JP2003508038A - ドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることができるトランスジェニック哺乳類 - Google Patents

ドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることができるトランスジェニック哺乳類

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ハーディング，フィオナ・エイ
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Abstract

(57)【要約】 本発明はヒト疾患のトランスジェニック非ヒト哺乳類モデル、そのようなモデルの作製方法ならびに治療的および予防的処置の有効度を評価するために、化合物の抗原的可能性および他の使用を評価するためにそのようなモデルを使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 多くのヒト疾患は、大部分が症状発現前の研究に適切なモデル系が欠けている
ことにより、不治のまま残されている。多くの病気がヒト病原体または機能異常
ヒト組織に特有であるので、人体外でそのような原因の過程をモデル化するのは
困難である。例えば、アレルギー反応の根拠は、宿主の遺伝的特質に深く根付い
ているので、異なった種において完全に研究をすることはできない。ＨＩＶのよ
うな感染性疾患には種特異的毒性因子がある。および、遺伝子要因の組み合わせ
により生じる癌細胞は、免疫不全動物に移植された場合、通常改変された特性を
示している。
【０００２】 不幸なことに、ヒト疾患の病理学を直接的に研究する方法はほとんどない。こ
れは順に新薬および新規療法の開発を制限している。ヒトおよび高度な霊長類両
方において、実験の実践的なおよび倫理的な制限があるとすれば、ヒト疾患の代
替モデルを開発する切迫した必要性が存在する。
【０００３】 疾患原因因子および免疫系間の相互作用が予期されるヒト疾患のモデルでは、
造血幹細胞または成熟循環リンパ球が免疫不全マウスの天然に存在する株に導入
される。ある点では以前のものよりも良好ではあるが、これらのモデルは疾患過
程を解くために決定的であるヒト細胞の機能的特性の多くを再現することを失敗
している。より基礎的レベルにおいて、同一種の個体間で造血幹細胞を移植する
試みでさえも、機能的にそこなわれた同種異系キメラを生成している。この理由
は明らかではないが、ドナー幹細胞が新しい宿主の成熟リンパ球に適切に分化で
きないことが関与している。
【０００４】 これらの問題を克服する試みにおいて、研究者は移植前にマウスに、外来的に
またはトランスジェニック的に、ＩＬ−７を与えた。しかしながら、この方法は
予期されないさらなる免疫学的機能不全を導いた。例えば、Ｋａｐｐ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２：２０２４（１９９８）（外因性ＩＬ−７はＢ細胞発育
の減少を導いた）；Ｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：３
０５（１９９３）（イムノグロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー調節
下のトランスジェニックＩＬ−７は皮膚リンパ球浸潤およびＴおよびＢ細胞リン
パ腫を導いた）；Ｖａｌｅｎｚｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ ．２４：１５２１（１９９６）（ＭＨＣクラスＩＩプロモーター下のＩＬ−７は
Ｂリンパ球腫瘍を誘導した）；Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｅｘｐ． Ｍｅｄ ．１８７：３８９（１９９８）（ＩＬ−７トランスジェニックマウスは慢
性大腸炎を発生した）；Ｕｅｈｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅ ｒｍａｔｏｌ ．１１０：７４０（１９９８）（ＩＬ−７トランスジェニックマウ
スは皮膚炎を発生した）；およびＭｅｒｔｓｃｈｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．２６：２８（１９９６）（ＩＬ−７トランスジェニック
マウスはリンパ滲出性疾患を発生した）を参照されたい。
【０００５】 従って、ヒト造血細胞の機能的特性を維持する標準トランスジェニック動物モ
デル系に対する要求が存続している。本発明はこのおよび他の要求を満たしてい
る。発明の要約 本発明は、免疫系を維持することができる内因性サイトカイン；造血幹細胞特
性（ＨＳＣ）を持つドナー特異的細胞に由来する細胞を含んでいるレシピエント
哺乳類を提供し；ここで、レシピエント哺乳類はドナー特異的機能性免疫を容易
に産生できる。好適な態様において、哺乳類はマウスである。
【０００６】 本態様の一つの側面において、細胞が造血幹細胞特性を持つドナー特異的細胞
から誘導されるので、サイトカインは同一種からのものである。サイトカインは
インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、イン
ターロイキン−７（ＩＬ−７）、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ
Ｆ）、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白
血病阻害因子（ＬＩＦ）およびオンコスタチンＭ（ＯＭ）から成る群より選択さ
れる。本態様の好適な側面において、サイトカインはＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ
−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦを含んでいる。本態様の別な好適
な側面において、サイトカインは哺乳類にトランスジェニック的に導入される。
【０００７】 本態様の別な好適な側面において、造血幹細胞特性を持つ細胞から誘導される
