JP2003508038A - ドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることができるトランスジェニック哺乳類 - Google Patents
ドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることができるトランスジェニック哺乳類Info
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Abstract
Description
ことにより、不治のまま残されている。多くの病気がヒト病原体または機能異常
ヒト組織に特有であるので、人体外でそのような原因の過程をモデル化するのは
困難である。例えば、アレルギー反応の根拠は、宿主の遺伝的特質に深く根付い
ているので、異なった種において完全に研究をすることはできない。HIVのよ
うな感染性疾患には種特異的毒性因子がある。および、遺伝子要因の組み合わせ
により生じる癌細胞は、免疫不全動物に移植された場合、通常改変された特性を
示している。
れは順に新薬および新規療法の開発を制限している。ヒトおよび高度な霊長類両
方において、実験の実践的なおよび倫理的な制限があるとすれば、ヒト疾患の代
替モデルを開発する切迫した必要性が存在する。
造血幹細胞または成熟循環リンパ球が免疫不全マウスの天然に存在する株に導入
される。ある点では以前のものよりも良好ではあるが、これらのモデルは疾患過
程を解くために決定的であるヒト細胞の機能的特性の多くを再現することを失敗
している。より基礎的レベルにおいて、同一種の個体間で造血幹細胞を移植する
試みでさえも、機能的にそこなわれた同種異系キメラを生成している。この理由
は明らかではないが、ドナー幹細胞が新しい宿主の成熟リンパ球に適切に分化で
きないことが関与している。
またはトランスジェニック的に、IL−7を与えた。しかしながら、この方法は
予期されないさらなる免疫学的機能不全を導いた。例えば、Kapp,et a
l.,Blood 92:2024(1998)(外因性IL−7はB細胞発育
の減少を導いた);Rich,et al.,J.Exp.Med.177:3
05(1993)(イムノグロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー調節
下のトランスジェニックIL−7は皮膚リンパ球浸潤およびTおよびB細胞リン
パ腫を導いた);Valenzona et al.,Exp.Hematol .24:1521(1996)(MHCクラスIIプロモーター下のIL−7は
Bリンパ球腫瘍を誘導した);Watanabe,et al.,J,Exp. Med .187:389(1998)(IL−7トランスジェニックマウスは慢
性大腸炎を発生した);Uehira et al.,J.Invest.De rmatol .110:740(1998)(IL−7トランスジェニックマウ
スは皮膚炎を発生した);およびMertsching,et al.,Eur .J.Immunol .26:28(1996)(IL−7トランスジェニック
マウスはリンパ滲出性疾患を発生した)を参照されたい。
デル系に対する要求が存続している。本発明はこのおよび他の要求を満たしてい
る。発明の要約 本発明は、免疫系を維持することができる内因性サイトカイン;造血幹細胞特
性(HSC)を持つドナー特異的細胞に由来する細胞を含んでいるレシピエント
哺乳類を提供し;ここで、レシピエント哺乳類はドナー特異的機能性免疫を容易
に産生できる。好適な態様において、哺乳類はマウスである。
から誘導されるので、サイトカインは同一種からのものである。サイトカインは
インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、イン
ターロイキン−7(IL−7)、マクロファージ−コロニー刺激因子(M−CS
F)、顆粒球−コロニー刺激因子(GM−CSF)、幹細胞因子(SCF)、白
血病阻害因子(LIF)およびオンコスタチンM(OM)から成る群より選択さ
れる。本態様の好適な側面において、サイトカインはIL−3、IL−6、IL
−7、M−CSF、GM−CSFおよびSCFを含んでいる。本態様の別な好適
な側面において、サイトカインは哺乳類にトランスジェニック的に導入される。
細胞は哺乳類には異種である。特に好適な側面において、細胞はヒト細胞である
。より好適な側面において、細胞は造血幹細胞である。最も好適な側面において
、造血幹細胞は臍帯血に由来する。しかしながら、代わりの側面において、細胞
は骨髄、動員末梢血、胚幹細胞または他のHSC源に由来している。別の代わり
の側面において、造血幹細胞特性を持つ細胞は分化している。特に、分化細胞は
リンパ球系、骨髄系または赤血球系の系列である。
される。この方法は、免疫不全哺乳類に導入遺伝子を導入する(ここで導入遺伝
子はドナー由来造血細胞の維持および成熟に必要なサイトカインをコードしてい
る);および哺乳類内へ造血幹細胞特性を持つ細胞導入する工程から成っている
。
特に好適な側面において、ドナー免疫系はヒト免疫系である。 この態様の一つの側面において、導入遺伝子の導入は胚幹細胞のトランスフェ
クションにより行われる。この態様の第二の側面において、導入遺伝子の導入は
前核移植により行われる。この態様の代わりの側面において、導入遺伝子の導入
は哺乳類と導入遺伝子を含む哺乳類の繁殖により行われる。
マウスである。本発明の別の側面において、哺乳類はヒト白血球抗原(HLA)
クラスIおよび/またはクラスII遺伝子を発現しているRAG−1またはRA
G−2変異体マウスである。本発明のさらなる側面において、哺乳類はHLAク
ラスIおよび/またはクラスII遺伝子を発現しているSCIDマウスである。
本発明のさらに別の側面において、哺乳類はHLAクラスIおよび/またはクラ
スII遺伝子を発現している免疫適格マウスであり、および、例えば、照射条件
付けにより免疫不全にされている。
る。しかしながら、特に好適な側面において、ドナー由来造血細胞はヒトからの
ものである。
供される。トランスジェニックキメラ哺乳類は、蛋白質、ペプチド、細胞または
抗原の他の発生源で免疫され、ドナー細胞由来免疫応答に含まれるエピトープが
決定される。これらには抗原特異的イムノグロブリン産生、Tヘルパー応答、T
細胞障害性応答、細胞増殖応答、先天性同種異系または異種応答およびナチュラ
ルキラー細胞活性が含まれるが、これらに制限されるわけではない。発明の詳細な説明 序 胸腺皮質上皮細胞がT細胞分化の間に起こる主要な陽性選択を実行することが
、種々のモデル系を使用してよく確立されている。(Paul編,FUNDAM
ENTAL IMMNOLOGY 第4版(1999),Lipincott−
Raven Press)。最近、陽性選択に関与している細胞型をさらに決定
する試みにおいて、骨髄(BM)由来細胞により選択されるべきCD4+および
CD8+単一陽性細胞の二叉分岐が明らかにされた。MHCクラスI欠損環境で
構築されたキメラ動物を使用して、CD8+T細胞が造血細胞により陽性選択で
きることが決定的に示された。(Bix & Raulet,Nature 3
59:330−333(1992))。しかしながら、照射MHCクラスI欠損
マウスを用いる同様のモデル系を使用してCD4+T細胞に対する反対の結果が
示されている(Markowitz,et al.,Proc.Nat’l A cad.Sci .90(7):2779−83(1 993))。これらの結果
は、選択がCD8+T細胞よりもCD4+に対してより厳重に制御されていること
を示唆している。
、非照射抗原レセプター組換え欠除、例えば、組換え活性化遺伝子−2(RAG
−2)マウスは、ドナーMHC拘束抗原特異的応答を示すCD4+T細胞を末梢
血に持っていることを発見した。これらの結果はSCIDキメラとして構築され
た新生児または成体のどちらにも観察されていない。このことは、造血細胞は胸
腺内でCD4+T細胞を陽性選択でき、および正常個体発生により密接に似てい
るT細胞分化を支援する独特のモデル系としての、哺乳類の抗原レセプター組換
え欠除株を提供することを示唆している。造血細胞によるCD4+T細胞の陽性
選択は、不完全免疫適格マウスの使用により、および/または照射の二次的効果
により他の系では通常的には検出されていないようである。
遺伝子が宿主哺乳類内へ取り込まれる方法を発見した。取り込み後、異種造血幹
細胞(HSC)が植え付けられたサイトカイントランスジェニック(CTG)哺
乳類は、ドナー限定抗原特異的応答が可能な機能的免疫応答を発生する。これら
の改変は、宿主のMHC発現組織上で発現されたMHC分子環境における、ドナ
ーリンパ球発生のための経路を提供する。II.定義 特に定義しない限り、本明細書で使用されたすべての技術および科学用語は、
本発明が属する分野の当業者により共通に理解されているものと同じ意味を持っ
ている。すべての参照文献はすべての目的のために本明細書に取り込まれる。本
明細書で説明されたものと類似のまたは同等な方法および材料が本発明の実施に
または試験に使用できるが、好適な方法および材料が記載されている。本発明の
目的のため、以下の用語が次に定義される。
る細胞表面糖蛋白質をコードしている免疫応答遺伝子を指している。本遺伝子は
、移植片拒否に関与している結果として発見された。MHC遺伝子には二つの主
なクラス、クラスIおよびクラスIIが存在する。句“ヒト白血球抗原”とはヒ
トのMHC複合体を指している。句“MHC拘束”とは、MHC分子の特定の対
立形状況におけるT細胞によるペプチドの認識を指している。ヒトならびにマウ
スにおけるMHC複合体のより完全な説明は、FUNDAMENTAL IMM
UNOLOGY,第4版,Paul(編)1999、を参照されたい。
胞であるが、細胞ドナーおよび宿主哺乳類間で主および副組織適合分子の発現が
相違しているため、宿主哺乳類には非自己として認識される。
らの細胞である。著しい遺伝子相違のためそれらは宿主哺乳類には非自己として
認識される。
髄を指している。この髄は造血幹細胞を含んでいる。句“臍帯血”とは新生児の
臍帯から得られた全血を指している。この血液もまた造血幹細胞を含んでいる。
句“動員末梢血”とは循環系における造血幹細胞の比率を増加させる目的で、組
換え成長因子、例えば、顆粒球−コロニー刺激因子(GM−CSF)および幹細
胞因子(SCF)で処理された個体から単離された末梢血を意味している。
長因子、インターロイキン、免疫系モジュレーターおよび免疫系を維持するため
に必要とされる他の型の蛋白質のような別の蛋白質を指している。例えば、サイ
トカインはインターロイキン、幹細胞因子、コロニー刺激因子および当業者には
既知である他の因子を包含している。“外因性サイトカイン”とはレシピエント
哺乳類には天然には存在しないサイトカインを指している。これらのサイトカイ
ンはレシピエント哺乳類において、天然に存在するサイトカインの種同族体また
は天然に存在する同族体を持っていないサイトカインであろう。
これらの哺乳類において、BおよびTリンパ球が適切に成熟されず、抗原を認識
できず、応答できない。
始および再配置に関与するRAG−1およびRAG−2遺伝子を指している。V
、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントでの遺伝子組換えがBおよびT細胞レセ
プターの産生に必要である。RAG−1およびRAG−2遺伝子における突然変
異はこの過程の初期工程を妨げ、骨髄におけるB細胞発生および胸腺における胸
腺細胞発生の封鎖を生じる(Mombaerts,et al.,Cell 6
8:869−77(1992);Shinkai,et al.,Cell 6
8:855−867(1992))。
ー種からの細胞を指している。最も明白な候補は造血幹細胞である。しかしなが
ら、胚幹細胞のようなHSCへ分化する細胞を含む(しかし限定するわけではな
い)他の細胞も想像される。
たは部分免疫機能を指している。例えば、本発明のレシピエント哺乳類において
、機能性免疫系ならびにドナー特異的免疫細胞の維持に必要なサイトカインが免
疫不全哺乳類内に、サイトカインをコードしている導入遺伝子の導入により、ま
たはあまり好適ではないが、動物へのサイトカインの投与により導入される。ド
ナー細胞は、レシピエント哺乳類の免疫系源である(および典型的には、必然で
はないが、サイトカイン)。
おけるすべての機能を示す必要はない。しかしながら、ドナー免疫系は少なくと
もドナーTおよびBリンパ球、およびマクロファージおよび樹状細胞のような抗
原提示細胞を含んでいることが好適である。
するわけではない)すべての細胞系列へ分化する能力を保持している細胞を指し
ている。用語“分化する”または“分化した”とは、より特化した細胞型になる
過程を指している。例えば、造血幹細胞は“リンパ球系”、“赤血球系”または
“骨髄系”系列の細胞へ分化する。リンパ球系細胞は免疫応答の特異性を仲介す
る細胞である。それらは二つの主な群、TおよびBリンパ球へ分割され、および
小集団の大型顆粒リンパ球またはナチュラルキラー細胞を含んでいる。赤血球系
細胞は赤芽球および赤血球である。骨髄系系列の細胞には血小板、好中球、好塩
基球、抗酸球および単球が含まれる。
生および維持するレシピエント哺乳類の能力を指している。典型的には、造血細
胞が機能的である、例えば、抗原へ結合し、異物または自己として抗原を認識し
、他の細胞(例えば、単球およびマクロファージ)が活性化されまたはサイトカ
イン(本明細書で定義したような)が放出されるように免疫系の他の細胞と通じ
合う、ことを可能にするため、ドナーへ特異的である造血細胞ならびにサイトカ
インおよび他の補助的化合物(必須であり、または望ましくもある)を免疫系は
含んでいる。
は直接的、例えば、ヒトから得られた初代培養物、または間接的、例えば、ヒト
