KR20070004574A

KR20070004574A - 줄기세포

Info

Publication number: KR20070004574A
Application number: KR1020067014238A
Authority: KR
Inventors: 마이어틀 고든; 너지 하빕
Original assignee: 옴니사이트 리미티드
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2007-01-09
Also published as: WO2005059113A1; MXPA06006706A; CN1918284A; CA2549930C; JP2007514434A; US20070274970A1; EP1697500B1; CN1918284B; US20090170193A1; BRPI0417194A; AU2004299718A1; EA200601187A1; CA2549930A1; JP2013039128A; EP1697500A1; GB0329449D0

Abstract

본 발명은 분리된 줄기세포 집단에 관한 것이며, 상기 줄기세포는 CD34⁺이고 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 및 내배엽성 세포로 분화가 가능하며 조직배양용 플라스틱에 부착이 가능하다. 동시에, 상기 세포의 분리방법, 배양방법 및 그들 세포로부터의 분화방법 및 그러한 분화방법을 통한 자손에 관한 것이며, 상기 줄기세포 및 그들의 분화된 자손을 이용한 치료목적의 이용을 포함하는 용도에 관한 것이다.

줄기세포, 내배엽, 중배엽, 외배엽, CD34+, 조직배양,

Description

줄기세포 {STEM CELLS}

　본 발명은 줄기세포에 관한 것으로서, 특히 골수와 혈액으로부터 분리될 수 있는 새로운 타입의 줄기세포에 관한 것이다.

　줄기세포는　신체의 어떤 조직의 손상도 회복할 수 있는 새로운 세포를 생성할 수 있으므로, 모든 타입의 재생성 의약 (regenerative medicine)으로서의 무궁한 잠재력을 가지고 있다. 줄기세포는 모든 신체 조직과 기관에 존재하나 골수와 혈액과 같은 경우의 몇몇 조직은, 간이나 뇌와 같은 다른 장기에 비해 수득이 용이하다. 그러나, 골수와 혈액의 줄기세포는 그 수가 매우 적어, 임상에 사용되기 위해서는 추출 후 숫자를 늘려야("expanded") 할 필요성이 있다. 현재 조직 특이적인 줄기세포 이식을 위한 충분한 수의 줄기세포를 제공하려는 목표를 달성하기 위한 시도가 많이 행해지고 있다.

　그러한 시도들은 골수를 줄기세포의 근원(source)으로 하려는데 집중되어 있다. 현재까지의 결과로서 골수는 2가지 타입의 줄기세포- 혈액을 만드는 조혈간세포(haemopoietic stem cell, HSC)와 신체 조직의 특정 부위를 이루는 세포를 생 성하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)-를 가진다. MSC는 정확히 정의되거나 분리되기가 어렵고, 다양한 세포의 타입을 제공하기에는 제한된 능력을 보인다. MSC들은 배양상의 자극(stimulation)에 반응하여 골아세포(osteoblast), 연골모세포(chondroblasts)와 지방세포 (adipocyte)를　형성하나, 간세포(Hepatocyte)와 같이 그들이 형성할 수 없는 세포타입도 상당수 존재한다. MSC의 배양을 연장하여 실시하게 되면 다(多)분화능 성체전구세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC)로 불리는 그들의 아세포집단(subpopulation)의 생성을 유발하며, 이들 아세포집단은 조직재생에 있어서 현재까지 가장 광범위한 잠재력을 가진 것으로 보인다. 그러나, MAPC 생성이전에 조직배양의 연장 및 많은 세포분화가 필요하다는 사실은, 첫째, 그들 세포가 축적된 유전적 손상을 가지고 있을 가능성과, 둘째, 그들이 정상상태의 골수세포 내 세포인자들을 보유하고 있을지 확신할 수 없다는 것을 의미한다. 실제로 그들은 조직 배양상의 아티팩트(artifact)일 수 있다. 이러한 중요한 고려사항 때문에 MAPC의 임상적용이 잠재적으로 금기시되고 있다. MAPC는 내배엽성, 외배엽성, 또는 중배엽성 마커를 가진 세포를 형성할 수 있지만, 결정적으로 배양과정에서 조혈 세포(haemopoietic cell)를 형성하지 못한다.

　줄기세포로부터 분화된 세포를 이용하여 천연의 단백질 산물을 제조하는 것은 재조합 단백질을 생산하는 세포를 이용하는 것보다 유리한데, 이는 특히 단백질 산물에 대해 적합한 당사슬화(glycosylation)와 번역후 변형(post-translational modification)을 할 수 있는 능력 때문이다.

　본 발명자들은 성체의 골수와 혈액, 예를 들면 말초혈액 (peripheral blood)으로부터 직접 분리될 수 있으며, 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성 세포로 분화할 수 있는 독특한 능력을 갖는 새로운 타입의 줄기세포를 동정(identified)하였다. 이들 세포들은 전분화능(totipotent)은 없지만 다(多)분화능(multipotent)을 확실히 가지고 있다. 따라서 본 발명에 명시된 줄기세포는 자가이식(개체 자신에게서 자신으로, autologous)의 형태로 조직이식될 수 있는 새로운 형태의 세포 원천(source)을 제공한다. 더욱이, 아래에 기술된 바와 같이 이들 줄기세포는 연장된 조직배양을 필요로 하지 않는다.

　본 발명의 줄기세포는 성체의 골수나 말초혈액 등 성체로부터 얻어진 샘플로부터 추출되는 것이 바람직하다. 따라서 이들은 성체 줄기 세포인 것이 바람직하다. 이들 세포들은 탯줄과 같은 다른 샘플로부터도 추출이 가능하며, 따라서 한 실시예에서 본 발명의 줄기세포 집단은 성체 세포뿐만 아니라 태아 세포를 포함할 수도 있다. 또한 태아의 줄기세포 원천, 예를 들어 태아의 간이나 골수가 사용될 수 있다.

　따라서, 본 발명의 일 측면은, CD34⁺이며 자기 재생(self regeneration)이 가능하고, 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성의 세포로 분화가 가능하며, 바람직하게는 조혈 세포로 분화가 가능한 분리된 줄기세포 집단을 제시한다. 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하다.

　이들 줄기세포는 배양하는 동안의 플라스틱 (예를 들어, 보통의 조직배양 용기)에 대한 부착능력에 따라 더 특징지워질 수 있다. 따라서 이 세포들은 본 발명에 명시된 배양방법 이외의 어떤 추가적인 특정 조건이나 조작 없이도 플라스틱에 부착할 수 있다. 플라스틱 용기로는 코닝 인코퍼레이션사 (Corning Incorporated, New York, USA)에서 제조된 것이 적합하다.

　본 발명의 줄기세포는 영양세포층 (feeder layers), 즉, 줄기세포의 성장을 돕는 (일반적으로 감마선 조사에 의해 불활성화되어 더 이상의 성장이나 스스로의 분열 없이 줄기세포에 중요 대사물질을 제공하는) 세포를 필요로 하지 않는다는 점에서 더 특징지워질 수 있다. 따라서, 본 발명의 줄기세포 배양시 영양세포층은 사용되지 않는 것이 바람직하다.

　이들 줄기세포가 가지는 한 가지 중요한 특징과 이점은 그들의 능력- 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성의 세포를 포함하는 매우 다양한 타입의 세포로 분화할 수 있는-이다. 따라서, 본 발명의 이들 줄기세포는 배아 발생단계의 3 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로부터 유래된 세포 타입으로 분화될 수 있으며, 그 예로써 중배엽으로부터 유래된 조혈세포와 근육세포, 외배엽으로부터 유래된 신경이나 상피세포, 내배엽으로부터 유래된 선상 상피(glandular epithelium) 또는 간세포(hepatocyte)를 들 수 있다.

상기　줄기세포 집단에 다른 타입의 세포는 실질적으로 배제되어 있다는 점에서, 본 발명의 줄기세포는 ‘분리(isolate)’되어지는 것이다. CD33, CD38, HLA/DR, CD19및 CD3를 발현하는 세포타입은 실질적으로 배제되는 것이 바람직하다. ‘실질적인 배제(substantially free)’라 함은 실시예에 기재된 바와 같은 경험적인 데이터와 일맥상통하도록 해석되는 것이 바람직하다. 또한, 이들 줄기세포 집단에는 특정 세포계보의 일원 및/또는 이들 세포계보에 연관된 마커를 가지고 있는 세포들이 실질적으로 배제된다. 상기 줄기세포 집단에는 20%미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 예를 들어, 5% 미만의 세포계보(cell lineage)에 관여(dedicated) 세포들이 포함되는 것이 바람직하다. 네거티브 셀렉션(세포의 제거)과 포지티브 셀렉션(세포의 분리)을 조합하는 것이 본 발명의 줄기세포 분리에 도움이 되며, 이 두 경우에 있어서 항체 결합반응이 사용될 수 있다. ‘분리된(isolated)’ 세포들은 샘플에서 직접 분리된 세포를 포함하며, 배양된 세포 또는 그런 샘플로부터 유래된 세포도 마찬가지이다.

　줄기세포는 성체의 골수에서 생성되는 것으로 알려져 있으나 혈액에서도 발견된다. 본 발명의 줄기세포는 일반적인 샘플링 기법을 통해 이들 원천 어느 것에서도 수집될 수 있다. 혈액 샘플의 채취는 G-CSF처리를 통해 혈류 내 줄기세포에 유동성을 부여하여 숫자를 늘린 후 행하는 것이 바람직하다. 예를 들어,　5 μg/kg·체중/하루 조건으로 5일 동안 피하(subcutaneously) 투여될 수 있다. 또한 흡기(aspiration) 등을 통해 골수 샘플을 직접 얻는 것도 가능하다.

　골수세포는 골수의 원천, 예를 들어 장골릉(iliac crests), 경골(tibiae), 대퇴(femora), 척추(spine), 또는 다른 뼈의 골소강(bone cavity)으로부터 채취될 수 있다.　 보통의 방법을 따라 편리하게 상기의 뼈로부터 골수를 뽑아(aspirate)낼 수 있다. 줄기세포의 다른 원천으로는 성체의 말초혈액과 탯줄의 혈액을 포함하는 혈액이 될 수 있다.

　줄기세포는 포유류에서 기원한 것, 즉 포유류의 샘플로부터 분리되거나 그러한 샘플로부터 분리된 세포로부터 유래한 줄기세포인 것이 바람직하다. 특히 인간과 쥐가 바람직한 포유류이다. 소, 말, 및 반려동물(companion animal)이 좀 더 바람직한 포유류에 포함된다.

세포계보에 연관된(dedicated) 세포들을　초기에 제거함으로써 다양한 기법들이 줄기세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 단일클론 항체들은 특히 특정 세포계보 및/또는 분화의 단계와 연관된 마커들(세포 표면 막단백질)을 확인하는데 유용하다. 상기 항체들은 고형의 지지체(support)에 부착될 수 있어 조분리(crude separation)를 가능케 한다. 사용되는 분리기법은 수집되는 분획(fraction)의 생존율(viability)의 유지를 최대화할 수 있어야 한다.　

