CN109468275B - 一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与应用，为神经肽和氧化石墨烯的复合物，能将树突状细胞诱导成为耐受性树突状细胞。与雷帕霉素、细胞因子鸡尾酒等其他免疫调节剂相比，该复合物适用于诱导耐受性树突状细胞，具有制备简单、稳定性高、价格低廉的优势，可用于治疗急性移植物抗宿主病、风湿性关节炎、免疫性糖尿病等自身免疫性疾病。

Description

一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及纳米免疫药物技术领域，特别是涉及一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与应用，特别涉及一种将未成熟树突状细胞诱导为耐受性树突状细胞的诱导剂及其制备方法与应用。

背景技术

树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，并且是唯一可以激活幼稚T细胞(Naive T Cells)的一类抗原递呈细胞(Antigen PresentingCells,APCs)。树突状细胞可以调动多种免疫抵抗机制，例如细胞毒T细胞、CD4⁺辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及自然杀伤T(NKT)细胞等。这些树突状的淋巴细胞都具有识别和杀死患病细胞、以及释放保护性细胞因子(例如IFN-γ,TNF-α)的作用。

根据细胞表型和生物学功能的不同，DCs大致可分为成熟DCs(mature DCs,mDCs)、未成熟DCs(immature DCs,imDCs)和半成熟DCs(semi-mature DCs,semi-mDCs)三种类型。在无外源性干预的情况下，imDCs遇炎症刺激时会转变为mDCs，由于mDCs会激活T细胞，从而无法正常发挥抗炎作用。然而若对imDCs进行外源性免疫抑制剂的干预，imDCs会在免疫抑制剂的诱导下分化成耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,tDCs)。tDCs是指能够诱导免疫耐受的DC群。tDCs因对T细胞增殖和活化具有抑制功能，从而可发挥抗炎作用和具备优异的免疫调节功能，成为预防和治疗急性移植物抗宿主病、风湿性关节炎、免疫性糖尿病等自身免疫性疾病的新手段。imDCs具有较强的吞饮能力，MHCII和CD40、CD80、CD86等共刺激分子表达水平偏低，能引导T细胞沉默并促进调节性T细胞产生。因此，imDCs被视为最原始的耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,tDCs)。目前tDCs获得途径通常有两种，即直接为原始imDCs或经传统免疫抑制剂，如雷帕霉素(rapamycin，RAPA)处理得到的imDCs；前者因未经过任何处理注入体内后遇炎症刺激容易进一步被诱导为mDCs而丧失免疫抑制功能，而经RAPA为代表的传统免疫抑制剂处理的imDCs往往细胞活性受损，且在体迁移归巢能力仍然较低，难以保证足够细胞迁移至T淋巴细胞富集区发挥作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种新的树突状细胞诱导剂，尤其是针对未成熟树突状细胞发挥诱导作用的诱导剂。该诱导剂能将未成熟树突状细胞诱导成为耐受性树突状细胞，为神经肽和氧化石墨烯的复合物，能将树突状细胞诱导成为耐受性树突状细胞；优选的，所述树突状细胞为未成熟树突状细胞。

所述神经肽和氧化石墨烯之间通过偶联形成复合物；所述偶联包括化学偶联和物理偶联，优选通过吸附作用的物理偶联。

所述复合物体系中氧化石墨烯的终浓度为1.95-31.2μg/mL，优选终浓度为1.95-7.8μg/mL，最优选终浓度为3.9μg/mL；神经肽的终浓度为0.1-10.0μmol/L，优选终浓度为0.5-5.0μmol/L，最优选终浓度为1.0μmol/L。

所述神经肽可选自血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、α-促黑色素细胞激素释放因子(α-melanocortins,α-MSH)、尿皮质激素(urocortin,UCN)、肾上腺皮质抑素(adrenomedullin,AM)中一种或几种。

所述氧化石墨烯具有微观片层结构，纯度不小于99％。

所述复合物中氧化石墨烯的片径尺寸为50-1500nm，优选50-500nm，更优选50-200nm；可选的，所述氧化石墨烯的片层厚度约为0.8-1.2nm。

第二方面，本发明提供制备上述树突状细胞诱导剂的方法，具体包括以下步骤：

(1)用无菌水将氧化石墨烯与神经肽混合重悬，重悬体系中氧化石墨烯的终浓度为1.95-31.2μg/mL，优选终浓度为1.95-7.8μg/mL，最优选终浓度为3.9μg/mL；神经肽的终浓度为0.1-10.0μmol/L，优选终浓度为0.5-5.0μmol/L，最优选终浓度为1.0μmol/L；

(2)将步骤(1)的重悬体系于室温下静置半小时以上，得到神经肽-氧化石墨烯复合物悬浮体系，其中神经肽-氧化石墨烯复合物即为树突状细胞诱导剂。

第三方面，本发明提供一种免疫调节剂，包括上述树突状细胞诱导剂和未成熟树突状细胞；还可以包括经由该树突状细胞诱导剂诱导的耐受性树突状细胞；优选的，所述免疫调节剂经树突状细胞诱导剂诱导未成熟树突状细胞成为耐受性树突状细胞得到。

第四方面，本发明提供一种制备上述免疫调节剂的方法，用培养基重悬未成熟树突状细胞并调整未成熟树突状细胞浓度为1×10⁶细胞/mL，得到细胞重悬液；

向细胞重悬液中加入权利要求1-6任一所述树突状细胞诱导剂，使得每200μL树突状细胞诱导剂中含有2×10⁶个未成熟树突状细胞，37℃孵育24-72h后收集细胞，即得到所述免疫调节剂。

