.396816 223217 s at N '???? 6.579339 5.8985357 7.933263 9.0830765 230110 at M COLN2 7.0183334 8.743037 8.322358 6.695663 235116 at T RAF1 7.515788 6.612626S 7.946375 8.608736 239196 at A KRD22 6.893366 7.2058015 7.997893 8.679558 1557359 at L OC285758 5.7492123 6.7752757 6.428899 8.264215 202833 s at S EjRPINAl 6.047883 6.2670393 8.372422 8.15069 220655 at T NIP3 4.227455 9.260285 8.14861 3.8333952 210354 at I FNG 7.0490704 9.9158745 9.995628 4.7299943 239331 at 4.9562793 7.907742 6.738407 7.5105863 Tabla 4: .Agrupación de expresión de IL-10. De acuerdo al algoritmo de CarmaWeb, los genes listados tienen un perfil de expresión que se asemeja a aquel de IL-10 (nombre del gen IL10) sugirieron una función similar a aquella de IL-10 (los números son logaritmos con base 2 con relación a las PC inmaduras ) LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único Nc :mbre 6 horas M horas M M M 1556300 s at 0 4.323714 1.5688843 0.257391 1556378 a at Li3C401530 0 3.3170495 -0.124789566 1.3912028 1556883 a at l )C401528 0 4.490707 -0.14703345 2.7003522 202291 s at < 3P 0 5.571205 2.098167 0.038769286 202878 s at c: LQR1 0 3.306639 0.3353752 1.2330873 204475 at MI 1P1 0 5.03655 0.2590128 0.17097393 204614 at SI ¡RPINB2 0 3.4892087 2.2649622 0.08403955 205676 at P27B1 0 3.6301327 0.1309929 0.7396309 223287 s at FC XP1 0 2.983712 1.7371364 0.5753527 224773 at N; >V1 0 3.3603613 0.35192382 0.9197203 227812 at TI 4FRSF19 0 3.3981404 1.6189107 0.044692483 235042 at o 4YA1 0 3.450752 0.328667 1.5720363 235444 at FC DXP1 0 3.0461197 -0.042442646 1.3964777 241860 at sr ["Í17B 0 2.671234 0.61670065 1.4493694 1556582 at L( DC440536 0 2.6907892 1.2484756 1.1807224 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único tfombre 6 horas M horas M M M 1564028 S at ?LJ40722 0 2.750025 0.67192906 1.4337206 1566480 x at TLJ31795 0 2.810023 1.4379538 0.6065171 1570388 a at .OC401530 0 3.911918 0.027789168 1.8137968 202877 s at C1QR1 0 3.3630056 0.6407456 1.4440103 204602 at QK 1 0 3.921798 3.6861098 0.3208148 204932 at TNFRSFllB 0 4.2726865 3.2933848 0.21878207 215268 at fACFl 0 2.6788146 1.2724367 0.8143623 216497 at LOC120364 0 2.3947499 1.1637448 0.9242658 216867 s at PDGFA 0 2.1128201 1.2416315 1.132686 220655 at G???3 0 3.474797 0.8904967 1.8436728 221870 at EÍD2 0 2.571253 0.94932306 1.2732899 224771 at MAV1 0 3.8266947 1.5089604 1.4963266 238712 at 0 4.2949014 1.8307322 2.142599 239311 at DHX57 0 2.27365 1.3914022 1.0178465 1556318 s at C¾ND1 0 2.3933206 0.9396068 1.3715496 227732 at ATXN7L1 0 3.4273734 0.6846624 2.2728565 239060 at EHD1 0 1.997289 0.32936123 1.8916218 206176 at BMP6 0 2.2903044 -0.18439728 2.1745071 207386 at CYP7B1 0 3.9868062 0.7309004 2.746021 210229 S at SF2 0 3.1023788 -0.1405712 2.5077276 215750 at KHA1659 0 3.0428922 -0.006880157 2.480364 225025 at IG13F8 0 1.905534 0.49440768 1.845558 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único ? om re 6 horas horas M M M 227345 at G NFRSF10D 0 2.1187048 0.36650723 2.0576801 236738 at ]. 