CN117511870A - 具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法及其应用 - Google Patents
具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法及其应用;制备方法的步骤为:从PBMC中分离出CD4+T细胞,获得辅助性T细胞;取辅助性T细胞培养,收集培养上清液并经消化液消化、离心后培养沉淀物,获得干细胞;将辅助性T细胞与干细胞混合共培养获得上清液;提取辅助性T细胞与干细胞共培养的上清液经离心、回流、浓缩、洗涤处理,获得外泌体制剂。这种辅助性免疫T细胞和干细胞共培养,可以相互促进富含免疫调节因子外泌体的分泌,并可缩短混合细胞培养周期,达到有效提高混合细胞外泌体的分泌效率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物制备领域,尤其涉及一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构;存在于细胞培养上清液液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中;外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息,不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用,更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
外泌体因来源细胞差异大小不一,变异范围从30~100nm到40~200nm不等,是生物活性蛋白、脂质、信使核糖核酸(mRNA)和微小核糖核酸(miRNA)的载体,在细胞间通讯及介导生物功能方面起至关重要的作用。外泌体起源于胞内早期内小体(earlyendosome),内小体膜内陷并发育成熟形成多囊体(MVBs),与质膜融合后通过胞吐作用释放。生理条件下,几乎所有代谢活跃的细胞均能释放外泌体,并通过血液、淋巴液、脑脊液等体液系统转运至机体各处,可广泛存在于血液、唾液、脑脊液、母乳、尿液等处。有确凿证据表明,外泌体具有与来源细胞相似的功能作用,而组织损伤、缺氧等应激条件,可影响相关细胞外泌体的成分组成及合成、分泌,进而参与损伤修复等病理过程。
目前,已有将脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞分泌的外泌体用于肝损伤修复、急性肝衰竭和病毒性肝炎药物的报道,但这些外泌体都是单一细胞分泌的,其一般只能用于治疗某一疾病药物方面的应用,不具备提升人体自身免调控功能,无法应用于自身免疫性疾病药物中,如多发性硬化症(MS),1型糖尿病(T1D)和系统性红斑狼疮(SLE)等疾病治疗/预防的药物中。
发明内容
基于上述问题,本发明所要解决的问题在于提供一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法及其应用。
本发明的技术方案如下:
一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法,包括如下步骤:
辅助性T细胞培养:首先,从健康供者外周血中分离出PBMC,并筛选出CD4+T细胞;其次,用第一培养基培养CD4+T细胞5~6天,回收第一培养液并离心去除上清液,收集细胞沉淀,获得辅助性T细胞,备用;
干细胞培养:首先,在所述辅助性T细胞培养至第3天时,取1×107个间充质干细胞用第二培养基培养2~3天,回收第二培养液中的上清液;其次,往回收的上清液中加入消化液进行消化处理,消化处理结束后,收集细胞悬液;最后,对收集的细胞悬液离心,去除上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用;
细胞共培养:首先,将所述辅助性T细胞和干细胞混合后用第三培养基重悬,得到混合细胞悬液;其次,将细胞悬液中的混合细胞接种至培养器中并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、3~8v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,培养结束后收集第三培养液中的上清液;
外泌体制剂提取:首先,对收集到的第三培养液中的上清液进行离心处理,离心结束后,收集离心上清液;其次,将离心上清液用第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,获得回流浓缩液;接着,往回流浓缩液中加入含1v/v%人血白蛋白的生理盐水,继续循环过滤,得到洗涤浓缩液;最后,将洗涤浓缩液用第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得T细胞与干细胞的复合细胞外泌体制剂。
一实施例,所述制备方法中,所述辅助性T细胞培养步骤中,所述第一培养基包括DMEM或DMEM/F12基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50~200IU/mL的IL-2、终浓度为1~10ng/mL的TGF-β1、终浓度为1~5ng/mL的TGF-β2、终浓度为50~500ng/mL的CD3、终浓度为20~200ng/mL的CD28、终浓度为2~10μg/mL的转铁蛋白、终浓度为0.5~3μg/mL的胰岛素样生长因子-1和终浓度为5v/v%的AB血清。
一实施例,所述制备方法中,所述辅助性T细胞培养步骤中,所述CD4+T细胞的筛选采用DynabeadsTM CD4 阳性分离试剂盒;CD4+T细胞培养时,CD4+T细胞的接种数量为2×107~5×107个。
一实施例,所述制备方法中,用第一培养基培养CD4+T细胞5~6天时,在第3天需补液一次,且第一培养基的补充量为培养器中培养液总体积量的2倍。
一实施例,所述制备方法中,所述干细胞培养步骤中,所述第二培养基包括DMEM或DMEM/F12基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为10~30ng/mL 的干细胞因子(SCF) 和终浓度为2v/v%的Ultroser G血清替代物。