細胞は哺乳類には異種である。特に好適な側面において、細胞はヒト細胞である
。より好適な側面において、細胞は造血幹細胞である。最も好適な側面において
、造血幹細胞は臍帯血に由来する。しかしながら、代わりの側面において、細胞
は骨髄、動員末梢血、胚幹細胞または他のＨＳＣ源に由来している。別の代わり
の側面において、造血幹細胞特性を持つ細胞は分化している。特に、分化細胞は
リンパ球系、骨髄系または赤血球系の系列である。
【０００８】 本発明の別の態様において、ドナー免疫系を持つ哺乳類を作製する方法が提供
される。この方法は、免疫不全哺乳類に導入遺伝子を導入する（ここで導入遺伝
子はドナー由来造血細胞の維持および成熟に必要なサイトカインをコードしてい
る）；および哺乳類内へ造血幹細胞特性を持つ細胞導入する工程から成っている
。
【０００９】 この態様の一つの側面において、ドナー免疫系は異種免疫系である。本態様の
特に好適な側面において、ドナー免疫系はヒト免疫系である。 この態様の一つの側面において、導入遺伝子の導入は胚幹細胞のトランスフェ
クションにより行われる。この態様の第二の側面において、導入遺伝子の導入は
前核移植により行われる。この態様の代わりの側面において、導入遺伝子の導入
は哺乳類と導入遺伝子を含む哺乳類の繁殖により行われる。
【００１０】 この態様の好適な側面において、哺乳類はＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２変異体
マウスである。本発明の別の側面において、哺乳類はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）
クラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺伝子を発現しているＲＡＧ−１またはＲＡ
Ｇ−２変異体マウスである。本発明のさらなる側面において、哺乳類はＨＬＡク
ラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺伝子を発現しているＳＣＩＤマウスである。
本発明のさらに別の側面において、哺乳類はＨＬＡクラスＩおよび／またはクラ
スＩＩ遺伝子を発現している免疫適格マウスであり、および、例えば、照射条件
付けにより免疫不全にされている。
【００１１】 本発明の別の側面において、ドナー由来造血細胞は異種哺乳類からのものであ
る。しかしながら、特に好適な側面において、ドナー由来造血細胞はヒトからの
ものである。
【００１２】 本発明のさらに別の態様において、抗原に対する免疫応答を決定する方法が提
供される。トランスジェニックキメラ哺乳類は、蛋白質、ペプチド、細胞または
抗原の他の発生源で免疫され、ドナー細胞由来免疫応答に含まれるエピトープが
決定される。これらには抗原特異的イムノグロブリン産生、Ｔヘルパー応答、Ｔ
細胞障害性応答、細胞増殖応答、先天性同種異系または異種応答およびナチュラ
ルキラー細胞活性が含まれるが、これらに制限されるわけではない。発明の詳細な説明 序 胸腺皮質上皮細胞がＴ細胞分化の間に起こる主要な陽性選択を実行することが
、種々のモデル系を使用してよく確立されている。（Ｐａｕｌ編，ＦＵＮＤＡＭ
ＥＮＴＡＬ ＩＭＭＮＯＬＯＧＹ 第４版（１９９９），Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ−
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）。最近、陽性選択に関与している細胞型をさらに決定
する試みにおいて、骨髄（ＢＭ）由来細胞により選択されるべきＣＤ４+および
ＣＤ８+単一陽性細胞の二叉分岐が明らかにされた。ＭＨＣクラスＩ欠損環境で
構築されたキメラ動物を使用して、ＣＤ８+Ｔ細胞が造血細胞により陽性選択で
きることが決定的に示された。（Ｂｉｘ ＆ Ｒａｕｌｅｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３
５９：３３０−３３３（１９９２））。しかしながら、照射ＭＨＣクラスＩ欠損
マウスを用いる同様のモデル系を使用してＣＤ４+Ｔ細胞に対する反対の結果が
示されている（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ ．９０（７）：２７７９−８３（１ ９９３））。これらの結果
は、選択がＣＤ８+Ｔ細胞よりもＣＤ４+に対してより厳重に制御されていること
を示唆している。
【００１３】 本発明者は、誕生後直接かまたは成体において発生させた完全同種キメラ動物
、非照射抗原レセプター組換え欠除、例えば、組換え活性化遺伝子−２（ＲＡＧ
−２）マウスは、ドナーＭＨＣ拘束抗原特異的応答を示すＣＤ４+Ｔ細胞を末梢
血に持っていることを発見した。これらの結果はＳＣＩＤキメラとして構築され
た新生児または成体のどちらにも観察されていない。このことは、造血細胞は胸
腺内でＣＤ４+Ｔ細胞を陽性選択でき、および正常個体発生により密接に似てい
るＴ細胞分化を支援する独特のモデル系としての、哺乳類の抗原レセプター組換
え欠除株を提供することを示唆している。造血細胞によるＣＤ４+Ｔ細胞の陽性
選択は、不完全免疫適格マウスの使用により、および／または照射の二次的効果
により他の系では通常的には検出されていないようである。
【００１４】 本発明者はさらに、異種造血幹細胞の増殖および分化に必要とされる異種導入
遺伝子が宿主哺乳類内へ取り込まれる方法を発見した。取り込み後、異種造血幹
細胞（ＨＳＣ）が植え付けられたサイトカイントランスジェニック（ＣＴＧ）哺
乳類は、ドナー限定抗原特異的応答が可能な機能的免疫応答を発生する。これら
の改変は、宿主のＭＨＣ発現組織上で発現されたＭＨＣ分子環境における、ドナ
ーリンパ球発生のための経路を提供する。ＩＩ．定義 特に定義しない限り、本明細書で使用されたすべての技術および科学用語は、
本発明が属する分野の当業者により共通に理解されているものと同じ意味を持っ
ている。すべての参照文献はすべての目的のために本明細書に取り込まれる。本
明細書で説明されたものと類似のまたは同等な方法および材料が本発明の実施に
または試験に使用できるが、好適な方法および材料が記載されている。本発明の
目的のため、以下の用語が次に定義される。