　“대체적으로 조야(crude)한” 추출에 있어서는, 다른 효율을 가지는 다양한 기법이 사용될 수 있으므로, 존재하는 총 세포의 10%까지, 보통 약 5%이하, 바람직하게는 1%이하가 상기 마커를 가지고 있지 않더라도 잔류 세포집단에 남아 있을 수 있다. 사용되는 특정 기법은 분리의 효율성, 방법상의 세포 독성, 수행의 용이성과 속도,　복잡한 장비의 필요 여부, 및/또는, 기술적 숙련도에 의존할 것이다.

　분리를 위한 과정은 항체가 고정된 마그네틱 비드(magnetic bead)를 이용한 마그네틱 분리법(magnetic separation), 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 단일클론 항체에 연결되거나 단일클론항체와 함께 사용되는 세포독성물질-예를 들어 보체(complement)와 세포독소(cytotoxin)- 및 플레이트 등과 같은 고체 기질에 부착된 항체와의 "패닝(panning)" 또는 다른 편리한 기법을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorters)가 포함되는데,　이것은 복수의 컬러 채널, 저각도 및 둔각의 광 산란 채널, 임피던스 채널 등 다양한 수준의 정교함을 보유하고 있다.

　편리하게는　상기 항체들은 마커 - 직접적인 분리가 가능하게 하는 마그네틱비드, 지지체에 결합된 아비딘(avidin) 이나 스트렙터아비딘(streptavidin)과 함께 제거가 가능한 바이오틴(biotin) 및 FACS(floorescence activated cell sorter)에 사용될 수 있는 플루오르크롬(fluorochrome) 또는 유사체 - 와 결합될 수 있어, 특정 타입의 세포의 분리를 용이하게 한다. 잔여 세포의 생존율에 과도하게 유해하지 않으면 어떤 기법도 사용이 가능하다.

　　혈액이나 골수샘플의 단일핵 분획(mononuclear fraction)은 Lymphoprep^TM (Axis Shield사)의 밀도 구배(density gradient)를 이용하여 분리하는 것이 바람직하다.　 CD34⁺ 세포들은 상기 단일핵 분획으로부터 MiniMACS (Miltenyl Biotec) 기술을 이용하여 분리할 수 있다.

　본 발명의 줄기세포는 그들의 분리에 사용된 방법들에 의해 더 특징지워질 수 있으며, 따라서 상기 세포는 부착법(adherence method)을 이용한 셀렉션과 친화성을 이용한 동정법(affinity purification)을 조합하여 얻어질 수 있다. 좀 더 자세하게는, 상기 세포는 CD34 단일클론 항체 (Mab)로 표지될 수 있고, 그리고 다시 CD34 MAb에 결합하는 상자성 비드(paramagnetic bead)를 붙여 표지될 수 있다.

또 다른　대안으로서, CD34 MAb으로 표지된 비드(bead) 자체가 상기 세포에 부착되는데 사용될 수 있다. 표지되거나 결합된 세포들은 컬럼에 적용되어 자석으로 모아질 수 있다; 표지되지 않은 세포들은 용리(elute)될 것이고, 표지된 세포들은 자석을 제거함으로써(또는 컬럼을 자석으로부터 제거함으로써) 방출될 것이다.

　상기 방법을 통해 방출된 CD34⁺세포들은 적정온도 - 예를 들어 35-38℃ 내지, 바람직하게는 37℃조건에서 조직배양 플라스틱 용기에 적어도 2시간, 바람직하게는 적어도 3시간, 예를 들어 3-5시간 동안 - 부착되지 않은 세포들을 HBSS(Hanks balanced salt salution)로 씻어내 주면서 배양될 수 있다. 부착성 CD34⁺ 세포들이 본 발명의 줄기세포이며, 총 CD34⁺세포집단 중 1% 미만을 포함한다. 이 세포들은 일반적으로 다른 줄기세포의 아집단(subpopulation)에 의해 오염되지 않은 실질적으로 균질한(homogeneous) 집단인 것이 바람직하다. 일반적으로, 수집된 세포의 30%미만, 바람직하게는 20%미만, 더 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 3% 미만의 세포들이 다름아닌 본 발명의 줄기세포이다. 그러나, 실시예에서 나타나듯, 모든 개개의 마커들이 분리된 세포집단의 모든 세포에서 발견되지 않을 수 있으며, ‘균질한 세포집단’이란 이러한 의미로 해석되어야 한다. 본 발명의 줄기세포 집단은 CD34 발현, 조직 배양용 플라스틱에 대한 부착성 및 작은 임파구와 유사한 형태(small lymphocyte-like morphology)에 대해 균질한 것이 바람직하다. ‘부착성’ 세포란 3차례의 강한 세정에도 고형 지지물(특히 조직배양용 플라스틱이나 유리)로부터의 이탈 없이 견딜 수 있는 세포를 말한다.　 배양을 위해 세포를 준비하는 과정에서 부착성 세포들이 보통 폐기될 수 있기 때문에, CD34⁺세포의 부착성 부분집단(subset)이 가지는 이로운 특징들은 놀랄만하다.

본 발명의 줄기세포는 매우 다양한 형태의 세포 타입으로의 분화가 가능할 뿐만 아니라 줄기세포에 대한 기본적 정의와도 일치하여,　자기 재생(self-regeneration) - 즉, 줄기세포는 줄기세포를 더 생성하도록 분열할 수 있다 - 이 가능하다.

　본 발명의 줄기세포는 CD34⁺인 - 즉, 줄기세포 표면, 특히 골수(HSC 및 MSC)로부터 제작된 줄기세포 표면에서 발견되는 (그렇게 절대적이지는 않지만) 당단백질 마커인 CD34항원을 발현하는- 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 줄기세포 집단은　Thy-1 마커를 발현하는 세포로 인리치(enrich) - 즉, 줄기세포 집단의 상당수 세포들이 Thy-1+ 인 세포를 포함하도록 - 될 수도 있다. 따라서 상기 줄기세포 집단은　배양시작 세포 집단(starting cell population)(상기 샘플)에 비해 Thy-1에 대해 인리치(enrich)될 수 있다.　 실시예 5는 평균이 28.1%이지만, 90%에 이르는 세포들이 Thy-1⁺임을 보여준다.

　더욱 상세하게는, 상기 세포들은 CD34⁺, CD38^-, CD33^- 및 HLA-DR^- 인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 세포군이 AC133⁺, Thy-1⁺및/혹은 c-met⁺, 좀 더 바람직하게는 AC133⁺, Thy-1⁺ 및/혹은 c-met⁺이 우세하도록 인리치(enrich)된다.

　상기 줄기세포들은 구형의 단일핵(round mononuclear)의 세포들이란 점과 높은 핵:세포질의 비율을 가지는 다소 작은 세포라는 점에서 임파구와 유사하다. 그런 형태는 원시줄기세포(primitive stem cell)와 연관이 있다.

그　줄기세포들은 16일 내에, 예를 들어 12-14일의 배양으로 분화된 세포를 생성할 수 있는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 분화가 14일 이내, 예를 들어 10일 이내에 관찰되는 것이 바람직하며, 7일 이내, 심지어 4-5일 이내인 것이 더 바람직하다.

　본 발명의 줄기세포는 다음과 같이 수득될 수 있는 것으로 더 특징지워 지는데:

(i)　조혈조직 (즉, 혈액이나 골수 샘플)을 밀도 구배 분리(density gradient)에 적용하는 방법;

(ii) 낮은 밀도의 세포들을 CD34의 친화성 리간드(affinity ligand)에 노출 (바람직하게는 상자성 비드(paramagnetic bead)에 부착)시키는 방법;

(iii) 상기 CD34 리간드에 부착된 세포를 회수하는 방법;

(iv) CD34⁺ 아집단을 조직배양용 플라스틱에 노출하는 방법; 및

(v) 상기 플라스틱에 부착된 CD34⁺세포들을 회수하는 방법을 통해 수득될 수 있다.

　본 발명의 줄기세포의 샘플은 ECACC (European Collection of Cell Cultures, Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, UK))에 2004년 9월 24일 기탁번호 04092401로 기탁되었다. 기탁은 본 발명자에 의해 행해졌으며, 세포주는 “Stem Cell Omnicyte"로 명명되었다.

　본 발명의 줄기세포는 어떤 종류의 동물 - 예를 들어 실험용, 가축 또는 반려동물(Companion animal) - 로부터도 얻어질 수 있으며; 바람직하게는 영장류, 가장 바람직하게는 인간으로부터 얻어질 수 있다.

　더 상세한 본 발명의 실시예에서:

　　　(i) CD34⁺이며 자기 재생이 가능하고 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로의 분화가 가능한 분리된 성체 줄기세포 집단; 및

　　(ii) 상기 줄기세포의 성장을 도울 수 있는 배지를 포함하는 배양을 제시한다

바람직하게는 본 발명은

　　　(i) CD34⁺이며 자기 재생이 가능하고 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로의 분화가 가능하며, 조직배양용 플라스틱에 부착이 가능한 (분리된) 줄기세포 집단; 및

　　(ii) 상기 언급된 줄기세포의 성장을 도울 수 있는 배지를 포함하는 배양을 제시한다.

　일단 줄기세포가 추출되면, 조절된(conditioned) 배양액에서 기질세포(stromal cell)로부터 성장함으로써 증식될 수 있으며, 그러한 기질세포는 골수, 태아의 흉선(fetal thymus) 또는 태아의 간(fetal liver)에서 얻어질 수 있고, 또한 이들은 줄기세포 유지에 관련된 성장 인자들(growth factors)을 제공하는 것으로 보여지며, 그러한 기질세포 또는 줄기세포의 증식을 돕는 유지 인자(maintenance factor)를 포함하는 배지에서 공동배양(coculture)하는 경우, 상기 기질세포는 자신으로부터 유래한 것(autologous)이거나, 동종(allogeneic) 혹은 이종(xenogeneic)의 개체에서 유래한 것일 수 있다.

공동배양(coculture)에 사용하기 전, 혼합된 기질세포 준비물에서 원하지 않는 세포를 제거하기 위해 적절한 단일클론 항체 - 예를 들어 항체-독소 접합체(antibody-toxin conjugates), 항체 및 보체(complement) 등 - 를 이용하여 조혈세포를 제거할 수 있다. 또 다른 대안으로는,　기질세포가 동종 또는 이종일 경우 클론화된(cloned) 기질세포주가 사용될 수 있다. 따라서, 상기 언급된 ‘배지’는 그러한 기질세포를 포함한다.

　본 발명의 줄기세포와 그로부터 분화된 세포들은 액체질소에서 냉동보존을 거쳐도 생존할 수 있다.

　　또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 CD34⁺이며, 자기 재생이 가능하고, 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성 세포로 분화가 가능한 성체줄기세포를 분리하는 방법을 제공하며, 이 방법은 어떤 대상으로부터 혈액 또는 골수 샘플을 채취하고, 그로부터 상기의 세포집단을 추출(extracting)하는 방법을 포함한다.