から得られた初代培養に由来する培養株、であろう。
ト哺乳類への外因性化合物、特にサイトカイン遺伝子の付加を指している。化合
物は本発明のレシピエント哺乳類へ、化合物をコードする遺伝子の導入を含む(
しかし限定するものではない)種々の方法で導入できる。化合物をコードする遺
伝子の導入は非胎児哺乳類内への遺伝子導入を通して、または哺乳類の生殖細胞
または胚内へのトランスジェニック的に行われる。化合物をコードしている遺伝
子の直接導入に加え、繁殖またはクローニングを通してレシピエント哺乳類内へ
遺伝子物質を導入できる、例えば、トランスジェニック親からの子孫の生殖細胞
内への化合物をコードしている遺伝子の導入。
支える外因性サイトカインの能力を指しており、それがなければそのような免疫
系は支えられないであろう。典型的には、しかしながら必然的ではない、外因性
サイトカインはドナーと同一の種で天然に観察される。従って、免疫系を維持す
るためにドナーで天然に観察される、ドナー由来免疫系の細胞とサイトカイン間
の相互作用がレシピエント哺乳類に供給される。
熟細胞型が機能性細胞(例えば、免疫系の)へ成熟するのを可能にするサイトカ
インを提供し、および細胞が一度成熟したら、機能するように生き残るのに必要
なサイトカインを提供することを指している。免疫系の細胞に加え、造血細胞の
他の型、例えば、赤血球、血小板、他のリンパ系組織(例えば、パイエルパッチ
、上皮内リンパ球を含んでいる絨毛、および粘膜固有層を通して散らばっている
リンパ球、および上皮表面下方の結合組織から成る腸関連免疫系)の維持および
成熟も含まれる。
にドナー免疫系を含むように、哺乳類の身体的特性を操作することを指している
。本発明の目的では、ヒト哺乳類は作製または産生できない。身体的特性を操作
はトランスジェニック技術、遺伝子導入、または哺乳類の遺伝子型の他の操作で
あるが、操作は哺乳類の身体的特性に影響する細胞、蛋白質または他の化合物の
導入によってもよい。
ト哺乳類”は、外因性導入遺伝子および造血幹細胞特性を持つドナー細胞の存在
のため、ドナー特異的免疫系の産生を容易にできる哺乳類である。本発明の目的
には、レシピエント哺乳類はヒトではない。
ウスはすべてのマウスを含んでいるが、特別には、RAG−1およびRAG−2
株の、またはそれに由来するマウスが含まれる。本発明のマウスは重度の免疫不
全性のため、それらは天然には観察されそうもない。典型的には、本発明のマウ
スはRAG−1、RAG−2またはSCIDマウスのような実験室株のマウスで
ある。
殖細胞または胚のゲノム内への導入を指している。好適には、遺伝子物質は蛋白
質をコードしており、導入は胎児哺乳類内へ行われる。“導入遺伝子”とは、蛋
白質コード領域および調節要素(例えば、プロモーターおよび終止配列、もし望
むなら)を含む核酸を指している。導入遺伝子はコード配列の単一コピーまたは
コード配列の多重コピーを含むことができる。もし多重コピーが存在するとした
ら、コード領域は部分コード領域であることがある。コード領域は調節要素によ
り分離されることができ、5’から3’へ、または5’から5’または 3’か
ら3’への配向で配置することができる。多重導入遺伝子(独立したコードおよ
び調節配列)は、最も好適には、同一領域に近接した様式で、またはレシピエン
ト哺乳類のゲノム中で他の場所へ分散して存在してもよい。
ものである。宿主哺乳類は正常では、異種細胞を非自己として認識する。 II.本発明の哺乳類の産生 好適な態様において、本発明のレシピエント哺乳類は免疫不全である。免疫不
全哺乳類を産生するため、哺乳類の天然に存在する免疫系は不活性化されなけれ
ばならない。不活性化は多数の免疫系関連活性を除去または破壊することにより
、またはただ一つの活性を除去または破壊することにより行うことができる。免
疫機能は多くの異なった機構(例えば、自発的突然変異、照射およびアンチセン
ス技術)で破壊できるが、好適な態様において、免疫機能は免疫系の成熟および
維持に必要な一つまたはそれ以上の遺伝子機能を、例えば、相同的組換えまたは
自発的突然変異によりノックアウトすることにより破壊される。ノックアウト哺乳類の発生 相同的組換えが、遺伝子置換、遺伝子の不活性化または改変に使用される。多
くの報告が哺乳類細胞における相同的組換えの使用を記載している。例えば、T
homas & Capecchi,Cell 51:503(1987);N
andi,et al.,Prac.Nat’l Acad.Sci.USA
85:3845(1988);およびMausour,et al.,Natu
re 336:348(1988);Schweizer,et al.,J. Biol.Chem .274:20450(1999);Hauser,et
al.,Proc.Nat’l Aced.Sci.USA 96:8120(
1999);Haber,Trends Biochem.Sci.24:27
1(1999);およびBonaventure,et al.,Mol.Ph armacol .56:54(1999)を参照されたい。
然変異を生殖細胞に導入するために相同的組換えを使用する種々の様相が説明さ
れている(Thomas & Capecchi,Cell 51:503(1
987);Thompson,et al.,Cell 56:316(198
9);Antoine,et al.,J.Cell Sci.112:255
9(1999);Molotkov,et al.,Cancer Lett.
132:187(1998);Bleich,et al.,Pflugers Arch .438:245(1999);Struble,et al.,N eurosci.Lett .267:137(1999);Schweizer
,et al.,J.Biol.Chem.274:20450(1999);
Cuzzocrea,et al.,Eur.Cytokine Netw.1
0:191(1999);およびMombaerts,et al.Cell
68:869−77(1992);およびShinkai,et al.Cel l 68:855−867(1992))。
ト哺乳類は、相同的組換えを使用して作製でき、標的化された遺伝子置換が達成
される。この技術において、問題とする特定のDNA配列は改変DNAにより置
換される。好適な態様において、所望の哺乳類種からの胚性幹(ES)細胞のゲ
ノムが改変される(Capecchi,Science 244:1288(1
989),米国特許第5,487,992号)。
の初期に活性化されるものである。特定の理論に縛られるわけではないが、所望
の遺伝子は、胸腺細胞がCD4-およびCD8-状態(二重陰性)またはCD44 low およびCD25+状態の間に活性化され、Bリンパ球はB220dull/CD4
3+状態にあると信じられている。これらの状態でTおよびB細胞レセプター再
配置が生じるので、VDJ組換を調節する蛋白質をコードしている遺伝子が置換
の標的であろうと信じられる。これらの遺伝子の例はRAG−1およびRAG−
2遺伝子、T細胞レセプター(TCR)およびイムノグロブリン(Ig)遺伝子
、CD3遺伝子、前T細胞レセプター、およびSCID遺伝子である。リンパ球
前駆体の生存および分化を調節する遺伝子の追加の型もまた潜在的標的である、
例えば、イカルス転写因子、共通ガンマ鎖サブユニット、IL−7およびとりわ
けIL−7レセプター。
または両方を不活性化するために用いられる方法は同様であろうし、主として配
列の選択、使用される選択可能マーカー、調節される蛋白質の不在を同定するた
めに使用される方法が異なっているが、特定の蛋白質発現の不在を確認するため
には類似の方法が使用される。方法が類似しているので、マウスにおけるRAG
−2遺伝子の不活性化は実施例のように使用されるであろう。米国特許第5,8
59,307号、その全体が本明細書に取り込まれている、を参照されたい。
またはこれらの組み合わせを持つことができる。例えば、RAG−2遺伝子は一
つの部位に欠失および/または別の部位での挿入を含むことができる。挿入され
た陽性マーカー遺伝子の存在は欠陥のある不活性蛋白質産物挿入、ならびに選択
のために使用できる遺伝子を生じる。好適には、欠失が用いられる。特に興味が
持たれる挿入遺伝子は、G418耐性を含むネオマイシン耐性のような抗生物質
耐性のようなマーカーを提供するものである。
100塩基対、および一般的には約20,000塩基対を超えないものであり、
ここで欠失は通常一つまたはそれ以上のエキソン、一つまたはそれ以上のイント
ロンを含んでいるコード領域の一部を含み、非コード領域、特に5’非コード領
域(転写調節領域)の一部は含んでいてもまたはいなくてもよい。従って、相同
性領域はコード領域を超えて5’非コード領域または代わりに3’非コード領域
内へ拡がっていてもよい。挿入は一般的に10,000塩基対を超えてはならず
、通常5,000塩基対を超えず、一般的に少なくとも50塩基対、より普通に
は少なくとも200塩基対である。
ず、好適には少なくとも約150塩基対、より好適には少なくとも約300塩基
対であり、および一般的には20,000塩基対を超えず、通常10,000塩
基対を超えず、および好適には総数で約5,000塩基対未満であり、および二
重交差組換えを提供するため、挿入および/または欠失の反対側の少なくとも約
50塩基対を持っている。
定するために提供される遺伝子である。この目的には、機能性HSV−tk遺伝
子を含む細胞に対する細胞毒性効果で、チミジンキナーゼ遺伝子の存在がアシク
ロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体の使用により検出でき
るので、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を用いることができる。
これらのヌクレオシドに感受性がないことは、チミジンキナーゼ遺伝子の不在、
従って、相同性組換えが起こった場合、二重交差もまた起こったことを示してい
る。
ノム内への標的化構築物の組み込みを立証する。しかしながら、相同性または非
相同性組換えが起こったかどうかを確立するために、DNA分析が必要とされる
であろう。これは挿入物に隣接する5’および3’領域へハイブリダイズする標
的DNAのためのプローブを用いることにより決定できる。標的化遺伝子中の挿
入物の存在、欠失または置換は、野生型対立遺伝子と標的化対立遺伝子のサイズ
を区別する制限エンドヌクレアーゼを使用して決定できる。
& Smithies,Nucleic Acid Res.16:8887
−8903(1988);およびJoyner,et al.,Nature
338:153−156(1989))。構築物内の配列と相補的である、およ
び構築物の外側の配列および標的座位と相補的であるプライマーが使用できる。
この方法では、もし相同的組換えが起こっていたら、相補的鎖中に存在する両方
のプライマーを持っているDNA二重鎖のみを得ることができる。プライマー配
列の存在または予期されるサイズ配列を示すことにより、相同的組換えの発生が
支持される。
。たいてい、これらの複製系はシミアンウイルス40、エプスタインバールウイ
ルス、パピローマウイルス、アデノウイルスなどのようなウイルス複製系を含ん
でいるであろう。
遺伝子の性質に依存して、野生型転写調節領域(特に転写開始調節領域または異
なった転写開始領域)を持つことができる。遺伝子が宿主からでも、哺乳類宿主
細胞の転写機構により転写開始領域が認識されない場合、異なった転写開始領域
が必要とされるであろう。この領域は構成的でもまたは誘導可能でもよいが、好
適には誘導可能なものである。多くの種類の転写開始領域が単離されており、異
なった遺伝子で使用されている。プロモーターとして特に興味を引かれるのは、
哺乳類宿主からのメタロチオネイン−IおよびII、チミジン キナーゼ、ベー
タ−アクチン、イムノグロブリン プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス
プロモーター、ホスホグリセラート キナーゼ(PGK)およびSV40プロモ
ーターなどのプロモーターである。プロモーターに加え、野生型エンハンサーが
存在してもよく、または異なった遺伝子からのエンハンサーがプロモーター領域
に連結されてもよい。
ーンの発現に続く制限地図作製または配列決定のような分析を可能にする、およ
びさらなる操作のために構築物を単離する際に使用するために原核生物(特に大
腸菌)の複製系を含むことができる。必要な場合、細菌形質転換体を検出するた
めに、異なったマーカーを使用してもよい。
菌配列)がベクターから除去されたら、DNA構築物は標的幹細胞内へ導入する
準備がここでできている。所望のDNAを幹細胞へ導入する方法は本分野ではよ
く知られている。簡単には、好適な方法にはリン酸カルシウム/DNA共沈物、
核内へのDNAのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の
細胞との細菌プロトプラスト融合、リポフェクションなどが含まれるが、これら
に限定されるわけではない。DNAは一本鎖または二本鎖でも、直鎖状または環
状でも、弛緩または超らせんDNAでもよい。哺乳類細胞を形質転換するための
種々の技術は、Keown,et al.,Methods in Enzym ology 185:527−537(1990);Sambrook,et
al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY M
ANUAL(第2版),1−3巻,Cold Spring Harbor L
aboratory,(1989)(”Sambrook”)またはCURRE
NT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.