【００１５】 句“主要組織適合複合体”（ＭＨＣ）とは免疫系の細胞間の相互作用を制御す
る細胞表面糖蛋白質をコードしている免疫応答遺伝子を指している。本遺伝子は
、移植片拒否に関与している結果として発見された。ＭＨＣ遺伝子には二つの主
なクラス、クラスＩおよびクラスＩＩが存在する。句“ヒト白血球抗原”とはヒ
トのＭＨＣ複合体を指している。句“ＭＨＣ拘束”とは、ＭＨＣ分子の特定の対
立形状況におけるＴ細胞によるペプチドの認識を指している。ヒトならびにマウ
スにおけるＭＨＣ複合体のより完全な説明は、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭ
ＵＮＯＬＯＧＹ，第４版，Ｐａｕｌ（編）１９９９、を参照されたい。
【００１６】 哺乳類に対して“同種異系”である細胞とは、哺乳類と同一種の個体からの細
胞であるが、細胞ドナーおよび宿主哺乳類間で主および副組織適合分子の発現が
相違しているため、宿主哺乳類には非自己として認識される。
【００１７】 宿主哺乳類に対して“異種”である細胞とは、哺乳類とは異なった種の個体か
らの細胞である。著しい遺伝子相違のためそれらは宿主哺乳類には非自己として
認識される。
【００１８】 句“骨髄”とは脊椎、胸骨、助骨、鎖骨、肩甲骨、骨盤および頭骨の骨の赤色
髄を指している。この髄は造血幹細胞を含んでいる。句“臍帯血”とは新生児の
臍帯から得られた全血を指している。この血液もまた造血幹細胞を含んでいる。
句“動員末梢血”とは循環系における造血幹細胞の比率を増加させる目的で、組
換え成長因子、例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および幹細
胞因子（ＳＣＦ）で処理された個体から単離された末梢血を意味している。
【００１９】 用語“サイトカイン”とは、サイトカインと通常称される蛋白質、ならびに成
長因子、インターロイキン、免疫系モジュレーターおよび免疫系を維持するため
に必要とされる他の型の蛋白質のような別の蛋白質を指している。例えば、サイ
トカインはインターロイキン、幹細胞因子、コロニー刺激因子および当業者には
既知である他の因子を包含している。“外因性サイトカイン”とはレシピエント
哺乳類には天然には存在しないサイトカインを指している。これらのサイトカイ
ンはレシピエント哺乳類において、天然に存在するサイトカインの種同族体また
は天然に存在する同族体を持っていないサイトカインであろう。
【００２０】 用語“免疫不全”とは哺乳類における抗原特異的免疫性の欠如を指している。
これらの哺乳類において、ＢおよびＴリンパ球が適切に成熟されず、抗原を認識
できず、応答できない。
【００２１】 句“組換え活性化遺伝子”（ＲＡＧ）とはＢおよびＴ細胞抗原レセプターの開
始および再配置に関与するＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２遺伝子を指している。Ｖ
、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの遺伝子組換えがＢおよびＴ細胞レセ
プターの産生に必要である。ＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２遺伝子における突然変
異はこの過程の初期工程を妨げ、骨髄におけるＢ細胞発生および胸腺における胸
腺細胞発生の封鎖を生じる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６
８：８６９−７７（１９９２）；Ｓｈｉｎｋａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６
８：８５５−８６７（１９９２））。
【００２２】 句“造血幹細胞特性を持つドナー特異的細胞”とは造血幹細胞特性を示すドナ
ー種からの細胞を指している。最も明白な候補は造血幹細胞である。しかしなが
ら、胚幹細胞のようなＨＳＣへ分化する細胞を含む（しかし限定するわけではな
い）他の細胞も想像される。
【００２３】 句“ドナー免疫系”とは、宿主哺乳類においては天然には観察されない完全ま
たは部分免疫機能を指している。例えば、本発明のレシピエント哺乳類において
、機能性免疫系ならびにドナー特異的免疫細胞の維持に必要なサイトカインが免
疫不全哺乳類内に、サイトカインをコードしている導入遺伝子の導入により、ま
たはあまり好適ではないが、動物へのサイトカインの投与により導入される。ド
ナー細胞は、レシピエント哺乳類の免疫系源である（および典型的には、必然で
はないが、サイトカイン）。
【００２４】 ドナー免疫系は完全に機能的である、即ち、天然に観察される哺乳類免疫系に
おけるすべての機能を示す必要はない。しかしながら、ドナー免疫系は少なくと
もドナーＴおよびＢリンパ球、およびマクロファージおよび樹状細胞のような抗
原提示細胞を含んでいることが好適である。
【００２５】 句“胚幹細胞”とは培養で連続的に増殖し、および造血細胞含む（しかし限定
するわけではない）すべての細胞系列へ分化する能力を保持している細胞を指し
ている。用語“分化する”または“分化した”とは、より特化した細胞型になる
過程を指している。例えば、造血幹細胞は“リンパ球系”、“赤血球系”または
“骨髄系”系列の細胞へ分化する。リンパ球系細胞は免疫応答の特異性を仲介す
る細胞である。それらは二つの主な群、ＴおよびＢリンパ球へ分割され、および
小集団の大型顆粒リンパ球またはナチュラルキラー細胞を含んでいる。赤血球系
細胞は赤芽球および赤血球である。骨髄系系列の細胞には血小板、好中球、好塩
基球、抗酸球および単球が含まれる。
【００２６】 句“ドナー特異的機能性免疫の容易な産生”とは機能性ドナー由来免疫系を発
生および維持するレシピエント哺乳類の能力を指している。典型的には、造血細
胞が機能的である、例えば、抗原へ結合し、異物または自己として抗原を認識し
、他の細胞（例えば、単球およびマクロファージ）が活性化されまたはサイトカ
イン（本明細書で定義したような）が放出されるように免疫系の他の細胞と通じ
合う、ことを可能にするため、ドナーへ特異的である造血細胞ならびにサイトカ
インおよび他の補助的化合物（必須であり、または望ましくもある）を免疫系は
含んでいる。