　바람직하게는, 본 발명은 CD34⁺이며, 자기 재생이 가능하고, 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성 세포로 분화가 가능하며,　조직 배양용 플라스틱에 부착이 가능한 줄기세포를 분리하는 방법을 제공하며, 이 방법은 어떤 대상으로부터 혈액 또는 골수 샘플을 채취하고, 그로부터 상기 세포집단을 추출(extracting)하는 방법을 포함한다. 바람직한 추출(extraction)의 단계는 상기에 논의되었으며, 혈액 샘플링의 경우에 있어서는, 대상물에 G-CSF를 투여하는 것이 바람직한 줄기세포 유동화(mobilization) 의 초기 단계가 대체로 있게 될 것이다.

　조직 배양용 플라스틱에 부착하는 것은 골수중간엽세포(marrow mesenchymal stem cell), 단핵세포(monocyte) 및 대식세포(macrophage)를 포함한 몇몇 세포 타입의 특성이지만, CD34-양성 세포들을 특징지우거나 아집단을 분리하기 위해 사용된 바가 아직 없었다. 조직배양 플라스틱에 부착하는 성질은 원시줄기세포(primitive stem cell)를 수 차례의 항체표지 과정이나 다른 조작(manipulation)에 의지하지 않고 줄기세포를 골라낼 수 있는 간단하고, 재현적이며 실질적인 방법으로 알려져 왔다. 본 발명의 CD34⁺세포들 또한 유리에 부착할 수 있으며, 따라서 조직배양용 플라스틱 대신 유리 또는 다른 적합한 고형의 지지체(solidsupports)들이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

　본 발명의 줄기세포는 연구 환경(research context)에 있어서의 용도를 가지는데, 예를 들면 줄기세포의 재생(regeneration)과 관련한 성장인자(growth factor)의 검출(detecting)이나 측정(evaluating)에 사용할 수 있다. 또한 상기 줄기세포는 자가유래(autologous) 줄기세포의 유전자조작(manipulation)이나 치환(replacement)을 통해 유전병의 치료에 직접 사용될 수도 있다. 특히 상기 세포들은 베타-지중해빈혈(Beta-thalassemia)과 겸형적혈구 빈혈증 (sickle cell anemia)과 같은 조혈세포와 연관된 질병의 치료에 있어서 사용될 수 있으며, 이 경우 야생형의 유전자가 줄기세포에 도입된다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에 의하면, CD34⁺이고, 자기 재생이 가능하며, 치료에 사용할 치료유전자(theraputic gene)를 더 포함(incorporate)하는 조혈세포(haematopoietic cell)와 중간엽세포(mesenchymal cell) 모두로 분화할 수 있는,　 추출된 성체줄기세포 집단을 제공한다.

　바람직하게는, 본 발명은 CD34⁺이며, 조직배양용 플라스틱에 부착이 가능하고 자기 재생이 가능하며, 치료에 사용할 치료유전자를 더 포함하는 조혈세포(haemopoietic cell)와 중간엽세포(mesenchymal cell) 모두로 분화할 수 있는, 분리된 줄기세포 집단을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은　CD34⁺이며, 자기재생이 가능하고 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성 세포로 분화가 가능하며, 치료유전자를 함유하는 줄기세포 집단-을 그 필요에 따라 환자에게 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 CD34⁺이며, 조직배양용 플라스틱에 부착이 가능하고, 자기 재생이 가능하며, 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성 세포로 분화가 가능하며, 치료유전자를 함유하는 줄기세포 집단-을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다.

　적합한 치료 유전자는 환자에게 결실된 유전자 또는 약물내성 유전자의 야생형 유전자를 포함하게 될 것이다.

　부가적인 치료 유전자가 없이도 상기 줄기세포는 여전히 치료목적의 용도를 지니는데, 예를 들어 줄기세포가 없는 환자의 조혈계(haematopoietic system)를 재생시키는 것이다.

　크게 주목받는 또 다른 용도들은 본 발명의 줄기세포로부터 각기 상이한 분화된 세포타입을 형성하는 것과 관련이 있다. 본 발명에 명시된 도면에 나타나 있듯이, 유익하게 짧은 시간(timescale)내에 중간엽세포(mesenchymal cell), 조혈세포(haemopoietic cell), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 관 형성세포(tube-forming cell), 및 수지상돌기 형성세포(dendrite forming cell)가 형성될 수 있었다. 특히 조혈세포와 중간엽세포의 제조(preparation)가 더 바람직하다. 　세포들은 14일이 경과하기 이전부터 간세포, 신경세포, 중간엽세포, 내피세포, 상피세포 및 조혈세포의 출현으로 관찰되었다.

　상기 줄기세포는 요구되는 세포타입에 따라 여러 사이토카인의 칵테일(cocktail)로 배양된다. 상기 칵테일은 일반적으로 G-CSF, GM-CSF, 인터류킨-3(IL-3)및 줄기세포 인자(stem cell factor)를 포함하며, 간세포(hepatocyte)의 분화를 촉진하기 위해 HGF및 FGF와 함께 첨가된다;　니코틴아마이드(nicotineamide) 와 LY294002는 췌장세포(pancreatic cell)로의 분화를 촉진하기 위해서, FGF및 cyclic AMP는 신경세포의 형성을 촉진하기 위해 첨가된다. 다른 성장인자들은 뼈, 연골, 골격근 및 심근, 신장, 폐, 신경, 피부 및 내분비 조직으로의 분화에 중요한 것으로 전문가(skilled man)에게 알려져 있다. 이 방법을 통해 생성되는 바람직한 세포타입은 간세포, 췌장세포, 조혈세포, 신경세포 및 빈돌기세포(oligodendrocytic cell)가 있다.

　따라서, 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 다수의 성장인자를 이용하여 본 발명의 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 타겟 세포타입의 제조 방법을 제공한다. 실시예와 도면에 기술되어 있듯이, 성공적인 분화는 육안관찰, 플로우 사이토메트리(flow cytometry), 역전사효소 연쇄중합반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 면역아형검사(immunophenotyping)를 통해 관찰될 수 있다. CD34뿐만 아니라, 예를 들어 알부민(albumin), 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein), 알파1-항트립신(alpha 1-antitrypsin)과 간세포(hepatocyte) 성장인자 수용체 (HGF receptor - c - met) (간세포의 특성), 비멘틴(vimentin, 골격근 및 신경세포) 와 평활근 액틴 (smooth muscle actin, 근육세포)을 발현하는 세포들이 확인(confirmed)되었다.

바람직하게는　분화된 세포들은 특징들 - 예를 들어 형태 및 자연적으로 발생하는 대응세포(counterpart)의 기능 - 을 가지게 될 것이다. 그러나 분화된 세포들은 그들의 균질성으로써 자연적으로 발생한 세포 및 분리된 세포로부터 구별될 수 있는데, 이 경우 균질성은 정상 세포주기(normal cell cycle)에 대한 상기 세포의 주기와 관련된다.　 본 발명의 이들 분화된 세포 집단은 실질적으로 균질(homogeneous)할 것이며, 이는 모든 구성세포들이 거의 같은 세포주기의 단계에 있을 것임을 말한다; 반대로 자연적으로 발생한 세포집단은 이런 측면에서 볼 때 이질적(heterologous)일 것이다.

　상기 분화된 세포는 차후 그들을 필요로 하는 환자들에게 이식될 수 있다. 특히 이로운 점은, 세포 또는 조직의 이식을 위해 환자 자신의 줄기세포로부터 유래된 분화된 세포를 생성할 수 있는 잠재력이다. 이러한 기술은 당업계에(in the art) 알려져 있으며, 특정 타겟 조직의 종류에 따라 상이한 투여방법을 이용한다. 예를 들어 간(liver)이 손상된 경우- 예로써, 간염(Hepatitis infection) 또는 알코올남용(alcohol abuse)의 결과로 - 건강한 간세포집단을 도입함으로써 스스로 재생이 가능하다. 면역억제(immune suppression)는 임파구(lymphocytes)를 투여함으로써 처치(treat)될 수 있으며, 근육쇠약(muscle wasting)에는 골격근세포를 투여하고, 당뇨병(diabetes)에는 췌장세포(pancreatic cells)를 투여하는 등의 방법이다.

　상기 세포들은 국소적인 방법(localised manner), 예를 들어 간(liver)과 같은 타겟 기관에 직접 주사하여 투여될 수 있다. 또 다른 대안으로서, 상기 세포들은 타겟 기관으로부터 멀리 떨어진 곳, 예를 들어 정맥을 통한 전달(intravenous delivery)로 투여될 수 있다. 타겟이 되는 조직으로의 전달은, 생성된 세포 타입과 함께 타겟팅 리간드 - 단일클론 항체, 세포 접착(adhesion) 분자 및 그들의 리간드, 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine) 및 톨유사 수용체(toll-like receptors)와 그들의 리간드 등 - 간의 복합체(complex)를 형성하여 수행될 수도 있다. 이러한 ‘복합체(complex)’는 표면에 타겟팅 리간드를 발현하는 세포들을 포함한다.

　본 발명의 줄기세포는, 재생 및 회복방법, 그리고 생체상(in vivo)에서 일어날 수 있는 상기 세포들의 분화 방법을 포함하는 치료방법에 직접적으로 사용될 수 있다. 줄기세포 및 분화된 세포를 이용하여 손상된 장기가 회복 및/또는 기관의 재생이 있을 수 있으며, 또한 정상적으로 발생하지 않은 경우처럼 기관이 '손상받지 않은' 때에도 마찬가지이다. 따라서‘재생(regeneration)’은 기관(organ)의 성장 또는 개선 방법 모두를 포함하도록 넓게 해석되어야 한다.

　바람직한 실시예에 따르면, 상기 이식된 세포들은 생체상(in vivo)에서 추적(tracked)되도록 적합화(adapt)된다. 즉, 그들은 신체 내에서 세포의 위치를 의미하는 표식부위(labeling moiety)를 함유(incorporate)하여 신체의 어디에 위치하는지 식별될 수 있다. 간편하게는 상기 세포들은 철산화물(iron oxide)과 같은 철화합물을 함유할 수 있고, 이후 MRI가　 이식된 세포의 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 특히 그 세포들이 타겟이 되는 조직에 도달하였는지 확인하는데 사용될 수 있다. 실시예 4에 기술된 바와 같이, MR agent Resovist®은 적합한 철 함유 화합물로써, 함께 배양시 세포들에 의해 섭취될 수 있다.

　따라서, 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기에 정의된(defined) 방법에 따라 준비된 분화된 세포집단 및 치료에 사용할 그러한 세포들과, 마찬가지로 분화된 이들 세포를 환자에 투여하는 의학적 치료방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 분화된 세포를 이식하는 방법을 포함하는데, 그 방법은:

　(i) 분화를 유발하기 위해 본 발명의 줄기세포 집단을 다양한 성장인자와 함께 배양하는 것; 및

　(ii) 상기 분화된 세포를 환자에 이식하는 것을 포함한다.