第五方面，本发明提供上述树突状细胞诱导剂在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病药物中的应用。

所述自身免疫性疾病包括但不限于急性移植物抗宿主病、风湿性关节炎、免疫性糖尿病等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与其作为免疫调节剂的应用。该诱导剂是由神经肽和氧化石墨烯复合得到，氧化石墨烯具有表面理化性质可调、易于获得、批次稳定且价格低廉的优势，本发明将其作为神经肽的递送体系，氧化石墨烯的大比表面积可充分发挥其对神经肽的富集功能，提高其局部丰度，并增强肽类小分子在体外培养刺激体系中的稳定性。

与未成熟树突状细胞的共孵育(共孵育即为将外加物质(如神经肽、氧化石墨烯或本发明诱导剂等)加入含有imDCs的培养基中一同孵育的过程，共孵育体系即为含有外加物质和imDCs的培养基体系)过程中，该诱导剂作为免疫调节剂诱导耐受性树突状细胞的优异表现及在体内发挥的疾病治疗效果得益于其与细胞的两种相互作用模式：

一方面，氧化石墨烯材料与树突状细胞表面的黏附作用模式使部分复合物停留于细胞表面，增加了神经肽与其细胞表面受体的作用时间和可能；

另一方面，纳米级的氧化石墨烯促进了未成熟树突状细胞的吞噬，可能提升树突状细胞疫苗的在体迁移及归巢能力，从而使其在淋巴组织发挥更好地抑制T细胞增殖及免疫抑制效果。

氧化石墨烯与神经肽协同发挥作用，使得本发明诱导剂对未成熟树突状细胞发挥更好的诱导效果。

此外，相比于其他采用纳米促进剂或免疫调节剂直接进行免疫的纳米疫苗，由于只有树突状细胞中吞噬的少量氧化石墨烯颗粒(通常小于孵育量的10％)会进入到生物体内，因此与其他疫苗佐剂相比，本发明的诱导剂具有更好的生物安全性，增加了该诱导剂向临床推广及应用的可能性。

附图说明

图1所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯的表征结果：其中A幅为透射电镜照片，B幅为动态光散射曲线图，C幅为原子力显微镜照片；

图2所示为树突状细胞经诱导培养不同时间的imDCs形态变化照片；

图3所示为四种神经肽对DCs分泌细胞因子的影响柱状图；

图4所示为神经肽UCN处理后DCs激活T细胞能力的柱状图；

图5所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯处理后imDCs细胞存活率图；

图6中A幅为不同片径尺寸的氧化石墨烯被DCs吞噬后的透射电镜照片，B幅为不同片径尺寸的氧化石墨烯被DCs吞噬后的瑞士-吉姆萨染色照片；

图7所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与DCs作用后DCs表面趋化因子受体CCR7表达水平；

图8所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯处理后DCs经脚垫输注后迁移能力的比较：其中A幅为脚垫输注带有萤火虫荧光素酶报告基因的imDCs后发光部位的注释图；B幅为DCs的动态迁移过照片；C幅为DCs迁移至PLN百分比的柱状图(*与Ctrl-DCs组比较，#与S-DCs组比较，P＜0.05)；

图9所示为采用本发明诱导剂处理后的树突状细胞存活率(A.流式图，B.柱状图)；

图10所示为本发明诱导剂的偶联效率柱状图；

图11所示为本发明诱导剂偶联前后的红外光谱图；

图12所示为采用本发明诱导剂抑制DCs分泌促炎细胞因子的效果柱状图；

图13所示为本发明建立aGVHD小鼠模型的效果图；

图14所示为过继性输注本发明诱导剂处理后的树突状细胞抑制aGVHD小鼠体内T细胞增殖情况图。

具体实施方式

神经肽最早被鉴定为神经递质，主要参与消化道腺体的分泌、肌肉的收缩和舒张等。近些年有研究发现，神经肽也是一种重要的内分泌调节肽，具有广泛免疫调节作用，被认为是治疗炎症和自身免疫性疾病最具前景的生物制剂之一。有研究指出，被命名为VIP和α-MSH的两种神经肽可下调DCs表达共刺激分子CD80和CD86，从而具有抗炎能力。UCN是一种同时分布在中枢与外周的神经肽，主要由巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞分泌，系统性炎症和自身免疫性疾病发生时，机体会分泌更多的UCN以下调巨噬细胞和单核细胞分泌的炎症相关细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p70等)，发挥抗炎作用。另一种神经肽AM也被发现具有保护心血管的作用及具有抗炎效果。然而，尽管神经肽表现出较强的免疫调节功能；但其分子量大、与细胞结合的稳定性差、易被降解是其未能广泛应用的主要因素。

近年来，随着纳米科技的进步，纳米材料被研究者们广泛地应用于生物医药领域，如纳米传感、纳米器件与纳米药物等，纳米疫苗也应运而生，并在生物医药和疫苗免疫领域表现出巨大的应用潜力。纳米疫苗是将纳米粒子作为载体，通过与功能性分子复合而增强其生物学效应的新型疫苗。发明人在前期研究工作中发现，纳米材料不仅可被作为载体递送功能性小分子，同时其本身也与免疫细胞存在可调的相互作用模式，这大大拓宽了通过精确设计而对其特殊性质进行应用的可能。