一实施例,所述制备方法中,所述干细胞培养步骤中,加入含浓度0.05%的胰酶的消化液消化处理1~2 min,且及消化液与第二培养基中回收上清液的体积比为3:1;细胞悬液采用300g离心6min,且获得的沉淀物,即干细胞采用PBS洗涤1~2次。
一实施例,所述制备方法中,所述细胞共培养步骤中,所述第三培养基包括DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50~100IU/mL的IL-2、终浓度为0.2~2μM的视黄酸、终浓度为5~30μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为5~20ng/mL 的干细胞因子、终浓度为0.4~2mg/mL的人血清白蛋白和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
一实施例,所述制备方法中,所述细胞共培养步骤中,混合细胞悬液中,辅助性T细胞和干细胞数量比为2~3:1;将混合细胞接种至培养器中时,混合细胞的接种密度控制在1.5×106~2.0×106个/mL;混合细胞接种至培养器静置培养12天时,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基时,并维持混合细胞密度为2.0×106个/mL。
一实施例,所述制备方法中,所述外泌体制剂提取步骤中,将收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min离心处理;离心上清液过滤时,所述第一中空纤维管中的中空纤维膜孔径为0.01μm;洗涤浓缩液制备时,回流浓缩液的体积数控制在所述离心上清液体积数的1/10,回流浓缩液与生理盐水的体积比为1:4,第二中空纤维管中的中空纤维膜孔径为0.2μm;洗涤浓缩液的体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数。
通过上述方法制得的复合细胞外泌体制剂,具有免疫调控功能;该外泌体制剂可以用于制备治疗自身免疫性疾病的药物;其中,免疫性疾病包括多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)和系统性红斑狼疮(SLE)等。
与现有技术相比,本发明具有如下技术优点:
1、辅助性免疫T细胞和干细胞共培养,可以相互促进富含免疫调节因子(如,IL-10、TGF-β)、表达蛋白(如,PD-L1、CD95L)及miRNA(如,Let-7d、miR-146a)等外泌体的分泌,并可缩短混合细胞培养周期(如,混合细胞培养到第9天与单一细胞培养到第12天的细胞扩增数量基本相当),达到有效提高混合细胞外泌体的分泌效率(如,混合细胞分泌的外泌体制剂颗粒浓度高达7.4×1010 Particles/mL,是单一细胞分泌外泌体制剂颗粒浓度的2~9倍);
2、相对于单一细胞分泌的外泌体,复合细胞外泌体制剂具有更好的杀瘤性,且杀瘤作用时并非细胞起作用,而是外泌体起作用;因此,外泌体可在体外进行工程化大规模异体细胞培养。
附图说明
图1为实施例1至3、对比例1至2中对应细胞培养扩增曲线图;
图2为实施例1中混合细胞共培养第12天外泌体制剂颗粒浓度测定图;
图3为实施例2中混合细胞共培养第12天外泌体制剂颗粒浓度测定图;
图4为实施例3中混合细胞共培养第12天外泌体制剂颗粒浓度测定图;
图5为对比例1中T细胞培养第12天外泌体制剂颗粒浓度测定图;
图6为对比例2中干细胞+PBMC共培养第12天外泌体制剂颗粒浓度测定图;
图7为小鼠给药后的细胞流失检测对照柱状图;
图8为小鼠给药后的ANA抗体检测水平对照柱状图;
图9为小鼠给药后的抗dsDNA检测水平对照柱状图;
图10为小鼠给药前、后尿蛋白水平曲线图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的干细胞和免疫T细胞的复合细胞外泌体制剂,属于细胞生物制剂,包括T细胞外泌体和干细胞外泌体,同时兼具有T细胞和干细胞的免疫活性,可实现免疫调控。
上述复合细胞外泌体制剂,采用如下工艺步骤制得:
S1、配制促进复合细胞外泌体分泌的培养基,包括第一培养基、第二培养基以及第三培养基等的配制。
该步骤S1中,下述三种培养基的配制工艺顺序,可以相互置换,具体操作如下:
S11、配制第一培养基:以DMEM或DMEM/F12基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50~200IU/mL的IL-2、终浓度为1~10ng/mL的TGF-β1、终浓度为1~5ng/mL的TGF-β2、终浓度为50~500ng/mL的CD3、终浓度为20~200ng/mL的CD28、终浓度为2~10μg/mL的转铁蛋白、终浓度为0.5~3μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和终浓度为5v/v%的AB血清;
S12、配制第二培养基:以DMEM或DMEM/F12基础培养基,该基础培养基中添加有终浓度为10~30ng/mL 的干细胞因子 (SCF) 和终浓度为2%的Ultroser G血清替代物;
S13、配制第三培养基:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50~100IU/mL的IL-2、终浓度为0.2~2μM的视黄酸、终浓度为5~30μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为5~20ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为0.4~2mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
S2、细胞培养,即辅助性T细胞培养和干细胞培养。
该步骤S2中,辅助性T细胞培养和干细胞培养分别如下。
S21、辅助性T细胞培养,其工艺如下:
S211、从健康供者的外周血中分离出PBMC,并用DynabeadsTMCD4 阳性分离试剂盒从PBMC中分选出CD4+T细胞;
S212、将分选出的CD4+T细胞,按照2×107~5×107个细胞数量,接种至培养器中,并在培养器中加入第一培养基后置于培养箱37℃、5v/v%CO2环境中培养CD4+T细胞5~6天,且在第3天需补液一次,补液量为培养器中培养液总体积量的2倍,培养结束后回收第一培养液;
