JP2009278873A - 培地および培養方法 - Google Patents
培地および培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009278873A JP2009278873A JP2008131103A JP2008131103A JP2009278873A JP 2009278873 A JP2009278873 A JP 2009278873A JP 2008131103 A JP2008131103 A JP 2008131103A JP 2008131103 A JP2008131103 A JP 2008131103A JP 2009278873 A JP2009278873 A JP 2009278873A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- hyaluronic acid
- sulfated hyaluronic
- cell
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】細胞を培養して神経分化を誘導するための培地であって、硫酸化ヒアルロン酸を含有する培地を提供する。また、細胞を播種する播種工程S1と、前記細胞を培養して神経分化を誘導する分化誘導工程S2とを有する培養方法であって、前記播種工程S1または前記分化誘導工程S2において、細胞培養液に硫酸化ヒアルロン酸を添加する培養方法を提供する。
【選択図】図8
Description
また、硫酸化の程度を変化させて合成されたヒアルロン酸が、ラットの骨芽細胞において、細胞の増殖および分化に影響することが報告されている(非特許文献2参照。)。
Ishibashi T et al, "Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses", Neuron, vol.49, 2006 p. 823–832 Misao Nagahata et al, "A novel function of N-cadherin and Connexin43:marked enhancement of alkaline phosphatase activity in rat calvarial osteoblastexposed to sulfated hyaluronan", Biochemical and Biophysical Research Communications,vol. 315, No. 3, March 12, 2004, p. 603-611
本発明は、細胞を培養して神経分化を誘導するための培地であって、硫酸化ヒアルロン酸を含有する培地を提供する。
発明者らは、硫酸化ヒアルロン酸を用いた細胞培養を行うことにより、アストロサイト等のグリア細胞および神経前駆細胞を含む未分化な細胞を活性化させ、神経細胞の増殖・分化を促進できることを見出した。
よって、本発明によれば、神経細胞への分化・成熟を著しく促進できるという効果を奏する。また、硫酸化ヒアルロン酸は室温で保存が可能な安定した物質であるため、品質管理が容易であるという利点がある。
発明者らは、分子量が数万程度の硫酸化ヒアルロン酸と比較して、分子量が10万を超える硫酸化ヒアルロン酸は、神経栄養因子等の活性化因子の産生・伝達を促進して細胞間の相互作用に及ぼす影響がより大きいことを見出した。
よって、本発明によれば、硫酸化ヒアルロン酸を一定量以上の分子量で合成することにより、小さな分子量の硫酸化ヒアルロン酸と比較して、より大きな効果を得ることができる。
このようにすることで、より培養細胞の細胞活性を高めることができ、成熟した神経細胞を培養することができる。
また、上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の濃度が10μg/mL以上であることとしてもよい。
発明者らは、上記硫酸化ヒアルロン酸を用いた細胞培養において、さらにFGF−2を加えることにより、アストロサイト等のグリア細胞および神経前駆細胞を含む未分化な細胞をさらに活性化させ、神経細胞への増殖・分化を促進し、より成熟させることが可能なことを見出した。
本発明によれば、より成熟した神経細胞を大量に増殖させて移植に用いることができ、より高い治療効果を得ることができる。
好ましくは、前記FGF−2の濃度が10ng/mL以上であることとする。
このようにすることで、例えば、完全に神経細胞へと分化する前に移植する等、未分化の細胞が有する再生能力を用いて治療効果を高めることができる。
このようにすることで、外胚葉由来の細胞に含まれる未分化な細胞および前駆細胞等を神経細胞へと分化誘導することができる。
このようにすることで、神経組織中の神経前駆細胞および脱分化したアストロサイトを神経細胞へと分化誘導することができる。
本発明によれば、播種時または培養工程の途中のいずれかから神経細胞への分化誘導を開始することができる。よって、細胞を活性化させ、神経細胞へと分化させる時期を選択することができる。
細胞間の結合であるギャップ結合は、隣り合う上皮細胞をつないで小さいイオンや分子を通過させる。並んだ2つの細胞の細胞膜にはコネクソンと呼ばれるタンパク複合体が複数並んでおり、橋渡し構造をなしている。このコネクソンがチャネルとなって、無機イオンや分子量1000程度の小さい分子が隣接細胞の細胞質間を移動できる。
上記ギャップ結合により、神経組織の成熟を促す神経栄養因子を細胞間で伝達することができる。よって、ギャップ機能の活性化の程度と上記神経栄養因子の伝達による神経細胞の成熟の程度との相互関係により、神経細胞への分化の程度を評価することができる。
本発明によれば、少量のサンプルで簡易に神経細胞への分化を評価でき、移植に適した神経分化の状態であるかについて確認してから移植を行うことができる。