与其他纳米材料相比，石墨烯基纳米材料除了其无可比拟的优越光电性质外，作为生物材料还具如下特点：1)通过氧化处理得到的氧化石墨烯材料亲水性强，具有良好的生物相容性；2)表面的改性处理可使其具备可调的表面理化性质；3)超大的比表面积有利于功能性分子在其表面富集；4)可控制反应条件制备出不同片径尺寸、不同层数的石墨烯材料以用于不同用途；5)不同片径氧化石墨烯与免疫细胞具有不同的作用模式。这些特点为石墨烯基材料成为理想的纳米疫苗奠定了坚实的基础。

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯经氧化处理后的衍生物，表面含氧的极性官能团使其具有更强的亲水性及良好的生物相容性，也使其在基因递送、肿瘤治疗和生物传感等方向备受研究者们关注。发明人在研究过程中发现：氧化石墨烯基材料因其片径尺度的差异，有些尺寸材料会与免疫细胞，如巨噬细胞/树突状细胞之间更多发生细胞膜表面的黏附，而有些会倾向于被免疫细胞通过巨胞饮等作用而吞噬入细胞内部。

因神经肽在液体环境中易被降解，且与DCs表面受体结合稳定性差，本发明采用氧化石墨烯材料作为免疫调节剂神经肽的递送体系，即利用其比表面积优势增强神经肽的局部富集效应，确保神经肽有足够浓度与时间与imDCs表面受体结合，完成向tDCs分化的信号传递；并隐藏其被蛋白酶降解位点，增强神经肽稳定性，通过CRHR2-cAMP-CREB通路诱导树突状细胞耐受功能，并有望将该种树突状细胞疫苗应用于GVHD和风湿性关节炎等自身免疫性疾病。

目前为止，以石墨烯基材料作为诱导树突状细胞耐受试剂的研究未见报道，更没有将其与神经肽复合作为免疫调节剂使用的。

本发明在此基础上提供了一种树突状细胞诱导剂，包括神经肽和氧化石墨烯，神经肽可选自血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、α-促黑色素细胞激素释放因子(α-melanocortins,α-MSH)、尿皮质激素(urocortin,UCN)、肾上腺皮质抑素(adrenomedullin,AM)中一种或几种；氧化石墨烯为采用hummer’s方法由鳞状石墨通过氧化反应等得到的具有片层结构的二维纳米材料，优选为单层氧化石墨烯，其片径尺度为50-1500nm，片层厚度约为0.8-1.2nm。神经肽和氧化石墨烯之间通过物理吸附复合，即通过两者的电位值差异以静电吸附的方式相互作用而偶联；神经肽和氧化石墨烯也可经化学修饰通过发生化学反应而偶联。树突状细胞可以为从小鼠骨髓分离出来的单核细胞经过1L-4和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子诱导分化得到的未成熟树突状细胞，最好是表面特异性表达的CD11c阳性率评价纯度达到65％以上的未成熟树突状细胞。

本发明还提供了制备上述树突状细胞诱导剂的方法，具体包括以下步骤：

(1)用高压灭菌后的去离子水将氧化石墨烯与神经肽重悬并混匀，重悬体系中氧化石墨烯的终浓度为0.00195-0.0312mg/mL，优选终浓度为0.00195-0.0078mg/mL，最优选终浓度为0.0039mg/mL；神经肽的终浓度为0.1-10μmol/L，优选终浓度为0.5-5.0μmol/L，最优选终浓度为1.0μmol/L；可通过在37℃、振动频率为100-400次/分的恒温水平摇床中水平振动5-240分钟混匀，优选振动频率为200-300次/分，振动时间为30分钟；也可采用手动或者其他方式混匀；

(2)将步骤(1)混合均匀的重悬体系于室温下静置半小时以上，使得神经肽通过物理吸附作用偶联于氧化石墨烯表面，得到神经肽-氧化石墨烯复合物，即为树突状细胞诱导剂。

本发明还提供了一种免疫调节剂，其原料包括上述树突状细胞诱导剂和未成熟树突状细胞。制备该免疫调节剂的方法具体为：收集培养至第5天的未成熟树突状细胞，1000r/min离心10min，用PBS洗涤两遍并计数，用1640完全培养基(含10％胎牛血清、5ng/mLIL-4、10ng/mL GM-CSF)重悬细胞并调整细胞浓度为1×10⁶cells/mL，向细胞重悬液中加入步骤(2)得到的树突状细胞诱导剂，使得每200μL树突状细胞诱导剂中含有2×10⁶个imDCs，并在37℃孵育24-72h后收集细胞，用PBS洗涤2-3次后，即得到耐受性树突状细胞，即免疫调节剂，将该免疫调节剂进行过继性输注即可。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似神经肽类免疫调节剂，或者相似反应条件实现本发明所描述的“神经肽-氧化石墨烯”复合物诱导树突状细胞进行耐受；或者在神经肽与石墨烯形成复合物的步骤中采用非物理吸附，如化学修饰的模式实现偶联，也在本发明的保护范围之类。另外，本发明中所说的树突状细胞，也不局限与小鼠骨髓来源的树突状细胞，其他来源(人或其他动物)来源的树突状细胞也包含在内，同时也不局限于髓系DCs(myeloidcells,myDCs),其他DCs亚群如浆样DCs(pDCs)以及将来发现的新型DCs亚群，这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或不同的应用都在本发明的覆盖范围之内。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例一、不同片径尺寸单层氧化石墨烯(graphene oxide,GO)的制备

用于本发明中的氧化石墨烯可参照已有技术制备得到。可为由石墨烯经强氧化剂(如高锰酸钾)氧化处理得到的片层结构的二维纳米材料，或采用浓硫酸中的高锰酸钾与石墨粉末经氧化反应之后，得到棕色的在边缘有衍生羧基及在平面上主要为酚羟基和环氧基团的石墨薄片，此石墨薄片层可以经超声或高剪切剧烈搅拌剥离为氧化石墨烯，并在水中形成稳定、浅棕黄色的单层氧化石墨烯悬浮液。