S213、将步骤S212中回收的第一培养液用500g离心10min;离心结束后,去除上清液,收集细胞沉淀,获得辅助性T细胞,备用。
S22、干细胞培养,其工艺如下:
S221、在步骤S212中的辅助性T细胞培养至第3天时,取1×107个/mL冻存复苏得到的间充质干细胞,也就是间充质种子干细胞,接种到另一培养器中并往该培养器中加入第二培养基后置于培养箱37℃、5v/v%CO2环境中进行传代培养2~3天,回收第二培养液中的上清液;
S222、对步骤S221中的回收上清液用PBS洗涤1~2遍,随后加入含0.05v/v%胰酶的消化液消化1~2min,且消化液与回收上清液的体积比为3:1,终止消化,收集细胞悬液;
S223、对步骤S222中收集的细胞悬液300g离心6min,离心结束后去除上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用。
S3、细胞共培养,即辅助性T细胞和干细胞的共培养,获得上清液。
该步骤S3的具体工艺如下:
S31、将辅助性T细胞与干细胞混合后用50mL第三培养基重悬,得到混合细胞悬液,并控制细胞悬液中辅助性T细胞与干细胞的数量比为2~3:1;
S32、按照混合细胞接种密度1.5×106~2.0×106/mL,将混合细胞悬液中的混合细胞接种至培养器后并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、3~8v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,且每次补液后维持混合细胞密度为2.0×106个/mL,培养结束,收集第三培养液中的上清液。
S4、T细胞与干细胞的复合细胞外泌体制剂的提取。
该步骤S4的具体工艺如下:
S41、将步骤S32中收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min,离心结束后,收集离心上清液;
S42、将离心上清液用中空纤维膜孔径为0.01μm的第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,直至获得的回流浓缩液的体积数为离心上清液体积数的1/10,停止循环,获得回流浓缩液;
S43、往回流浓缩液中加入含1v/v%人血白蛋白的生理盐水,且生理盐水与回流浓缩液的体积比为4:1;继续循环过滤,直至获得的洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数,停止循环,得到洗涤浓缩液;
S44、将洗涤浓缩液用中空纤维膜孔径为0.2μm的第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得复合细胞外泌体制剂。
上述方法制得的复合细胞外泌体制剂,具有免疫调控功能,可用于制备免疫性疾病治疗的药物,如在制备多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)和系统性红斑狼疮(SLE)等药物中的应用。
本发明的复合细胞外泌体制剂的制备工艺中,第一培养基、第二培养基以及第三培养基等的配制时,较好地;第一培养基、第二培养基以及第三培养基配制如下:
配制第一培养基:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为70~150IU/mL的IL-2、终浓度为2~8ng/mL的TGF-β1、终浓度为2~4ng/mL的TGF-β2、终浓度为100~400ng/mL的CD3、终浓度为60~150ng/mL的CD28、终浓度为3~8μg/mL的转铁蛋白、终浓度为1~2μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和终浓度为5v/v%的AB血清;
配制第二培养基:以DMEM/F12基础培养基,该基础培养基中添加有终浓度为15~25ng/mL 的干细胞因子 (SCF) 和终浓度为2%的Ultroser G血清替代物;
配制第三培养基:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为60~80IU/mL的IL-2、终浓度为0.6~1μM的视黄酸、终浓度为10~25μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为10~16ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为0.8~1.5mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
本发明中,外周血采用脐带血,从脐带血中分离、培养单个核细胞(PBMC),具体工艺如下。
1、脐带血单个核细胞的分离
(1)粗分离
将脐带血分装到两支规格为50mL的离心管(标记为1号和2号离心管)中,每支离心管分装30mL,并计算血液体积。
用3mL规格的巴氏吸管吸取血样,滴2滴到EP管中,进行血细胞分析仪检测细胞数量。
将离心管中的血液离心处理;离心过程中,离心力为650g、离心时间为10min,且先升8档、后降8档。
另外准备两支相同规格的离心管(标记为3号和4号),每支离心管加入15mL淋巴细胞分离液。
(2)血浆制备
两支装有全血的离心管离心结束后,将离心管转移至安全柜台面,用25mL移液管吸取上层血浆至一支新的离心管(标记为5号)中。取1mL血浆作为留样,标记并放置于-20度冰箱储存。将装有剩余血浆的5号离心管封口膜封口,放置56℃水浴锅,灭火30min。
灭活结束后,立即将装有血浆的5号离心管放置在-20℃冰箱中15min,随后,取出5号离心管进行离心处理,此时,离心力为3000g、离心时间为10min。
最后,将5号离心管中的血浆上清液倒入至另一支新的离心管(标记为6号)中,封口,置于2-8℃冰箱中冷冻保存,待用。
(3)单个核细胞制备
用生理盐水1:1稀释上述1号和2号离心管中剩余下层血细胞并混匀。并将对应的将血细胞稀释液分别加入到盛有淋巴细胞分离液的3号和4号离心管中。处理过程如下:
倾斜45°装有淋巴分离液的3号和4号离心管,分别用电动移液器将少量血细胞悬液加入到分离液上方1cm处,把血细胞悬液铺开;倾斜离心管的目的是使悬液与分离液接触。