Ausubel et al.,編,Greene Publishing a
nd Wiley−Interscience,New York(1987)
(”Ausubel”)を参照されたい。
びアシクロビルまたはガンシクロビル耐性のような陽性および/または陰性マー
カーにより選択される。所望の表現型を示す細胞は次に、制限分析、電気泳動、
サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによりさらに分析できる。標的遺伝子部
位に突然変異の存在を示す断片を同定することにより、標的遺伝子を不活性化す
るように相同的組換えが起こった細胞を同定できる。
まだ標的遺伝子の一つの非突然変異コピーを保持している。必要に応じ、これら
の細胞は拡充でき、所望のDNAを含んでいるベクターによる、第二の形質転換
にかけることができる。必要に応じ、所望のDNA内の突然変異は第一の突然変
異と同一でもまたは異なったものでもよい。もし、欠失または置換突然変異が含
まれていれば、第二の突然変異は最初に導入された突然変異の少なくとも一部と
重複してもよい。必要に応じ、異なった陽性選択マーカーがこの形質転換で使用
できる。もし異なったマーカーが使用されるなら、両方の突然変異を持つ細胞が
二重選択培地で選択できる。もしくは、細胞が形質転換された両方のコピーに突
然変異を含むかどうかを決定するため、細胞は問題とする機能性蛋白質が完全に
無いことでスクリーニングできる。野生型標的遺伝子の不在を確実にするために
細胞のDNAがさらにスクリーニングされる。
下記参照)、および一つの突然変異配列を持つ動物は一つまたは二つの突然変異
配列を持つ他の哺乳類と繁殖でき、両方のコピーに突然変異を含む(同型接合体
)子孫が本発明のレシピエント哺乳類として選択された。同様に、二つの突然変
異遺伝子を持つ形質転換細胞からのキメラ哺乳類から発生させたレシピエント哺
乳類はより多くのレシピエント哺乳類を産ませるために繁殖できる。
シピエント哺乳類胚内へ挿入してキメラ哺乳類が製造された。典型的には、哺乳
類胚盤胞内へ幹細胞クローンを注入することにより行われた。胚盤胞は次に偽妊
娠メス内へ移植された。移植胚盤胞からの子孫は、子孫がキメラ生殖細胞系を含
むかどうかを決定するために、親株の動物と試験交配される。改変幹細胞に由来
する生殖細胞を持つキメラは試験交配の子孫へ改変ゲノムを伝搬し、標的DNA
について異型接合体の哺乳類が得られる(一つの標的DNAおよび一つの置換D
NAを含んでいる)。異型接合体動物は、置換DNAに関して同型接合体を作り
出すためにお互いに繁殖させる。
する必要がある。そのような環境は当業者にはよく知られており、免疫不全マウ
スを維持するための技術はImmunodeficient rodents: a guide to their immunobiology,husba ndry and use ,Committee on Immunologi
cally Compromised Rodents,Institute
of Laboratory Animal Resources,Commi
ssion on Life Sciences,National Rese
arch Council.Washington,D.C.:Nationa
l Academy Press,1989、に見ることができる。
に入手可能である。例えば、RAG−2突然変異を持つマウスはTaconic
から、RAG−1およびTCRベータ/デルタ変異体マウスはJackson
Laboratoryから、またはSCIDマウスはJacksonおよびTa
conicから入手可能である。
プターの端切断形またはヒトCD3エプシロン)の導入はリンパ球欠乏を達成す
る例である。
望ましい。スクリーニングは表現型的または遺伝子型的に実施できる。表現型ス
クリーニングには、成熟TおよびB細胞の不在、および血清イムノグロブリンの
不在のような成熟TおよびB細胞の不在に相関する他の表現型変化が含まれるが
、これらに限定されるわけではない。しかしながら、もし変異遺伝子が優勢表現
型を示すとしたら、その遺伝子が異型接合的である動物は所望の同型接合体と同
一の表現型特性を示すであろう。従って、遺伝子型スクリーニングにより同型接
合体をスクリーニングするのが望ましい。
lおよびSambrook、に見ることができる。簡単には、DNA含有細胞を
試験動物から取り除く。マウスにおいて、このことは尾の先端を取り除き、細胞
を単離することにより実施できる。細胞からゲノムDNAが単離され、制限エン
ドヌクレアーゼにより取り扱えるサイズに切断する。切断ゲノムDNAはアガロ
ースゲルで電気泳動され、野生型と改変DNA断片を区別できる標識核酸で探査
される。
イブリダイズして残るプローブの能力に依存している。核酸のハイブリダイゼー
ションへの広範な指導は、Tijssen,LABORATORY TECHN
IQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR
BIOLOGY−−HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC
ACID PROBES,Elsevier,New York(1993)、
に見られる。一般的に、より高いストリンジェントハイブリダイゼーションおよ
び洗浄条件は、決められたイオン強度およびpHにて、特異的配列の熱的融点(
Tm)より5℃低いように選択される。Tmとは標的配列の50%が完全に一致し
たプローブとハイブリダイズする温度である(決められたイオン強度およびpH
下)。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのTmと等しいように
選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上での、100
以上の相補的残基を持つ相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の例では、1mgのヘパリンを含む50%
ホルマリン中、40および50℃(好適には42℃)の間で、ハイブリダイゼー
ションが一夜行われる。高いストリンジェント洗浄条件の例は、0.15M N
aCl、70から80℃(72℃が好適である)で約15分である。ストリンジ
ェント洗浄条件の例は、約60から70℃(好適には65℃)、15分間の0.
2xSSC洗浄である(SSC緩衝液の説明は上記Sambrook参照)。し
ばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェ
ンシー洗浄に先立って高ストリンジェンシーせんじょうが行われる。例えば、1
00ヌクレオチドより多い二重鎖の、中程度のストリンジェンシー洗浄の例は約
40から50℃(好適には45℃)、1xSSCで15分間である。例えば、1
00ヌクレオチドより多い二重鎖の、中程度のストリンジェンシー洗浄の例は約
35から45℃(好適には40℃)、4−6xSSCでの15分間が好適である
。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、非相関プローブで
観察されたものの2x(またはそれより高い)の信号ノイズ比は特異的ハイブリ
ダイゼーションの検出を示している。非結合プローブ除去後、標識が検出され、
哺乳類ゲノム中の所望DNAの存在または不在が決定される。
漏出表現型とは少数の胸腺細胞および/または前B細胞が機能的レセプター転位
され、各々TおよびB細胞へ成熟する。それ故、SCIDマウスは漏出表現型を
示す。この表現型は、動物の生涯を通して、レシピエント哺乳類中の宿主Tおよ
びB細胞および/または血清イムノグロブリンの発生をモニターすることにより
決定できる。トランスジェニック哺乳類 造血細胞の分化は高度に制御された過程であり、とりわけサイトカイン、接着
分子およびケモカインを含む多くの因子の協調した発現を含んでいる。進化的変
化のため、マウス因子はヒト相当物のように必ずしも効率的に、または同じ様式
で相互作用しないように、マウスおよびヒト成長因子間にかなりの相違が起きて
いる。外因性サイトカインを供給する場合に主に考慮することは用量、組み合わ
せ、および送達の型である。サイトカインはその起点に非常に密接して、低濃度
でおよびお互いに共同的に作用する強力なシグナリング分子であるので、外因性
サイトカインの全身送達では正常発育に必要な生理学的レベルを提供しそうもな
い。
あり、それにより所望の因子をコードしているゲノムDNAのコピーが宿主のゲ
ノム内へ取り込まれる。DNAは組織特異的調節配列および正常RNAプロセッ
シングに必要なイントロンおよびエキソン(代わりに少し変更された変異体を含
んで)を含まなければならない。後者は蛋白質が異なった生理学的効果を持って
いる膜結合および可溶性形の両方として存在する場合に特に重要である。それ故
、ドナー種特異的機能性免疫系を維持するためには、本発明のレシピエント哺乳
類の生殖細胞系内にドナー特異的サイトカインを導入することが必要である。
することにより製造される。種々の発生段階の胚性標的細胞が導入遺伝子を導入
するために使用できる。胚性標的細胞の発生段階に依存して異なった方法が使用
される。例えば、接合体はマイクロインジェクションの最もよい標的である。マ
ウスの場合、接合体のオス前核は約20マイクロメーターの直径に達する。この
サイズでは、1−2pLのDNA溶液の再現性ある注入が実施できる。遺伝子導
入標的としての接合体の使用は別の主要な利点を持っており、ほとんどの場合、
最初の分割前に、注入されたDNAは宿主ゲノム内へ取り込まれるであろう(B
rinster,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438−4442(1985))。その結果、レシピエント哺乳類の
すべての細胞は取り込まれた導入遺伝子を運ぶであろう。このことはまた、子孫
の50%の生殖細胞が導入遺伝子を運ぶであろうので、親トランスジェニック哺
乳類の子孫への導入遺伝子の効率的な伝搬に反映される。
内へ導入遺伝子を導入するために使用できる。Perry,et al.,Sc ience 284:1180(1999)を参照されたい。簡単には、精子頭
部および直鎖状化DNAを短時間インキュベートし、卵母細胞内へ同時注入する
。DNAとのインキュベーションに先立って精子頭部が膜破壊されている場合、
改良された導入遺伝子形成の比率が観察される。
に使用できる。発生している胚は胚盤胞までインビトロで培養できる。胚盤胞が
レトロウイルス感染の標的である(Jaenisch,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 73:1260−1264(1976))。割球の
効率的な感染が透明帯を除くための酵素処理により得られる(Hogan,et
al.,MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO,C
old Spring Harbor Laboratory Press,C
old Spring Harbor,N.Y.(1986))。導入遺伝子を
導入するために使用されたウイルスベクター系は典型的には、導入遺伝子を運ん
でいるレプリコン欠損レトロウイルスである(Jahner,et al.Pr oc.Natl.Aced.Sci.USA 82:6927−6931(19
85);Van der Putten,et al.Proc.Natl.A ced.Sci.USA 82:6148−6152(1985))。割球をウ
イルス産生細胞の単層上で培養することにより感染が容易におよび効率的に得ら
れる(Van der Putten,上記文献;Stewart,et al
.EMBO J.6:383−388(1987))。もしくは、感染をより遅
い段階でも実施できる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を割腔内へ注入できる
(Jahher,D.,et al.Nature 298:623−628(
1982))。レシピエント哺乳類を形成する細胞の一部のみしか取り込みが起
こらないので、最初のもののほとんどはモザイクであろう。さらに、最初のもの
はゲノム中の異なった位置に導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入物を含んで
おり、それは一般的に子孫で分離するであろう。加えて、中期妊娠胚の子宮内レ
トロウイルス感染により、たとえ低効率だとしても、生殖細胞内へ導入遺伝子を
導入することも可能である(Jahner,D.et al.上記文献)。
ES細胞はインビトロで培養され、および胚と融合された着床前胚から得られる
(Evans,et al.Nature 292:154−156(1981
);Bradley,et al.Nature 309:255−258(1
984);Gossler,et al.Proc.Natl.Aced.Sc i.USA 83:9065−9069(1986);およびRobertso
n,et al.Nature 322:445−48(1986))。導入遺
伝子はDNAトランスフェクションまたはレトロウイルス仲介形質導入によりE
S細胞内へ効率的に導入される。そのような形質転換ES細胞はその後非ヒト動
物からの胚盤胞と混合できる。その後ES細胞は胚をコロニー化し、生じるキメ
ラレシピエント哺乳類の生殖細胞系に寄与する。例えば、総説としてJaeni
sch,Science 240:1468−1474(1988);Brad
ley,et al Biotechnology(NY)10(5):534
−9(1992);およびWilliams,Bone Marrow Tra nsplant 5(3):141−4(1990)を参照されたい。
要な蛋白質をコードしている配列を含んでいる。当業者は必要とされるサイトカ
インが所望の機能性に依存して変化することを認識するであろう。そのようなサ
イトカインにはIL−6、IL−7、GM−CSFおよびSCF、LIF、M−
CSFおよびOMが含まれるが、それらに限定されるわけではない。加えてまた
は代わりに、同じ種からのMHC遺伝子およびドナーHSCのそれとしてのハプ
ロタイプがレシピエント哺乳類内へ導入でき、内因的にMHC分子を発現する組
織で発現される。この場合、ドナー胸腺細胞はトランスジェニックMHC分子と
の相互作用を経て、レシピエント組織(特に、胸腺)の発生の間に“制限される
”ようになる。このことは、宿主哺乳類と同じハプロタイプのトランスジェニッ
クMHC分子を示している、ドナーBリンパ球と同種の相互作用を持つことがで
きるT細胞の成熟を導く。例えば、HSCドナーと同一のハプロタイプのヒトH
LA−DR、−DQおよび/または−DP遺伝子がマウス組織で発現される。ト
ランスジェニックMHC発現の発現は、RAG−2またはRAG−1遺伝子の突
然変異を持つ株よりほかのマウス株において最も有益である。
。しかしながら、ブタ、ヒツジまたはラットのような他の哺乳類源を使用しても
よい。代わりの態様において、同一種、しかしドナーには同種異系の哺乳類がサ
イトカイン源である。