以下以具体实例说明如何获得不同片径尺寸的氧化石墨烯：

1g鳞状石墨，1g NaNO₃，46mL浓H₂SO₄混合后在冰浴中搅拌30分钟，缓慢加入4.0-6.0g KMnO₄，1h后将反应体系转至油浴中35℃搅拌2h，再缓慢升温至60℃搅拌2h。将反应体系加至200mL水中，80-90℃下搅拌5h，加入30wt％H₂O₂水溶液至反应体系中无气泡产生。此时溶液由黄色变成棕色，趁热过滤，先用5wt％的稀盐酸清洗滤饼，然后用去离子水洗涤，直至滤液呈中性并无SO₄ ^2-(可用BaCl₂检测)。将滤饼冷冻干燥后，即得到单层氧化石墨烯。

将制得的单层氧化石墨烯研磨成粉末并分散在去离子水中，经300W超声处理，根据处理时间长短即可得到不同片径尺寸的氧化石墨烯，如超声处理2小时可得到片径尺寸约为50-200nm的氧化石墨烯，超声处理10小时可得到片径尺寸约为200nm-500nm的氧化石墨烯，超声处理18小时可得到片径尺寸约为500-1500nm的氧化石墨烯。

用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射仪(DLS)、原子力电镜(AFM)和Zeta电位测定仪对以上方法得到的三级片径尺寸的GO进行表征，结果见图1。

透射电镜结果如图1中A幅所示，从中可以看出三级片径的GO尺寸差异明显，在水溶液中分散均匀，均为不规则多边形状。

DLS结果如图1中B幅所示，从中可以看出三级氧化石墨烯的平均片径分别为103.1nm(S-GO)，362.5nm(M-GO)，1192.1nm(L-GO)。

AFM表征结果如图1中C幅所示，从中可以看出三级片径尺寸的GO平均厚度均为1-2nm，符合单层GO结构特征。

Zeta电位表征结果见表1，可见三种片径尺寸的GO在水溶液中的Zeta电位绝对值均大于30mV，说明上述方法得到的GO胶体稳定性较好。

表1不同片径尺寸的GO的Zeta电位表征结果

命名	S-GO	M-GO	L-GO
				流体力学半径(nm)	103.1	362.5	1192.1
Zeta电位(mV)	-32.76±1.19	-31.58±1.34	-30.74±0.82

实施例二、小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞的培养与鉴定

1、小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞的培养与诱导分化

颈椎脱臼处死L2G85.C57BL/6J小鼠(6-8周)，浸泡在75％(v/v)酒精中后置于超净工作台内分离其股骨和胫骨，浸泡于PBS中，以无菌剪刀和镊子去掉肌肉和骨骺，用2mL注射器针头吹出骨髓腔中的骨髓，吸取1640培养基反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔变白为止。用注射器轻轻将骨髓细胞吹散，并用40μm的过滤器过滤至离心管中。

将分散的骨髓细胞以2×10⁶cells/mL培养于6孔板中，每孔加入1640完全培养基(含10wt％胎牛血清、5ng/mL IL-4、10ng/mL GM-CSF)。培养第三天时半量换液，将一半旧的培养基用等量新的1640完全培养基代替；第5天时半量换液，将一半旧的培养基用等量新的1640完全培养基代替。然后在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。培养第6天收集细胞即为骨髓来源未成熟的树突状细胞。

2、小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞的鉴定

倒置相差显微镜下观察未成熟树突状细胞(imDCs)的形态，结果见图2：在培养第一天，imDCs的骨髓前体细胞为小而圆的细胞，细胞膜光滑、无突起。第3天半量换液时可见多数为贴壁细胞，有少量小的半悬浮细胞集落。第5天半量换液时可见细胞集落增大、增多，多数悬浮生长，细胞体积增大，表面有毛刺状突起。

由于小鼠骨髓来源的imDC特异性表达CD11c，以CD11c阳性率评价DC的纯度。在imDC培养的第6天，培养细胞中imDC纯度可达到65％以上，说明诱导成功，进行下一步试验。

实施例三、神经肽的筛选

(1)四种神经肽抑制DCs分泌促炎细胞因子

四种神经肽UCN、α-MSH、VIP和AM委托上海吉尔生化公司加工生产并采用高效液相色谱进行纯化处理，其氨基酸序列分别为：尿皮质激素UCN(DDPPLSIDLTFHLLRTLLELARTQSQRERAEQNRIIFDSVGK)、血管活性肠肽VIP(HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN)、肾上腺皮质抑素AM(YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMAPRNKISPQGY)、促黑色素细胞激素释放因子α-MSH(SYSMEHFRWGKPV)。

采用UCN、α-MSH、VIP和AM四种神经肽(分别为UCN-DCs组、VIP-DCs组、α-MSH-DCs组和AM-DCs组)以10^-7mol/L终浓度分别共孵育处理未成熟树突状细胞48小时，同时给予低剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(200ng/ml)以共孵育方式刺激，以不用神经肽处理并给予低剂量LPS刺激未成熟树突状细胞为阴性对照组(标记为LPS-DCs组)，以既不用神经肽处理也不给予LPS刺激的未成熟树突状细胞为空白对照组(Ctrl-DCs组)，通过ELISA检测各组imDCs中IL-12p⁷⁰、IL-6、IL-1β和TNFα等促炎细胞因子的分泌水平，评价四种神经肽处理后imDCs的炎症应答能力，结果如图3所示。