硫酸化ヒアルロン酸を一定量以上の分子量となるように合成することにより、小さな分子量の硫酸化ヒアルロン酸と比較して、より大きな効果を得ることができる。
また、上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸濃度が10μg/mL以上となるように添加されることとしてもよい。
このようにすることで、神経細胞に分化させながらさらに増殖を促進することができ、より成熟した治療効果の高い細胞を多く得ることができる。
好ましくは、前記FGF−2濃度が10ng/mL以上となるように添加されることとする。
このようにすることで、例えば、完全に神経細胞へと分化する前に移植する等、未分化の細胞が有する再生能力を用いて治療効果を高めることができる。
また、上記発明においては、前記細胞が外胚葉由来の細胞であってもよく、神経組織由来の細胞であってもよい。
このようにすることで、完全に未分化な細胞から分化誘導培養を開始することと比較して、神経細胞への成熟が早期に行われ、より早く移植に用いることができる。
本発明の第1の実施形態に係る培地は、例えば、組織から単離された神経前駆細胞およびアストロサイトを活性化し神経細胞へと分化誘導するための培地である。
つまり、神経細胞用培地に硫酸化ヒアルロン酸を加えた培地を用いた培養により、神経細胞への分化誘導が行われる。
つまり、神経細胞用培地に硫酸化ヒアルロン酸およびFGF−2を加えた培地を用いた培養により、細胞の増殖および神経細胞への分化誘導が行われる。
つまり、硫酸化ヒアルロン酸およびFGF−2を加えた培地を用いた培養方法により、細胞の増殖および神経細胞への分化誘導が行われる。
また、前記硫酸化ヒアルロン酸およびFGF−2の添加時期は上記実施形態に限定されるものではなく、前記播種工程S1において、前記硫酸化ヒアルロン酸およびFGF−2を両方加えた培地に細胞を播種して培養を開始してもよく、前記分化誘導工程S2において前記硫酸化ヒアルロン酸とFGF−2とを両方添加して培養することとしてもよい。
図1は、ヒアルロン酸(Hya)および硫酸化ヒアルロン酸(SHya)について、二糖の繰り返し単位の構造を示している。
合成された硫酸化ヒアルロン酸において、繰り返し単位あたりの導入された硫酸基の数は特に限定されるものではなく、2糖残基あたり1〜4個の硫酸基を含むことができる。
同様に、TMA(Aldrich Chemical 社製)の10%ヒアルロン酸溶液にTMA−SO3複合体を加えて混合し、60℃で48時間攪拌した。この析出物から上記と同様の方法により硫酸化ヒアルロン酸を得た。
なお、硫酸化ヒアルロン酸の合成方法は上記実施例に限定されるものではなく、当業者がなしえる公知の合成方法であってもよい。
図2は、上述の方法により硫酸化度が0.4または1.0で合成された硫酸化ヒアルロン酸についての細胞毒性試験の評価を示す。0.1,1,10,50,100μg/mLの硫酸化ヒアルロン酸を、1%FBS(Fetal Bovine Serum)入りMEM培地に加えて培地として用い、V79細胞(チャイニーズハムスター由来細胞)を37℃、7日間培養してコロニー形成阻害試験を行った。
図2に示されるグラフについて、横軸は硫酸化ヒアルロン酸の濃度を示しており、縦軸は硫酸化ヒアルロン酸を加えていないコントロールと比較した細胞生存率を示している。
このことから、硫酸化ヒアルロン酸は細胞毒性が非常に低い物質であるといえる。よって、硫酸化ヒアルロン酸を加えて培養を行っても、細胞の生存率に影響を与えることなく高い細胞生存率を維持しながら細胞培養が可能であるといえる。
硫酸化ヒアルロン酸およびFGF−2を加えて培養した細胞の増殖能について以下に述べる。
図3は、硫酸化度が0.4または1.0の硫酸化ヒアルロン酸濃度が10μg/mLとなるように、また、FGF−2濃度が10ng/mLとなるように添加した培地用いて培養した正常ヒトアストロサイト(NHA)の増殖についてのグラフを示す。正常ヒトアストロサイトは1%FBS入りアストロサイト基本培地(ABM)を用いて、2日に一度培地交換をしながら37℃で80日間培養した。
よって、硫酸化ヒアルロン酸を培養開始時または培養途中で加えても、アストロサイトの増殖能に影響を与えることなく細胞を培養することができるといえる。
硫酸化度が1.0の硫酸化ヒアルロン酸10μg/mLで培養した細胞は、硫酸化ヒアルロン酸を加えていないコントロールと比較して、培養初期は増殖率が少し低下していたが、培養50日目以降にはコントロールと同様の増殖がみられた。
よって、FGF−2を培養開始時または培養途中に加えることにより、アストロサイトの増殖能を高めることができ、硫酸化ヒアルロン酸に加えてFGF−2を添加して培養した場合も、アストロサイト等の神経系細胞の増殖能を高めて培養することができる。
培養5日目では、図4に示されるように、硫酸化度が1.0の硫酸化ヒアルロン酸10μg/mLで培養した細胞、および硫酸化度が0.4または1.0の硫酸化ヒアルロン酸10μg/mLに加えてFGF−2を10ng/mLを添加して培養した細胞は形態変化がみられ、細胞に突起状の形態が現れていることがわかる。
一方、FGF−2のみを10ng/mL添加した場合は、硫酸化ヒアルロン酸およびFGF−2を加えないコントロールと比較して形態変化はみられない。また、硫酸化ヒアルロン酸のみを加えて培養した細胞は、コントロールと比較して形態変化が少しずつ現れて始めている状態である。
よって、硫酸化ヒアルロン酸とFGF−2とを組み合わせて添加することにより、細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟をより促進することができるといえる。