再继续沿3号和4号离心管壁缓慢加入剩余的细胞悬液。操作时,切勿打乱液面界面,每管最多加到45mL。完后,保持3号和4号离心管竖直放置,小心转移放置到离心机中,进行离心处理,离心力为650g、离心时间为30分钟,且升1档,降0档。
3号和4号离心管离心结束,小心取出离心管,可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放,保持离心管竖直放置,以免破坏细胞分层。缓慢转移到安全柜中,用10mL移液管将上层残留血浆去除后剩余2mL,再分别吸取3号和4号离心管中第二层白膜细胞约10mL加入到另外新的对应离心管(标记为7号和8号)中。
往7号和8号离心管中分别加入生理盐水到50mL刻度,混匀。将7号和8号离心管离心处理,离心力为650g、离心时间为10min,且离心时升8档、将8档。离心结束后,分别向7号和8号离心管内加入5~10mL生理盐水重悬细胞,将各离心管中的细胞沉淀后,合并收集到7号离心管中,并添加生理盐水补足到50mL刻度,再用10mL移液管吹打均匀后,滴2滴到EP管中,进行计数。
计数结束,从细胞液中取5×107数目单个核细胞单独装入到8号离心管中并重悬到50mL。随后将8号离心管进行离心处理,离心力为300g、离心时间为10min,且离心时升8档、降8档。离心结束后,弃去上清液,沉淀物即为所需的单个核细胞(PBMC)。
下面通过具体实施例来详细说明。
一、外泌体制剂制备
实施例1
配制第一培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为100IU/mL的IL-2、终浓度为5ng/mL的TGF-β1、终浓度为3ng/mL的TGF-β2、终浓度为200ng/mL的CD3、终浓度为100ng/mL的CD28、终浓度为6μg/mL的转铁蛋白、终浓度为1μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和终浓度为5v/v%的AB血清。
配制第二培养基1000mL:以DMEM基础培养基,该基础培养基中添加有终浓度为20ng/mL 的干细胞因子 (SCF) 和终浓度为2v/v%的Ultroser G血清替代物。
配制第三培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为70IU/mL的IL-2、终浓度为1μM的视黄酸、终浓度为20μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为15ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为1mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
取上述脐带血PBMC,用DynabeadsTMCD4 阳性分离试剂盒分选出3×107 个 CD4+T细胞,接种至培养器中;用上述配制的50mL第一培养基培养5天,培养结束后,回收第一培养液;对回收的第一培养液500g离心10min;离心结束后,去除上清液,收集细胞沉淀,获得辅助性T细胞,备用。
在辅助性T细胞培养至第3天时,取1×107 个/mL冻存复苏得到的间充质种子干细胞,接种到培养器中,用上述配制的第二培养基进行传代培养3天,回收第二培养液的上清液;对回收的上清液采用PBS洗涤1遍,随后加入含0.05v/v%胰酶的消化液消化2min,且消化液与回收上清液的体积比为3:1,终止消化,收集细胞悬液;对收集的细胞悬液300g离心6min,离心结束后去除上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用。
将辅助性T细胞与干细胞用50mL第三培养基重悬,得到混合细胞悬液,并控制混合细胞悬液中辅助性T细胞与干细胞的数量比为2:1;按照细胞接种密度2.0×106/mL,将混合细胞悬液接种至培养器中,并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、5v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,且每次补液后混合细胞密度维持在2.0×106个/mL,培养结束,收集第三培养液中的上清液。
将收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min,离心结束后,收集离心上清液;将离心上清液用中空纤维膜孔径为0.01μm的第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,直至获得的回流浓缩液体积数为离心上清液体积数的1/10,停止循环,获得回流浓缩液;往回流浓缩液中加入含1%人血白蛋白的生理盐水,且生理盐水与回流浓缩液的体积比为4:1;继续循环过滤,直至获得的洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数,停止循环,得到洗涤浓缩液;将洗涤浓缩液用中空纤维膜孔径为0.2μm的第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得复合细胞外泌体制剂。
实施例2
配制第一培养基1000mL:以DMEM/F12基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50IU/mL的IL-2、终浓度为10ng/mL的TGF-β1、终浓度为5ng/mL的TGF-β2、终浓度为50ng/mL的CD3、终浓度为200ng/mL的CD28、终浓度为2μg/mL的转铁蛋白、终浓度为0.5μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和终浓度为5v/v%的AB血清。
配制第二培养基1000mL:以DMEM基础培养基,该基础培养基中添加有终浓度为10ng/mL 的干细胞因子 (SCF) 和终浓度为2v/v%的Ultroser G血清替代物。
配制第三培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50IU/mL的IL-2、终浓度为0.2μM的视黄酸、终浓度为5μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为20ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为0.4mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1%的Ultroser G血清替代物。