由图3可以看出，若体系中既无LPS又无神经肽参与(即Ctrl-DCs组)，imDCs分泌各炎症因子浓度均较低。若体系中同时给予低剂量LPS刺激和神经肽处理，UCN-DCs组分泌的促炎类细胞因子IL-12p⁷⁰(63.55±9.19pg/mL vs.102.92±10.78pg/mL)、IL-6(2386.76±524.44pg/mL vs.27370.14±1640.17pg/mL)、IL-1β(1248.70±34.33pg/mL vs.1574.46±37.39pg/mL)、TNF-α(27568.09±2706.38pg/mL vs.35040.75±892.64pg/mL)浓度均低于LPS-DCs组，差异有统计学意义(P<0.05)。VIP-DCs组、α-MSH-DCs组和AM-DCs组分泌的IL-12p⁷⁰、IL-6、IL-1β以及TNF-α浓度相比LPS-DCs组也有不同程度的降低。

上述结果表明，神经肽能够抑制imDCs分泌促炎类细胞因子，说明神经肽已将imDCs诱导成为tDCs。其中UCN的抑制效果最好，这意味着UCN诱导imDCs成为tDCs的效果最好，可作为诱导tDCs的优选神经肽。

(2)UCN处理后DCs共刺激分子表达水平

用CFSE标记BALB/C来源的CD3e+T细胞，将C57BL/6J来源的imDCs采用终浓度10^{- 7}mol/L的UCN共孵育48小时，然后与上述标记的CD3e+T细胞混合培养72h后，流式检测T细胞的增殖情况，以评价UCN处理是否对imDCs抑制T细胞产生影响。以不用UCN处理的imDCs为对照组(Ctrl-DCs组)，以用UCN处理的imDCs为UCN处理组(UCN-DCs组)。此外，为了检验imDCs与T细胞的混合比例对T细胞增殖的影响，将imDCs和T细胞按照2：1、4：1以及8：1混合培养，结果见图4。

图4表明imDCs与T细胞以2：1、4：1以及8：1混合培养时，UCN处理组(即图中UCN-DCs)处理后体系中T细胞增殖的百分比均低于对照组(即图中Ctrl-DCs)，分别为(22.89±2.49)％vs.(48.10±1.53)％、(1.92±1.42)％vs.(59.81±1.86)％、(5.94±0.77)％vs.(35.40±2.20)％，数据均有统计学差异(P<0.05)。

上述结果说明UCN能将imDCs诱导为tDCs，进而通过tDCs抑制T细胞增殖，且以imDC与T细胞比例为4：1时为优选的抑制比例。该实验结果验证了UCN处理可能会促进imDCs诱导T细胞沉默的推论。

实施例四、氧化石墨烯的效果实验

本实施例中使用的氧化石墨烯GO和未成熟树突状细胞imDCs的获得参见实施例一和实施例二。

1、共孵育体系中氧化石墨烯对树突状细胞存活率的影响

分别将浓度为7.8μg/ml、15.6μg/ml、31.2μg/ml、62.5μg/ml的S-GO(50-200nm)、M-GO(200-500nm)、L-GO(500-1500nm)三级片径GO水溶液加入实施例二含有诱导成功的imDCs的培养基中共孵育48h后(分别标记为S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组)，用流式细胞术检测共孵育体系中的细胞存活率，结果如图5所示。

由图中结果可以看出，与对照组imDCs(标记为Ctrl-DCs组)比较，7.8μg/ml浓度GO处理的S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组细胞存活率分别为(93.29±0.99)％、(93.29±0.99)％、(91.89±2.97)％，15.6μg/ml浓度处理后的细胞存活率分别为(91.65±1.65)％、(91.56±1.60)％、(91.89±1.32)％，31.2μg/ml浓度处理后的细胞存活率分别为(83.71±1.66)％、(83.62±1.65)％、(83.48±1.98)％，62.5μg/ml浓度处理后的细胞存活率分别为(78.93±0.33)％、(78.72±0.29)％、(76.88±3.22)％。

因为7.8μg/ml、15.6μg/ml浓度下S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组的细胞存活率均高于90％，为获得更好的促进效果，优选15.6μg/ml为实施例中GO的工作浓度。

本实验存活率还表明使用氧化石墨烯GO对树突状细胞无明显毒副作用。

2、树突状细胞对氧化石墨烯的吞噬

结合实验1，采用透射电子显微镜和瑞士-吉姆萨染色观察不同片径GO被DCs摄取的情况，从而比较三种片径的氧化石墨烯(S-GO(50-200nm)、M-GO(200-500nm)、L-GO(500-1500nm))内吞模式的差异，结果如图6所示。

图6中的A幅(第二排为第一排图片中方框部分的放大图)可以看出，在透镜下观察到呈丝状的S-GO和M-GO被包裹在树突状细胞内囊泡中，S-GO游移至近核的区域，而L-GO呈条束状游离于树突状细胞膜外。透镜观察到的树突状细胞中氧化石墨烯尺寸与使用前单独GO材料的尺寸相符，说明GO未在培养基或细胞质中降解，以原有状态被树突状细胞吞噬。

图6中的B幅通过瑞士-吉姆萨染色也观察到摄取了不同片径GO后的DCs，直观地看到树突状细胞对不同片径GO的吞噬，而这种吞噬发生后，GO以团簇的形式(图中箭头所指)在细胞质中富集，分析正是这种吞噬行为的发生促进了其在体内的迁移能力。