3C401097 0 2.4518428 1.685922 1.7134967 242B17 at c; PR54 0 1.9395804 0.21328141 2.186202 228910 at <F D82 0 3.5779603 1.2853656 2.5263379 229307 at Al NKRD28 0 3.1102884 0.8216141 2.5533133 231832 at G M.NT4 0 2.2378843 0.72167736 2.091024 37005 at N BL1 0 2.158463 1.2050192 2.0193584 227410 at F AM43A 0 3.1527455 1.5260311 2.2625198 228625 at C ITED4 0 2.2035446 0.8985138 2.1428196 240432 x at 0 2.0101619 1.3507649 2.0001297 203074 at A] ÍXA8 0 2.754555 0.79692614 2.6273892 206009 at I ?GA9 0 1.9594706 0.54135984 2.3522627 235438 at 0 4.0041165 0.70460325 3.542835 1560869 a at 0 2.5460286 1.5980372 2.5416172 223525 at D L,L4 0 3.5447857 0.5724994 3.72409 232090 at D NM3 0 4.302288 3.442975 2.8309567 203904 x at C D82 0 2.0282779 1.3777583 2.4270318 225645 at E ¾F 0 4.428559 2.14202 3.7522347 235737 at T 3_.P 0 4.959613 1.5306113 4.4908447 202237 at NI WIT 0 3.6071026 3.2686546 2.8587787 207433 at I LIO 0 4.00954 1.7226B76 3.7454016 214414 x at H 0 2.1132698 1.575519 2.6071193 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas y 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único tfombre 6 horas horas M M M 224940 S at PAPPA 0 2.786031 2.7599206 0.7074637 212730 at DM 0 3.6943512 0.91267496 4.2896175 219874 at SLC12A8 0 2.8926702 3.182794 1.9976637 224646 x at ¡119 0 2.466048 2.7163086 2.6425989 209324 s at RGS16 0 3.3799229 2.467596 3.7553544 243788 at BHF11 0 2.1383092 2.2994013 2.1082926 202238 s at NNMT 0 4.160124 4.563192 3.5705357 224997 x at H19 0 2.8080769 3.1897178 3.0020173 236176 at 0 2.051894 0.7956073 3.2491539 44790 S at C13orfl8 0 2.1295624 2.4644802 2.7274456 206825 at OXTR 0 2.7509916 0.5947344 4.1146626 207442 at CSF3 0 2.2279809 1.6218964 3.2061028 216575 at 0 2.1809235 1.0562297 3.4115193 237559 at GPR55 0 2.0120387 1.6486369 3.2241027 200951 s at CCND2 0 -0.061742224 2.055891 5.531777 204163 at EMILIN1 0 -0.08650574 2.116541 3.2442234 215646 s at CSPG2 0 1.0869541 0.9552003 4.6304297 220442 at 3ALNT4 0 1.6785349 2.2396698 2.8896742 223194 S at C6orf85 0 1.4545181 1.8726805 3.2625294 227703 S at SYTL4 0 -0.012060306 2.8051267 3.7273147 1552393 at FLJ25421 0 -0.008524944 0.79469424 4.0263605 1552394 a at FL{T25421 0 0.4518348 1.1220381 3.568555 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único tfombre 6 horas M horas M M M 1553785 at *ASGEF1B 0 0.8244259 3.0841393 2.744691 1554079 at 3ALNTL4 0 0.80384594 2.1117246 3.2543478 1559777 at 0 1.373273 1.964059 4.745006 1562433 at FLJ10489 0 0.26058874 3.4475367 4.6152167 1568949 at PITPNC1 0 0.004084121 2.9905202 3.3454092 1569095 at 0 1.0567621 1.0456768 3.5029418 200783 S at ÉTMNl 0 0.2741603 1.4904935 3.2696452 202403 S at COL1A2 0 0.83871436 2.151641 3.4803479 202431 s at YC 0 1.0226223 2.5720317 3.490832 202998 s at L0XL2 0 0.4333325 1.7000065 3.451721 203108 at GPRC5A 0 1.6255034 1.8504707 4.352528 203131 at