硫酸化度が0.4の硫酸化ヒアルロン酸10μg/mLに加えてFGF−2を10ng/mLを添加して培養した細胞は、薄くなった細胞体が星状に形態変化している。
また、硫酸化度が1.0の硫酸化ヒアルロン酸10μg/mLに加えてFGF−2を10ng/mLを添加して培養した細胞は、細胞体が薄く拡張することなく、細胞形態の星状化が顕著に現れていることがわかる。
図7は、正常ヒトアストロサイトについて、GFAP(グリア細胞繊維性酸性タンパク質)およびNestin(ネスチン)のmRNAの発現を示すグラフである。GFAPは成熟したアストロサイト等のグリア細胞の指標とされており、Nestinは神経前駆細胞を含む未分化な細胞(幹細胞)の指標とされている。
硫酸化ヒアルロン酸とFGF−2とを両方添加した場合に、GFAPについてもNestinについても、それぞれについて添加した場合と比較して、さらに高く発現していることがわかる。
硫酸化度が1.0の硫酸化ヒアルロン酸を10μg/mLおよびFGF−2を10ng/mLとなるようにそれぞれについて添加した場合、コントロールと比較してGFAPの発現が高くなっていることがわかる。
よって、硫酸化ヒアルロン酸とFGF−2とを組み合わせて添加することにより、細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟をより促進することができるといえる。
具体的には、培養したコンフルエント状態の細胞表面にカミソリで直線的に切れ目をつけて、蛍光色素を加えた。次に洗浄を行い、蛍光顕微鏡で観察した。また、蛍光色素が細胞間のギャップ結合により流入した長さをイメージスキャナにより測定した。
図9(a)に示されるように、硫酸化度が1.0の硫酸化ヒアルロン酸10μg/mLを添加して培養した場合には、蛍光色素が細胞に流入した長さが有意に長くなっており、図9(b)に示される蛍光顕微鏡写真からも、コントロールと比較して、細胞間の連結を通じて流入している蛍光色素量が多いことがわかる。
また、上記細胞について、細胞間の情報伝達を介して細胞間の恒常性維持に働くことが知られているコネキシン(Cx)遺伝子の発現を測定したところ、アストロサイトに特異的に発現するCx26,Cx43およびアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに特異的に発現するCx32の遺伝子発現がみられた(図示せず)。
FGF−2のみを10ng/mLで添加して培養した場合は、Midkine(ヘパリン結合性の成長因子)およびNGF(神経成長因子)については、コントロールと比較して、有意なmRNAの発現がみられたが、FGF−2、BDNF(脳由来神経栄養因子)およびIGF-1(インスリン様増殖因子I)については、有意なmRNAの発現はみられなかった。
したがって、活性化された増殖能の高い細胞および成熟した細胞を得ることができ、これらの細胞を用いることにより、治療効果の高い神経再生のための移植を行うことができる。
なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において適宜変更することができる。
Claims (19)
- 細胞を培養して神経分化を誘導するための培地であって、硫酸化ヒアルロン酸を含有する培地。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸の分子量が20万以上である請求項1に記載の培地。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が0.4以上である請求項1または2に記載の培地。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸の濃度が10μg/mL以上である請求項1から3のいずれかに記載の培地。
- FGF−2をさらに含む請求項1から4のいずれかに記載の培地。
- 前記FGF−2の濃度が10ng/mL以上である請求項5に記載の培地。
- 前記細胞が未分化の細胞を含む請求項1から6のいずれかに記載の培地。
- 前記細胞が外胚葉由来の細胞である請求項1から6のいずれかに記載の培地。
- 前記細胞が神経組織由来の細胞である請求項1から6のいずれかに記載の培地。
- 細胞を播種する播種工程と、
前記細胞を培養して神経分化を誘導する分化誘導工程とを有する培養方法であって、
前記播種工程または前記分化誘導工程において、細胞培養液に硫酸化ヒアルロン酸を添加する培養方法。 - 前記分化誘導工程の後に、細胞間の結合を測定することにより神経分化を評価する評価工程を有する請求項10に記載の培養方法。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸の分子量が20万以上である請求項10または11に記載の培養方法。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が0.4以上である請求項10から12のいずれかに記載の培養方法。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸の濃度が10μg/mL以上となるように添加される請求項10から13のいずれかに記載の培養方法。
- 前記播種工程または前記分化誘導工程のいずれかにおいて、細胞培養液にFGF−2がさらに添加される請求項10から14のいずれかに記載の培養方法。
- 前記FGF−2の濃度が10ng/mL以上となるように添加される請求項15に記載の培養方法。
- 前記細胞が未分化の細胞を含む請求項10から16のいずれかに記載の培養方法。
- 前記細胞が外胚葉由来の細胞である請求項10から16のいずれかに記載の培養方法。