取上述脐带血PBMC,用DynabeadsTMCD4 阳性分离试剂盒分选出1×107 个 CD4+T细胞,接种至培养器中;用上述配制的50mL第一培养基培养5天,培养结束后,回收第一培养液;对回收的第一培养液500g离心10min;离心结束后,去除上清液,收集细胞沉淀,获得辅助性T细胞,备用。
在辅助性T细胞培养至第3天时,取1×107 个/mL冻存复苏得到的间充质种子干细胞,接种到培养器中,用上述配制的第二培养基进行传代培养3天,回收第二培养液的上清液;对回收的上清液采用PBS洗涤1遍,随后加入含0.05v/v%胰酶的消化液消化2min,且消化液与回收上清液的体积比为3:1,终止消化,收集细胞悬液;对收集的细胞悬液300g离心6min,离心结束后去除上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用。
将辅助性T细胞与干细胞用的50mL第三培养基重悬,得到混合细胞悬液,并控制混合细胞悬液中辅助性T细胞与干细胞的数量比为3:1;按照细胞接种密度2.0×106个/mL,将混合细胞悬液接种至培养器中,并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、3v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,且每次补液后混合细胞密度维持在1.5×106个/mL,培养结束,收集第三培养液中的上清液。
将收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min,离心结束后,收集离心上清液;将离心上清液用中空纤维膜孔径为0.01μm的第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,直至获得的回流浓缩液体积数为离心上清液体积数的1/10,停止循环,获得回流浓缩液;往回流浓缩液中加入含1%人血白蛋白的生理盐水,且生理盐水与回流浓缩液的体积比为4:1;继续循环过滤,直至获得的洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数,停止循环,得到洗涤浓缩液;将洗涤浓缩液用中空纤维膜孔径为0.2μm的第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得复合细胞外泌体制剂。
实施例3
配制第一培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为200IU/mL的IL-2、终浓度为1ng/mL的TGF-β1、终浓度为1ng/mL的TGF-β2、终浓度为500ng/mL的CD3、终浓度为20ng/mL的CD28、终浓度为10μg/mL的转铁蛋白、终浓度为3μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和终浓度为5%的AB血清。
配制第二培养基1000mL:以DMEM/F12基础培养基,该基础培养基中添加有终浓度为30ng/mL 的干细胞因子 (SCF) 和终浓度为2v/v%的Ultroser G血清替代物。
配制第三培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为100IU/mL的IL-2、终浓度为2μM的视黄酸、终浓度为30μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为5ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为2mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
取上述脐带血PBMC,用DynabeadsTMCD4 阳性分离试剂盒分选出5×107 个 CD4+T细胞,接种至培养器中;用上述配制的50mL第一培养基培养5天,培养结束后,回收第一培养液;对回收的第一培养液500g离心10min;离心结束后,去除上清液,收集细胞沉淀,获得辅助性T细胞,备用。
在辅助性T细胞培养至第3天时,取1×107 个/mL冻存复苏得到的间充质种子干细胞,接种到培养器中,用上述配制的第二培养基进行传代培养3天,回收第二培养液的上清液;对回收的上清液采用PBS洗涤1遍,随后加入含0.05v/v%胰酶的消化液消化2min,且消化液与回收上清液的体积比为3:1,终止消化,收集细胞悬液;对收集的细胞悬液300g离心6min,离心结束后去除上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用。
将辅助性T细胞与干细胞用的50mL第三培养基重悬,得到混合细胞悬液,并控制混合细胞悬液中辅助性T细胞与干细胞的数量比为2.5:1;按照细胞接种密度2.0×106个/mL,将混合细胞悬液接种至培养器中,并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、8v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,且每次补液后混合细胞密度维持在2.0×106个/mL,培养结束,收集第三培养液中的上清液。
将收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min,离心结束后,收集离心上清液;将离心上清液用中空纤维膜孔径为0.01μm的第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,直至获得的回流浓缩液体积数为离心上清液体积数的1/10,停止循环,获得回流浓缩液;往回流浓缩液中加入含1%人血白蛋白的生理盐水,且生理盐水与回流浓缩液的体积比为4:1;继续循环过滤,直至获得的洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数,停止循环,得到洗涤浓缩液;将洗涤浓缩液用中空纤维膜孔径为0.2μm的第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得复合细胞外泌体制剂。