P::GFRA 0 -0.45227933 1.4600621 3.411754 203592 s at FETL3 0 0.14812845 2.2247574 3.3438997 203980 at FABP4 0 -0.009128572 1.3565757 4.341141 204301 at K::AAO7H 0 -0.015199099 1.469634 3.7521276 204411 at KIF21B 0 0.99417245 2.3202088 3.2713737 204619 s at C£ PG2 0 1.7562126 1.4990444 4.1206384 204620 s at CSPG2 0 1.6183093 1.011578 4.371935 204879 at PDPN 0 -0.15425473 0.95934194 3.9027925 204904 at 3JA4 0 0.30981743 2.2777586 3.7517166 205100 at 3FPT2 0 1.5140616 1.8844032 5.630774 205289 at BMP2 0 0.60859656 1.5663037 3.305952 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único Nombre 6 horas M horas M M M 205290 s at BMP2 0 0.07147631 1.7073456 4.3988748 205826 at MYOM2 0 -0.004983342 3.2177415 6.163263 205861 at 3PIB 0 0.7059429 2.4294124 2.704671 205898 at :X3CR1 0 -0.010416569 2.8846204 5.349967 206027 at 3100A3 0 0.13657278 1.5692319 3.4727564 206090 s at DISC1 0 -0.8741116 1.8682606 5.05058 206729 at TNFRSF8 0 0.27889317 2.6180744 5.8870077 206741 at LOC51066 0 0.47887027 2.5547576 5.7319098 206859 s at I'AEP 0 -0.001321607 1.3401538 3.7394311 207510 at IIDKRB1 0 2.0661907 3.4934416 3.781754 209325 s at FGS16 0 1.5113075 2.5088499 3.8291175 210095 s at 1GFBP3 0 0.21584912 2.5991304 3.2872534 211372 s at IL1R2 0 -0.6165594 1.6310264 3.7544057 211571 s at OSPG2 0 0.91350543 0.87646186 5.6404405 211596 s at LPIGl 0 3.8467457 2.826491 5.69805 211597 s at HDP 0 0.1277425 1.6993432 6.786917 212143 S at IGFBP3 0 -0.19099335 3.7475343 4.0994177 212444 at 0 1.1151347 1.3201189 3.6738355 213139 at SNAI2 0 0.001255514 3.9536047 5.2359695 215495 S at SAMD4 0 -0.6807276 2.1140902 4.5931683 218574 s at LtlCDl 0 0.004399216 0.005991654 4.832267 218975 at COL5A3 0 1.8476033 3.2505863 4.3477015 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-y 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-? 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus iDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único Nombre 6 horas horas M M M 219168 s at PRR5 0 0.3802334 1.883373 5.4903607 219181 at LIPG 0 0.034028087 1.7650458 4.60227 221731 x at :SPG2 0 1.1740024 1.1199198 4.3726726 224950 at PTGFRN 0 0.2711382 2.548231 4.0687737 225571 at -IFR 0 1.2333707 2.1292431 2.7829444 226621 at KGG 0 0.91611135 2.2092934 3.1336222 227256 at USP31 0 0.66912067 1.812497 3.3547237 228245 s at OVOS 2 0 -0.6036949 1.9032807 5.509818 228367 at ALPK2 0 1.9285325 1.4045739 3.7516391 228854 at 0 0.013371324 1.4183841 4.6363435 229247 at FLJ37440 0 9.65E-04 0.14736369 5.156355 229622 at FILJ43374 0 0.15105823 2.228979 3.3192601 230233 at R,¾SGEF1B 0 0.44206667 2.0026255 4.1667137 231496 at FZPMR 0 0.0146722 3.7155752 2.9080575 231867 at ODZ2 0 -0.002545893 -9.53E-04 4.766165 232739 at SPIB 0 -0.03394005 2.8278906 2.699333 235100 at 0 1.1068798 2.099443 3.164012 237344 at 0 0.14466353 0.72832346 5.1735163 239808 at P] TPNC1 0 -0.035855636 0.69854295 4.18631 240770 at PRP2 0 0.35803238 1.2584826 3.8403585 242691 at 0 0.042725943 2.1449049 3.0019956 40687 at GJA4 0 -0.001706956 2.8572736 4.300132 LPS CD40L LPS CD40L LPS IFN-? 