法が存在する。例えば、DNAは既知のサイトカイン配列と相補的な配列を持っ
ている標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムまたはcDNAライ
ブラリーからDNAが単離できる。例えば、完全長cDNAプローブを使用して
もよいし、または既知の配列の副配列から成るオリゴヌクレオチドプローブを使
用してもよい。そのようなプローブは、サイトカインをコードするDNAを単離
するために、ハイブリダイゼーションアッセイで直接的に使用できる。代わりの
プローブがPCRのような増幅技術で使用するために設計でき、サイトカインを
コードするDNAがPCRのような方法を用いて単離できる。
される。例えば、IL−7が骨髄間質により発現されるので、これらの細胞はI
L−7をコードしているmRNAの適した供給源であろう。cDNAが本分野で
よく知られている方法に従ってmRNAから逆転写され、細菌クローニングベク
ター内へ挿入される。繁殖、スクリーニングおよびクローニングのため、ベクタ
ーは組換え宿主内へ形質転換される。cDNAライブラリーの作製方法およびス
クリーニングはよく知られている。Gubler & Hoffman,Gen e 25:263−269,(1983)およびSambrook,et al
.を参照されたい。
的剪断または酵素的消化によりDNAが小片に切断され、例えば、約12−50
kbの断片が得られた。所望のサイズの断片が濃度勾配遠心分離により分離され
、バクテリオファージラムダベクターまたは他のベクター内へ挿入される。これ
らのベクターおよびファージは、Sambrook,et al.に記載されて
いるようにインビトロでパッケージングされた。組換え体ファージはAusub
elに記載されているように、プラークハイブリダイゼーションによりサイトカ
イン核酸の存在が分析できる。
AC、BAC、P1およびPACベクターのような種々のクローニングベクター
を使用して調製される。これらのライブラリーを発生するための技術はよく知ら
れている。Markie編(YACSに対して)Methods in Mol ecular Biology 54(1997),Ramsay(YACSに
対して),Mol Biotechnol 1(2):181−201(199
4),Monaco et al.,Trends Biotechnol.1
2:280−6(1994),およびShepherd et al.,Gen et Eng (NY)16:213−28(1994)を参照されたい。
ンをコードする既知の配列、または別の種からの相同的サイトカインをコードす
る配列、例えば、相同的配列でヒトcDNAライブラリーを探査するためのマウ
ス配列に由来するプローブ、が含まれる。当業者は、もし相同的配列がプローブ
として使用されるなら、洗浄条件のストリンジェンシーは低くしなければならな
いことを認識するであろう。
加え、本発明に必要なサイトカインをコードする多くの核酸が商業的に入手可能
である。そのような供給元にはR&D Systems、Genetic Sy
stemsおよびCEPHが含まれる。
法は以下のようである。動物およびインビトロ両方の研究から、IL−3、IL
−6、IL−7、M−CSF、GM−CSF、幹細胞因子、LIF、およびオン
コスタチンMは造血に役割を果たし、骨髄または胸腺で発現され、またはマウス
蛋白質はマウスvsヒト細胞に特異性を示す、それ故、レシピエント哺乳類に植
え付けられたヒトHSCは天然の哺乳類サイトカインを認識しないことを示唆し
ている。これらのヒト遺伝子のためのゲノムクローンを得ることができ、ES細
胞内へ導入された。ES細胞は、レシピエント哺乳類の生殖細胞内へドナー導入
遺伝子を移すため胚盤胞内へ導入された。ゲノムクローンの単離 好適な方法において、PCRプライマー組は、遺伝子を含んでいる構築物がP
CRにより同定できるように、ゲノム配列の5’または3’末端に対して設計さ
れる。加えて、これらのプライマー組は、天然の哺乳類遺伝子がトランスフェク
トされたES細胞または疑われるレシピエント哺乳類のゲノムまたは転写スクリ
ーニングの間に間違って同定されないように、マウスおよびヒト遺伝子を区別す
るように設計できる。
グする(実施例2およびゲノムライブラリースクリーニングの一般的説明にはA
usubelを参照されたい)。必要に応じ、陽性クローンは同一の遺伝子に対
する他のプライマー組かまたはサザンブロット分析によりさらに確認できる。遺
伝子のサイズに依存して、クローニングベクターの異なった型およびライブラリ
ーが容易に利用可能である。約15kbまでの遺伝子はラムダライブラリーから
得られる。50kbまでの遺伝子はコスミドライブラリーから同定できる。50
kbを超えるより大きな遺伝子はBAC、PAC、P1、YAC、MACまたは
他のそのようなライブラリーから同定できる。ゲノム構築物からのインビトロ転写の例示 導入遺伝子は哺乳類宿主から発現されるであろうので、とても貴重なES細胞
内へのトランスフェクション前に、ヒト以外の哺乳類細胞(好適にはマウス)に
より転写されるヒト配列の能力を決定するのが望ましい。未消化または消化ゲノ
ム構築物は、各々のサイトカインの内因性形を発現するマウス細胞株内へ、リポ
フェクションによりトランスフェクトできる。市販品リポフェクション試薬は広
範囲に入手可能であり、過渡的アッセイでの適当なトランスフェクション効率を
得るために特定の細胞型への最適化が必要である。トランスフェクト細胞からの
mRNAが続いて構築物の転写のために分析される。当業者の好みに依存して、
mRNAは標準法に従って電気泳動でき、次にノーザンブロットで探査でき、ま
たは最初に鎖cDNAが標準逆転写法により合成できる。生じたcDNAは次に
標識プローブおよびサザンブロットまたはPCR法により分析できる。ヒトサイトカイン遺伝子を含んでいるES細胞の選択 二つの等しく好適な実施態様が、すべての望まれる遺伝子を一つの株内へ結合
するために使用できる。第一の方法において、遺伝子の群はES細胞内へネオマ
イシン耐性のための選択可能マーカーとともに同時にトランスフェクトされる。
例えば、遺伝子の一つの群はIL−7、SCFおよびLIF構築物を含むことが
でき、第二はGM−CSF、M−CSFおよびIL−6構築物を含んでいる。第
二の方法において、すべての望まれる遺伝子は一緒に同時トランスフェクトされ
る。もし、必要な導入遺伝子のすべてが一つのトランスジェニック哺乳類の生殖
細胞中に存在しないなら、哺乳類は、その生殖細胞に必要な導入遺伝子を含んで
いる哺乳類と繁殖でき、すべての必要な導入遺伝子を持つ子孫を創造する。
NAを直鎖状化する望ましい制限エンドヌクレアーゼで消化する。各々の群内で
、DNA構築物は等モル量で混合されるのが好適である。しかしながら、当業者
はもし一つの遺伝子のより多くのコピーが望まれるなら、その遺伝子のDNA構
築物を過剰に提供しなければならないことを認識するであろう。陽性選択のため
、マーカー含有プラスミドをこれらのDNAと約4:1のモル比で混合できる。
できる。好適なトランスフェクションプロトコールはリポフェクション試薬の製
造元により提供されているプロトコールと同様であり、実施例2に詳細に説明さ
れている。選択培地で適当な時間後(好適には、5−20日後およびより好適に
は10−14日後)、個々のトランスフェクトされたES細胞コロニーはクロー
ニングおよび拡張のために96−ウェルディッシュ内へ移される。
殖細胞中へ導入遺伝子を挿入する他の方法が既知であり、また利用できることを
認識するであろう。これらの方法のいくつかは、米国特許第4,873,191
、5,434,340、4,464,764、5,487,992、5,814
,318号;PCT公開特許出願WO 97/20043、WO 99/078
29、WO 99/08511;およびPerry,et al.,Scien ce 284:1180(1999)に見ることができる。
異なった技術が使用できる。例えば、ゲノムDNAまたはRNA転写体から作製
されたcDNAを検出するためにPCRが使用でき、導入遺伝子の遺伝子産物が
ES細胞で合成されるか、または細胞外に存在するかどうかを決定するためには
ELISAおよび他の抗体に基づいたアッセイが使用でき、およびそのようなア
ッセイが利用可能ならば、機能性アッセイが遺伝子産物を検出するために使用で
きる。免疫系の再構築 ヒト造血幹細胞の生物学を研究する共通の方法は、それらを免疫不全マウス内
へ導入することである。SCID、NOD/SCIDおよびベージュ/ヌード/
xidマウスのような自発的突然変異を運んでいるマウスの近交系が最も広く使
用されている宿主である。遺伝子標的化の出現は非常に多様な免疫不全動物を導
き、それらは現在この目的のために評価されている。動物は通常致死量以下の照
射により条件付けされ、しばしば骨髄移植のレベルを増加させるためおよび前駆
および/または成熟細胞の拡大のためにヒト成長因子の注射で補われている。S
CID突然変異を持つマウスでの研究において、B6/129マウスに優性遺伝
子型が存在しているようであり、このマウスに突然変異が位置されていると、突
然変異で観察される表現型のいくつかを無効にするように働いている。より少な
い効果がBalb/cバックグラウンドで観察される。さらにより少ない効果が
NODバックグラウンドで観察される。従って、RAG突然変異のための好適な
マウスバックグラウンドはNOD/SCIDである。なぜ特定の遺伝子バックグ
ラウンドが他よりも良好であるのか、または補給成長因子が有益であるのかどう
かはよく理解されていない。例えば、幹細胞因子、GM−CSFおよびIL−3
のヒト遺伝子を発現するトランスジェニックSCIDマウスは、非トランスジェ
ニックSCIDマウスよりも有効に移植されるが、NOD/SCIDマウスより
は良好ではない。ヒト遺伝子は内因性調節配列よりもむしろウイルスプロモータ
ーにより駆動されており、多分、発現の異常なパターンおよびレベルを持ってい
た(Bock,et al.J.Exp.Med.182:2037−2043
)。
ピエント哺乳類に有益である。例えば、SCID突然変異での実験で、γcノッ
クアウト突然変異またはβ−2マイクログロブリンノックアウト突然変異は異種
HSCの植え付けを改良することが示された。移植された造血幹細胞 造血幹細胞源には臍帯血(CB)、骨髄(BM)および動員末梢血(MPB)
が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
ces Inc(ABR),Alameda,CAまたはPurecell,S
an Mateo,CAから得ることができる。CBは地方病院からABRによ
り集められ、24時間内に出荷されおよび現場で処理される。もしくは、ヒトB
M、CBおよび/またはMPB細胞は、新鮮または凍結細胞、および分画または
未分画細胞としてPurecellから得られる。使用前に、すべての試料はB
型およびC型肝炎およびHIVが試験された。ウイルス陽性であることが観察さ
れた試料を含んでいる実験材料は即座に廃棄され、動物は除去され、印を付け、
汚染動物死体廃棄のための方法に従って廃棄された。実験進行を通して、すべて
の試料は、それらが病原体を運んでいるヒト血液で汚染されているかもしれない
という仮定の下で処理されるべきである(生物安全性レベル2、BL−2)。ヒ
ト血液細胞を持つマウスを扱うすべての人はB型肝炎ワクチンを受けるべきであ
る。
条件付けられている成体動物(4−8週齢)であるが、他の型の条件付けも知ら
れており構想されている。ドナー造血幹細胞のハプロタイプは、特異的抗原に対
する特定個体の応答性を決定するため、問題とする試験集団に基づいて選択され
る(例えば、集団内の蛋白質またはペプチドのアレルゲン性を決定する目的のた
め)。
され、および計数される。基準として、成体マウスは0.1−107総細胞を受
けることができる。もしくは、動物はまた、例えば、Dynal Detach
−a−Bead研究用分離システムを使用して、またはFACS選別により、例
えば臍帯血から純化されたCD34+細胞も移植される。臍帯血から純化された
CD34+細胞は次に、新生児または成体動物へ注射された。マウスにおいて、
子供には約105細胞が、成体には約5x105細胞が注射された。
胞の活性を減少させるため、ウサギポリクローナル抗アシアロ抗体で、マイナス
1日目に処理する。もしくは、レシピエント哺乳類(特にマウス)は、ペルフォ
リン欠損マウスのようなNK細胞機能がバックグラウンド欠損マウスと交配され
る。新生児動物はNK活性をほとんどから全く持っていず、それ故、それらを処
理する必要はない。
静脈内へ注射される。それらはまた眼窩後方洞を通して注射され、この場合、動
物は最初に麻酔される。典型的には、腹腔内または筋肉内へ送達されるケタミン
およびキシラジンの混合物が使用される。動物は暖かく保たなければならず、眼
は過程中湿らせて、それらが回復するまでモニターしなければならない。マウス
新生児の眼窩後方洞内へ細胞を注射するには、眼静脈がよく見えるように光源下
に子供が固定された。針を静脈と平行に保ち、皮膚表面直下にねらいを定めなが
ら挿入する。細胞はゆっくり注入し、その間血液が針の所の下流で清澄化されて
いること、および静脈の周辺で膨潤が起こっていないことを決定するために凝視
する。注射後、細胞が循環系に入るのを可能にするため、針はその場所で短時間
保つ。必要に応じ、子供はその活動を減少させるために氷上で短時間冷却される
。
従ってガンマ−照射を受ける(Bix.et al.Nature 349:3
29−331(1991);Markowitz,et al.Proc.Na tl.Acad.Sci .90:2779−2783(1993))。例として
マウスを使用すると、Mark I Model 30シールドCs−照射機ま
たは類似の装置が使用プロトコールに従って、100−1000cGy/動物の
線量範囲での投与に使用される。ナチュラルキラー細胞の減少を改良するため、
照射の致死レベルが分割線量として投与される(例えば、Balb/cマウスに
対して2x500R)。照射はヒト造血細胞の注射2−24時間前に実施される
。
り、Pflumio,et al.Blood 88:3731−3740(1
996);Dick,et al.Stem Cells 15 Suppl
l:199−203(1997);Ramirez.et al.Exp.He matol .26:332−344(1998);Hogan,et al.B iol.Blood Marrow Transplant 3:236−24
6(1997);Hogan,et al.Blood 90:85−96(1
997);およびLapidot et al.J.Mol.Med 75:6
64−673(1997)を含んでいる。
が存在することを理解するであろう。好適な方法において、レシピエント哺乳類
からのリンパ球が取り出され、ヒト細胞表面抗原の存在が調べられる。CD45
が好適である。この決定は典型的には、BおよびTリンパ球の両方で観察され、
マウスCD45には存在しない、ヒトCD45へ結合する抗体へコンジュゲート
された色素で細胞を染色することにより実施される。Colas,et al.