　상기 환자는 인간인 것이 바람직하고, 또한 상기 분화된 세포를 형성하기 위한 줄기세포는 환자 자신으로부터 얻어지는 것이 바람직하다.

　환자로부터 샘플을 채취하고 투여를 위해 분화된 세포로 성장시키는 동안 소요되는 시간이 짧은 것이 본 발명이 제시하는 특별한 이점이다.

　본 발명의 줄기세포와 그로부터 유래된 분화된 세포는, 원하는 단백질을 시험관상태(in vitro)에서 생산하는데 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 줄기세포 또는 그로부터 유래한 분화된 세포를 배양하고　수확하여,　상기 세포들로부터 발현되는 하나이상의 단백질을 얻는 것을 포함하는, 시험관상태(in vitro)의 단백질 제조 과정을 제공한다.

　동물 세포들이 시험관상태(in vitro)의 타겟 단백질 - 특히 치료제(therapeutic agents) - 제조의 발현(expression) 시스템으로써 우세해졌으며, 이는 단백질에 대한 번역후 변형(post-translational modification)(예를 들어, 당사슬화(glycosylation))을 수행할 수 있는 그들의 능력 때문이다. 본 발명의 줄기세포와 그들의 분화된 자손들은, 치료목적의 모든 단백질은 아니더라도, 에리스로포이에틴(erythropoietin), 성장 인자(growth factor) 및 인슐린(insulin) 등과 같은 단백질 호르몬, 또는 합성 단백질과 같이 대개의 경우에 사용될 수 있다. 상기 세포들은 특정 타겟 단백질의 생산을 제공(provide) 또는 항진(enhance)시키기 위해 유전적(genetically)으로 조작될 수 있다.

　그러나, 상기 세포들이 유전공학의 필요없이 목적하는 단백질을 자연적으로(naturally) 생산하도록 적절한 세포타입(예를 들어 실질 세포(parenchymal cell))으로의 분화가 수행될 수 있다는 것은, 본 발명에 의해 가능해진 세포 타입의 특히 바람직한 특징이다.

상기에 기술된 본 발명의 (줄기세포 또는 분화된 세포) 세포의 용도는 스테로이드(steroid)와 같이 단백질이 아닌 산물에 대해서도 적용이 가능(applicable)하며, 두 가지 경우 모두 적합한 배양 또는 수확기술 이 전문가(skilled man)에게 알려져 있다.

　본 발명의 줄기세포는 아데노 바이러스(adenovirus), 레트로 바이러스(retrovirus), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) 등의 벡터를 증식할 수 있는 세포 내 기구(machinery)들을 가지며; 이는 현시점의 양호한 생산 실시(Current good manufacturing practice, cGMP)를 준비하기 위해 필수적인 단계이다. 따라서 또 다른 측면에서, 본 발명은 여기에 정의되고 기술된 바와 같이 벡터의 제조, 특히 바이러스 벡터(viral vector)의 제조에 있어서 본 발명의 줄기세포의 용도를 제시한다. 또 다른 대안으로 조망되었듯, 본 발명은 여기에 정의되고 기술된 대로 본 발명의 줄기세포에서 증식되는, 의도하는(of interest) 벡터의 제조방법을 제시한다. 상기 벡터 (유전 가능 물질)는 일반적으로 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노 계열의 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다.

본 발명은 아래의 제한되지 않은(non-limiting) 실시예들과 도면에 대한 참조로 더 기술될 것이며, 도면에 있어서:

도 1-10은 본 발명의 줄기세포들이 시간의 경과에 따라 중간엽세포(mesenchymal cell)(도 3, 5 및 6), 조혈 세포(haemopoietic cell)(도 4), 상피양세포(epithelioid cell)(도 7, 8), 관 형성세포(tube-forming cell)(도 9)와 수지상돌기 형성세포(dendrite forming cell)(도 10)로 분화하는 것을 보여주는 사진이다.

도 11은 실시예 4에 기술된 실험방법에 따라 어떻게 CD34⁺세포들이 Resovist®Schering AG)을 흡수할 수 있었는지를 보여주는 사진이다. 이 그림에 있어서, 각각의 점들은 다음을 나타낸다:

1.　　　　　　10⁶cells, 0.25 mmol Resovist, 하룻밤 배양 (overnight incubation)

2.　　　　　　　10⁶ cells, 0.25 mmol Resovist + 비드(beads), 하룻밤 배양

3.　　　　　　　10⁶ cells, 비드, 하룻밤 배양.

4.　　　　　　　10⁶ cells, 음성 대조군 (무염색, no staining)

5.　　　　　　　5x10⁵ cells, 음성 대조군 (무염색, no staining)

6.　　　　　　　5x10⁵ cells, 0.25 mmol Resovist, 하룻밤 배양

7.　　　　　　　5x10⁵ cells, 0.25 mmol Resovist + 비드, 하룻밤 배양

8.　　　　　　　5x10⁵ cells, 비드, 하룻밤 배양

9.　　　　　　　10⁶ cells, 0.25 mmol Resovist, 2시간 배양.

10.　　　　　10⁶ cells, 0.25 mmol Resovist + 비드, 2시간 배양

11.　　　　　10⁶ cells, 비드, 2시간 배양

12.　　　　　5x10⁵ cells, 0.25 mmol Resovist, 2시간 배양

13.　　　　　5x10⁵ cells, 0.25 mmol Resovist + 비드, 2시간 배양

14.　　　　　5x10⁵ cells, 비드, 2시간 배양

15.　　　　　비드만 첨가, 세포 없음.

도 12는 간세포(hepatocyte) 표지물질인 알부민(albumin)과 알파 페토프로틴(alpha fetoprotein)의 존재로 확인되듯이, 줄기세포의 간세포로의 분화를 보여주는 사진이다.

도 13은 간세포 성장 인자(HGF)와 상피성장인자(EGF)를 기본적인 사이토카인들(GM-혼합물)(GM-혼합물/기본적인 사이토카인들은 G-CSF, GM-CSF, 인터류킨-3(IL- 3) 및 줄기세포의 인자(stem cell factor)의 조합이다)에 배양의 7일째에 첨가하는 것이, 0일이나 3일째에 첨가하는 것보다 세포수에 있어서 더 큰 영향을 주는 것을 보여주는 그래프이다.

도 14는 기본적 사이토카인으로 유지된 60일간 배양에서의 실제(actual) 및 누적된(cumulative) 세포수를 보여주는 그래프이다.

도 15는 배양 7일 후의 텔로머라제 활성을 보여주는 젤의 방사선사진이다.

도 16은　사이토케라틴 18(cytokeratin 18)이 대조군 쥐의 간에는 없고, 이식된 쥐의 간에서는 양성임을 나타내는 면역페록시다제(immunoperoxidase) 면역세포화학(immunocytochemistry)으로 현상된(developed) 현미경 슬라이드의 사진이다.

도 17은 인간 알부민이 대조군 쥐의 간에는 없고, 이식된 쥐의 간에는 양성임을 나타내는 면역페록시다제(immunoperoxidase) 면역세포화학(immunocytochemistry)으로 현상된(developed) 현미경 슬라이드의 사진이다.

도 18은 사이토케라틴 18과 알부민에 대한 이중 항체염색의 3색 형광이미지를 보여주는 사진이다.

도 19는 인간 세포핵에 대한 항체로 염색하여 대조군 쥐와 이식된 쥐의 간에 인간 세포핵이 각각 없음과 있음을 나타내 주는 간의 섹션(section)사진이다.

도 20은 이식된 쥐의 간에 인간 염색체에 대한 인시투 하이브리드(in situ hybridization)결과를 보여주는 형광사진이다.

도 21은 갓 추출된 ASC23의 각각 상이한 혈청(serum)농도에서의 저온보관과, 그 후 배양에서의 성장에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.

　섹션 A

실시예 1. 세포 추출

조혈원시세포는 이식을 목적으로 정상개체(normal individual)의 골수 또는 이동 혈액(mobilized blood)으로부터 수득되었다. Lymphoprep^TM 밀도 구배(density gradient)를 이용하여 전체로부터 단핵의 분획이 분리되었다.

CD34⁺세포는 MiniMACS기술을 이용하여 분리되었다. 세포는 우선 CD34의 단일클론 항체로 표지되고, 그 후 상자성 비드(paramagnetic bead) 로 표지되었다. 표지된 세포는 자석 위에 설치된 컬럼 위에 로딩되어, 표지되지 않은 세포들은 용출(elute)되고, 표지된 세포들은 컬럼을 자석으로부터 제거시킴으로써 방출(release)되도록 하였다. 상기 CD34⁺ 세포들은 조직배양용 플라스틱 용기에서 적어도 2시간 동안 37℃로 배양되었다. 부착성이 없는 세포들은 HBSS로 세척하여 제거하였다.

실시예 2. 세포배양

세포들 (2 x 10⁵/ml)은 혈청(serum), 100ng/ml의 과립성 백혈구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 5ng/ml 의 인터류킨-3(IL-3), 20ng/ml의 줄기세포인자(SCF)와 1ng/ml 과립성 백혈구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor) (GM-CSF)를 포함하는 메틸셀룰로즈(methylcellulose) 배지에서 배양되었다. 이러한 사이토카인의 조합은 또한 "기본적 사이토카인들" 또는 "GM-혼합물(GM-mix)"로 불러질 수 있다. 이는 차후에 더 특징지워질 수 있는 이질적 세포 집단(heterogeneous population of cells)을 야기한다. 선택된 각 집단은 이어, 맞추어진(tailored) 사이토카인 칵테일을 이용하여 분화되도록 하였다.

실시예 3. 플로우 사이토메트리와 면역 세포 화학( flow cytometry and immunocytochemistry )

플로우 사이토메트리 ( flow cytometry ) 배양액 내 이미 발달한 부착성 집단은 배양접시를 스크래핑함으로써 제거(remove)되었다. 세포들은 4% 파라포름알데히드(paraformalehyde)에서 고정되고 침투성이 부여(permeablised)되었다. 세포들은 FITC가 연결된 단일클론항체로 표지되고, Becton Dickinson 플로우 사이토미터(flow cytometer)로 분석되었다.

면역 세포 화학( immunocytochemistry ) 배양액 내 이미 발달한 부착성 집단은 배양접시를 스크래핑하여 제거되었다. 세포들은 유리 슬라이드 상에 사이토스핀(cytospin)된 후 메탄올로 고정되었다. 세포들은 단일클론 항체로 표지되고 APAAP(alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatise) 반응을 이용하여 가시화 되었다.

플로우 사이토메트리와 면역 세포 화학의 결과는 아래 표 1에 나타나 있다.

항원	플로우 사이토메트리	면역 세포 화학
알부민( Albumin )	9.2%*	Large cells +ve**
알파 페토 프로틴 (Alpha feto protein )	12.3%	Large cells +ve
알파 1 안티트립신 (Alpha 1 antitrypsin )	20.1%	N/A
cMET ( HGF 수용체))	34.9%	+ve
평활근 액틴( Smooth muscle actin )	61.2%	Large cells +ve
GFAP( astrocytes )	57.4%	- ve
cKIT	22.1%	- ve
비멘틴( Vimentin )	6.3%	Large cells +ve
hTERT	20.1%	- ve

* 는 세포집단에서 양성 세포의 %를 나타낸다.