本实验证明了树突状细胞对氧化石墨烯的吞噬能力，基于实验1对孵育48h后孵育体系中氧化石墨烯浓度的计算，粗略获知树突状细胞中吞噬的氧化石墨烯纳米颗粒的量小于氧化石墨烯用量(孵育量)的10％。

3、与氧化石墨烯共孵育后树突状细胞趋化因子受体表达水平

imDCs表面趋化因子受体表达与其迁移能力相关，本实验通过监测DCs表面趋化因子受体CCR7表达率，评价GO对DCs迁移功能的影响，结果见图7和表2。

如表2及图7所示，S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组CCR7表达丰度分别为20.00±2.53％、15.54±4.75、18.71±4.75，明显高于对照组imDCs(Ctrl-DCs组)8.66±2.06，差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果说明GO刺激的imDCs的表面CCR7表达率较对照组表达上调，表明GO可增强DCs迁移能力。

表2 DCs表面趋化因子受体CCR7表达率

实施例五、与氧化石墨烯共孵育后树突状细胞在体迁移与分布模式

通过动物体内实验验证GO处理对DCs体内归巢和迁移模式带来的促进作用，即采用组成型表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)的FVB转基因小鼠(Fluc.L2G85)骨髓来源的未成熟树突状细胞进行与氧化石墨烯的共孵育过程。

以携带萤火虫荧光素酶报告基因的未处理树突状细胞作为阴性对照组，阳性药物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激得到的成熟DCs作为阳性对照组(LPS-DCs组)，实施例四的S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组为GO处理组，将对照组及各GO处理组得到的Fluc+DCs(阴性对照为imDCs，下同)经脚垫被输注至已脱毛的野生型C57BL/6J小鼠中，小动物活体成像技术动态监测DCs从输注部位迁移到局部淋巴结的细胞数量，结果见图8。实验分别监测了DCs输注后4、24、48和72h后的发光情况。利用活体成像软件分析各淋巴组织发光强度数据，进一步计算出DCs的迁移数量。

图8中a区(腘窝淋巴结位置)发光信号强度能表示DCs从脚垫迁移到腘窝淋巴结(PLN)的数量，b区(脚垫位置)发光信号强度能表示DCs残留在脚垫的数量(图8中的A幅和B幅)。结果显示，S-DCs组细胞迁移至腘窝淋巴结区域的信号强度在24h、48h和72h均高于L-DCs组、M-DCs组和阴性对照组，信号强度在72h超过阳性对照(图8中的B幅和C幅)。发光信号强度系通过活体成像软件分析得到，经计算，S-DCs组、L-DCs组、M-DCs组及阴性对照组、阳性对照组DCs在48h迁移到PLN的百分比分别为0.17±0.02、0.12±0.06、0.11±0.05、0.07±0.01、0.17±0.01；72h迁移到PLN的百分比分别为0.24±0.05、0.16±0.09、0.15±0.05、0.08±0.02、0.23±0.08；说明迁移速率顺序为LPS-DCs≈S-DCs组＞L-DCs组＞M-DCs组＞对照组，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。该实施例证明氧化石墨烯可增强了皮下输注DCs的局部迁移及向淋巴组织归巢能力。

实施例六、树突状细胞诱导剂(即神经肽-氧化石墨烯复合物)的制备与表征

(1)神经肽-氧化石墨烯复合物的制备方法

用高压灭菌去离子水将15.6μg不同片径尺寸的氧化石墨烯与20μL(10^-5M)神经肽重悬于高压灭菌的EP管中，使体系偶联复合物终体积为200μL。用移液枪轻轻吹匀，将EP管盖关紧，移至洁净的恒温水平摇床，37℃下以200r/min频率水平振动30min，使GO与神经肽充分接触，室温静置0.5小时以上以用于后续试验。上述每EP管体系复合物优选诱导2×10⁶个DCs。

(2)神经肽-氧化石墨烯复合物与树突状细胞作用的工作浓度

本实施例采用流式细胞术检测了浓度分别为3.9μg/ml、7.8μg/ml、15.6μg/ml、31.2μg/ml的片径尺寸分别为S(50-200nm)和L(500-1500nm)的UCN-GO(氧化石墨烯)复合物(分别标记为UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组)以共孵育方式处理imDCs 48h后的细胞存活率，以找出最适合本发明的神经肽-氧化石墨烯复合物使用浓度，即至少保证在共孵育体系中DCs细胞存活率高于90％，结果如图9所示。

由图9可以看出，与对照组(即图中的Ctrl-DCs)比较，3.9μg/ml浓度UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组细胞存活率分别为(93.51±1.07)％，(93.34±2.27)％，7.8μg/ml浓度的细胞存活率分别为(90.02±2.95)％，(90.19±1.98)％，15.6μg/ml浓度的细胞存活率分别为(85.15±3.7)％，(82.65±1.75)％，31.2μg/ml浓度的细胞存活率分别为(83.93±1.23)％，(80.69±0.89)％。可知，3.9μg/ml、7.8μg/ml浓度下S-DCs组和L-DCs组的细胞存活率均高于90％。为获得与神经肽UCN高的偶联效率，应尽量使石墨烯过量，因此本发明优选较大剂量即7.8μg/ml为后续实施例中神经肽-氧化石墨烯复合物的氧化石墨烯工作浓度。