,Transplantation 67:984(1999)を参照されたい
。他の方法には、リンパ球からのヒトDNA配列のPCR増幅が含まれる。 III.本発明の哺乳類の使用 本発明の哺乳類は種々に使用される。例えば、本発明のレシピエント動物は非
ドナー(例えば、非ヒト)高分子のアレルゲン性を決定するためのモデルとして
使用できる。これらの高分子には蛋白質、炭水化物、脂質および他の化合物が含
まれる。蛋白質には細菌プロテアーゼ、真菌セルラーゼなどのような商業的に重
要な酵素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。前に説明したように
、モデルとして、動物は試験化合物に暴露でき、動物の免疫応答がモニターされ
る。動物モデルの応答に基づいて、免疫応答が、例えば、アレルゲン性を減少さ
せるためには少なくなるように、例えば、もし化合物がワクチンとして使用され
るならば大きくなるように、化合物は修飾できる。
用できる。明らかな倫理的理由で、実験化合物はヒト患者には使用できない。機
能性ヒト免疫系を持つマウスは、このより意味のある前臨床試験を行うことを可
能にする。
にヒトポリクローナルまたはモノクローナル抗体を発生する。本分野で入手可能
な現在のヒト抗体と異なり、他種抗体の遺伝子操作(例えば、ヒト化)は必要と
されないであろうし、抗原への偶発的暴露でヒトから精製された抗体が持つよう
な、同じ生物学的危険性を持っていないであろう。本発明のマウスが、ヒト化ま
たは他のモノクローナル抗体がヒト免疫系の応答を上昇させるかどうかを決定す
るために使用できることも企図されている。
ヒト細胞仲介応答を調べるためにも使用できる。例えば、病原体中に存在する蛋
白質のT細胞エピトープが決定できる。病原体に加え、自己免疫応答に関与する
蛋白質のような他の蛋白質がT細胞エピトープの存在で試験できる。
与する因子が決定できる。これらの因子は、これらの因子の生物学的特性を同定
するために、および前臨床モデルにおいて治療分子としての有効性を試験するた
めの両方に役に立つことができる。特に興味を持たれることは、造血再構築(例
えば、骨髄移植後または免疫不全の他の状態)を増大する因子は、細胞性対体液
性エフェクターに対する免疫応答の標的化を指示でき、有害な炎症性または自己
免疫応答を抑制し、感染性因子または癌性組織の免疫仲介クリアランスを刺激す
る。 実施例 以下の実施例は例示の目的のみで提示され、本発明を制限していると解釈して
はならない。実施例1.RAG−2変異体マウスの同種異系再構成 骨髄(BM)由来リンパ球前駆体の発生を支えるCB17.SCID(SCI
D;H−2d)およびRAG2-/-変異体(RAG;H−2b)マウスの能力を比
較するため、誕生後約72時間に、107T細胞枯渇BM細胞が静脈内で動物に
植え付けられた。RAGマウスは同遺伝子型(H−2b)C57Bl/6または
(129xC57B1/6)F1 BM(RAG−(syn);H−2b−>H
−2b)または完全同種異系Balb/c BM(RAG−(allo); H
−2d−>H−2b)を植え付けられた。SCIDマウスは同遺伝子型(SCID
−(syn);H−2d−>H−2d)または完全に同種異系C57B1/6 B
M(SCID−(allo);H−2b−>H−2d)を植え付けられた。
スから取り出され、冷DPBSを満たした3mlの注射筒に付けられた25ゲー
ジ針を使用して水洗し、単一細胞懸濁液中に細胞を得た。細胞はDPBSで洗浄
し、ペレット化した。骨髄試料は機能性成熟T細胞を含んでいるので、T細胞は
2−5x107細胞/mlに対して10μg/mlの抗−Thy−1 mAb(
30H12)を、氷上30分間使用して枯渇させた。細胞は遠心分離し、抗−ラ
ットIgG(MAR18.5)培養上清に約2−5x107細胞/mlで再懸濁
した。モルモットおよびウサギ補体を各々1:20まで加え、37℃で45分間
インキュベートした。細胞は遠心分離し、3mlの室温DPBSに再懸濁し、3
mlの室温Histopaque密度=1.119を下に敷き、800gで10
分間遠心分離した。界面から生存細胞を集め、2%FCS/DPBSで洗浄し、
計数し、FCSを含まないDPBSに3x108細胞/mlの濃度まで再懸濁し
た。
)(平均的マウスに対して〜200μl)溶液を使用して麻酔した。3x107
(100μl)T−枯渇骨髄細胞は眼窩後方洞を経て適したドナー内へ静脈内で
注射された(同一の性、5から6週齢)。新生児マウスは107骨髄細胞を含ん
でいる50μlを超えない注射液を、注射可能麻酔なしで、ただ氷で体温を低下
させて眼窩後方静脈から受けた。同遺伝子型(同一MHCハプロタイプ)および
同種異系(MHCハプロタイプ非一致)マウスの両方が移植された。マウスは8
週間放置して骨髄の植え付けを可能にし、その時点でマウス(通常各々の群に3
匹)を安楽死させ、研究のために臓器を取り除いた。胸腺、脾臓、腸間膜リンパ
節(いくつかの場合)および末梢血(MB)の詳細な細胞分析(FACS)が実
施された。これらの領域で、蛍光−結合細胞型特異的抗体を使用してT細胞、B
細胞および顆粒球が評価された。表1参照。
ントで植え付ける傾向がある。このことは多くの異なった時間点に渡って正しい
ことが観察された。8週齢動物の胸腺はよく植え付けし、CD4+およびCD8+ 単一陽性細胞の正常なパーセントを示した。加えて、胸腺フローサイトメトリー
プロフィールはCD3+細胞のパーセントを含んで同等であった。示されている
RAG(allo)キメラはわずかにより未成熟な二重陰性(DN)胸腺細胞を
持っていた;しかしながら、DN胸腺細胞の濃縮は、本研究の過程で試験された
RAG−(allo)マウスのX数に渡って、再現性のある発見ではなかった。
腹腔内に免疫し、2週間後にKLHを含むIFAで追加免疫した。免疫マウスは
1週間後に血液を採り、血清試料のIgGならびにIgG1(いくつかの場合)
をELISAにより試験した。下記図2および表2を参照されたい。
抗原特異的同源T−B相互作用の欠如を示している。このことは宿主胸腺上皮に
よるドナーCD4+T細胞の陽性選択によるものであると推定されており、ドナ
ーMHC発現B細胞と相互作用できないT細胞を生じている。対照的に、RAG
−(allo)マウスは、RAG−(syn)動物と等しいレベルの抗原特異的
IgGを産生した(図2A)。出血前血清は通常バックグランドに等しい吸光度
を示した。加えて、血清IgGは、オブアルブミン(OVA)被覆プレートで試
験した場合、交差反応的ではない。抗原特異的IgM応答は気付かれなかった。
この現象は第二の抗原KLHについて調べられた。図2Bに示されているように
、2匹の独立したRAG−(allo)動物について、抗原特異的血清IgG応
答は対照RAG−(syn)応答の次数であることが観察され、類似の速度論で
発生した。すべてのマウスからの血清は無関係な抗原で被覆されたELISAプ
レート上で交差反応しないことが観察された。この結果は、ドナー由来BM細胞
はCD4+T細胞を陽性選択でき、それは次に末梢でドナー由来抗原特異的B細
胞と相互作用でき、アイソタイプのIgGへのスイッチが生じることを示唆して
いる。
4+T細胞は、植え付けした動物のリンパ節から単離され、混合リンパ球培養(
MLR)で反応性が試験された。図1AおよびCは、C57B1/6、Balb
/cおよび第三者H−2k発現マウスからのLPS誘導脾臓芽細胞に対するRA
G−(syn)(A)およびSCID−(syn)(C)CD4+T細胞の増殖
応答を示している。RAG−(syn)およびSCID−(syn)の両方とも
自己には陰性であったが、異抗原には応答性であった。RAG−(allo)マ
ウスはC57B1/6およびBalb/cの両方に陰性であったが、第三者H−
2k同種異系抗原には応答性であった。しかしながら、SCID−(allo)
は機能的に傷つけられており、自己MHCに不完全な陰性を示している。加えて
、第三者H−2k発現刺激剤への応答が害されている。SCID−(allo)
への注射と同一のBM接種物で作製された対照RAG−(syn)がパネルDに
示されている。従って、RAG−(allo)マウスはドナーおよび宿主MHC
へは陰性であり、および第三者へは応答性であること観察されたが、SCID−
(allo)は機能的にそこなわれている。加えて、脾細胞およびリンパ節の分
裂促進反応性が試験された。RAG−(allo)脾細胞は正常にT細胞分裂促
進剤PHAに応答したが、一方、SCID−(allo)T細胞は低応答性であ
った。すべての植え付け動物の脾細胞はLPSに対して対照レベルの応答を示し
た。
が後肢足蹠に免疫され、その後ドレイニング(draining)リンパ節から
CD4+T細胞が精製された。初回抗原刺激を受けたCD4+T細胞は抗原パルス
LPS誘導脾臓芽細胞と一緒に培養され、増殖が評価された。図3は二つの異な
ったRAG−(allo)動物からのKLH初回抗原刺激を受けたドレイニング
CD4+T細胞の増殖応答を示している。KLHパルスC57B1/6刺激剤へ
の応答は優性であることが観察され、胸腺上皮細胞MHCについては抗原の認識
でのCD4+T細胞の優先選択を示している。しかしながら、KLHパルスBa
lb/c芽細胞に対する抗原特異的応答は、対照応答の約30%であった。この
実験は5回繰り返され、同様のレベルのドナー拘束応答が認められた(範囲=宿
主応答の20から50%)。同様の結果が成体植え付けマウスで得られた。
性選択したことを示唆している。胸腺上皮細胞は胸腺で起こる陽性選択の大部分
に影響することは広く受け入れられている。しかしながら、他の細胞型によるお
よびMHC障壁を超えた選択はCD8+T細胞にのみ観察されている。MHCク
ラスI拘束(Pawlowsky,et al.Nature 364:642
−5(1993))およびクラスII拘束(Hugo,et al.Proc. Nat’l Acad.Sci .90:10335−10339(1993))
T細胞両方の陽性選択は、胸腺内に注射されたトランスフェクト線維芽細胞に起
こることが示されている。MHCクラスII拘束細胞の選択は、胸腺細胞が胸腺
上皮細胞および注射された線維芽細胞両方のMHCハプロタイプを共有している
場合に示されている。この制約は、MHCクラスI拘束細胞の選択では明らかで
はない。CD4+T細胞に対するBM細胞による胸腺陽性選択はBM植え付け照
射成体MCクラスII欠損マウスでは起こらないが、他の人たちは親からF1へ
の骨髄キメラを使用してドナーMHCへの機能性拘束を示している。一方、BM
由来細胞による陽性選択を示している、ドナーMHCへのCD4+T細胞の機能
性制限は完全同種異系キメラでは示されていないが、いくつかの例外が存在する
(Longo,et al Nature 287:4447(1980);L
ongo,et al.J.Immunol 130:2525−2528(1
983);およびLongo,et al.Proc.Nat’l Acad. Sci .82:5900−5904(1985))。これらのデータを一緒にす
ると、胸腺上皮細胞およびBM由来細胞は有効な陽性選択を達成するにはMHC
ハプロタイプを共有していなければならず(Zink,およびElliot)、
CD4+T細胞の選択に対する要求は、CD8+T細胞の選択に対する要求よりも
より厳密であろう。
、および胸腺上皮細胞によるハプロタイプ共有なしで起こることを可能にする環
境を提供するので独特であることを示唆している。RAGマウスの独特さは突然
変異の非漏出性によるものであろう。SCIDマウスは時折、機能性抗原レセプ
ターを持つ細胞を発生させることがよく知られている。たとえ少なくとも抗原レ
セプター陽性細胞の発生は、陽性選択ができるドナーBM由来細胞の動員および
/または機能性を不可能にする機能性変化を胸腺微小環境に誘導するには十分な
信号であろう。新生児および成体SCIDマウスの両方がこれらの実験で使用さ
れ、両者ともドナー同種異系BM拘束を支える能力を示さなかった。それ故、R
AGマウスはそのリンパ球生成微小環境が、胸腺表現型により示唆されるように
、機能的に胎児発生段階で凍結されているモデルを代表するものである。もしR
AGマウスが“胎児”モデルを表すとすると、BM由来細胞に対する選択は胸腺
では正常なことであり、この現象はSCIDマウスの使用による、または照射の
二次効果による他の系では日常的には観察されていない。実施例2.ヒトサイトカイン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの発生 動物およびインビトロ両方の研究に基づくと、以下の組の導入遺伝子は造血に
役割を果たし、骨髄または胸腺で発現され、またはマウス蛋白質がマウスvsヒ
ト細胞に特異性を示している:IL−3、IL−6、IL−7、M−CSF、G
M−CSF、幹細胞因子、LIF、およびオンコスタチンM。ヒト遺伝子のこの
組のゲノムクローンが得られ、トランスジェニックマウスを誘導するためのES
細胞クローンを選択するために使用された。ゲノムクロ−ンの単離 遺伝子を含んでいる構築物が容易にPCRにより同定できるように、ゲノム配
列の5’または3’末端に対してPCRプライマー組が設計された。加えて、こ
れらのプライマー組はマウスおよびヒト遺伝子を区別するように設計された。ヒ
トクローンの同定に以下のプライマーおよび条件が使用された。