** 는 세포집단에서 큰 세포들은 양성임을, 작은 세포들은 음성임을 나타낸다.

알부민, 알파 페토 프로틴, 알파 1 안티트립신 및 c-MET(HGF 수용체)은 간세포 마커들이며; GFAP(성상세포, astrocyte) 는 뇌세포의 마커; 그리고 평활근 액틴은 중간엽세포(mesenchymal cell)의 마커이다.

도 12는 12일 배양후 간세포(liver cell) 마커를 나타내는 세포들을 보여준다.

실시예4 . 세포내로 철 산화물의 인입과 상자성 비드를 이용한 세포의 표지

CD34⁺ (10⁶ and 5x10⁵) 세포는 0.25　mmol Resovist®(Ferrixan의 상품명, 카르복시-덱스트란(carboxy-dextran)으로 코팅된 산화철 나노입자이며 Schering AG로부터 입수가능)에서 2 내지 24 시간동안 37℃ 에서 배양되었으며 MRI로 분석되었다. 두 경우 모두에 있어서, MRI에 의해 양성신호가 얻어졌으며, 이는 생체수준의 상태(in vivo)에서 CD34⁺세포의 검출(detected)에 있어Resovist를 이용하는 것이 가능함을 보여준다. 도 11의 결과는 입자들이 세포에 의해 흡수될 수 있으며 따라서 CD34⁺세포 또는 그들의 분화된 자손들이 체내에서 이동하거나 타겟 조직에 위치하는지를 추적하는데 사용될 수 있음을 보여준다.

시험관 수준의 Resovist의 독성은 트리판블루 익스클루젼 어세이(Trypan blue exclusion assay)분석을 통해 테스트되었고 크게 중요하지 않은 것으로 나타났다(<4%). 이 실험의 결과는 도 11에 나타나 있다.

섹션 B (추가적인 실시예들 )

실시예 5: ASC 34의 근원( source )

건강한 공여자(donor)로부터 흡기(aspiration)를 통해 얻어진 골수(Bone marrow)와, 일개 코스(course)의 과립형 백혈구 콜로니 자극인자(G-CSF) 를 이전에 부여받은 건강한 공여자로부터, 백혈구 성분 채집술(leukapheresis)을 통해 얻어진 이동말초혈액(mobilised peripheral blood, PB), 및 만삭의 출산에서 얻어지는 제대혈(umbilical cord blood (UCB))이 일반적인 ASC 34의 근원(source)으로 사용되었다.

모든 경우에 있어서 정보가 제공된 동의(informed consent)와 연구 윤리 위원회의 승인이 요구된다. 성체의 조혈조직과 제대혈에서 발견되는 것과 마찬가지로, ASC-34의 활성은 성체의 골수, 만삭의 제대혈, 태아의 간(임신중 연령 11.6-13.8주) 및 태아의 골수(12.7-15.4주)에서도 검출되었다. 이들 세포들은 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 상이한데, 이는 배아가 수정(fertilization) 이후 8주에 이르러 태아가 되는 것으로 여겨지기 때문이다.

실시예 6: 부착성 CD34 -양성 인간 줄기세포( ASC34 )의 균일 세포집단의 정제( purification )

자기 재생(self-renewal), 분화 및 생체수준에서의 이식에 대한 잠재력을 향후 관찰하기 위해, 줄기세포를 균일(homogeneity)하게 초기에 정제하는 것이 요구된다. 그러한 세포집단은, 순차적인 밀도 구배 분리, 면역 자기 비드 선별(immunomagnetic bead selection) 및 차등적 부착성(differential adherence)을 통해 얻어지며, CD34의 발현, 조직배양용 플라스틱 또는 유리에 대한 부착성 및 작은 임파구와 유사 형태라는 면에서 균일(homogeneous)하다.

상기 단핵세포 (MNC)분획은 Lymphoprep을 통한 밀도구배 원심분리로 전체 샘플에서 분리되었으며, 그 후 CD34-양성 분획은 상기 MNC로부터 MiniMACS 기술(Miltenyi Biotech)을 이용하여 분리되었다. 이를 위해, 세포들은 우선 항CD34 단일클론 항체로 표지되었고, 그 후 상자성 마이크로비드(microbeads)로 표지되었다. 상기 표지된 세포들은 자석 위에 설치된 컬럼 위에 로딩되었고, 표지되지 않은 세포들이 용출(eluted)된 후, 표지된 세포들은 자석에서 컬럼을 분리함으로써 방출(released)되었다. 상기 정제된(>98%) CD34-양성 세포들은 15% 혈청(serum)이 보충된 알파 배지(alpha medium)에 2X10⁵/ml로 희석되었다.

부착성의 CD34-양성 줄기세포(ASC 34)는 CD34-양성 세포의 현탁액을 조직배양 플라스틱 용기에서 적어도 2 시간동안 37℃로 배양함으로써 얻어졌다.

비(非)부착성 CD34-양성 세포들은 상기 조직배양 용기를 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 세척하여 제거되었다.

접착성 CD34-양성 세포들은, 배양을 시작하기 위해 사용된 조혈 조직(BM, PB, UCB)에 상관없이, 전체 CD34-양성 세포의 ~1%를 포함한다. 분화되지 않은 CD34⁺ 부착성 줄기 세포(ASC34)는 높은 핵:세포질 비율을 가지면서 작은 임파구와 유사한(small lymphocyte-like) 형태를 보인다. 배양의 시작단계에 있어서 그들은 조직배양 표면에서 단일 세포로 넓게 간격을 두어 분포한다. 상기 시작단계의 세포들은 정의상, CD34-양성이다. 골수모양(myeloid)콜로니 형성 세포의 생성을 리드아웃(readout)으로 이용하여 측정되는 바와 같이, 항-Thy-1 단일클론 항체를 이용한 항체소거(antibody depletion)는, 실제로 부착성 CD34⁺ 세포의 모든 활성을 제거하였다. 6개의 독립 샘플로부터 분리된 세포들을 이용한 면역세포화학 결과에 의하면, 평균적으로 28.1%, 그러나 90%까지 Thy-1을 발현했다. 그들은 또한 AC133과 핵에 분포하는 c-met을 발현했으나 CD3 또는 CD19는 발현하지 않았다. 그들은 CD33, CD38 또는 HLA-DR은 발현하지 않았다.

그들은 5-플루오우라실(5-fluorouracil)과 같은 세포주기 활성화 시약의 처리에 저항성을 가지는 비주기성(non-cycling) 세포들이다.

표 2는 CD33, CD38과 HLA-DR의 발현 측면에서 볼 때, 상기 ASC34가 비(非)부착성 CD34양성 세포에 비해 유의하게 더 균질함을 보여준다.

부착성 또는 비(非)부착성 분획에 있어서 항원 음성 CD34-양성 세포들의 퍼센트

항원	부착성CD34+	비부착성CD34+	P 값 **
CD38 (n=4) CD33 (n=4) HLA-DR(n=4)	87.6±3.1* 87.5±4.9 71.4±8.9	17.4±15.8 58.8±17.2 43.3±16.9	0.008 0.02 0.03

*평균 ± SEM (평균의 표준오차); ** 부착성과 비부착성의 CD34+ 세포를 비교하는 Mann-Whitney U 검정;

n=테스트된 샘플수.

실시예 7: 선택 마커로써 조직배양 플라스틱에 대한 부착성의 이용

조직배양 플라스틱에 대한 부착성(adhesion)은 골수 중간엽 줄기 세포 (Marrow mesenchymal stem cell), 단핵세포(monocyte) 및 대식세포(Macrophage)를 포함하는 몇몇 세포 타입의 특성으로서, CD34 -양성세포의 아집단을 특징짓는데 이전에는 사용되지 않았다. 조직 배양 플라스틱에 대한 부착성은 다중의 항체표지과정이나 다른 조작이 필요없는, 간단하고, 재현성이 있으며 실용적인 원시 줄기세포의 선별방법임이 밝혀졌다. 또 다른 장점은 상기 플라스틱을 그들의 초기성장(initial growth)의 기질(substrate)로 사용한다는 점이며, 정제 후에 별도의 배양환경으로 옮길 필요가 없다는 점이다.

배양 배지에 현탁된 CD34-양성세포들은 5x10⁵ 세포/ml의 농도로 조직배양 플라스틱 용기에 도입된다. 상기 용기는 습기를 함유한 5% CO₂ 상태의 공기 중에 37℃에서 배양된다. 전체 CD34-양성세포의 99%를 포함하는 비부착성 CD34-양성 세포들은 배양 배지로 구석구석까지 씻어주면서 제거된다. ASC34는 유리에는 쉽게 부착하지만 조직배양용이 아닌 등급의 플라스틱에는 잘 부착되지 않는다.

ASC34는 더 이상의 연구나 조작을 위해 세포 스크래퍼(scraper)를 이용하여 조직배양 플라스틱에서 기계적으로 떼어내어 수득될 수 있다. 트립신(trypsin)이나 아큐타제(Accutase)는 효율적이지 않다.

실시예 8: 부착성 CD34 -양성 인간 줄기 세포( ASC34 )의 원천으로 이동 혈액(mobilised blood ) 의 사용

배양된 줄기세포를 이용하여 조직을 재생하는 과정에 있어서, 배양을 시작하는데 이용할 수 있는 세포의 수가 하나의 제한요소가 된다. 골수와 제대혈은 선호되는 원천이다. 그러나, 말초혈액 전구세포(PBPC,Phripheral Blood Progenitor Cell)는 배양을 시작하기 위해 훨씬 많은 수의 세포를 수확할 수 있으므로, 증폭의 정도 및 임상적으로 유용한 결과물을 생성하는데 소요되는 시간이 줄어든다.

공여자(Donor, 자가공여 또는 동종의 공여)는 일주일 코스(course)로 5mg/kg의 G-CSF를 피하에 투여받는다. 세포들을 프로그램된 혈액성분 분리기(apheresis machine)을 이용한 백혈구 성분채집술(leukapheresis)을 통해 수확한다. 일반적인 세포 수득율은 5-10x10¹⁰이며, 이들 중 대부분이 단핵세포이고, ~1% (5-10x10⁸) 가 CD34⁺이다. 상기 CD34-양성 세포들은 CliniMacs 시스템(MiniMacs의 스케일-업 버젼)을 이용해 분리된다. 직접적 관찰에 의하면, 상기 ASC34는 CD34-양성 세포군(5-10x10⁶)의 ~1%이다. 이러한 평가는 조혈 콜로니 형성 세포 어세이를 리드아웃(readout)으로 이용하여 ASC34의 활성을 제한적 희석 분석(limiting dilution analysis)함으로써 확인되었다. 따라서, 1-2주 기간에 걸쳐 도달 가능한 3-4의 로그 확장(expansion)은, 임상에 적용할 5-100x10⁹ 개 세포의 수득을 가져올 것이다.

