CN114874981A - 一种间充质干细胞外泌体及用于免疫细胞培养的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞外泌体及用于免疫细胞培养的用途。本发明提供了一种人脐带间充质干细胞分泌的外泌体，通过2‑氨基阿糖腺苷对人脐带间充质干细胞干预培养获得。体外和体内活性研究均表明，该外泌体可以增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，效果显著优于未经2‑氨基阿糖腺苷干预培养的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。因此，本发明提供的外泌体可用于相关体外培养基或体内抗肿瘤药物。

Description

一种间充质干细胞外泌体及用于免疫细胞培养的用途
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种间充质干细胞外泌体及用于免疫细胞培养的用途。
背景技术
作为干细胞临床治疗最常用的细胞类型之一，间充质干细胞(MSCs)是基质来源的成体干细胞，主要存在于骨髓、牙髓、脂肪、脐带等结缔组织和器官间质中。研究发现MSCs的作用机制是由于其旁分泌因子和外泌体/微囊泡的作用，其中可能主要由囊泡中包含的旁分泌因子介导。细胞外囊泡(EV)目前被认为是通过生物活性脂质、蛋白质和RNA转移进行细胞间通讯的重要信使。外泌体直径为30～150nm，当多泡体与细胞膜融合时释放到细胞外，外泌体富含许多生物活性分子，如脂质、蛋白质、mRNA、转移RNA(tRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和线粒体DNA(mtDNA)。外泌体被释放到细胞外，可以被微环境中的靶细胞吸收，也可以通过生物体液运送到远处。目前公认的是，在多种间充质干细胞中，脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)相对而言是外泌体较为理想的来源。
近年来，肿瘤免疫治疗在多种恶性肿瘤中显示了确切的临床疗效，主要包括免疫检查点抑制剂和免疫细胞治疗。细胞免疫治疗通过回输激活的免疫细胞介导抗肿瘤免疫反应，以达到治疗肿瘤的目的。与传统的肿瘤治疗手段相比，细胞免疫治疗更注重个体化，同时还能产生持久的抗肿瘤免疫记忆。CIK细胞是众多免疫细胞中的一种。
由于细胞免疫治疗的效果依赖回输免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，研究者们花费了很多精力在提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性方面。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种间充质干细胞外泌体及用于免疫细胞培养的用途，以提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
本发明技术方案如下：
一种间充质干细胞外泌体，该外泌体为2-氨基阿糖腺苷干预培养的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
上述间充质干细胞外泌体用于制备增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤活性的培养基的用途，所述免疫细胞为CIK细胞，所述肿瘤细胞为K562肿瘤细胞。
上述间充质干细胞外泌体用于制备增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物的用途，所述免疫细胞为CIK细胞，所述肿瘤细胞为K562肿瘤细胞。
有益技术效果：
本发明提供了一种人脐带间充质干细胞分泌的外泌体，通过2-氨基阿糖腺苷对人脐带间充质干细胞干预培养获得。体外和体内活性研究均表明，该外泌体可以增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，效果显著优于未经2-氨基阿糖腺苷干预培养的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。因此，本发明提供的外泌体可用于相关体外培养基或体内抗肿瘤药物。
附图说明
图1为流式检测hUC-MSCs表面标志物CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR的表达，显示CD73、CD90、CD105阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达。
图2中A为外泌体透射电镜观察结果，外泌体呈类圆形，直径约100nm；B为外泌体标志蛋白表达检测，各组CD9、CD63和CD81蛋白表达基本一致。
图3为各组裸鼠移植瘤剥离后比较大小。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
一、试验材料
人脐带间充质干细胞hUC-MSCs购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。
胎牛血清、α-MEM培养基和RPMI 1640培养基购自Gibco公司。
青链霉素、western blot和流式检测试剂材料购自碧云天生物。
2-氨基阿糖腺苷购自天门恒昌化工有限公司，纯度99％。
ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒购自普迈精医科技(北京)有限公司。
人淋巴细胞分离液购自索莱宝，INF-γ、IL-2、IL-1α和抗人CD3单抗购自碧云天生物。
肿瘤细胞K562细胞购自ATCC。6～8周龄雄性BALB/c-nu裸鼠(SPF清洁级，体重20±2g)购自赛业生物科技有限公司。
二、试验方法
1、hUC-MSCs培养
将hUC-MSCs用α-MEM完全培养基(体积分数为10％胎牛血清+1％青链霉素+α-MEM培养基)置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，当细胞达约75％融合时，消化传代。倒置显微镜下观察细胞生长状态。流式检测表面标志物CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR表达。
2、hUC-MSCs分组干预及外泌体的分离制备、鉴定
取生长状态良好的hUC-MSCs，消化，用α-MEM完全培养基置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，12h后，普通组更换为不含胎牛血清的α-MEM培养基，干预A组更换为不含胎牛血清、含50μM 2-氨基阿糖腺苷的α-MEM培养基，干预B组更换为不含胎牛血清、含100μM 2-氨基阿糖腺苷的α-MEM培养基，继续培养72h，收集细胞培养上清液，3000r/min离心30min去除细胞碎片，0.22μm滤膜过滤，收集滤液，用微孔离心过滤装置100000r/min离心2h浓缩，得到浓缩液，使用ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒依据说明书提取浓缩液中的外泌体。用PBS将外泌体重悬，BCA法测定其浓度，-80℃保存备用。
鉴定1，透射电镜观察形态：取少量外泌体悬液滴加在铜网上，室温1min后滴加20μL磷钨酸溶液，1min后吸去磷钨酸溶液，红外灯下烘烤10min，吸去多余液体，透射电镜观察。