L−7およびSCFに対する)およびPAC(GM−CSFに対する)ライブラ
リー(Genome Systems,Inc)が上記遺伝子特異的プライマー
組を使用してスクリーニングされた。IL−3およびOMは各々GM−CSFお
よびLIFに密接して並んでおり、最初の回はスクリーニングされなかった。陽
性クローンは同じ遺伝子の他のプライマー組かまたはサザンブロットにより確認
された。以下のプライマーがPCR確認に使用された:
0 Magnumカラム(Genome Systems,Inc)を使用して
調製された。詳細な実験法は製造元から供給される使用説明書に詳細に記載され
ている。DNA濃度を定量するため、DNA構築物はEcoRIで消化され、続
いて0.8%アガロースゲル上、既知の濃度のDNA標品とともに電気泳動され
た。プラスミドDNA濃度は標品との比較により決定された。
づいて標的遺伝子の完全構造配列を持っていると同定された:
ールドゲル電気泳動により決定された。ゲル泳動条件は以下の組であった: 初期スイッチ時間:1秒 最終スイッチ時間:6秒 全運転時間:12時間 電圧:6v/cm 角度:120°ゲノム構築物からのインビトロ転写の例示 マウス細胞により転写されるべきヒトゲノムクローンの能力を決定するため、
未消化ゲノム構築物が、使用説明書に従い、Tfx50(Promega)を使
用するリポフェクションによりMM54細胞(各々のサイトカインの内因性形を
発現するマウス細胞株、ATCC#6434−CRL)内へトランスフェクトさ
れた。細胞は、mRNA分析のため48時間後に採取した。全RNAはUltr
specTM RNA単離システム(Biotecx)を使用して調製された。R
NA収量を高めるため、エタノール沈殿に先立って10mgのゼラチンキャリア
蛋白質が加えられた。第一鎖cDNAは標準逆転写法により合成された。簡単に
は、RNAを29.5mlのH2Oに再懸濁し、10mlの5x第一鎖緩衝液、
2.5mlの10mM dNTP、5mlの1M DTT、1mlの0.5mg
/mlランダムプライマー、および2mlのM−MLV逆転写酵素(Life
Technologies)と混合した。反応液は37℃で1時間インキュベー
トし、cDNAはフェノール/クロロホルム抽出により精製された。生じたDN
Aは次に20mlのH2Oに再懸濁した。ヒト特異的転写体は入れ子状態−PC
R法により分析した。1mlのcDNA試料は最初に第一のPCRプライマー組
で30サイクル増幅した。その後、反応混合物から5μlを採り、さらに30サ
イクル、入れ子状態−PCRプライマー組で2回目のPCRにかけた。DNA試
料は1%アガロースゲルで分離した。 入れ子状態−PCRのためのプライマー組:
ションでの使用に選ばれた。
細胞)はヒト造血成長因子の3組の遺伝子でトランスフェクトした。リポソーム
試薬、Tfx−50(Promega)が使用説明書に従って使用された。遺伝
子の各々の組は等モル濃度の3つの直鎖状化成長因子DNAを含んでいた。第一
のDNA組(GM−CSF組)はGM−CSF、M−CSFおよびIL−6を含
んでいた。第二のDNA組(IL−7組)はIL−7、SCFおよびLIFを含
んでいた。第三のDNA組は6つすべての導入遺伝子を含んでいた。PGK−H
yg(RAG-/-ES細胞に対する)かまたはPGK−Neo(129v/J野
生型ES細胞に対する)の選択可能マーカーを持つプラスミドDNAが陽性選択
に使用された。
因子DNA混合物(2.18μg)および直鎖状化選択可能マーカーDNA(0
.42μg)を1mlの無血清Opti−MEM培地中で混合し、170.6μ
g(97.5μl)のTfx−50と15分間、室温でインキュベートした。マ
ーカー対DNA混合物のモル比は4:1であり、Tfx−50対全DNA(マー
カーおよび成長因子DNA)は25:1であった。次に、5mlの無血清Opt
i−MEM培地中の6−9x106ES細胞をDNA/リポソーム混合物へ加え
、37℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、細胞を
採取し、ウェル当たり2.5x105ES細胞濃度で6ウェルプレートへ再プレ
ートした。ヒグロマイシン(120μg/ml)またはG418(400μg/
ml)選択はトランスフェクション24時間後に開始した。薬剤耐性ESコロニ
ーを10から14日の選択後に拾い上げた。トランスジェニックESクローンのサザン分析および遺伝子コピー数の決定 遺伝子のすべてのDNAプローブはヒトゲノムDNAまたはcDNA試料から
PCRにより発生させ、続いてpCRR2.1−TOPOベクター内へクローン
化した。EcoRI消化によりプラスミドからPCR断片が回収され、例えば、
Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用してゲル精製さ
れた。
出されたcDNAから、プライマー組hSCFSF3/hSCFB−R(配列番
号:39および40)で増幅された。この断片は続いてpCRR2.1−TOP
Oベクター内へクローン化した。EcoRI消化後、808bp DNA断片は
ゲルから精製され、SCFを同定するためのプローブとして使用された。
サブクローン化され、プローブとして使用された(hLIF−3F/hLIF−
3R;配列番号:21および22)。
がプライマー組CT−hGMCSF−F/CT−hGMCSF−R(配列番号:
47および48)によるPCRにより発生した。
CSF−R(配列番号:9および10)を用いて400bpプローブを発生させ
た。
番号:11および12)を用いて298400bpプローブを発生させた。 ESクローンはゲノム配列の存在を確認するため、およびヒトDNA対照と比
較した相対コピー数を決定するため、サザンブロッティングにより分析された。
各々のES細胞クローンからの10・gのDNAをEcoRI(IL−7および
SCFに対して)、BamHI(LIFおよびIL−6に対して)またはHin
dIII(GM−CSFおよびM−CSFに対して)で消化し、1%アガロース
ゲルで分離した。DNAはアルカリ性移送によりナイロン膜へ移した(使用説明
書、Genescreen Plus)。膜は標準ホルムアミド含有緩衝液(A
usubel)を用い、42℃で一夜プリハイブリダイズした。各々のプローブ
はPrime−It II Kit(Stratagene)を使用して標識さ
れ、膜へ加えられた。ハイブリダイゼーションは回転させながら42℃で一夜実
施された。膜を2回、各々低ストリンジェンシー緩衝液(2xSSC、0.1%
SDS)で10分間、室温で洗浄した。膜は次に2層のWhatman濾紙で吸
い取って乾燥させ、ホスホスクリーン(Molecular Dynamics
)へ暴露した。イメ−ジはSTORM System(Molecular D
ynamics)により定量された。各々の導入遺伝子のコピー数はヒト対照と
比較することにより誘導された。
ーンがさらに調べられた。これらのコロニーから、179ESクローンが注射に
適していることが見出された。これらの注射可能ESクローンの間で、2つは6
遺伝子、18は5遺伝子および95クローンは3導入遺伝子を持っていた。
IL−6遺伝子を1コピーを持っていたのに、クローン15は同じ遺伝子を2コ
ピー持っていた。一方、同一のクローン内で、一つの遺伝子のコピー数は他の遺
伝子とは異なっていた。例えば、クローン18はIL−7遺伝子の1コピーを持
っており、SCF遺伝子を2コピー、およびLIF遺伝子の3コピーを持ってい
た。トランスジェニックマウスの発生 ヒトサイトカイン遺伝子を含んでいるES細胞クローンが、Robertso
n(編),Teratocarcinomas and embryonic
stem cells−a practical approach(1987
),IRL Pressに記載されているようにトランスジェニックマウスを誘
導するために使用される。ES細胞は3.5日p.c.C57BL/6胚内へ注
射され、擬妊娠メスの子宮内へ移植され、誕生まで発育させた。オスキメラは野
生型C57Bl/6メスと交配し、生殖系トランスジェニック系統を得た。ヒト導入遺伝子を持つマウスの同定 取り込まれたヒト導入遺伝子を持つマウスを同定するには2つの方法がある:
サザンブロットおよびPCR分析。その速さおよび実験法の容易さのためマウス
の遺伝子型を決定するためにPCRを使用するのが好適である。しかしながら、
PCR結果の正当性には心配があり、結果を確認するためにサザンブロットを実
施すべきである。簡単には、DNA試料はマウス尾の先端から標準プロトコール
に従って単離された(Qiagcnマニュアル,DNeasy 96 Tiss
ue Kit)。ヒト特異的プライマー組を使用するPCR分析(ゲノムクロー ンの単離 を参照されたい)が各々の導入遺伝子に対して実施された。ヒトDNA
を含んでいる陽性対照試料およびマウスDNAを含んでいる陰性対照試料もまた
、PCR生成物の特異性を確かにするために同時に実施された。予期されたヒト
導入遺伝子を含むマウスのみがさらなる交配および実験のために選択された。
ローン12およびクローン71はIL−6、M−CSFおよびGM−CSFを持
っている。クローン74およびクローン75はIL−7、SCFおよびLIFを
持っている。クローン182およびクローン185は生殖細胞に6つすべての導
入遺伝子を持っているのに、クローン201はLIFを除くそれぞれの遺伝子を
持っている。同一の方法が、マウスの遺伝子型を確認するために繁殖工程を通し
て行われた。ゲノム構築物からのインビボ転写の例示 脾臓、胸腺、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、肺、脳および骨髄を含む各々のトラン
スジェニックマウスからの9つの組織から全RNA試料が調製された(RNea
sy Midi Kit,Qiagen)。総cDNAは前に説明したように調
製された(ゲノム構築物からのインビトロ転写の例示)。各々の導入遺伝子の遺
伝子発現分析は入れ子状態−PCR(前を参照されたい)により実施された。結
果の再現性を確かにするため、各々の遺伝子型で少なくとも2匹のマウスがこの
方法により分析された。
からのマウスは異なった組織において3つすべての導入遺伝子の発現を示した。
ヒトIL−6は主として脾臓および胸腺で発現された。ヒトGM−CSF発現は
胸腺に限定されていた。一方、ヒトM−CSFはより広範囲の組織分布を持って
おり、脾臓、胸腺、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、肺および脳が転写体を持っていた
。クローン75、ヒトIL−7、SCFおよびLIFを持っている、からのマウ
スも組織において3つすべての導入遺伝子の発現を示した。ヒトIL−7および
SCFはM−CSFと類似の広範囲な分布パターンを持っていたが、ヒトLIF
発現は脳に限定されていた。
びLIFを含む他のES細胞からのマウスも同じ方法で分析された。ある組織で
は発現パターンが異なっていたが、全体のパターンは同様であった。この変異は
、導入遺伝子の挿入部位、および各々の遺伝子のコピー数の相違によるものであ
ろう。マウス内因性遺伝子もまた入れ子状態−PCRにより分析された。ある種
の特異的組織での相違にも関わらず、発現パターンはヒト導入遺伝子のパターン
と大部分は一致していた。
現がELISAにより試験された。 導入遺伝子発現パターンおよびレベルはクローン、同腹子、同腹子仲間、およ
び同一のマウスからの間質細胞間さえも変化していた。下記の表は4ES細胞ク
ローンを注射したマウスからのELISA結果を提供している。
。 ヒト造血に対するトランスジェニックマウス造血微小環境の効果を試験するた
め、トランスジェニックまたは野生型同腹子に誘導された長期骨髄培養が組織培
養フラスコに準備された。
う。造血幹/前駆体細胞が次に間質層に付着する。造血細胞は増殖および分化す
るにつれて、それらは非付着性となり、培養上清に自由に浮いている。造血幹細
胞の増殖および分化の程度を決定するため、分化した細胞の細胞数が計数および
染色できる。
せるために培養物は照射された。しかしながら、照射はインビトロでヒト造血を
支える間質細胞の能力は維持されている。照射後、ヒト臍帯血単核細胞が培養物
に加えられた。細胞計数は週に1回行われ、培地の50%が換えられた。毎週、
非付着細胞が計数され、FACSにより分析された。
てクローン12およびクローン75よりも良好にヒト造血を支えた。トランスジ
ェニック同時培養から採取された非付着細胞は、クローン71同腹子から確立さ
れた野生型同時培養よりも、数が多かった。クローン71および75トランスジ
ェニックマウスからの間質細胞の混合物は、インビトロにおいて、クローン71
またはクローン75単独よりも、非付着細胞性において、より良好にヒト造血を
支えた。
ェニックの発現はクローン71および75マウスのトランスジェニック同腹子に
おいて、骨髄B細胞前駆細胞産生を増加させた。実施例3:機能性植え付けを支える照射H−2b−>H−2dC1D/RAG−2 およびH−2bC2D/RAG−2骨髄キメラの能力 MHCが同種異系の植え付けを容易にするために必要かどうかを評価するため
に、MHCクラスI欠損(C1D)/RAG−2およびクラスII欠損(C2D
)/RAG−2マウスが試験された。非照射同種異系C1D/RAG−2キメラ