실시예 9: ASC34 의 배양

1 단계 조건: 배양의 첫 단계는 부착성 세포를 증식(expand)하는 것으로 구성된다. 상기 ASC34는 메틸셀룰로즈 함유 혈청(Methocult H4230; Metachem Diagnostics, Northampton, UK) 및 기본적 사이토카인 칵테일(100 ng/ml G-CSF (Chugai Pharma, London, UK)1 ng/ml GM-CSF, 5ng/ml IL-3, 20 ng/ml SCF (모두First Link, West Midlands, UK로부터 얻어짐)로 덧씌워(overlaid)진다. 상기 배양액은 습기를 함유한 5% CO₂ 함유 공기 중에서 37^oC 로 배양된다. ASC34는 분열과 자기 재생을 통해 부착성 줄기세포의 콜로니를 형성하고 그 후 중간엽세포, 상피세포, 도관세포(vascular cell) 및 신경세포 타입의 형태를 보이는 부착성 세포를 형성한다. 배양 첫 일주일 간 부착성 세포의 수는 40배 증가한다. 또한, 비부착성 세포들은 거대한 조혈세포(백혈구)의 콜로니가 발견되는 메틸셀룰로즈(metylcellulose)로 방출된다.

배양조건에서 메틸셀룰로즈를 생략하게 되면 세포의 생성은 60% 만큼 감소한다. 통상적인 5x10⁵/ml를 넘어서, 접종되는 CD34⁺ 세포를 증가시키더라도 세포의 생산에 있어서 상응하는 개선은 유도되지 않는다. 세포수는 4mM의 리튬염화물(lithium chloride)의 첨가로 개선되지 않았다.

2단계 조건: 2단계에서는, 세포들은 사이토카인을 더 첨가하는 액상 배양조건으로 옮겨져 필요에 맞도록 선택적인 세포분화가 유발되도록 한다. 상이하게 지향된(directed) 각각의 분화에 적합한 사이토카인은 아래에 정리되어 있다.

지향된 분화를 위한 적합한 조건들

조직	첨가물의 예시
신경	DMSO; butylated hydroxyanisole; isobutyl methylxanthine; b-FGF; FGF-8
췌장	bFGF; EGF; activin A; betacellin; HGF; nicotinamide
골격근	EGF; PDGF; 5-azacytidine
심장	Norepinephrine; forskolin; retinoic acid
간	EGF; HGF; FGF-4
뼈	BMP-4
연골	TGF-beta; dexamethosone; BMP-6

도 13에서 볼 수 있듯이, 몇몇 사이토카인들은 배양 7일째에 첨가되는 것이 0일째나 3일째에 첨가되는 것보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 표 4는 각기 상이한 사이토카인과 조합들이 2주가 경과된 배양내의 총세포수에 미치는 영향을 나타낸다.

여러 사이토카인과 사이토카인 조합이 세포 수득율에 미치는 영향*.

첨가된 사이토카인(들)	0 일	7 일
aFGF bFGF FGF4 IGF VEGF HGF bFGF + IGF VEGF + IGF HGF + FGF4 HGF + VEGF HGF + EGF HGF + b cellulin HGF+EGF+ b cellulin+activin A KGF niotinamide + glucose	2.5 1.2 1.0 1.75 1.0 1.4 1.38 0.87 1.2 1.14 1.0 - - -	0.98 1.0 0.99 0.62 1.01 0.8 1.18 0.71 - 1.14 1.8 1.0 3.5 0.83

* GM-혼합물만에 대한 상대적인 세포의 수득율은, 첨가된 사이토카인의 존재하에서의 세포의 수득율 : GM-혼합물만의 존재하에서의 세포의 수득율이다

상기 데이터는 첨가되는 사이토카인들이 세포수 전반에 있어서 그리 큰 영향을 미치지 않음을 보여준다. 더 중요한 점은, 분화를 유발하기 위한 조합(HGF+EGF+ β cellulin + activin A/ KGF + nicotinamide + glucose)이 상기 세포 수득율을 감소시키지 않는다는 점이다.

배양은 2단계 조건에서 60일간 유지될 수 있다(도 14).

실험예 10: 텔로머라제 ( telomerase ) 활성

텔로머라제의 활성은 TRAP 분석을 통해 측정되었다. 세포들은 1 x CHAPS 완충액으로 옮겨지고 그로부터 유래된 용해질(lysate)은 DC 분석(Bio-Rad)을 통해 단백질 농도분석이 행해졌으며, CHAPS 완충용액으로 77ng/ul로 표준화(normalize)하고 1:10, 1:40 및 1:160이 되도록 희석하였다. 용해질은 TRAPeze 텔로머라제 검출 키트(Intergen)을 이용하여 분석되었다. TS 프라이머는 37 ^oC에서 20분 동안 표지되었으며 85^oC에서 5분간 열변성하였다. 그 후 중합효소 연쇄반응(PCR)은 59^oC의 어닐링(annealing) 온도에서 28 사이클 수행되었다. TRAP의 결과물은 TRAP 로딩염료에 희석되고 12.5%의 아크릴아마이드 - 0.5 x TBE 젤에 러닝(run)된 다음, 건조후 X-ray film에 노출되었다.

TRAP 분석에 의해 평가된 바와 같이, 초기배양상태에서는 세포들이 텔로머라제 활성을 발현하지 않았으며, 이는 분리(isolation)시 세포의 휴지기적 특징(quiescent nature)과도 상응하는 것이다. 유의적인 텔로머라제의 활성은 7일 배양된 세포에서부터 뚜렷하며(도 15) 이는 상기 단계에서 일어나는 세포의 증식과도 상응하는 결과이다.

실시예 11: 중합효소 연쇄반응( Polymerase chain reaction )

실시예에 명시된 바와 같이 ASC34(0일) 및 기본적 사이토카인 또는 HGF 나 EGF가 처리되어 7일과 14일 배양된 ASC34유래 세포들로부터 용해질이 준비되었다. 차후의 실험에서, 세포들은 배양상태에서 35일까지 분석되었다. 상기 배양된 세포의 부착성, 비부착성 세포분획으로부터 구별된 용해질이 준비되었다. 유전자의 발현은 PCR에 의해 분석되었다.

0일째 ASC34 에 의한 유전자 발현

자기재생 및 다분화능 마커 ( Self - renewal and pluripotency markers )

Rex -1 : 산화환원감지 전사저해자 (redox-sensing transcriptional repressor)

Oct 4 : 8량체 결합 전사조절인자-4(octamer-binding transcription factor-4)

Nanog : ES 세포의 자기재생을 촉진하는 호메오 도메인 단백질 (homeodomain protein promoting ES cell self-renewal)

조혈세포 마커 ( Haemopoietic cell markers )

CD34 : 조혈줄기세포 마커(haemopoietic stem cell marker)

CD133 : 콜레스테롤 결합 단백질 프로미닌 1. 지방 래프트 마커 (cholesterol-binding protein prominin 1. Lipid raft marker)

RECAM : 혈소판-내상피 결합 분자 (platelet-endothelial adhesion molecule)

VWF : 폰 빌리브란트 인자. 응괴 (von Willibrand factor. Coagulation)

TAL -1 : T세포 급성백혈병-1 유전자. 기본적 나선-고리-나선 단백질 (T cell acute leukaemia-1. Basic helix-loop-helix protein)

CXCR4 : SDF-1에 대한 케모카인 수용체. 줄기세포의 귀환 및 이식에 중요 (chemokine receptor for SDF-1. Important for stem cell homing and engraftment)

엔지오포이에틴 1 ( Angiopoietin 1) : Tie2에 대한 리간드. 조혈세포를 휴지상태로 유지 (Ligand for Tie 2. Maintains haemopoietic stem cell quiescence)

Tie 2 : 안지오포이에틴-1에 대한 수용체. 조혈세포를 휴지상태로 유지 (Receptor for angiopoietin-1. Maintains haemopoietic stem cell quiescence)

골격근 마커 ( Skeletal muscle markers )

TNNT1 : 스켈레탈 슬로우 트로포닌-1 (skeletal slow troponin 1)

데스민 ( Desmin ) : 근육의 주요한 중간섬유 단백질 (major intermediate filament protein of muscle)

네뷸린 ( Nebulin ) : 가로무늬 근절 섬유의 구조상의 구성요소 (structural component of striated muscle sarcomere filaments)

심장 ( Heart )

컨넥신 -43 ( Connexin -43) : 심근세포의 협간극결합의 구성요소(gap junction component in cardiomyocytes)

GATA -4 : 심근세포에서 FOG2에 결합하는 전사조절인자(zinc finger transcription factor binding to FOG2 in cardiomyocytes)

신경 ( Nerve )

CXCR4 : 신경전구체에서 SDF-1에 대한 케모카인 수용체(chemokine receptor for SDF-1 on neural precursors)

컨넥신 -43 ( Connexin -43) : 성상세포상의 협간극결합 구성인자 (gap junction component on astrocytes)

내피 ( Endothelium )

CD34 : 조혈줄기세포 마커, 내피세포에 의해서도 발현됨 (haemopoietic stem cell marker. Also expressed by endothelial cells)

CD133 : 콜레스테롤 결합 단백질 프로미닌 1. 지방 래프트 마커 (cholesterol binding protein prominin 1. Lipid raft marker)

VEGF : 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor)

KDR : 키나제 삽입도메인 수용체. VEGF의 수용체 (kinase insert domain receptor. A receptor for VEGF)

엔지오포이에틴 1 ( Angiopoietin 1) : 혈관생성 인자. Tie 2에 대한 리간드 (angiogenesis factor. Ligand for Tie 2)

엔지오포이에틴 2 ( Angiopoietin 2) : 혈관생성인자. Tek 에 대한 리간드 (angiogeneis factor. Ligand for Tek)

Tie 2 : 엔지오포이에틴 1에 대한 수용체 (receptor for angiopoietin 1)

CXCR4 : SDF-1에 대한 케모카인 수용체. 혈관생성에 중요 (chemokine receptor for SDF-1. Important for vascularisation)

PECAM : 혈소판-내피세포 부착 분자 (platelet-endothelial cell adhesion molecule)

ICAM 2 : 세포간 결합 분자 2 백혈구의 분출을 매개. (intercellular adhesion molecule 2. Mediates leukocyte extravasation)

VE cadherin : 지지접합 형성 (formation of adherens junctions)

TAL -1 : T세포 급성 백혈병-1 (T cell acute leukaemia-1)

VWF : 폰 빌리브란트 인자. 응괴 인자 (von Willibrand factor. Coagulation factor)

간 ( Liver )

알파 -1 안티트립신 ( Alpha -1 antitrypsin )

사이토케라틴 18 ( Cytokeratin 18)

네스틴 ( Nestin )

비멘틴 ( Vimentin )

c- met : 간세포 성장인자의 수용체 (receptor for hepatocyte growth factor)

CD34 : 조혈줄기세포 항원. 또한 간줄기세포로 예정된 세포에서도 발현됨 (haemopoietic stem cell antigen. Also expressed on candidate liver stem cells)