本实验还表明氧化石墨烯材料可与树突状细胞表面黏附，该黏附作用模式使部分复合物停留于细胞表面，可增加了神经肽与其细胞表面受体的作用时间和可能。

(3)神经肽-氧化石墨烯复合物的偶联效率与红外光谱表征

应用荧光成像系统监测神经肽与不同片径GO的偶联情况(采用本实施例第(2)部分中优选的工作浓度)评价静电吸附法偶联神经肽与GO的效率。首先，用标记了Cy5的四种神经肽分别与两种片径的GO(片径尺寸50-200nm,标记为S；片径尺寸500-1500nm，标记为L)以静电吸附方式进行偶联，以相同浓度的Cy5-神经肽水溶液作为对照组。偶联结束后，18000g离心30min将GO与游离的神经肽分离。通过计算各偶联组与对照组中游离神经肽水溶液的总荧光强度的比值(Y)，计算出四种神经肽与GO的偶联效率(CR)％，公式：(CR)％＝1-Y。

结果如图10(图中Nerp代表神经肽)所示，UCN与小片径GO，即S的偶联效率(89.33±1.53)％高于GO与其他神经肽(即α-MSH、VIP和AM)的偶联效率，GO与α-MSH、VIP和AM的偶联效率分别为(76.00±2.65)％、(47.33±1.15)％、(36.00±2.01)％；与大片径GO，即L的偶联效率(86.33±1.53)％也高于其他组(分别为(55.67±0.58)％、(35.33±2.08)％、(32.67±1.73)％)，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明，上述两种片径GO与UCN的偶联效率均可达85％以上。

应用傅立叶变换红外光谱(FTIR)对神经肽-氧化石墨烯复合物进行表征，以表现UCN与S、L不同片径GO的偶联情况。如图11所示，UCN、UCN-S和UCN-L样品均有明显肽键吸收峰，而S和L无偶联样品则没有，说明UCN与S、L尺寸片径GO偶联成功。

实施例七、神经肽-氧化石墨烯复合物与诱导树突状细胞耐受

本实施例用来体现神经肽-氧化石墨烯复合物与树突状细胞作用后抑制细胞因子分泌情况。实施例三已证明神经肽处理可抑制DCs分泌促炎类细胞因子，为了验证应用GO负载UCN后诱导tDCs的能力是否进一步提高，本实施例通过ELISA检测UCN被GO负载前后抑制imDCs促炎因子分泌的能力。

实验过程参见实施例三的第(1)部分，分组按照实施例三第(2)部分中的分组方式，结果如图12所示，给予低剂量LPS刺激后(200ng/ml)，UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组分泌的促炎类细胞因子浓度均低于UCN-DCs组，分别为IL-12p⁷⁰(61.85±4.99pg/mL vs.61.03±0.52pg/mL vs.68.99±3.91pg/mL)、IL-6(19935.66±1286.64pg/mL vs.22733.32±5396.41pg/mL vs.30440.11±1655.73pg/mL)、IL-1β(1395.66±62.12pg/mL vs.1394.44±62.12pg/mL vs.1566.65±13.82pg/mL)、TNF-α(64292.69±1278.26pg/mL vs.61986.79±2537.94pg/mL vs.71771.30±883.27pg/mL)，组间差异均有统计学意义(P<0.05)；Ctrl-DCs组与S-DCs组、L-DCs组分泌的四种促炎细胞因子分泌水平无组间差异。同时也发现，单纯GO处理并未显著改变各细胞因子的分泌水平。该结果说明，UCN被GO负载后抑制DCs分泌促炎类细胞因子的能力提高，说明UCN被GO负载后对T细胞增殖的抑制能力增强，从而表明UCN被GO负载后诱导tDCs的能力增强。

实施例八、活体成像监测“神经肽-氧化石墨烯复合物”诱导耐受性DCs在体抑制急性移植物抗宿主病的效果

(1)急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)小鼠模型的建立

采用60Coγ射线对受鼠行全身放射性照射(total body irradiation,TBI)，剂量率80cGy/min，总剂量8.5Gy。在照射后4-6h内经尾静脉输注供者造血干细胞进行移植。供者细胞制备：颈椎脱臼法处死BALB/C小鼠，在超净台内取其股骨、胫骨和脾脏，用无菌培养基从胫骨和股骨中冲洗出骨髓，研磨脾脏，采用200目钢筛分别制成骨髓和脾脏单核细胞悬液，裂解红细胞后用PBS重悬。每只C57BL/6J受鼠接受来自BALB/C供鼠的骨髓细胞(1×10⁷/只)和脾细胞(2×10⁷/只)，每只小鼠接受注射的总体积为300μL。

以C57BL/6J小鼠(H-2Kb)作为受鼠，BALB/C小鼠(H-2Kd)作为供鼠进行异基因型造血干细胞移植。受体小鼠在0d进行60Coγ(8.5Gy)照射后，6h内经尾静脉输注供者骨髓细胞和脾细胞混合液，考察不同时间点供者植入情况(见图13A)及小鼠存活情况(见图13B)。

结果显示，经TBI照射后BALB/C为供者的小鼠可形成完全的供体植入，小鼠MHC由H-2Kb转换为H-2Kd。对移植小鼠进行观察发现，同基因移植组(C57BL/6J→C57BL/6J)小鼠无明显变化，且可全部存活；TBI组小鼠明显消瘦，活动度迅速下降，在实验第11d全部死亡。相比之下，异基因移植组(BALB/C→C57BL/6J)小鼠在实验第3d至第5d体重明显下降、出现弓背，且毛发絮乱并缺乏光泽，活动度下降合并腹泻，皆为aGVHD典型症状，实验第17d该组小鼠全部死亡。