は、キメラが末梢血に10%より多いドナーBリンパ球を含んでいる場合、抗原
特異的IgG抗体を産生した。比較して、C1D/RAG−2宿主の照射(80
0ラド)は、末梢血中のB細胞のより高いパーセントを伴う、ドナー細胞植え付
けレベルの相対的増加を導いた。これらのキメラのすべてがKLHに対する良好
な抗原特異的IgG抗体を産生した。同種異系C1D/RAG−2キメラの機能
性植え付けに、照射条件付けが絶対的な要求であることは観察されていないが、
照射宿主は細胞性および機能性植え付けをより広範に支えた。
ウスは細胞性同種異系の植え付けを支えることができず、従って、照射による前
条件付けが使用された。800Rの照射を受けたH−2b−>H−2bCC2D/
RAG−2マウスは有意に良好であった。CD4+細胞の相対パーセントはC1
D/RAG−2キメラと比較して減少しているが(それは宿主発現MHCクラス
II分子の不在と相関している)、CD4発育が存在していた。これらのキメラ
は免疫後に抗KLH抗体応答を惹起し、これらのマウスの機能性植え付けを示し
ている。このことは、RAG−2マウスの機能性植え付けには、クラスIまたは
クラスIIのどちらもレシピエントで絶対的には必要とされないことを示唆して
いる。ドナーMHC拘束免疫性を支えることにおけるMHCハプロタイプ依存性の評価 以下の実験が実施され、RAG−2突然変異は同種異系のHSCの機能性発育
を支えるための“普遍的”特性を与えるという結論が導かれた。
主 (ii)C57B1/6(H−2b)−>Balb/c RAG−2(H−2d )宿主 (iii)Balb/c(H−2d)−>129 RAG−2(H−2b)宿主 (iv)C57B1/6(H−2b)−>129 RAG−2(H−2b)宿主 (v)Balb/c(H−2d)−>C57B1/6 SCID(H−2b)宿
主 (vi)C57B1/6(H−2b)−>C57B1/6 SCID(H−2b )宿主 第一の組のキメラ(i−iv)は、H−2dバックグラウンドのRAG−2変
異体マウスが同種異系ドナー特異的免疫性を支える能力を持っているかどうかを
決定するために設計された。これらのキメラのすべてが機能性植え付けを支持し
た。
のSCID変異体マウス、H−2bバックグラウンド、の能力を試験するために
製造された。同種異系キメラは同遺伝子型群と比較して植え付けは非常に悪く(
胸腺は試料としては小さすぎた)、それは報告されているH−2bSCID内へ
のH−2dの結果と非常に類似している。これらの結果は、MHCハプロタイプ
のTリンパ球非依存性の細胞発生を支えることに対してSCIDおよびRAG−
2間には著しい相違が存在することを示唆している。
を支えることができるかどうかを評価するため、H−2k AKR−>H−2b
RAG−2キメラが製造された。これらのマウスはドナー由来免疫性を支えた。
く、異なったドナー系統からの骨髄の同種異系の植え付けを支えることを示して
いる。このことは、これらのマウスは任意のドナーからの造血を支えることがで
きることを示唆している。ドナー由来免疫性に対する他の突然変異の評価 RAG−2マウスは、RAG−1およびTCRβ/δマウスにおける移植研究
(宿主B細胞を除去するために照射)が実施されるまで、ドナー拘束免疫性を支
えることにおいて、他の免疫不全系統と比較して独特であるようであった。非照
射RAG−1キメラは同種異系ドナーからの植え付けを支えていないが、照射(
800ラド)RAG−1マウスは機能性植え付けを支えた。RAG−1およびR
AG−2遺伝子の両方ともTおよびBリンパ球レセプター再配置を開始するため
に必要とされている。加えて、照射TCRβ/δマウスもまたドナー由来免疫性
を支えることを研究で示された。チトクローム−c特異的TCRトランスジェニック(H−2kクラスII拘束)
−>H−2bRAG−2骨髄キメラは同起源MHCクラスII分子の宿主発現不
在下でドナーCD4+T細胞の細胞性植え付けを支える ドナー由来免疫性の機構を決定するために、SJL−TgN(TcrAND)
53HedマウスがJackson Laboratoryから得られ、AKR
(H−2k)マウスへ戻し交雑して、TCR−トランスジェニック(TCR−t
g)T細胞(I−Ek状況下でcyt−cを認識する)の陽性選択のために適し
たMHCクラスII分子(I−Ek)が提供される。これらのマウスからの骨髄
は、トランスジェニックT細胞のための同起源MHCクラスIIレセプターを発
現しないH−2bRAG−2マウスを植え付けるのに使用される。このことはト
ランスジェニック骨髄細胞のための宿主微小環境を作り出し、それはクラスII
ノックアウトバックグラウンドと機能的に等価である。ドナーT細胞発育は従っ
て、ドナー由来抗原提示細胞に依存するようになり、TCR−tg T細胞を陽
性に選択する。
型AKR−>RAG−2マウスと同様であった。これらのキメラの両方とも、T
CRtgxAKRドナーマウスと比較すると全体で低いT細胞のパーセンテージ
を持っており、同種異系RAG−2キメラの他のハプロタイプ組み合わせと一致
している。B細胞再構成のレベルは比較的高かった(10%を超える)。TCR
tgxAKR−>RAG−2およびAKR−>RAG−2の両方が、抗原特異的
IgG抗体を産生するそれらの能力を決定するためにチトクロームcで免疫され
た。実施例4.ヒトHLAクラスII遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの 開発 本発明の別の態様は、マウスのMHCクラスII−運搬組織におけるヒトHL
AクラスII分子の発現を含んでいる。この実施例において、ドナーHSCが導
入され、それはトランスジェニックHLAクラスII分子と同じHLAハプロタ
イプを発現する。この組み合わせは、宿主組織(特に胸腺)上で発現されたトラ
ンスジェニックHLAクラスII分子環境で発育したドナーTリンパ球、および
ドナー由来Bリンパ球間の同起源の相互作用を提供する。DR3ハプロタイプの
ヒトHLAクラスII分子を発現するトランスジェニックマウスを作製するため
の方法が教えられるが、これらの方法は、集団中の他の個体を表している応答を
評価する目的で、クラスI遺伝子のものを含む任意の望まれるHLAハプロタイ
プへ応用できる。リポフェクションのためのYAC DNA調製 はHLAクラスII領域の約550kbに及んでいる(Rajgoussis
et al.Nucleic Acids Research,20:313
5−3138(1992)およびRagoussis,et al.,Tsuj
i,et al.(編)HLA 1991,Oxford Univ.Pres
s(1992))。それは一つの末端がRING3遺伝子に接しており、および
反対の末端はDRaに接している。それはDR3ハプロタイプのDRa、DRb
、DQaおよびDQb鎖を含んでいる。
09細胞/mlを含んでいる、1%低融点アガロース中にアガロースブロックを
形成させた。YACは1%低融点アガロースでのパルスフィールドゲル電気泳動
により酵母染色体から分離された。泳動条件は:200V、40時間持続、50
秒スイッチ時間であった。電気泳動後、外側縁および真ん中で、ゲルを縦に切断
した。三つのスライスはエチジウムブロミドで染色し、宿主染色体に関して4D
1 YACの位置を可視化した。4D1 YACの位置を刻み目で印を付け、マ
ーカー片を、非染色ゲル部分で再整列させた。4D1 YACを含んでいる水平
バンドを、刻み目の位置に基づいて切り出した。
(Epicentre Technologies)で1時間、2回平衡化した
。二回目のゆすぎ後に緩衝液を交換し、4℃で一夜放置した。酵母DNA注入量
に基づくと、全ゲル中の4D1 DNAの見積もり量は約8mgであった。次の
日、ゲルスライスを各々約1グラムの重量の20ブロックに切断し、個々のチュ
ーブ内に置いた。ゲル断片は70℃、20分で溶け、45℃で15分間平衡化し
た。チューブ当たり10単位のゲラーゼ(Epicenter Technol
ogies,1単位/ml)を加え、45℃で45分間インキュベートした。ゲ
ラーゼ工程は繰り返された。ES細胞内へのYAC DNAのトランスフェクション 各々のアガロースブロックは約400ngのYAC DNAを含んでいる(ま
たは400ng/ml)。ネオマイシン耐性プラスミド(PGKneo)を約4
:1のモル比で加えた(ゲルブロックml当たり20ng)。Transfec
tam (Promega ロット318402)を50:1 重量:重量比で
加え(ゲルブロックml当たり19mg)、混合物は室温で1時間放置した。E
S細胞は前の日に1:2に分割されており、100mmプレートへ播種されてい
る。細胞はトランスフェクション当日にトリプシン処理されており、無血清ES
培地に3x106細胞/mlで再懸濁されている。1mlのES細胞を8mlの
無血清ES培地を含む60mmディッシュに置いた。1mlのDNA/脂質混合
物を加え、細胞を37℃で4時間インキュベートした。その後、リポフェクショ
ン/ES細胞混合物を100mmディッシュ当たり1x106ES細胞でフィー
ダーセル上に置いた。G418(400mg/ml)を次の日に加え、クローン
が現れるまで9−12日の間、1日おきに培地を交換した。個々のクローンを拾
い上げ、96ウェルで増殖させた。細胞は二重の96ウェルプレート内へ1:2
に分割した。一つのプレートはその場所で凍結し、他方はDNA分析のために採
取した。4D1−陽性クローンの特徴付け 全YACの存在は、全550kbに及ぶ6つの遺伝子のためのPCRプライマ
ーを使用して決定された:TAP−1、TAP−2、DQb、DQa:DRbお
よびDRa。最初のスクリーニングはTAP−1およびDRaプライマー組を含
んでいる。これら二つの末端領域遺伝子に二重陽性であるクローンは4つのプラ
イマー組の残りでさらにスクリーニングした。
INOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS−A PR
ACTICAL APPROACH(1987).IRL Press、に記載
されているようにトランスジェニックマウスを誘導するために使用される。ES
細胞は3.5日p.c.C57BL/6胚内へ注射され、擬妊娠メスの子宮内へ
移植され、誕生まで発育させた。キメラオスは野生型C57Bl/6メスと交配
し、生殖系トランスジェニック系統を得た。トランスジェニックマウスの抗体応答 4匹のD1/C2D/RAG−2(HLA−トランスジェニック)マウスから
血液を採り、それらの血清はFACS分析を使用して、I−Eアルファ、I−E
ベータおよびDRアルファ発現が試験された。表面DRを発現するが、I−Eア
ルファを発現しないことが確認されたマウスが機能性試験に選ばれた。これらの
マウスは足蹠に50μg/mlで免疫された。3つの蛋白質が免疫原として使用
された。2つは真菌プロテアーゼであり、三番目のものはインビトロヒトT細胞
エピトープアッセイで減少したアレルゲン性であることが観察されている2つの
蛋白質のハイブリッドであった。蛋白質は足蹠当たり100μlの総容量のCF
Aで乳化し、2週間後、別の足蹠に同じ濃度のIFAで追加免疫した。免疫マウ
スは1週間後に血液を採り、血清試料の適切な蛋白質に対する抗体をELISA
で試験した。動物の第二の組は抗体応答のために免疫されたが、異なったプロト
コールが使用され、それは以下のようである:マウス当たり100μlの総容量
のCFAで乳化された同じ3つの蛋白質の50μg/マウスで腹腔内で免疫され
、2週間後に同じ濃度のIFAで追加免疫された。マウスは1週間後に血液を採
り、血清試料の抗体を試験した。
を評価するために、主要なT細胞エピトープであることが知られている陽性対照
免疫原性ペプチド(HSP651−20)が使用された。マウスはGeluk
et.al.により以前に報告されているプロトコールに従って免疫された。膝
窩リンパ節をとり、T細胞増殖アッセイ(またGeluk et.al.により
報告されている)を使用してT細胞増殖を評価した。
傷であり、DR3特異的免疫応答を評価するために使用してもよいことを示唆し
ている。実施例5.ヒト造血幹細胞でのトランスジェニック免疫不全マウスの植え付け ヒトIL−3、IL−7、SCF、LIF、IL−6、M−CSF、OMおよ
びGM−CSFを発現するトランスジェニック免疫不全マウスはヒト造血幹細胞
源で植え付けされる。植え付けのための年齢は誕生後約72時間である。好適な
ドナー細胞源は臍帯血である。この実施例のためには、ドナー細胞のハプロタイ
プは特異的抗原に対する特定個体の応答性を決定するため(例えば、集団内の蛋
白質またはペプチドのアレルゲン性を決定する目的のため)、問題とする試験集
団に基づいて選択される。移植のための材料源 ヒト臍帯血(CB)はAdvanced Biosciencc Resour
ces Inc(ABR),Alameda,CAまたはPurecell,S
an Mateo,CAから得ることができる。CBは地方病院からABRによ
り集められ、24時間内に出荷されおよび現場で処理される。もしくは、ヒト骨
髄(BM)、CBおよび/またはMPB細胞は、新鮮または凍結細胞、および分
画または未分画細胞としてPurecellから得られる。使用前に、すべての
試料はB型およびC型肝炎およびHIVが試験された。ウイルス陽性であること
が観察された試料を含んでいる実験材料は即座に廃棄され、動物は除去され、印