鉴定2，Western blot检测外泌体标志蛋白：各组取等量外泌体检测外泌体标志物蛋白CD9、CD63和CD81的表达。
3、CIK细胞培养
采集健康志愿者外周血用预冷的PBS等体积稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g、4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI 1640培养基重悬细胞后置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养2h。收集单核细胞中的悬浮细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度至2×106个/mL，加入1000U/mL INF-γ，24h后添加500U/mL IL-2、l00U/mL IL-1α和50ng/mL抗人CD3单抗。每3d添加含10％胎牛血清、500U/mL IL-2的RPMI 1640培养基继续培养，并调整细胞密度为2×106个/mL。
连续培养12天，收集细胞备用。
4、CIK细胞体外杀伤活性
效应细胞的制备：取连续培养12天的CIK细胞，消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养过夜，普通组更换为含有20μg/mL“2、hUC-MSCs分组干预及外泌体的分离制备、鉴定”中普通组外泌体的RPMI 1640完全培养基，干预A组更换为含有20μg/mL“2、hUC-MSCs分组干预及外泌体的分离制备、鉴定”中干预A组外泌体的RPMI 1640完全培养基，干预B组更换为含有20μg/mL“2、hUC-MSCs分组干预及外泌体的分离制备、鉴定”中干预B组外泌体的RPMI 1640完全培养基，对照组使用不含任何干细胞外泌体的RPMI 1640完全培养基，培养72h，收集细胞备用。
靶细胞的制备：取肿瘤细胞K562细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，消化传代。
效靶共孵育：以上述不同方法制备的CIK细胞为效应细胞，以对数生长期的K562细胞为靶细胞，分别用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基制成2×106/mL、2×105/mL的细胞悬液，各取100μL接种于96孔板中(效靶比10:1)，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养。24h后，每孔加入20μL CCK-8试剂，继续培养4h，用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光度OD值，根据公式计算杀伤率：杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×l00％。
5、CIK细胞体内杀伤活性
杀伤细胞的制备：取连续培养12天的CIK细胞，消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养过夜，普通组更换为含有20μg/mL“2、hUC-MSCs分组干预及外泌体的分离制备、鉴定”中普通组外泌体的RPMI 1640完全培养基，干预组更换为含有20μg/mL“2、hUC-MSCs分组干预及外泌体的分离制备、鉴定”中干预B组外泌体的RPMI 1640完全培养基，培养72h，收集细胞备用。
肿瘤细胞的制备：取肿瘤细胞K562细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，消化传代。
裸鼠移植瘤模型的构建：将对数生长期的K562细胞调整细胞浓度至107/mL。用1mL无菌注射器吸取细胞悬液0.2mL(含2×106细胞)备用。消毒裸鼠右侧腰部皮肤，将注射器内细胞注射于右侧腰部皮下。注射完毕后，连续观察12d，待裸鼠右侧腰部长出直径约7mm的皮下瘤，裸鼠移植瘤模型建立成功。
分组、注射、剥离移植瘤和比较：挑选15只移植瘤大小一致的裸鼠，随机分为空白组、普通组和干预组，普通组注射上述普通组制备的杀伤细胞，干预组注射上述干预组制备的杀伤细胞，空白组注射等体积生理盐水。具体方法为：将上述杀伤细胞用生理盐水重悬，每次通过尾静脉注射3×107个CIK细胞，5天1次，注射3次；最后1次注射后第5天处死，剥离移植瘤，比较各组移植瘤大小。
6、统计学分析
应用SPSS统计软件进行统计学分析，计量资料以平均值±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
三、试验结果
1、hUC-MSCs培养
细胞呈长梭形漩涡状生长排列紧密，流式检测显示CD73、CD90、CD105阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达(如图1)，符合hUC-MSCs特点。
2、外泌体的分离制备和鉴定
透射电镜观察如图2中A所示，呈类圆形，直径约100nm。外泌体标志蛋白表达如图2中B所示，各组CD9、CD63和CD81蛋白表达水平基本一致。
3、CIK细胞体外杀伤活性
各组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率如表1所示，与对照组相比，普通组CIK细胞的杀伤活性提高明显，这符合MSCs外泌体有助于增强CIK细胞杀伤力的现有认知；与普通组相比，干预A组和干预B组CIK细胞的杀伤活性提高明显，说明2-氨基阿糖腺苷干预培养的hUC-MSCs分泌的外泌体对CIK细胞杀伤力的增强作用更明显。
表1各组CIK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤率
对照组 普通组 干预A组 干预B组
杀伤率(％) 35.4±3.2 45.8±3.7 63.1±4.1 78.5±3.8
4、CIK细胞体内杀伤活性
图3为各组剥离移植瘤的大小比较，肉眼可见地发现干预组移植瘤明显小于普通组和空白组，该体内试验同样说明2-氨基阿糖腺苷干预培养的hUC-MSCs分泌的外泌体对CIK细胞杀伤力的增强作用更明显。
体外和体内活性研究均表明，本发明提供的外泌体可以增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，效果显著优于未经2-氨基阿糖腺苷干预培养的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体，可能与2-氨基阿糖腺苷干预培养影响了外泌体内相关生物信号分子的表达有关。

Claims (3)

1.一种间充质干细胞外泌体，其特征在于：该外泌体为2-氨基阿糖腺苷干预培养的人脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
2.权利要求1所述的间充质干细胞外泌体用于制备增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤活性的培养基的用途，所述免疫细胞为CIK细胞，所述肿瘤细胞为K562肿瘤细胞。
3.权利要求1所述的间充质干细胞外泌体用于制备增强免疫细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物的用途，所述免疫细胞为CIK细胞，所述肿瘤细胞为K562肿瘤细胞。
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