췌장 ( Pancreas )

NGN -3 : 베타세포 분화에 있어서 pdx-1의 타겟 (target of pdx-1 in beta cell differentiation)

배양 14일 후 ASC 34에서 생성된 세포에서 발현되는 유전자

조혈세포 마커 ( Haemopoietic cell markers )

CD133 : 콜레스테롤 결합 단백질 프로미닌 1. 지방 래프트 마커 (cholesterol-binding protein prominin 1. Lipidraft marker)

PECAM : 혈소판-내피세포 결합 분자 (platelet-endothelial cell adhesion molecule)

VWF : 폰 빌리브란트 인자. 응괴인자 (von Willibrand factor. Coagulation)

TAL -1 : T세포 급성백혈병-1. 기본적 나선-고리-나선 단백질 (T cell acute leukaemia-1. Basic helix-loop-helix protein)

엔지오포이에틴 1 ( Angiopoietin 1) : Tie2에 대한 리간드. 조혈세포를 휴지상태로 유지 (ligand for Tie 2. Maintains haemopoietic stem cell quiescence)

골격근 마커 ( Skeletal muscle markers )

네뷸린 ( Nebulin ) : 거대 세포골격 단백질. 가로무늬근의 근절 필라멘트의 구성요소 (giant cytoskeletal protein. Structural component of striated muscle sarcomere filaments)

심장 ( Heart )

트로포닌 1 ( Troponin 1) : 트로포닌 복합체의 서브유니트 (subunit of troponin complex)

네뷸린 ( Nebulin ) : 거대 세포골격 단백질 (giant cytoskeletal protein)

신경 ( Nerve )

CXCR4 : 신경전구체의 SDF-1에 대한 케모카인 수용체 (chemokine receptor for SDF-1 on neural precursors)

내피 ( Endothelium )

VEGF : 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor)

엔지오포이에틴 1 ( Angiopoietin 1) : 혈관 생성 인자 Tie 2에 대한 리간드 (angiogenesis factor. Ligand for Tie 2)

엔지오포이에틴 2 ( Angiopoietin 2) : 혈관 생성 인자. Tek 에 대한 리간드 (angiogenesis factor. Ligand for Tek)

CXCR4 : SDF-1에 대한 케모카인 수용체. 혈관 생성에 중요 (chemokine receptor for SDF-1. Important for vascularisation)

ICAM 2 : 세포간 결합 분자 2. 백혈구의 분출을 매개. (intercellular adhesion molecule 2. Mediates leukocyte extravasation)

VWF : 폰 빌리브란트 인자. 응괴 인자 (von Willibrand factor. Coagulation)

TAL -1 : T 세포 급성 백혈병-1. 기본적 나선-고리-나선 단백질 (T cell acute leukaemia-1. Basic helix-loop-helix protein)

간 ( Liver )

알파-1 안티트립신 ( Alpha -1 antitrypsin ) : 단백질분해효소 저해제 (protease inhibitor)

사이토케라틴 18 ( Cytokeratin 18) : 세포골격 구성인자 (cytoskeletal component)

LDLR : 저밀도 지질단백질 수용체. 콜레스테롤 항상성에 기능함. (low density lipoprotein receptor. Role in cholesterol homeostasis)

알부민 ( Albumin ) : 스테로이드, 지방산 및 갑상선 호르몬 대한 캐리어 단백질 (carrier protein for steroids, fatty acids and thyroid hormones)

HGF : 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor)

HNF3 -B : 간세포 핵인자 3 베타. 전사조절인자 (hepatocyte nuclear factor 3 beta. Transcription factor)

트렌스페린 ( Transferrin ) : 철운반 단백질 (iron transport)

AFP : 알파페토 단백질 (alphafeto protein)

췌장 ( Pancreas )

Pax -6

Pdx -1

인슐린 ( Insulin ) : 고혈당증의 대응물 및 지방형성 촉진 (counteracts hyperglycemia and stimulates lipogenesis)

IGF -1 : 인슐린 유사 성장인자 1. 소마토메딘 (insulin-like growth factor 1. Somatomedin)

HNF3 -B : 간세포 핵인자 3베타. 글루카곤 생성 췌장 섬세포에서 발현되는 전사조절인자) (hepatocyte nuclear factor 3 beta. Transcription factor expressed in glucagon-producing islet cells.

NeuroD -1 : 인슐린 유전자의 발현을 조절 (regulates insulin gene expression)

NGN3

인슐린, PDX-1, Neuro D-1 의 발현 및 기본 사이토카인류(GM-혼합물)하에 배양된 세포에 의한 NGN3 유전자의 발현은 일주일 간격으로 조사되었다. 그 결과, 인슐린은 7일부터 35일, PDX-1은 7일부터 35일, NeuroD-1 은 14일부터 35일, 그리고 NGN3는 21일부터 35일까지 발현되는 것으로 나타났다. 따라서, 인슐린 생성에 관여된 유전자의 발현은 3-5주 경과된 배양에서 나타나는 가장 광범위한 발현을 수반하며 3-4주 동안 유지되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 상기 줄기세포는 인슐린의 생성에 관여된 유전자(insulin, PDX-1, Neuro D-1 및 NGN3)를 발현하는 자손을 생성할 수 있다.

실시예 12: ASC34 의 조혈세포로의 분화

14일 이후 배양액으로부터 수확된 세포들은 일반적인 조혈 콜로니-형성세포 분석(haemopoietic colony-forming cell assays)에 투입되었다. 대체적으로, ~10³ 의 과립형백혈구-대식세포 콜로니가 형성되었으며, 이는 배양액 내 전체세포의 ~1%에 해당된다.

ASC34 유래세포들이 수확되어 조혈 콜로니 분석에서 자라게 되었을 때, 적혈구의(Erythroid) BFU-e, 거대핵세포의 (Mk-CFC) 및 다분화능의 (GEMM) 콜로니 형성 세포들 또한 확연하였다. 더욱 중요한 것은, ASC34가 이미 형성되고 배양된 스트로마 상에 접종되었을 경우에는, 모세포(blast cell) 콜로니/자갈"cobblestone"영역을 형성하는 골수 스트로마-부착성 줄기/전구세포(bone marrow stroma-adherent stem/progenitor cells)를 형성하며, 시험관 수준(in vitro)의 연장된(5주) 배양에 있어서도 장기간 조혈세포의 생성이 가능하다는 것이다.

사이토스핀을 통해 세포를 준비하고 로마노프스키(Romanowsky) 세포화학 염색을 통해 염색하였다. 이는 과립형백혈구, 단핵세포-대식세포, 거핵구계(mekakaryocytic)세포 및 적혈구(erythroid) 세포 분화의 형태적 증거를 제시한다.

실시예 13: 동물 모델에서의 이식( engraftment )

실험 1: 정맥 또는 피하주사를 통해 많은 수의 (1 x 10⁶) ASC34-유래 세포를 누드마우스에 주사하였으나, 사망이나 인식 가능한 병적 현상을 전혀 일으키지 않았다.

실험 2: 간독소(liver toxin)(1g/kg Thioacetamide)로 처리된 누드 마우스가 비장에 직접 주사된 후보 간세포(candidate hepatocyte)를 포함하는 1x10⁶의 ASC34-유래 세포를 수여받았다. 독소만을 수여 받은(received) 누드 마우스 수여개체(recipient)는 대조군으로 사용되었다. 사이클로스포린((cyclosporin (CsA))의 처리여부에 상관없이, 세포를 수여받은 모든 개체들이 생존하는 동안 대조군 마우스는 7일째에 모두 사망하였다. (표 5)

간 손상이 있는 마우스에게 ASC34-유래 세포를 이식한 결과

	Tx*만 있는 대조군 n=4	Tx+ 세포 n=6	Tx+세포+ 사이클로스포린 (cyclosporine) n=6
7일째의 사망률(%)	100	0	0

* 간 독소

실험 3

3개의 실험그룹이 준비되었다: 그룹 1, TA + 세포; 그룹 2, TA + CsA + 세포; 그룹 3, TA만 처리. 그룹 2 동물에 1주일당 2회에 걸쳐 CsA 투여용량이 투여되었다. 그룹 3의 모든 마우스는 TA 처리 후 2 일내에 사망하였다. 그룹 1과 2의 동물들은 조직샘플링을 위해 희생될 때(1일째, 8일째, 15일째)까지 생존하였다. 그룹 2 마우스의 간 절편(section)은 인간의 ASC34-유래 세포의 존재를 나타내는 간-특이적 마커인 사이토케라틴(cytokeratin) 18에 대한 염색에 있어 양성을 보였다. 대조군 동물의 절편을 통해서는 아무런 염색결과도 보이지 않았다(도 16).

실험 4

진행중인 만성형 간 이상을 유발하기 위해 항-Fas 항체 JO2가 사용되었다. 각 개체에는 1x10⁶ 개의 세포가 4주 동안 250 μg JO2/kg/주(week)의 조건으로 첫 번째 JO2 주사 이후 24시간 후에 비장 내(intrasplenically)로 투여되었다. CsA는 한 주에 두 번 제공되었다. 12 개체 중 2개체에 있어서 2일 후 실험과정과 연관된 사망이 있었으며, 한 개체는 82일 동안 생존하였다. 나머지 생존한 개체는 조사를 위해 희생되었다(2일째 1 개체, 8 일째 2개체, 13 일째 3개체 및 21 일째 3개체).

도 16-20에 제시된 분석결과는 인간 세포가 마우스의 간에 이식(engraft) 되었으며 알부민(albumin)과 사이토케라틴 18(cytokeratin 18)을 생성하였음을 나타낸다.

Example 14: 냉동보존 및 저장

세포들(부착성의 CD34-양성 분획 또는 배양에서 생성된 그들의 자손)은 30% 혈청(serum)/10% DMSO에 현탁되고 냉동보존 용기에 담아져 알코올 냉동 용액조(alcohol freezing bath)에 -80^oC로 하룻밤 배양(overnight)하였다. 저장하기 위해, 냉동된 용기는 이후 기화상태에 있는 액체질소로 옮겨졌다. 냉동된 세포들은 37^oC 수조에서 빠르게 해동된 후 내용물을 배양액으로 희석하고 세포들을 세척하여 회수되었다.

처리과정에 투입되기 전, 백혈구 성분채집술(leukapheresis)의 산물은 차후의 시험관 수준의 생존이나 성장에 있어서 37^oC 조건에서 24시간 동안 아무런 유해한 영향이 없이 보관될 수 있다(미공개 데이터). 상기 부착성 세포들이 10% DMSO 와 30-50% 혈청(serum)으로 냉동보존 하기 전에 정제된 다음 해동되었을 때, 그들은 92 ± 4.8% (평균 ± 표준편차) 의 생존율을 유지하였으며, 그들의 시험관 수준의 성장에는 아무런 영향이 없었다(도 21).

이 결과들은 실용적인 의미를 가진다.