を付け、汚染動物死体廃棄のための方法に従って廃棄された。実験進行を通して
、すべての試料は、それらが病原体を運んでいるヒト血液で汚染されているかも
しれないという仮定の下で処理されるべきである(生物安全性レベル2、BL−
2)。ヒト血液細胞を持つマウスを扱うすべての人はB型肝炎ワクチンを受ける
べきである。
いている研究者が選択すべき系統であるから、それらは実験対照として移植を受
ける(Bhatia et al,Proc.Nat’l Acad.Sci. 94:5320−5325(1997),Cashman et al.Blo od 89:4307−4316(1997),Hogan,et al.Bl
ood 90(1):85−96(1997),Vormoor,et al. Blood 83:2489−2497(1994)およびWang,et a
l.Blood 89:3919−3924(1994))。
ェニックマウスが移植を受ける。マウス組織におけるヒト主要組織適合抗原遺伝
子産物の発現は、胸腺細胞発生の代わりの発生経路を提供する。マウスに注射するための方法 HSC濃縮集団は静脈内に注射される(i.v.)。新生児マウスは50μL
以上の細胞を受けるべきではない。眼静脈がよく見えるように光源下に子供が固
定される。針は静脈と平行に保ち、皮膚表面直下にねらいを定めながら挿入する
。細胞はゆっくり注入し、その間血液が針の所の下流で清澄化されていること、
および静脈の周辺で膨潤が起こっていないことを決定するために凝視する。注射
後、細胞が循環系に入るのを可能にするため、針はその場所で10−30秒保つ
。動物は温かく保ち、眼は回復するまで湿らせる。必要に応じ、子供はその活動
を減少させるために氷上で短時間冷してもよい。マウスの分析 2週間から数ヶ月の種々の時間間隔で、マウスはヒト免疫細胞の再構築が分析
される。末梢血が眼窩洞または尾静脈から抜かれ、ヒト造血細胞細胞に特異的な
モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーにより分析される。動物を
殺し、その末梢免疫系器官がフローサイトメトリーにより、ヒト細胞の存在が試
験される(Pflumio,et at.Blcod 88:3731−374
0(1996);Dick,et al.Stem Cells 15 Sup
pl I:199−203(1997);Ramirez et al.Exp .Hematol .26:332−344(1998);Hogan,et a
l.Biol.Blood Marrow Transplant 3:236
−246(1997);Hogan,et al.Blood 90:85−9
6(1997);およびLapidot et al.J.Mol.Med 7
5:664−673(1997))。有糸分裂刺激、同種異系または異種細胞へ
の混合リンパ球反応(MLR)、およびイムノグロブリンの異なったクラスを誘
導する能力のような、成熟ヒト細胞の機能性特徴が決定される。特異的蛋白質、
ペプチドまたは糖蛋白質による免疫化が、抗体の特定のサブクラスおよび抗原特
異的T細胞応答を誘導する能力を決定するために実施される。実施例6.機能性ヒト免疫細胞を得るための方法 四つの型のヒトHSCキメラが本発明により描かれた。宿主マウスの系統はす
べて、ヒトドナーHSCを支えるために必要な種特異的因子を提供するヒト成長
因子導入遺伝子を含んでいる。宿主系列はその免疫不全性の性質により、および
それらがHLA分子のトランスジェニック発現を含んでいるかどうかで変化する
。
ウスから成っている。実施例1に示したように、同種異系RAGキメラはドナー
拘束免疫応答を支える能力を示す。それ故、CTG RAGマウスは、臍帯血か
らのヒトHSCで植え付けられ、抗原特異的TおよびB細胞応答を提供すること
で機能するヒトTおよびBリンパ球を発生する。新生児または成体マウス両方の
植え付けは、造血誘導抗原提示細胞の宿主およびドナーの両方が存在する混合骨
髄キメラを導く。混合キメラ化の主たる生物学的効果は、ドナーおよび宿主起源
のAPCにより仲介される、“宿主”−反応性T細胞の陰性選択である。このこ
とはドナーおよび宿主MHCハプロタイプの両方に陰性であるT細胞の発生を導
くが、MLRにおいて同種異系または異種抗原の両方と反応する可能性がある。
胸腺と独立して発生したT細胞もまたCTG宿主により支持される。これらには
主として小腸および大腸の腸管上皮リンパ球、および他の腸関連リンパ球組織(
GALT)が含まれる。
主発生経路には胸腺上皮細胞上に発現されたMHC分子環境での陽性選択が含ま
れる。第二の型のキメラはそれ故、内因的にMHC分子を発現する宿主組織中で
ヒトHLA遺伝子をまた発現するヒトCTG RAGマウスから成っている。こ
のことは、ドナーヒトHSCがRAG変異体宿主中で発生する追加の経路を提供
し、導入遺伝子のHLAハプロタイプに拘束されているいくつかのT細胞を生じ
る。成熟T細胞が続いて同起源のT細胞レセプター:HLA相互作用を通してド
ナー由来Bリンパ球と相互作用するように、ドナーHSCのHLAハプロタイプ
とトランスジェニックHLA分子のハプロタイプが一致するのが好ましい。
免疫不全であり、ドナーHSC源として同一のハプロタイプのヒトHLA導入遺
伝子を発現するマウスで製造される。例えば、ヒトGFTG SCIDマウスは
DR3クラスIIトランスジェニックマウスと交配され、HLA DR3ハプロ
タイプHSCを植え付けるために使用される。ヒトTリンパ球のいくつかはHL
A DR3クラスII分子環境下で陽性に選択され、DR3ドナーBリンパ球と
相互作用できて抗原特異的抗体を産生する。
導入遺伝子を発現する免疫適格ヒトCTGマウスにおいて製造される。ヒトHS
Cを植え付けるため、これらの宿主はその内因性免疫系を枯渇させなければなら
ない(例えば、致死線量の照射または他の方法で)。リンパ球発生のパターンは
上記第三の型のキメラと類似している。
MHCには陰性であるが、第三者同種異系抗原へは応答性であることを示してい
る。CD4+T細胞は、クラスII+およびCD8+細胞の細胞毒性除去により、
同遺伝子型移植RAGマウス(RAG−(syn),A);同種異系移植RAG
マウス(RAG−(allo),B);同遺伝子型移植SCIDマウス(SCI
D−(syn),C);同種異系移植SCIDマウス(SCID−(allo)
,D);およびRAGマウス,E)パネルDに示されたSCID−(allo)
マウス中に置かれたものと同一の骨髄調製物を移植、骨髄接種の陽性対照として
、のリンパ節から単離された。 CD4+T細胞は、Balb/C(ダイヤ型);C57Bl/6(四角);C
BA(丸、パネルAおよびB)または(C57Bl/6xCBA)F1マウス(
丸、パネルC、DおよびE)からの照射されたLPS誘導脾臓芽細胞と共培養さ
れた。増殖は日(d)=5に比色法で評価され(Celltiter;Prom
ega)、y軸にOD490x1000として報告されている。バックグラウンド
吸収は差し引かれている。
を示している。図2Aにおいて、対照Balb/cマウス(白三角)、RAG−
(allo)(黒四角;マウス#30)、RAG−(syn)マウス(白四角;
マウスRN0003)およびSCID−(allo)マウス(黒丸;二匹SN0
05およびSN006が示されている)、は後肢足蹠に、完全フロイントアジュ
バント(CFA)に乳化した総量で50μgのニワトリ卵白色リゾチーム(HE
L)で免疫した。2週間後、動物は同量のHELを含む不完全フロイントアジュ
バント(IFA)を用いi.p.で追加免疫した。追加免疫1週間後、動物から
血液を採り、血清でのHEL−特異的IgGの存在をELISAにより試験した
。y軸はOD490x1000を表している。図2Bにおいて、RAG−(syn
)マウス(縞のある棒線;マウス#61および62)およびRAG−(allo
)マウス(小さなはん点のついた棒線;マウス#46および51)はd=0にC
FAに乳化した総計で50μgのKLHを用いて後肢足蹠に免疫した。動物は2
週間後皮下にIFA中のKLHで追加免疫した。血清試料はd=0、14および
21日に採取し、KLH特異的IgGをELISAにより試験した。グラフ上の
無地の棒線は個々の対照マウスを表している:(C57B1/6xl29)F1
マウスは白い棒線により表され、Balb/cマウスは灰色の棒線により表され
ている。y軸は血清の1:1000希釈のOD415-490x1000を表している
。x軸は初回免疫化後の日数を表している。特異性はHEL被覆プレート上での
ELISAにより試験された;交差反応性は観察されなかった。
−(allo)キメラにおいては、ドナーおよび宿主MHCの両方で拘束されて
いることを表している。RAG−(allo)マウス#135(A)および13
6(B)はCFA中のKLHを用いて後肢足蹠に免疫された。10日後、ドレイ
ニングリンパ節を取り出し、細胞毒性除去によりB細胞およびマクロファージを
枯渇させた。得られたリンパ節T(LNT)細胞はBalb/cおよびC57B
l/6マウスからのマイトマイシンC固定、抗原パルス処理LPS−芽細胞と2
:1の比で3日間共培養した。増殖性応答は比色アッセイ(CellTiter
;Promega)を使用して定量された。バックグラウンド応答は差し引かれ
ている。免疫化Balb/cマウスからのLNTは抗原パルス処理Balb/c
芽細胞へ応答してOD490x1000=547を与えた。
Claims (27)
- 【請求項1】 レシピエント哺乳類であって 免疫系を維持することができる外因性サイトカイン;および 造血幹細胞特性を持つドナー特異的細胞に由来する細胞を含んでいる哺乳類;
ここでレシピエント哺乳類はドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることが
できる。 - 【請求項2】 該哺乳類がマウスである、請求項1に記載の哺乳類。
- 【請求項3】 該サイトカインが該造血幹細胞特性を持つドナー特異的細胞
に由来する細胞と同一の種からのものである、請求項1に記載の哺乳類。 - 【請求項4】 該サイトカインがIL−3、IL−6、IL−7、M−CS
F、GM−CSF、SCF、LIF、およびオンコスタチン−Mから成る群より
選択される、請求項1に記載の哺乳類。 - 【請求項5】 該サイトカインがIL−3、IL−6、IL−7、M−CS
F、GM−CSF、SCFから成る、請求項4に記載の哺乳類。 - 【請求項6】 該サイトカインが該哺乳類にトランスジェニック的に導入さ
れる、請求項1に記載の哺乳類。 - 【請求項7】 造血幹細胞特性を持つ細胞に由来する該細胞が哺乳類には異
種である、請求項1に記載の哺乳類。 - 【請求項8】 該細胞がヒト細胞である、請求項7に記載の哺乳類。
- 【請求項9】 該細胞が造血幹細胞である、請求項1に記載の哺乳類。
- 【請求項10】 該造血幹細胞が臍帯血に由来する、請求項9に記載の哺乳
類。 - 【請求項11】 該細胞が胚性幹細胞である、請求項1に記載の哺乳類。
- 【請求項12】 造血幹細胞特性を持つ細胞に由来する細胞が分化されてい
る、請求項1に記載の哺乳類。 - 【請求項13】 分化した細胞が骨髄系系列のものである、請求項12に記
載の哺乳類。 - 【請求項14】 分化した細胞がリンパ球系系列のものである、請求項12
に記載の哺乳類。 - 【請求項15】 分化した細胞が赤血球系系列のものである、請求項12に
記載の哺乳類。 - 【請求項16】 ドナー免疫系を持つ哺乳類を作製する方法であって、以下
の工程を含んでいる: VDJ組換えが欠損している哺乳類に導入遺伝子を導入し、ここで該導入遺伝
子はドナー由来造血細胞の維持および成熟に必要なサイトカインをコードしてい
る; 該哺乳類に造血幹細胞特性を持つ細胞を導入する。 - 【請求項17】 該ドナー免疫系が異種免疫系である、請求項16に記載の
方法。 - 【請求項18】 該ドナー免疫系がヒト免疫系である、請求項17に記載の
方法。 - 【請求項19】 導入遺伝子を導入する工程が前核移植を通したものである
、請求項16に記載の方法。 - 【請求項20】 導入遺伝子が胚性幹細胞にある、請求項16に記載の方法
。 - 【請求項21】 導入遺伝子を導入する工程が該哺乳類と導入遺伝子を含む
哺乳類との繁殖を通したものである、請求項16に記載の方法。 - 【請求項22】 哺乳類がRAG−1またはRAG−2マウスである、請求
項16に記載の方法。 - 【請求項23】 該サイトカインがIL−3、IL−6、IL−7、M−C
SF、GM−CSF、SCF、LIF、およびオンコスタチン−Mから成る群よ
り選択される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項24】 該サイトカインがIL−3、IL−6、IL−7、M−C
SF、GM−CSF、SCFから成る、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 該ドナー由来造血細胞がヒトからのものである、請求項1
6に記載の方法。 - 【請求項26】 該哺乳類がさらにMHC導入遺伝子を含む、請求項1に記
載の哺乳類。 - 【請求項27】 該MHC導入遺伝子がヒトHLA導入遺伝子である、請求
項26に記載の哺乳類。
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