对比例1 (T细胞)
配制第一培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为100IU/mL的IL-2、终浓度为5ng/mL的TGF-β1、终浓度为3ng/mL的TGF-β2、终浓度为200ng/mL的CD3、终浓度为100ng/mL的CD28、终浓度为6μg/mL的转铁蛋白、终浓度为1μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和终浓度为5v/v%的AB血清。
配制第三培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为70IU/mL的IL-2、终浓度为1μM的视黄酸、终浓度为20μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为3ng/mL的TGF-β1、终浓度为3ng/mL的TGF-β2、终浓度为3ng/mL的TGF-β3,终浓度为15ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为1mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
取上述脐带血PBMC,用DynabeadsTMCD4 阳性分离试剂盒分选出3×107 个 CD4+T细胞,接种至培养器中;用上述配制的50mL第一培养基培养5天,培养结束后,回收第一培养液;对回收的第一培养液500g离心10min;离心结束后,去除上清液,收集细胞沉淀,获得T细胞。
将T细胞用50mL第三培养基重悬,得到T细胞悬液;按照细胞接种密度2.0×106个/mL,将T细胞悬液接种至培养器中,并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、5v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,且每次补液后混合细胞密度维持在2.0×106个/mL,培养结束,收集第三培养液中的上清液。
将收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min,离心结束后,收集离心上清液;将离心上清液用中空纤维膜孔径为0.01μm的第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,直至获得的回流浓缩液体积数为离心上清液体积数的1/10,停止循环,获得回流浓缩液;往回流浓缩液中加入含1%人血白蛋白的生理盐水,且生理盐水与回流浓缩液的体积比为4:1;继续循环过滤,直至获得的洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数,停止循环,得到洗涤浓缩液;将洗涤浓缩液用中空纤维膜孔径为0.2μm的第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得复合细胞外泌体制剂。
对比例2(干细胞+PBMC)
配制第二培养基1000mL:以DMEM基础培养基,该基础培养基中添加有终浓度为30ng/mL 的干细胞因子 (SCF) 和终浓度为2v/v%的Ultroser G血清替代物。
配制第三培养基1000mL:以DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为100IU/mL的IL-2、终浓度为2μM的视黄酸、终浓度为30μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为5ng/mL 的干细胞因子(SCF)、终浓度为2mg/mL的人血清白蛋白(HSA)和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
取1×107 个/mL冻存复苏得到的间充质种子干细胞,接种到培养器中,用上述配制的第二培养基进行传代培养3天,回收第二培养液的上清液;对回收的上清液采用PBS洗涤1遍,随后加入含0.05v/v%胰酶的消化液消化2min,且消化液与回收上清液的体积比为3:1,终止消化,收集细胞悬液;进行细胞计数,取2.85×107 对应的细胞悬液,300g离心6min,离心结束后去除上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用。
将干细胞用第三培养基重悬,加入7.15×107数量脐带血PBMC,得到混合细胞悬液,并控制混合细胞悬液中辅助性T细胞与干细胞的数量比为2.5:1;按照细胞接种密度2.0×106个/mL,将混合细胞悬液接种至培养器中,并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、8v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,且每次补液后混合细胞密度维持在2.0×106个/mL,培养结束,收集第三培养液中的上清液。
将收集到的第三培养液中的上清液进行3000g离心60min,离心结束后,收集离心上清液;将离心上清液用中空纤维膜孔径为0.01μm的第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,直至获得的回流浓缩液体积数为离心上清液体积数的1/10,停止循环,获得回流浓缩液;往回流浓缩液中加入含1%人血白蛋白的生理盐水,且生理盐水与回流浓缩液的体积比为4:1;继续循环过滤,直至获得的洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数,停止循环,得到洗涤浓缩液;将洗涤浓缩液用中空纤维膜孔径为0.2μm的第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得复合细胞外泌体制剂。
二、外泌体制剂的检测分析
1、细胞扩增生长检测分析