1. 처리과정에 앞서(Prior to processing ): 백혈구 성분채집술(Leukapheresis)산물은 처리 전 4℃에서 24시간 동안 보관될 수 있다. 따라서, 차가워진 백혈구 성분채집 산물은 수집센터로부터 처리센터에 이르기까지 세계 전역으로 운송될 수 있다.

2. 정제 후(After purification): ASC34는 10% DMSO/30-50% 혈청(serum)에 현탁되고 액체질소에 냉동될 수 있다. 해동(thawing)시에 있어서 그들은 90-100%의 생존율을 유지하며, 신선한 세포와 마찬가지로 조직배양 플라스틱에 재-부착(re-adhere)하며 배양 중에 증식한다. 따라서, 분리된 기능적인 ASC34는 세계 전역으로 이송되거나 오랜 기간 보관될 수 있다.

3. 배양 후(After culture): 14일 동안 배양된 세포들은 냉동보존 및 해동되고, 재배양(recultured)되었다. 14일 동안 배양된 세포들은 주위온도(ambient temperature) 하에서 유지되고 생존을 지속할 수 있다. 따라서, 배양된 세포들은 세계 전역으로 이송되거나 장기간 보관될 수 있다.

실시예 15: ASC -34 와 중간엽 줄기세포(( mesenchymal stem cells (MSC))간의 차이점 요약

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells)는 성체 골수로부터 유래될 수 있는 분리된(separate) 세포집단이다. MSC (다분화능 성체전구세포 (Multipotent Adult Progenitor Cells, MAPC))로도 불림) 및 ASC-34 세포(본 발명의 세포)는 아래에 요약된 중요한 차이점을 보인다. MSC/MAPC세포가 CD34를 발현하지 않는다는 것 또한 주지되어야 할 것이다.

특징	다분화능 성체전구세포(Multipotent adult progenitor cell (MAPC))*	ASC-34
생체조건상에서 알려진 형질(Known phenotype in vivo)	-¹	+
조직에서의 분리가능성(Prospective isolation from tissue)	-	+
보고된 개체발생 (Known ontogeny)	-	+
균질성(Homogeneity)	-	+
정량 분석 (Quantitative assay)	-	+
생체조건상 휴지상태 (Quiescent in vivo)	?	+²
배양중 조혈세포 생성(Produce haemopoietic cells in culture)	-	+

* 참조문헌: Javazon, Beggs and Flake. Exp Hematol 2004, 32:414.

¹ - MAPC 는 연장된 배양(prolonged culture)후에서만 발견됨. 신선한 골수 샘플에서는 확인되지 않았음.

² - ASC-34 세포는 5-플루오르우라실(5 fluorouracil)에 내성을 가짐.

Claims

CD34⁺이며, 자기 재생이 가능하고, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 및 내배엽성 세포로 분화가 가능하며, 조직배양용 플라스틱에 부착이 가능한 분리된(isolated) 줄기세포 집단.
제 1항에 있어서, 상기 세포 집단은 분리 후 3시간 이내에 조직 배양용 플라스틱에 부착이 가능하고, 적어도 72시간 동안 부착 상태를 유지할 수 있는 줄기세포 집단.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 CD33^-, CD38^-, HLA-DR^-, CD3^-, 및 CD19^-인 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 또한 Thy-1⁺인 세포로 인리치(enrich)되어 있는 줄기세포 집단.
제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 또한 AC133⁺ 및/또는 c-met⁺인 세포로 인리치(enrich)되어 있는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 Rex-1, Oct 4, Nanog, CD34, CD133, PECAM, VWF, Tal-1, CXCR4, 엔지오포이에틴 1(Angiopoietin 1), Tie 2, TNNT1, 데스민(Desmin), 네불린(Nebulin), 컨넥신-43(Connexin-43), GATA-4, VEGF, KDR, Angiopoietin 2, ICAM-2, VE 케드헤린(VE cadherin), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 사이토케라틴 18(Cytokeratin 18), 네스틴(Nestin), 비멘틴(Vimentin) 및 c-met을 코딩하는 유전자를 발현하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 배양 후 증식된 그들의 자손이 CD133, PECAM, VWF, Tal-1, CXCR4, Angiopoietin-1, Nebulin, Troponin 1, VEGF, 엔지오포이에틴 2(Angiopoietin 2), ICAM 2, 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 사이토케라틴 18(Cytokeratin 18), LDLR, 알부 민(Albumin), HGF, HNF-3β, 트랜스페린(transferring), 알파페토 단백질(Alphafeto protein), Pax-6, Pdx=1, 인슐린(Insulin), IGF-1, NeuroD-1 및 NGN3를 코딩하는 유전자를 발현하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 그들의 자손이 인슐린의 생성에 관여된 유전자를 발현하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포가 성체줄기세포인 줄기세포 집단.
제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 탯줄 샘플과 같은 비(非)태아 샘플로부터 얻어진 태아세포를 포함하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 기탁번호 04092401로 ECACC에 기탁된 세포의 특징을 가지는 것인 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 포유류를 그 기원으로 하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 인간을 그 기원으로 하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 쥐과(科), 말과(科), 또는 소과(科)를 그 기원으로 하는 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 반려동물(companion animal, 伴侶動物)로부터 얻어진 샘플에서 분리되거나 유래한 줄기세포 집단.
제 1 항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포 집단은 배양에 있어서 영양세포층(feeder layers)을 필요로 하지 않는 줄기세포 집단.
(i) 조혈조직에 대해 밀도구배분리(density gradient separation)를 수행하는 단계;

(ii) 낮은 밀도의 세포들을 CD34에 대한 친화 리간드에 노출시키는 단계;

(iii) 상기 CD34 리간드에 부착된 세포들을 회수하는 단계;

(iv) CD34⁺ 세포의 아집단(subpopulation)을 조직배양용 플라스틱에 노출시키는 단계; 및

(v) 상기 플라스틱에 부착된 CD34⁺세포들을 회수하는 단계에 의해 얻어질 수 있는,

자기재생이 가능하고 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 및 내배엽성 세포로 분화가 가능한 분리된 줄기세포 집단.
(i) CD34⁺이며, 조직배양용 플라스틱에 부착 가능하고, 자기재생이 가능하며 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 및 내배엽성 세포로 분화가 가능한 줄기세포 집단; 및

(ii) 상기 줄기세포의 성장을 지지할 수 있는 배지를 포함하는 배양액을 포함하는 배양(a culture)
대상자로부터 혈액 또는 골수 샘플을 채취하는 단계 및 이것으로부터 세포집단을 추출하는 단계를 포함하는, CD34⁺이며, 조직배양용 플라스틱에 부착 가능하고, 자기재생이 가능하며, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 및 내배엽성 세포로 분화가 가능한 줄기세포 집단의 분리 방법.
제 19항에 있어서,

(i) 조혈조직에 대해 밀도구배분리를 수행하는 단계;

(ii) 낮은 밀도의 세포들을 CD34에 대한 친화 리간드에 노출시키는 단계;

(iii) 상기 CD34 리간드에 부착된 세포들을 회수하는 단계;

(iv) CD34⁺ 세포의 아집단을 고형 지지물에 노출시키는 단계; 및

(v) 상기 고형 지지물에 부착된 CD34⁺세포들을 회수하는 단계를 포함하는 줄기세포 집단의 분리방법.
제 20항에 있어서, 상기 고형 지지물은 조직배양용 플라스틱 또는 유리로부터 선택되는 것인 줄기세포 집단의 분리방법.
제 19 항 또는 제 20항에 있어서, 상기 분리된 줄기세포 집단을 배양하는 단계를 더 포함하는 줄기세포 집단의 분리방법.
제 1 항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기술된 줄기세포 집단을 상기 줄기세포 집단의 분화를 유발하는 다수의 성장인자와 함께 배양하는 단계를 포함하는 타겟 세포집단의 제조방법.
제 23항에 있어서, 상기 타겟 세포는 간세포(liver cell), 췌장세포(pancreatic cell), 조혈세포(haematopoietic cell), 신경 세포 (neuronal cell) 및 빈돌기 세포(Oligodendrocytic cell)를 포함하는 그룹에서 선택되는 것인 타겟 세포집단의 제조방법.
제 1 항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기술된 줄기세포 집단의 증식을 촉진 및/또는 유지시키는 다수의 성장인자와 상기 세포집단을 접촉시키는 단계를 포함하는 줄기세포 집단의 배양방법.
제 19 내지 제25항 중 어느 한 항에 청구된 방법에 따라 제조된 세포집단.
제 1 항 내지 제 17 항 및 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포집단은 냉동보존(cryopreservation)을 거쳐도 생존할 수 있는 세포집단.
제 1 항 내지 제 17 항, 제 26 항 또는 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈이 핵산 부위의 삽입으로 변형된 세포집단.
제 28항에 있어서, 상기 게놈은 DNA 바이러스, RNA 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 이용한 DNA 삽입으로 변형된 세포집단.
제 1 항 내지 제 17 항, 제 26 또는 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 게놈의 일부가 예를 들어, 안티센스(antisense) 핵산분자, 리보자임(ribozyme) 서열 또는 저해 RNA(inhibitory RNA)서열의 존재를 통해 불활성화된 것인 세포집단.
제 1 항 내지 제 17 항, 제 26 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포집단은 회복을 목적으로 사용되는 세포집단.
제 1 항 내지 제 17 항, 제 26 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포집단은 기관의 재생 또는 손상된 기관의 회복을 목적으로 사용되는 세포집단.
제 1 항 내지 제 17 항, 제 26 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 기관의 재생 또는 환자의 손상된 기관을 회복시키는 방법.
제 32 또는 제 33항에 있어서, 상기 기관은 조혈조직 또는 면역조직, 간, 폐, 췌장, 뼈, 연골, 근육, 피부, 뇌 또는 신경계 및 심장 또는 순환계를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 세포집단 또는 방법.
제 32 항 내지34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 추적이 가능한 마커, 바람직하게는 철산화물 또는 상자성 비드(paramagnetic bead)로 표지되는 것인 세포집단 또는 방법.
제 1 항 내지 제 17 항, 제 26 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 세포집단을 대상자에게 도입하는 단계를 포함하는 세포이식 방법.
제 23 항 또는 제 24항의 방법에 의해 제조된 세포를 물질(an agent)에 노출하여 기관- 특이적(organo-specific) 효과를 가지는 물질의 검색 방법.
제 37항에 있어서, 상기 물질은 기관-특이적 독성을 가질 것으로 추측되는 독소인 물질의 검색 방법.
제 37항에 있어서, 상기 물질은 기관-특이적 독성을 가질 것으로 추측되는 약물(drug) 또는 치료제(therapeutic)인 물질의 검색 방법.
제 37항에 있어서, 상기 물질은 기관-특이적 이점(beneficial effect)을 가질 것으로 추측되는 약물 또는 치료제인 물질의 검색 방법.
제 1 항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 줄기세포 또는 그로부터 유래된 분화된 세포주를 배양하는 단계 및 상기 세포들로부터 발현된 하나 이상의 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 시험관 수준의 단백질 생산방법