- 前記細胞が神経組織由来の細胞である請求項10から16のいずれかに記載の培養方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008131103A JP2009278873A (ja) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | 培地および培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008131103A JP2009278873A (ja) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | 培地および培養方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009278873A true JP2009278873A (ja) | 2009-12-03 |
Family
ID=41450039
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008131103A Pending JP2009278873A (ja) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | 培地および培養方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2009278873A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015534825A (ja) * | 2012-11-08 | 2015-12-07 | インジェネロン インコーポレイテッド | 再生細胞の培養、保存、及び投与のための培地 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09507747A (ja) * | 1993-11-09 | 1997-08-12 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 中枢神経系の幹細胞の原位置修飾及び操作 |
JPH10509592A (ja) * | 1994-11-14 | 1998-09-22 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 神経幹細胞増殖調節 |
JP2005218308A (ja) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 神経幹細胞増殖助剤及びこれを含んだ神経幹細胞用培地 |
WO2006004149A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 神経細胞の製造方法 |
JP2006211920A (ja) * | 2005-02-01 | 2006-08-17 | Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho | ヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体 |
JP2007514434A (ja) * | 2003-12-19 | 2007-06-07 | オムニサイト リミテッド | 幹細胞 |
-
2008
- 2008-05-19 JP JP2008131103A patent/JP2009278873A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09507747A (ja) * | 1993-11-09 | 1997-08-12 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 中枢神経系の幹細胞の原位置修飾及び操作 |
JPH10509592A (ja) * | 1994-11-14 | 1998-09-22 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 神経幹細胞増殖調節 |
JP2007514434A (ja) * | 2003-12-19 | 2007-06-07 | オムニサイト リミテッド | 幹細胞 |
JP2005218308A (ja) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 神経幹細胞増殖助剤及びこれを含んだ神経幹細胞用培地 |
WO2006004149A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 神経細胞の製造方法 |
JP2006211920A (ja) * | 2005-02-01 | 2006-08-17 | Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho | ヒト細胞の培養方法、培養容器および生体組織補填体 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6012062701; Journal of Materials Science: Materials in Medicine(1994)Vol.5, p.830-3 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015534825A (ja) * | 2012-11-08 | 2015-12-07 | インジェネロン インコーポレイテッド | 再生細胞の培養、保存、及び投与のための培地 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Achilleos et al. | Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy | |
JP2022078245A (ja) | 多能性細胞を分化させるための方法 | |
US20150030681A1 (en) | Method of making a hydrogel | |
Yang et al. | 3D bio-printed living nerve-like fibers refine the ecological niche for long-distance spinal cord injury regeneration | |
US20120156785A1 (en) | Methods and products for biasing cellular development | |
GB2414995A (en) | Neural stem cells | |
Li et al. | Spheroid cultures promote the stemness of corneal stromal cells | |
EP3167047B1 (en) | Methods and compositions to modulate hair growth | |
US10377985B2 (en) | Neural progenitor cell differentiation | |
Pan et al. | Current state of the development of mesenchymal stem cells into clinically applicable Schwann cell transplants | |
Liu et al. | The effects of different phenotype astrocytes on neural stem cells differentiation in co-culture | |
Pan et al. | Conversion of mouse embryonic fibroblasts into neural crest cells and functional corneal endothelia by defined small molecules | |
Vasyliev et al. | Comparative analysis of biological properties of large‐scale expanded adult neural crest‐derived stem cells isolated from human hair follicle and skin dermis | |
CN106754657B (zh) | 一种猴胚胎干细胞的无血清培养基 | |
Zhang et al. | Cadherin-based biomaterials: Inducing stem cell fate towards tissue construction and therapeutics | |
CN101124319B (zh) | 神经干细胞 | |
Lu et al. | Retrovirus delivered neurotrophin-3 promotes survival, proliferation and neuronal differentiation of human fetal neural stem cells in vitro | |
Ramos-Hryb et al. | Matrigel supports neural, melanocytic and chondrogenic differentiation of trunk neural crest cells | |
KR20110094753A (ko) | 나노단위의 패턴화된 표면을 가지는 지지체 이용한 배아줄기세포의 신경세포로의 분화방법 | |
JP2009278873A (ja) | 培地および培養方法 | |
Park et al. | Homogeneous generation of iDA neurons with high similarity to bona fide DA neurons using a drug inducible system | |
Yue et al. | Induce differentiation of embryonic stem cells by co-culture system | |
Mumaw et al. | Neural differentiation of human embryonic stem cells at the ultrastructural level | |
JP2010004796A (ja) | 分化抑制剤、分化抑制基材及び分化抑制方法並びにその使用 | |
Dolatyar et al. | High-efficient serum-free differentiation of trabecular meshwork mesenchymal stem cells into Schwann-like cells on polylactide electrospun nanofibrous scaffolds |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121204 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20130111 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130204 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130226 |