(2)活体成像监测耐受性DCs在体抑制急性移植物抗宿主病的效果

利用小动物活体成像系统监测T细胞在移植后受体小鼠体内的扩增。在6组可视化aGVHD模型小鼠行造血干细胞移植同一天分别经尾静脉过继性输注4×10⁶个imDCs，这6组输注的imDCs在输注前先分别未经处理、采用S-GO、L-GO、UCN、UCN-S-GO、UCN-L-GO处理，即分别对应形成Ctrl-DCs组、S-DCs组、L-DCs组、UCN-DCs组、UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组，将不输注DCs组命名为BM+Tc组(即为空白对照组)。监测到的小鼠全身发光信号强度表示T细胞的增殖水平，通过活体成像软件分析得到实验结果见图14。

各组小鼠体内总荧光强度均低于BM+Tc组(8.18×10⁸±3.06×10⁷)，在移植第6天时，Ctrl-DCs组、S-DCs组、L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为(1.23×10⁸±1.54×10⁷)、(1.29×10⁸±1.41×10⁷)、(1.47×10⁸±1.41×10⁷)，UCN-DCs组、UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为(5.19×10⁷±1.47×10⁶)、(1.28×10⁷±4.00×10⁵)、(2.33×107±2.25×10⁶)；其中，UCN-DCs组总荧光强度低于Ctrl-DCs组，UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组总荧光强度低于UCN-DCs组，差异有统计学意义(P<0.05)，Ctrl-DCs组、S-DCs组和L-DCs组间无统计学差异，(P>0.05)。UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组间无统计学差异(P>0.05)。综上说明UCN-GO复合物诱导tDCs在移植受鼠体内抑制T细胞增殖的能力强于UCN，且不同片径GO纳米载体均增强UCN诱导tDCs能力从而具有更强的抗GVHD治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (20)

1.一种树突状细胞诱导剂，其特征在于，为神经肽和氧化石墨烯的复合物，能将树突状细胞诱导成为耐受性树突状细胞；所述神经肽和氧化石墨烯之间通过偶联形成复合物；所述偶联包括化学偶联和物理偶联，所述复合物体系中氧化石墨烯的终浓度为1.95-31.2μg/mL，神经肽的终浓度为0.1-10.0μmol/L。

2.根据权利要求1所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述树突状细胞为未成熟树突状细胞。

3.根据权利要求1所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述神经肽和氧化石墨烯之间通过吸附作用的物理偶联形成复合物。

4.根据权利要求1所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述复合物体系中氧化石墨烯的终浓度为1.95-7.8μg/mL；神经肽的终浓度为0.5-5.0μmol/L。

5.根据权利要求1所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述复合物体系中氧化石墨烯的终浓度为3.9μg/mL，神经肽的终浓度为1.0μmol/L。

6.根据权利要求1-5任一所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述神经肽选自血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、α-促黑色素细胞激素释放因子(α-melanocortins,α-MSH)、尿皮质激素(urocortin,UCN)、肾上腺皮质抑素(adrenomedullin,AM)中一种或几种。

7.根据权利要求1所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述氧化石墨烯具有微观片层结构，纯度不小于99％。

8.根据权利要求7所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述复合物中氧化石墨烯的片径尺寸为50-1500nm。

9.根据权利要求7所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述复合物中氧化石墨烯的片径尺寸为50-500nm。

10.根据权利要求7所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述复合物中氧化石墨烯的片径尺寸为50-200nm。

11.根据权利要求7-10任一所述树突状细胞诱导剂，其特征在于，所述氧化石墨烯的片层厚度为0.8-1.2nm。

12.一种制备权利要求1-11任一所述树突状细胞诱导剂的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)用无菌水将氧化石墨烯与神经肽混合重悬，重悬体系中氧化石墨烯的终浓度为1.95-31.2μg/mL，神经肽的终浓度为0.1-10.0μmol/L；

(2)将步骤(1)的重悬体系于室温下静置半小时以上，得到神经肽-氧化石墨烯复合物悬浮体系，其中神经肽-氧化石墨烯复合物即为树突状细胞诱导剂。

13.根据权利要求12所述方法，其特征在于，所述重悬体系中氧化石墨烯的终浓度为1.95-7.8μg/mL，神经肽的终浓度为0.5-5.0μmol/L。

14.根据权利要求12所述方法，其特征在于，所述重悬体系中氧化石墨烯的终浓度为3.9μg/mL，神经肽的终浓度为1.0μmol/L。

15.一种免疫调节剂，其特征在于，包括权利要求1-11任一所述树突状细胞诱导剂和未成熟树突状细胞。

16.根据权利要求15所述免疫调节剂，其特征在于，还包括经由该树突状细胞诱导剂诱导的耐受性树突状细胞。

17.根据权利要求15或16所述免疫调节剂，其特征在于，所述免疫调节剂经树突状细胞诱导剂诱导未成熟树突状细胞成为耐受性树突状细胞得到。

18.一种制备权利要求15-17任一所述免疫调节剂的方法，其特征在于，用培养基重悬未成熟树突状细胞并调整未成熟树突状细胞浓度为1×10⁶细胞/mL，得到细胞重悬液；

向细胞重悬液中加入权利要求1-11任一所述树突状细胞诱导剂，使得每200μL树突状细胞诱导剂中含有2×10⁶个未成熟树突状细胞，37℃孵育24-72h后收集细胞，即得到所述免疫调节剂。

19.权利要求1-11任一所述树突状细胞诱导剂在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病药物中的应用。

20.根据权利要求19所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为急性移植物抗宿主病、风湿性关节炎、或免疫性糖尿病。

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