【００２７】 本発明の目的での、用語“ヒト細胞”とはヒトに由来する細胞である。誘導化
は直接的、例えば、ヒトから得られた初代培養物、または間接的、例えば、ヒト
から得られた初代培養に由来する培養株、であろう。
【００２８】 本発明の目的での、用語“導入”または“導入する”とは本発明のレシピエン
ト哺乳類への外因性化合物、特にサイトカイン遺伝子の付加を指している。化合
物は本発明のレシピエント哺乳類へ、化合物をコードする遺伝子の導入を含む（
しかし限定するものではない）種々の方法で導入できる。化合物をコードする遺
伝子の導入は非胎児哺乳類内への遺伝子導入を通して、または哺乳類の生殖細胞
または胚内へのトランスジェニック的に行われる。化合物をコードしている遺伝
子の直接導入に加え、繁殖またはクローニングを通してレシピエント哺乳類内へ
遺伝子物質を導入できる、例えば、トランスジェニック親からの子孫の生殖細胞
内への化合物をコードしている遺伝子の導入。
【００２９】 句“免疫系を維持する”とはレシピエント哺乳類におけるドナー由来免疫系を
支える外因性サイトカインの能力を指しており、それがなければそのような免疫
系は支えられないであろう。典型的には、しかしながら必然的ではない、外因性
サイトカインはドナーと同一の種で天然に観察される。従って、免疫系を維持す
るためにドナーで天然に観察される、ドナー由来免疫系の細胞とサイトカイン間
の相互作用がレシピエント哺乳類に供給される。
【００３０】 句“ドナー由来造血細胞の維持および成熟”とは、造血幹細胞および他の未成
熟細胞型が機能性細胞（例えば、免疫系の）へ成熟するのを可能にするサイトカ
インを提供し、および細胞が一度成熟したら、機能するように生き残るのに必要
なサイトカインを提供することを指している。免疫系の細胞に加え、造血細胞の
他の型、例えば、赤血球、血小板、他のリンパ系組織（例えば、パイエルパッチ
、上皮内リンパ球を含んでいる絨毛、および粘膜固有層を通して散らばっている
リンパ球、および上皮表面下方の結合組織から成る腸関連免疫系）の維持および
成熟も含まれる。
【００３１】 用語“哺乳類を作製する”または“哺乳類を産生する”とは、哺乳類が操作後
にドナー免疫系を含むように、哺乳類の身体的特性を操作することを指している
。本発明の目的では、ヒト哺乳類は作製または産生できない。身体的特性を操作
はトランスジェニック技術、遺伝子導入、または哺乳類の遺伝子型の他の操作で
あるが、操作は哺乳類の身体的特性に影響する細胞、蛋白質または他の化合物の
導入によってもよい。
【００３２】 “哺乳類”は哺乳綱の温血脊椎動物である。本発明の目的には、“レシピエン
ト哺乳類”は、外因性導入遺伝子および造血幹細胞特性を持つドナー細胞の存在
のため、ドナー特異的免疫系の産生を容易にできる哺乳類である。本発明の目的
には、レシピエント哺乳類はヒトではない。
【００３３】 “マウス”とはハツカネズミ種の哺乳類を指している。本発明に包含されるマ
ウスはすべてのマウスを含んでいるが、特別には、ＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２
株の、またはそれに由来するマウスが含まれる。本発明のマウスは重度の免疫不
全性のため、それらは天然には観察されそうもない。典型的には、本発明のマウ
スはＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２またはＳＣＩＤマウスのような実験室株のマウスで
ある。
【００３４】 用語“トランスジェニック的”とは、外因性遺伝子物質または導入遺伝子の生
殖細胞または胚のゲノム内への導入を指している。好適には、遺伝子物質は蛋白
質をコードしており、導入は胎児哺乳類内へ行われる。“導入遺伝子”とは、蛋
白質コード領域および調節要素（例えば、プロモーターおよび終止配列、もし望
むなら）を含む核酸を指している。導入遺伝子はコード配列の単一コピーまたは
コード配列の多重コピーを含むことができる。もし多重コピーが存在するとした
ら、コード領域は部分コード領域であることがある。コード領域は調節要素によ
り分離されることができ、５’から３’へ、または５’から５’または ３’か
ら３’への配向で配置することができる。多重導入遺伝子（独立したコードおよ
び調節配列）は、最も好適には、同一領域に近接した様式で、またはレシピエン
ト哺乳類のゲノム中で他の場所へ分散して存在してもよい。
【００３５】 宿主哺乳類に対して“異種”である細胞は、宿主哺乳類とは異なった種からの
ものである。宿主哺乳類は正常では、異種細胞を非自己として認識する。 ＩＩ．本発明の哺乳類の産生 好適な態様において、本発明のレシピエント哺乳類は免疫不全である。免疫不
全哺乳類を産生するため、哺乳類の天然に存在する免疫系は不活性化されなけれ
ばならない。不活性化は多数の免疫系関連活性を除去または破壊することにより
、またはただ一つの活性を除去または破壊することにより行うことができる。免
疫機能は多くの異なった機構（例えば、自発的突然変異、照射およびアンチセン
ス技術）で破壊できるが、好適な態様において、免疫機能は免疫系の成熟および
維持に必要な一つまたはそれ以上の遺伝子機能を、例えば、相同的組換えまたは
自発的突然変異によりノックアウトすることにより破壊される。ノックアウト哺乳類の発生 相同的組換えが、遺伝子置換、遺伝子の不活性化または改変に使用される。多
くの報告が哺乳類細胞における相同的組換えの使用を記載している。例えば、Ｔ
ｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７）；Ｎ
ａｎｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒａｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：３８４５（１９８８）；およびＭａｕｓｏｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３３６：３４８（１９８８）；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２７４：２０４５０（１９９９）；Ｈａｕｓｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８１２０（