6 LPS CD40L IFN- IFN-? 24 IFN-y 48 horas ? 12 horas horas versus horas versus versus ÍDC versus iDC 12 iDC 24 horas iDC 48 horas ID único Nombre 6 horas M horas M M M 41469 at PI3 0 0.08784416 3.8997574 2.944381 47069 at PRR5 0 -0.30954257 1.9246503 5.094549 52255 s at -OL5A3 0 2.9138856 3.5991492 5.075999 223503 at ::KFZP566N034 0 0.001206623 0.010989565 4.3298063 E:i los presentes microarreglos de DNA, también se identificaron genes inducidos en las DC en la señalización de LPS/IFN y o CD40L/IFN-y con implicación en la regulación de los genes IL-10, TSLP, INDO, IL2RA, CSF-2 y CSF-3, todos los cuales se conoce que tienen un efecto inmunosupresor . A fin de identificar los cambios principales potenciales de la inmunorreguüjación, se generó una red de reguladores para estos genes con el software Pathway Studio usando Resnet 5 (versión 1.2 enero, 2007) , una base de datos de rutas mamíferas e interacciones moleculares derivada de PudMed y 44 publicaciones de acceso abierto . Al cargar los datos de microarreglois de las DC diferencialmente activadas a la red reguladora, entonces se pueden seleccionar los reguladores principales potenciales inducidos en las DC en maduración (Tabla 5) .

IDO, o que corresponden agrupación cambios principales de inmunorregulación están comprendidos en los circuitos de retroalimentación, inmunosupresores , reguladores, negativos. Se diseñaron experimentos similares a aquellos en los cuales se silenció la expresión de IL-10 o IDO usando interferencia de RNA. Se transíectarpn las DC con genes específicos de siRNA de la tabla 3, 4 o 5. Se muestran en la figura 9 los genes MAPKAPK2, IRF2, PHF11, IRF4 , JAK1 , CEBPB, y ETV6. Después del inicio de la maduración por una exposición de 6 horas con LPS/IFN g, las DC creadas por ingeniería genética se co-cultivaron ?? linfocitos T alogeneicos durante 6 días. Los linfocitos [G alogeneicos se marcaron con CFSE, un tinte fluorescente que entra a las células, se unen a proteínas y se retiene dentro de la célula; se lava el exceso de CFSE. Con cada división celular, la intensidad de fluorescencia de los linfocitos T se dividió en dos, lo que permitió la valoración de la proliferación de linfocitos T en el día 6 del co-cultivo. Como controles se usaron DC no transíectadas o DC transfretadas con siRNA de control. La mejora de la capacidad de las DC creadas por ingeniería genética para estimular lijifocitos T alogeneicos proporciona evidencia de la implicación de los genes que tienen como objetivo siRNA en circuitos de retroalimentación, reguladores, negativos.

Esto indica además que una medicina inmunitaria de DC que se crea por ingeniería genética para el silenciamiento de estos genes tendrá un efecto terapéutico mejorado en comparación a los productos inmunitarios convencionales.