由图1可知,从实施例1至3和对比例1可以看出,本发明培养方案下,培养至第12天时,干细胞和CD4+T细胞共培养的细胞扩增倍数比单纯CD4+T细胞培养的细胞扩增倍数要高两倍左右;从实施例1至3和对比例2可以看出,培养至第12天时,本发明培养方案下,干细胞和PBMC共培养的细胞扩增倍数比干细胞和CD4+T细胞共培养的细胞扩增倍数要低3~4倍左右。由此可以说明,干细胞作用于提纯后的CD4+T细胞效果更强,可以相互促进细胞扩增生长。
2、细胞外泌体制剂颗粒浓度、粒径检测分析
分别在第12天抽样,对细胞外泌体制剂浓度检测分析。检测结果如表1、图2至6所示;其中,表1中的数据分别与图2至6中的相应数据一一对应的。
细胞外泌体制剂浓度检测使用纳米颗粒跟踪分析仪(制造商:德国PARTICLEMETRIX公司;型号:Zeta View PMX-120),检测结果Zeta View纳米颗粒跟踪分析仪检测参数如下:
1)样本参数:pH值:7.0;样本稀释液:PBS;
2)仪器参数:激光波长:488nm;过滤波长:散射。
表1 外泌体制剂检测结果
由表1、图2至6可知,实施例1至3中的外泌体制剂颗粒浓度为在7.1~7.4×1010Particles/mL范围、外泌体制剂颗粒平均粒径在93~95nm范围;对比例1和2中的外泌体制剂颗粒浓度分别为0.82×1010 、3.6×1010 Particles/mL、外泌体制剂颗粒平均粒径分别为151.3 nm 、126.1nm。因此,说明本发明制备的复合细胞外泌体制剂中,T细胞和干细胞可以相互促进富含免疫调节因子(如,IL-10、TGF-β)的外泌体分泌。
3、外泌体中细胞因子检测
表2为实施例1至3、对比例1和2中外泌体中细胞因子,的检测结果。细胞因子采用对应因子的ELISA试剂盒检测,表达蛋白采用免疫组化检测,miRNA采用定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测。
表2 外泌体中细胞因子的检测结果
由表2可知,其一,外泌体释放的IL-10和TGF-β为抗炎因子,在免疫调节中可以抑制T细胞的激活,降低活化的T细胞所引起的炎症反应;其二,外泌体释放的表达蛋白,其高表达的PD-L1是PD-1的配体,能结合PD-1从而降低炎症程度,且外泌体释放的CD95/CD95L互为配体,在免疫稳态中的发挥关键作用,其中CD95L能抑制CD8+T细胞,保留Treg细胞活性;其二,外泌体释放的Let-7d和miR-146a属于miRNA,可参与炎性因子所致的自身免疫性疾病的免疫调控。
4、动物实验检测
4.1、小鼠造模
4.1.1、PBMC提取与标记
分别采集健康供者和SLE患者的外周血(年龄18-50岁),按分血操作分离提取PBMC,备用。
4.1.2、PBMC移植小鼠体内
将总共1×107个PBMC皮内(背部)移植到6周龄的BALB/c无胸腺雌性裸鼠(单只)。植入4周后挑选状态相似的小鼠作为SLE小鼠,移植健康供者PBMC的为对照组小鼠,分别进行给药处理。
4.2、小鼠给药
4.2.1、注射辅助性T细胞(标识:实验A组)
对SLE小鼠尾静脉注射2×106/200μl实施例1培养获得的辅助性T细胞+干细胞(即第三培养基培养完离心收集的细胞,用生理盐水重悬)。
4.2.2、注射外泌体制剂(标识:实验B组)
对SLE小鼠尾静脉注射200μl实施例1获得的外泌体制剂。
4.2.3、注射抗体药物(标识:实验C组,即对照组)
对SLE小鼠尾静脉注射100ug(200ul生理盐水)贝利尤欧六单抗。
4.2.4、注射生理盐水(标识:空白对照组)
对SLE小鼠尾静脉注射200ul生理盐水。
4.3、检测
4.3.1、CD4+CD8+细胞流式比例检测
分别采集给药后的第0、5、10、15、20天后的小鼠静脉血,100ul血样加入1.8mL RBCLysis Buffer (1×) 室温孵育2min,400g离心5min;离心停止后弃上清;PBS清洗细胞沉淀,随后2mL PBS重悬细胞沉淀,400g离心5min,弃上清;随后再加入100ul PBS,接着加入CD3、CD4、CD8流式抗体各2ul,避光孵育20min;孵育结束后加入1mL PBS流式洗涤一遍后,400g离心5min;离心结束弃上清,用100ul PBS重悬细胞沉淀,上机检测。
4.3.2、自身抗体ELISA和ANA检测
给药两周后,取小鼠血清,按照制造商的说明通过ELISA定量试剂盒(AlphaDiagnostic International)检测其中的抗dsDNA及抗ANA抗体浓度。
4.3.3、蛋白尿测量
给药前和给药后,第1-3周内,每间隔一周收集来自小鼠的尿液,检测SLE小鼠和空白对照组小鼠的蛋白尿水平。通过ELISA试剂盒(Albuwell-M和Creatinine-Companion-Elisa, Exocell, PA.)测定尿白蛋白和肌酐水平并计算尿白蛋白/肌酐(ug/mg)的比值为真实参考依据。
4.4、检测结果分析
4.4.1、细胞流式检测
健康人PBMC中的CD4+CD8+比值,介于1.5~2.5之间,95%的正常人CD4+CD8+的比值都在1以上。在SLE患者的PBMC中,CD4+与CD8+的比例失衡比较严重(CD4+细胞比例较低,CD8+细胞较高),将SLE患者的PBMC植入到无胸腺小鼠会保持大致的CD4+与CD8+比例。根据上述第4.1.1中,因为造模打的是人的PBMC,而且造模的小鼠没有胸腺,自身不会产生成熟淋巴细胞,所以打进去的人PBMC基本是不变的比例(空白对照组可以看出曲线比较稳定),给药影响的也是打进去人的PBMC的变化。
检测结果如图7所示,实验A组和B组中,小鼠给药第12天的CD4+CD8+比例相近,且变化幅度大于实验C组(对照组);这说明外泌体制剂和CD4+T细胞两者作用效果相似,且强于传统对照组(即实验C组)抗体药物;实验B组给药的SLE小鼠比实验A组的比例变化快,如,第3天实验B组变化明显大于实验A组;说明在SLE的药物作用上,外泌体优先于细胞起功效,这是由于CD4+ T细胞注射小鼠体内也会分泌外泌体。
4.4.2、抗dsDNA、ANA抗体水平检测
对于SLE小鼠模型产生的自身抗体,可以检测到几种主要的自身抗原(如dsDNA、ANA、Ro、RNP、抗La等)和IgG的亚型(如IgG I、IgG II)。抗dsDNA自身抗体是用于诊断和模拟SLE疾病活动度的代表性自身抗体。
检测结果如图8和9所示,实验A组和B组给药的SLE小鼠两周后的抗dsDNA、ANA抗体水平降低幅度相近,说明外泌体和CD4+T细胞的作用效果相近,且均比对照组(实验C组)小鼠的下降幅度大,说明作用效果要强于抗体药物。
4.4.3、尿蛋白水平检测