１９９９）；Ｈａｂｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：２７
１（１９９９）；およびＢｏｎａｖｅｎｔｕｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈ ａｒｍａｃｏｌ ．５６：５４（１９９９）を参照されたい。
【００３６】 さらに、胚幹細胞に特異的遺伝子突然変異を作り出すため、およびこれらの突
然変異を生殖細胞に導入するために相同的組換えを使用する種々の様相が説明さ
れている（Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１
９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５６：３１６（１９８
９）；Ａｎｔｏｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１２：２５５
９（１９９９）；Ｍｏｌｏｔｋｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．
１３２：１８７（１９９８）；Ｂｌｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ．４３８：２４５（１９９９）；Ｓｔｒｕｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ ｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ ．２６７：１３７（１９９９）；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ
，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０４５０（１９９９）；
Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１
０：１９１（１９９９）；およびＭｏｍｂａｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ
６８：８６９−７７（１９９２）；およびＳｈｉｎｋａｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌ ｌ ６８：８５５−８６７（１９９２））。
【００３７】 従って、リンパ球の成熟に必要な必須内因性遺伝子を欠く本発明のレシピエン
ト哺乳類は、相同的組換えを使用して作製でき、標的化された遺伝子置換が達成
される。この技術において、問題とする特定のＤＮＡ配列は改変ＤＮＡにより置
換される。好適な態様において、所望の哺乳類種からの胚性幹（ＥＳ）細胞のゲ
ノムが改変される（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８（１
９８９），米国特許第５，４８７，９９２号）。
【００３８】 前に述べたように、相同的組換えにより置換されるべき遺伝子はリンパ球発生
の初期に活性化されるものである。特定の理論に縛られるわけではないが、所望
の遺伝子は、胸腺細胞がＣＤ４-およびＣＤ８-状態（二重陰性）またはＣＤ４４ low およびＣＤ２５+状態の間に活性化され、Ｂリンパ球はＢ２２０dull／ＣＤ４
３+状態にあると信じられている。これらの状態でＴおよびＢ細胞レセプター再
配置が生じるので、ＶＤＪ組換を調節する蛋白質をコードしている遺伝子が置換
の標的であろうと信じられる。これらの遺伝子の例はＲＡＧ−１およびＲＡＧ−
２遺伝子、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）およびイムノグロブリン（Ｉｇ）遺伝子
、ＣＤ３遺伝子、前Ｔ細胞レセプター、およびＳＣＩＤ遺伝子である。リンパ球
前駆体の生存および分化を調節する遺伝子の追加の型もまた潜在的標的である、
例えば、イカルス転写因子、共通ガンマ鎖サブユニット、ＩＬ−７およびとりわ
けＩＬ−７レセプター。
【００３９】 初期胸腺発育を調節する特定の蛋白質をコードしている遺伝子のコピーの一つ
または両方を不活性化するために用いられる方法は同様であろうし、主として配
列の選択、使用される選択可能マーカー、調節される蛋白質の不在を同定するた
めに使用される方法が異なっているが、特定の蛋白質発現の不在を確認するため
には類似の方法が使用される。方法が類似しているので、マウスにおけるＲＡＧ
−２遺伝子の不活性化は実施例のように使用されるであろう。米国特許第５，８
５９，３０７号、その全体が本明細書に取り込まれている、を参照されたい。
【００４０】 構築物の標的化のための相同的配列は一つまたはそれ以上の欠失、挿入、置換
またはこれらの組み合わせを持つことができる。例えば、ＲＡＧ−２遺伝子は一
つの部位に欠失および／または別の部位での挿入を含むことができる。挿入され
た陽性マーカー遺伝子の存在は欠陥のある不活性蛋白質産物挿入、ならびに選択
のために使用できる遺伝子を生じる。好適には、欠失が用いられる。特に興味が
持たれる挿入遺伝子は、Ｇ４１８耐性を含むネオマイシン耐性のような抗生物質
耐性のようなマーカーを提供するものである。
【００４１】 欠失は少なくとも約５０塩基対でなければならず、より普通には少なくとも約
１００塩基対、および一般的には約２０，０００塩基対を超えないものであり、
ここで欠失は通常一つまたはそれ以上のエキソン、一つまたはそれ以上のイント
ロンを含んでいるコード領域の一部を含み、非コード領域、特に５’非コード領
域（転写調節領域）の一部は含んでいてもまたはいなくてもよい。従って、相同
性領域はコード領域を超えて５’非コード領域または代わりに３’非コード領域
内へ拡がっていてもよい。挿入は一般的に１０，０００塩基対を超えてはならず
、通常５，０００塩基対を超えず、一般的に少なくとも５０塩基対、より普通に
は少なくとも２００塩基対である。
【００４２】 相同的配列は、標的配列の少なくとも約１００塩基対を含んでいなければなら
ず、好適には少なくとも約１５０塩基対、より好適には少なくとも約３００塩基
対であり、および一般的には２０，０００塩基対を超えず、通常１０，０００塩