Conclusión Ss proporciona evidencia por la presente invención que las características de una medicina inmunitaria de DC se pueden modular por ingeniería genética. Se demostró que la sobre-expresión de moléculas inmunoestimuladoras en las DC así como el silenciamiento de las moléculas inmunosupresoras da por resu tado capacidad inmunoestimuladora mejorada. Esto puede encontrar una aplicación como una vacuna de cáncer DC o una dicina inmunitaria de DC anti-infecciosa, en la cual las se cargan con antígenos derivados de tumor o antígenos derivados de microbios, expuestas a un estímulo de maduración, y creadas por ingeniería como se describe. Adicionalmente, los datos presentados aquí implican que se puede diseñar una medicina de DC inmunosupresora por el silenciamieni;o de moléculas inmunoestimuladoras y por la sobreexpresión de moléculas inmunosupresoras. Esta medicina iinnmmuunniittaarriiaa de DC, supresora, puede tener aplicaciones en alergia o autoinmunidad, pero también en medicina de trasplante , a fin de tolerar el sistema inmunitario del receptor del trasplante al tejido trasplantado.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Preparación farmacéutica, caracterizada porque comprende células dendríticas parcialmente maduradas obtenibles por un método que comprende los pasos de: proporcionar células dendriticas inmaduras o células precursoras de las mismas o células dendriticas parcialmente maduradas, obtenibles al poner en contacto células dendriticas inmaduras con al menos un agente de maduración de células dendriticas para producir células dendriticas parcialmente maduradas (DC semimaduras, smDC) como se define por su capacidad para segregar IL-12, b)' manipular las células del paso a) , en particular las células dendriticas parcialmente maduradas (DC semimaduras, smDC) que liberan IL-12 del paso a), para .) sobre-expresar al menos una molécula inmunitaria capaz de mantener la capacidad estimuladora de linfocitos T de las células dendriticas caracterizada por secreción ccntinua de IL-12 durante al menos 24 horas, de manera preferente al menos 48 horas, y seleccionadas del grupo que consiste de CD40L al introducir moléculas de ácido nucleico que codifican para al menos una de estas moléculas; y (H ) inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula supresora de linfocitos T que actúa dentro de las células Idendríticas expuestas a un agente primario de maduración tal como LPS/IFN-? o que se libera de células dendríticas expuestas a un agente primario de maduración tal como LPS/IFN-? y que se selecciona del grupo que consiste de interleucina 10 (IL-10) indolamina-2.3-dioxigenasa (IDO), como al| menos uno de los genes dados en las tablas 3, 4 5, por silenciamiento del gen o un fragmento del mismo que codifica para al menos una molécula supresora de linfocitos T o al introducir moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ácido ribonucleico, para inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula supresora de linfocitos T que es activa dentro de la célula dendrítica f se distribuye de las células dendríticas a las células T, c adicionar opcionalmente sustancias para transformar células precursoras de células dendríticas en células dendríticas. Preparación de conformidad con reivindicaci 5n 1, caracterizada en que los precursores las células dendríticas inmaduras, en particular monocitos células madre hematopoyéticas, o las células dendríticas inmaduras se obtiene de la piel, bazo, médula ósea, timo, nodulos linf áticos, sangre de cordón umbilical, o sangre periférica . 3. Preparación de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada en que el por lo menos un agente cae maduración de células dendríticas se selecciona del grupo que consiste de agonistas de TLR tal como Bacilo Calmette-Guerin tratado con formalina o inactivado con calor ¡¡BCG) , preferentemente constituyentes de la pared celular del BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG o componentes de BCG, lipopolisacárido (LPS) derivado de E. coli, o microorganismos Gram-positivos o Gram-negativos inactivados un compuesto de imidazoquinolina , preferentemente un compuesto de imidazoquinolina-4 -amina, en particular 4-amino-2-etoximetil-x-dimetil-lH-imidazol [4.5-c] quinolin-i-etanol o 1- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4.5-c] quinolin-4 -amina, o derivados de los mismos un poliribonucleótido sintético de doble hebra, preferentemente polil:C, RNA. natural de doble hebra o virus de RNA o fragmentos ce RNA, o análogos sintéticos, o una molécula de ácido nucleico sintética o natural que comprenda motivos CpG no metilados, combinaciones de citocinas, preferentemente factor a de necrosis tumoral (TNF-OÍ) , IL-1, IL-6 o prostaglandina E6, CD40L, preferentemente CD40L recombinante o proteínas de fusión que comprenden el dominio CD40L, o con células primarias o líneas celulares creadas por ingeniería genética para expresar CD40L, o con linfocitos T activados que favorecen fisiológicamente la expresión de CD40L tal como linfocitos T. 4. Preparación de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que antes del paso b) de manjipulación, las células dendríticas inmaduras se ponen en cjontacto con al menos un agente de maduración de células cjiendríticas durante al menos dos horas, preferentemente durante al menos cuatro horas, de manera más preferente durante al menos seis horas, en particular durante al menos doce horas, a un máximo de veinticuatro horas , paral dar células dendríticas parcialmente maduradas. . Preparación de conformidad con cualquier de las reivindicac¡iones 1 a 4, caracterizada en que las células dendríticas inmaduras o parcialmente maduradas se cargan con al menos un antígeno . 6 Preparación de conformidad con la reivindicacjLón 5, caracterizada en que el por lo menos un antígeno se selecciona del grupo a que consiste de antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos bacterianos, o cualquier otro patógeno parásito o microbiano humano; o que consiste de antígenos ambientales que provocan alergia, autoantígenos contra los cuales se inició una respue inmunitaria que provoca enfermedad, antígenos de trasplante Método para producir células dendríticas, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar células dendríticas inmaduras, poner en contacto las células dendríticas inmaduras bon al menos un agente de maduración de células dendríticas para producir células dendríticas parcialmente maduradas (DC semimaduras, smDC) como se define por su capacidad pjara segregar IL-12, ) manipular las células del paso a) , en particular las células dendríticas parcialmente maduradas (DC semimaduras , smDC) que liberan IL-12 del paso b) , para ( i) sobre-expresar al menos una molécula iinnmmuunniittaarriiaal capaz de mantener la capacidad estimuladora de linfocitos T de las células dendríticas caracterizada por secreción c,ontinua de IL-12 durante al menos 24 horas, de manera preferente al menos 48 horas, y seleccionada del grupo que consiste de CD40L al introducir moléculas de ácido nucleico que codifican para al menos esta molécula; y/o (i i) inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula supresora de linfocitos T que actúa dentro de la célula dendrítica expuestas a un agente primario de maduración i:al como LPS/IFN-? o que se libera desde las células dendríticas expuestas a un agente primario de maduración tal como LPS/IFN-? y que se selecciona del grupo que consiste de interleucina 10 (IL-10) indolamina-2.3 -dioxigenasa (IDO) , tal como al menos uno de los genes dados en las tablas 3, 4 y/o 5, por silenciamiento del gen o un fragmento de!, mismo que codifica para al menos esta molécula supresora cae linfocitos T o al introducir moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ácido ribonucleico, para inhibir o prevenir la expresión de al menos una molécula sijpresora de linfocitos T que es activa dentro de la célula dendrítica o se distribuye desde las células dendríticas a las células T. 8 Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado en que los precursores de las células dendríticas inmaduras o las células dendríticas inmaduras o células dendríticas parcialmente maduradas se obtienen de la piel, bazo, médula ósea, timo, nodulos linfáticos, sangre cordón umbilical, o sangre periférica. Métodos de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado en que el por lo menos un agente de maduración de células dendríticas se selecciona del grupo que consiste de agonistas de TLR tal como el Bacilo Calmette-Guerin (BCG) tratado con formalina o inactivado con calor, preferentemente constituyentes de la pared celular de BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG o componentes de BCG, lipopolisacárido (LPS) derivado de E. coli, o microorganisnos Gram-positivos o Gram-negativos inactivados, un compuesto de imidazoquinolina, preferentemente un compuesto de imidazoquinolina- 4 -amina, en particular 4-amino-2-etoximetil-x-dimetil-lH-imidazol [4.5-c] quinolin-1-etanol o ]]- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4.5-c] quinolin-4- amina, o derivados de los mismos un poliribonucleótido sintético de doble hebra, preferentemente poliI:C, RNA natural de doble hebra o virus de RNA o fragmentos de RNA, o análogos intéticos, o una molécula de ácido nucleico sintética ó natural que comprenda motivos CpG no metilados, combinaciones de citocina, preferentemente factor de necrosis tumoral (TNF-a) , IL-1, IL-6 o prostaglandina E6, CD40L, pre erentemente CD40L recombinante o proteínas de fusión que comprenden el dominio CD40L, o con células primarias o líneas celulares creadas por ingeniería genética expresar CD40L, o con linfocitos T activados que favorecen fisiológicamente la expresión de CD40L tal como linfocitos T . 1C Método de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque antes del paso c) de manipulación, las células dendríticas inmaduras se ponen en contacto con al menos un agente de maduración de células dendríticas durante al menos dos horas, preferenteme te durante al menos cuatro horas, de manera más preferente durante al menos seis horas, en particular durante al menos doce horas, a un máximo de veinticuatro horas . 11. Método de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado en que las células dendríticas Inmaduras o parcialmente maduradas se cargan con al menos un antígeno. 12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado en que el por lo menos un antígeno se selecciona del grupo ) que consiste de antígenos tumorales, antígenos virales, aijitígenos bacterianos, o cualquier otro patógeno parásito o microbiano humano; o que consiste de antígenos ambientales que provocan aljergia, autoantígenos contra los cuales se inició uunnaa rreessppuueejsta inmunitaria que provoca enfermedad, o antígenos de trasplante. 12·. Células dendríticas, caracterizadas porque se pueden obtener por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12. 14 Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una célula dendrítica de acuerdo a la reivindicaci5n 13. 15 Uso de una célula dendrítica según la reivindicación 13 o una preparación de acuerdo con cualquiera dé las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer y/o infecciones microbianas o parásitas; o para tratar y/o prevenir alejrgias, enfermedad autoinmunitaria, o rechazo de trasplante de} órganos o células madre. 16.| Uso según la reivindicación 15, caracterizado en que el Medicamento se administra a un individuo antes de, simultáneo con, o subsiguiente a la terapia de radiación y/o quimioterap1 ia anti-tumoral o anti-microbiana , o cualquier terapia cue tenga como finalidad tratar alergias, enfermedades autoinmunitarias , o rechazo de trasplante de órganos o cj;élulas madre . 1 ¡7. Uso de una célula dendrítica según la reivindicac??? 13 o una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir enfermedad inmunológica provocada por una sobre- reacción patológica del sistema inmunitario contra antígenos ambientales. Tal como alérgenos, o contra autoantígenos en el trascurso de una enfermedad qutoinmunitaria . 19 . Uso según la reivindicación 17, caracterizado en que el mddicamento se administra a un individuo antes de, simultáneo pon, o subsiguiente a otras modalidades que tienen como finalidad tratar o prevenir alergias o enfermedad a Utommunxtaria . 19 Uso de una célula dendrítica según la reivindicación 13 o una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para tratar y/o prevenir el rechazo inmunológico de un trasplante alogeneico de células madre, preferentemente usado en el tratamiento de malignidades hematológicas , o para tratar y/o prevenir el rechazo de un trasplante álogeneico de órganos. 20. Uso según la reivindicación 19, caracterizado en que el medicamento se administra a un individuo antes de, simultáneo con, o subsiguiente a otras modalidades que tienen como finalidad tratar o prevenir el rechazo de un trasplante álogeneico de células madre o de órganos.