SLE是一个全身性疾病,它很容易导致肾脏出问题,即为狼疮肾炎(lupusnephritis, LN)。诊断为SLE的患者中最终可能有高达75%的患者会出现肾脏损伤。最常见的肾脏损伤标志是蛋白尿、血肌酐增高等。
检测结果如图10所示,给药前(即第0周)检测结果显示,该SLE小鼠模型具有LN症状。给药后第1-3周检测结果显示,外泌体和CD4+T细胞给药后尿蛋白水平3周内下降至原来50%水平(实验A、B组),说明对LN症状的SLE也有一定作用效果,且降低幅度大于传统单抗药物(对比实验C组)。
应当理解的是,上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细,并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制,本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种具有免疫调控的复合细胞外泌体制剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
辅助性T细胞培养:首先,从外周血中分离出PBMC,并筛选出CD4+T细胞;其次,用第一培养基培养CD4+T细胞5~6天,回收第一培养液并离心去除上清液,收集细胞沉淀,获得辅助性T细胞,备用;
干细胞培养:首先,在所述辅助性T细胞培养至第3天时,取1×107 个间充质干细胞用第二培养基培养2~3天,回收第二培养液中的上清液;其次,往回收上清液中加入消化液进行消化处理后收集细胞悬液;最后,对收集的细胞悬液离心,去上清液,收集沉淀物,获得干细胞,备用;
细胞共培养:首先,将所述辅助性T细胞和干细胞混合后用第三培养基重悬,得到混合细胞悬液;其次,将混合细胞悬液中的混合细胞接种至培养器中并置于培养条件为37℃、5v/v%CO2、3~8v/v%O2的培养箱中静置培养12天;培养期间,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基,培养结束后收集第三培养液中的上清液;
外泌体制剂提取:首先,对收集到的第三培养液中的上清液进行离心处理后,收集离心上清液;其次,将离心上清液用第一中空纤维管循环过滤,去除小分子液体,获得回流浓缩液;接着,往回流浓缩液中加入含1v/v%人血白蛋白的生理盐水,继续循环过滤,得到洗涤浓缩液;最后,将洗涤浓缩液用第二中空纤维管过滤,收集滤液,获得T细胞与干细胞的复合细胞外泌体制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述辅助性T细胞培养步骤中,所述第一培养基包括DMEM或DMEM/F12基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50~200IU/mL的IL-2、终浓度为1~10ng/mL的TGF-β1、终浓度为1~5ng/mL的TGF-β2、终浓度为50~500ng/mL的CD3、终浓度为20~200ng/mL的CD28、终浓度为2~10μg/mL的转铁蛋白、终浓度为0.5~3μg/mL的胰岛素样生长因子-1和终浓度为5v/v%的AB血清。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述辅助性T细胞培养步骤中,所述CD4+T细胞的筛选采用DynabeadsTM CD4 阳性分离试剂盒;CD4+T细胞培养时,CD4+T细胞的接种数量为2×107 ~5×107个。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,用第一培养基培养CD4+T细胞5~6天时,在第3天需补液一次,且第一培养基的补充量为培养器中培养液总体积量的2倍。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述干细胞培养步骤中,所述第二培养基包括DMEM或DMEM/F12基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为10~30ng/mL 的干细胞因子和终浓度为2v/v%的Ultroser G血清替代物。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述干细胞培养步骤中,消化处理时,加入含浓度0.05v/v%胰酶的消化液消化处理1~2min,且消化液与回收上清液的体积比为3:1;细胞悬液离心处理时,采用300g离心6min。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述细胞共培养步骤中,所述第三培养基包括DMEM基础培养基,在该基础培养基中添加有终浓度为50~100IU/mL的IL-2、终浓度为0.2~2μM的视黄酸、终浓度为5~30μM的香叶基焦磷酸铵盐、终浓度为5~20ng/mL 的干细胞因子、终浓度为0.4~2mg/mL的人血清白蛋白和终浓度为1v/v%的Ultroser G血清替代物。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述细胞共培养步骤中,混合细胞悬液中,辅助性T细胞和干细胞的数量比为2~3:1;混合细胞接种至培养器中时,混合细胞的接种密度控制在1.5×106~2.0×106个/mL,且混合细胞接种至培养器静置培养12天时,每隔3天补加一次新鲜的第三培养基时,并维持混合细胞密度为2.0×106个/mL。
9.据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述外泌体制剂提取步骤中,对第三培养基中的上清液进行离心处理时,采用3000g离心60min;离心上清液过滤时,所述第一中空纤维管中的中空纤维膜孔径为0.01μm,获得回流浓缩液的体积数控制在所述离心上清液体积数的1/10;洗涤浓缩液制备时,回流浓缩液与生理盐水的体积比为1:4;洗涤浓缩液过滤时,第二中空纤维管中的中空纤维膜孔径为0.2μm,且洗涤浓缩液体积数控制在所述回流浓缩液相等的体积数。
10.权利要求1至9任一所述制备方法制得的所述复合细胞外泌体制剂在制备治疗多发性硬化症、1型糖尿病或系统性红斑狼疮药物中的应用。
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