基対を超えず、および好適には総数で約５，０００塩基対未満であり、および二
重交差組換えを提供するため、挿入および／または欠失の反対側の少なくとも約
５０塩基対を持っている。
【００４３】 所望のＤＮＡから上流および／または下流は二重交差が起こったかどうかを同
定するために提供される遺伝子である。この目的には、機能性ＨＳＶ−ｔｋ遺伝
子を含む細胞に対する細胞毒性効果で、チミジンキナーゼ遺伝子の存在がアシク
ロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体の使用により検出でき
るので、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を用いることができる。
これらのヌクレオシドに感受性がないことは、チミジンキナーゼ遺伝子の不在、
従って、相同性組換えが起こった場合、二重交差もまた起こったことを示してい
る。
【００４４】 問題とするＲＡＧ−２遺伝子内へ挿入されたマーカー遺伝子の存在は、宿主ゲ
ノム内への標的化構築物の組み込みを立証する。しかしながら、相同性または非
相同性組換えが起こったかどうかを確立するために、ＤＮＡ分析が必要とされる
であろう。これは挿入物に隣接する５’および３’領域へハイブリダイズする標
的ＤＮＡのためのプローブを用いることにより決定できる。標的化遺伝子中の挿
入物の存在、欠失または置換は、野生型対立遺伝子と標的化対立遺伝子のサイズ
を区別する制限エンドヌクレアーゼを使用して決定できる。
【００４５】 ポリメラーゼ連鎖反応もまた相同的組換えの存在の検出に使用できる（Ｋｉｍ
＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６：８８８７
−８９０３（１９８８）；およびＪｏｙｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３３８：１５３−１５６（１９８９））。構築物内の配列と相補的である、およ
び構築物の外側の配列および標的座位と相補的であるプライマーが使用できる。
この方法では、もし相同的組換えが起こっていたら、相補的鎖中に存在する両方
のプライマーを持っているＤＮＡ二重鎖のみを得ることができる。プライマー配
列の存在または予期されるサイズ配列を示すことにより、相同的組換えの発生が
支持される。
【００４６】 構築物はさらに、哺乳類宿主細胞で機能的である複製起点を含むことができる
。たいてい、これらの複製系はシミアンウイルス４０、エプスタインバールウイ
ルス、パピローマウイルス、アデノウイルスなどのようなウイルス複製系を含ん
でいるであろう。
【００４７】 挿入物および／または隣接遺伝子としてマーカー遺伝子が含まれている場合、
遺伝子の性質に依存して、野生型転写調節領域（特に転写開始調節領域または異
なった転写開始領域）を持つことができる。遺伝子が宿主からでも、哺乳類宿主
細胞の転写機構により転写開始領域が認識されない場合、異なった転写開始領域
が必要とされるであろう。この領域は構成的でもまたは誘導可能でもよいが、好
適には誘導可能なものである。多くの種類の転写開始領域が単離されており、異
なった遺伝子で使用されている。プロモーターとして特に興味を引かれるのは、
哺乳類宿主からのメタロチオネイン−ＩおよびＩＩ、チミジン キナーゼ、ベー
タ−アクチン、イムノグロブリン プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス
プロモーター、ホスホグリセラート キナーゼ（ＰＧＫ）およびＳＶ４０プロモ
ーターなどのプロモーターである。プロモーターに加え、野生型エンハンサーが
存在してもよく、または異なった遺伝子からのエンハンサーがプロモーター領域
に連結されてもよい。
【００４８】 構築物はさらに、構築物を製造する、各々の操作後にクローニングする、クロ
ーンの発現に続く制限地図作製または配列決定のような分析を可能にする、およ
びさらなる操作のために構築物を単離する際に使用するために原核生物（特に大
腸菌）の複製系を含むことができる。必要な場合、細菌形質転換体を検出するた
めに、異なったマーカーを使用してもよい。
【００４９】 構築物が製造および操作され、および望まれない配列（例えば、望まれない細
菌配列）がベクターから除去されたら、ＤＮＡ構築物は標的幹細胞内へ導入する
準備がここでできている。所望のＤＮＡを幹細胞へ導入する方法は本分野ではよ
く知られている。簡単には、好適な方法にはリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈物、
核内へのＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の
細胞との細菌プロトプラスト融合、リポフェクションなどが含まれるが、これら
に限定されるわけではない。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖でも、直鎖状または環
状でも、弛緩または超らせんＤＮＡでもよい。哺乳類細胞を形質転換するための
種々の技術は、Ｋｅｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７（１９９０）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ
ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ Ｍ
ＡＮＵＡＬ（第２版），１−３巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）またはＣＵＲＲＥ
ＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．
Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）
（”Ａｕｓｕｂｅｌ”）を参照されたい。
【００５０】 標的細胞の形質転換後、多くの標的細胞は、前に示したネオマイシン耐性およ
びアシクロビルまたはガンシクロビル耐性のような陽性および／または陰性マー
カーにより選択される。所望の表現型を示す細胞は次に、制限分析、電気泳動、
サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによりさらに分析できる。標的遺伝子部
位に突然変異の存在を示す断片を同定することにより、標的遺伝子を不活性化す
るように相同的組換えが起こった細胞を同定できる。
【００５１】 遺伝子の一つのコピー（例えば、ＲＡＧ−２）のみが不活性化された細胞は、
まだ標的遺伝子の一つの非突然変異コピーを保持している。必要に応じ、これら
の細胞は拡充でき、所望のＤＮＡを含んでいるベクターによる、第二の形質転換
にかけることができる。必要に応じ、所望のＤＮＡ内の突然変異は第一の突然変
異と同一でもまたは異なったものでもよい。もし、欠失または置換突然変異が含
まれていれば、第二の突然変異は最初に導入された突然変異の少なくとも一部と
重複してもよい。必要に応じ、異なった陽性選択マーカーがこの形質転換で使用
できる。もし異なったマーカーが使用されるなら、両方の突然変異を持つ細胞が
二重選択培地で選択できる。もしくは、細胞が形質転換された両方のコピーに突
然変異を含むかどうかを決定するため、細胞は問題とする機能性蛋白質が完全に
無いことでスクリーニングできる。野生型標的遺伝子の不在を確実にするために
細胞のＤＮＡがさらにスクリーニングされる。
【００５２】 代わりの態様において、キメラ哺乳類は形質転換された幹細胞から発生でき（
下記参照）、および一つの突然変異配列を持つ動物は一つまたは二つの突然変異
配列を持つ他の哺乳類と繁殖でき、両方のコピーに突然変異を含む（同型接合体
）子孫が本発明のレシピエント哺乳類として選択された。同様に、二つの突然変
異遺伝子を持つ形質転換細胞からのキメラ哺乳類から発生させたレシピエント哺
乳類はより多くのレシピエント哺乳類を産ませるために繁殖できる。
【００５３】 形質転換後、置換ＤＮＡの一つかまたは二つのコピーを含んでいる幹細胞をレ
シピエント哺乳類胚内へ挿入してキメラ哺乳類が製造された。典型的には、哺乳
類胚盤胞内へ幹細胞クローンを注入することにより行われた。胚盤胞は次に偽妊
娠メス内へ移植された。移植胚盤胞からの子孫は、子孫がキメラ生殖細胞系を含
むかどうかを決定するために、親株の動物と試験交配される。改変幹細胞に由来
する生殖細胞を持つキメラは試験交配の子孫へ改変ゲノムを伝搬し、標的ＤＮＡ
について異型接合体の哺乳類が得られる（一つの標的ＤＮＡおよび一つの置換Ｄ
ＮＡを含んでいる）。異型接合体動物は、置換ＤＮＡに関して同型接合体を作り
出すためにお互いに繁殖させる。
【００５４】 本発明のレシピエント哺乳類は免疫不全であるため、それらを無菌環境に維持
する必要がある。そのような環境は当業者にはよく知られており、免疫不全マウ
スを維持するための技術はＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｄｅｎｔｓ： ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｈｕｓｂａ ｎｄｒｙ ａｎｄ ｕｓｅ ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ Ｒｏｄｅｎｔｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、に見ることができる。
【００５５】 ノックアウト哺乳類を製造することに加え、本発明の免疫不全哺乳類は商業的
に入手可能である。例えば、ＲＡＧ−２突然変異を持つマウスはＴａｃｏｎｉｃ
から、ＲＡＧ−１およびＴＣＲベータ／デルタ変異体マウスはＪａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、またはＳＣＩＤマウスはＪａｃｋｓｏｎおよびＴａ
ｃｏｎｉｃから入手可能である。
【００５６】 別の態様において、転写的に活性な導入遺伝子（例えば、転位された抗原レセ
プターの端切断形またはヒトＣＤ３エプシロン）の導入はリンパ球欠乏を達成す
る例である。
【００５７】 ノックアウト遺伝子の存在でレシピエント哺乳類をスクリーニングすることが
望ましい。スクリーニングは表現型的または遺伝子型的に実施できる。表現型ス
クリーニングには、成熟ＴおよびＢ細胞の不在、および血清イムノグロブリンの
不在のような成熟ＴおよびＢ細胞の不在に相関する他の表現型変化が含まれるが
、これらに限定されるわけではない。しかしながら、もし変異遺伝子が優勢表現
型を示すとしたら、その遺伝子が異型接合的である動物は所望の同型接合体と同
一の表現型特性を示すであろう。従って、遺伝子型スクリーニングにより同型接
合体をスクリーニングするのが望ましい。
【００５８】 ＤＮＡスクリーニングは当業者にはよく知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅ
ｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、に見ることができる。簡単には、ＤＮＡ含有細胞を
試験動物から取り除く。マウスにおいて、このことは尾の先端を取り除き、細胞
を単離することにより実施できる。細胞からゲノムＤＮＡが単離され、制限エン
ドヌクレアーゼにより取り扱えるサイズに切断する。切断ゲノムＤＮＡはアガロ
ースゲルで電気泳動され、野生型と改変ＤＮＡ断片を区別できる標識核酸で探査
される。
【００５９】 ゲノムＤＮＡへの標識プローブの結合は、使用された洗浄条件下でゲノムへハ
イブリダイズして残るプローブの能力に依存している。核酸のハイブリダイゼー
ションへの広範な指導は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮ
ＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＢＩＯＬＯＧＹ−−ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、
に見られる。一般的に、より高いストリンジェントハイブリダイゼーションおよ
び洗浄条件は、決められたイオン強度およびｐＨにて、特異的配列の熱的融点（
Ｔm）より５℃低いように選択される。Ｔmとは標的配列の５０％が完全に一致し
たプローブとハイブリダイズする温度である（決められたイオン強度およびｐＨ
下）。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴmと等しいように
選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上での、１００
以上の相補的残基を持つ相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の例では、１ｍｇのヘパリンを含む５０％
ホルマリン中、４０および５０℃（好適には４２℃）の間で、ハイブリダイゼー
ションが一夜行われる。高いストリンジェント洗浄条件の例は、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、７０から８０℃（７２℃が好適である）で約１５分である。ストリンジ
ェント洗浄条件の例は、約６０から７０℃（好適には６５℃）、１５分間の０．
２ｘＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）。し
ばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェ
ンシー洗浄に先立って高ストリンジェンシーせんじょうが行われる。例えば、１
００ヌクレオチドより多い二重鎖の、中程度のストリンジェンシー洗浄の例は約
４０から５０℃（好適には４５℃）、１ｘＳＳＣで１５分間である。例えば、１
００ヌクレオチドより多い二重鎖の、中程度のストリンジェンシー洗浄の例は約
３５から４５℃（好適には４０℃）、４−６ｘＳＳＣでの１５分間が好適である
。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、非相関プローブで
観察されたものの２ｘ（またはそれより高い）の信号ノイズ比は特異的ハイブリ
ダイゼーションの検出を示している。非結合プローブ除去後、標識が検出され、
哺乳類ゲノム中の所望ＤＮＡの存在または不在が決定される。
【００６０】 哺乳類が成熟するにつれて、“漏出表現型”が示される。本発明の目的では、
漏出表現型とは少数の胸腺細胞および／または前Ｂ細胞が機能的レセプター転位
され、各々ＴおよびＢ細胞へ成熟する。それ故、ＳＣＩＤマウスは漏出表現型を
示す。この表現型は、動物の生涯を通して、レシピエント哺乳類中の宿主Ｔおよ
びＢ細胞および／または血清イムノグロブリンの発生をモニターすることにより
決定できる。トランスジェニック哺乳類 造血細胞の分化は高度に制御された過程であり、とりわけサイトカイン、接着
分子およびケモカインを含む多くの因子の協調した発現を含んでいる。進化的変
化のため、マウス因子はヒト相当物のように必ずしも効率的に、または同じ様式
で相互作用しないように、マウスおよびヒト成長因子間にかなりの相違が起きて
いる。外因性サイトカインを供給する場合に主に考慮することは用量、組み合わ
せ、および送達の型である。サイトカインはその起点に非常に密接して、低濃度
でおよびお互いに共同的に作用する強力なシグナリング分子であるので、外因性
サイトカインの全身送達では正常発育に必要な生理学的レベルを提供しそうもな
い。
【００６１】 宿主へヒト特異的因子を提供する好適な方法は、導入遺伝子形成を経るもので
あり、それにより所望の因子をコードしているゲノムＤＮＡのコピーが宿主のゲ
ノム内へ取り込まれる。ＤＮＡは組織特異的調節配列および正常ＲＮＡプロセッ
シングに必要なイントロンおよびエキソン（代わりに少し変更された変異体を含
んで）を含まなければならない。後者は蛋白質が異なった生理学的効果を持って
いる膜結合および可溶性形の両方として存在する場合に特に重要である。それ故
、ドナー種特異的機能性免疫系を維持するためには、本発明のレシピエント哺乳
類の生殖細胞系内にドナー特異的サイトカインを導入することが必要である。
【００６２】 本発明のレシピエント哺乳類は非ヒト動物の生殖細胞系内へ導入遺伝子を導入
することにより製造される。種々の発生段階の胚性標的細胞が導入遺伝子を導入
するために使用できる。胚性標的細胞の発生段階に依存して異なった方法が使用
される。例えば、接合体はマイクロインジェクションの最もよい標的である。マ
ウスの場合、接合体のオス前核は約２０マイクロメーターの直径に達する。この
サイズでは、１−２ｐＬのＤＮＡ溶液の再現性ある注入が実施できる。遺伝子導
入標的としての接合体の使用は別の主要な利点を持っており、ほとんどの場合、
最初の分割前に、注入されたＤＮＡは宿主ゲノム内へ取り込まれるであろう（Ｂ
ｒｉｎｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２（１９８５））。その結果、レシピエント哺乳類の
すべての細胞は取り込まれた導入遺伝子を運ぶであろう。このことはまた、子孫
の５０％の生殖細胞が導入遺伝子を運ぶであろうので、親トランスジェニック哺
乳類の子孫への導入遺伝子の効率的な伝搬に反映される。
【００６３】 別の、代わりの態様において、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）が中期卵母細胞
内へ導入遺伝子を導入するために使用できる。Ｐｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ２８４：１１８０（１９９９）を参照されたい。簡単には、精子頭
部および直鎖状化ＤＮＡを短時間インキュベートし、卵母細胞内へ同時注入する
。ＤＮＡとのインキュベーションに先立って精子頭部が膜破壊されている場合、
改良された導入遺伝子形成の比率が観察される。
【００６４】 レトロウイルス感染もまたレシピエント哺乳類内へ導入遺伝子を導入するため
に使用できる。発生している胚は胚盤胞までインビトロで培養できる。胚盤胞が
レトロウイルス感染の標的である（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：１２６０−１２６４（１９７６））。割球の
効率的な感染が透明帯を除くための酵素処理により得られる（Ｈｏｇａｎ，ｅｔ
ａｌ．，ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８６））。導入遺伝子を
導入するために使用されたウイルスベクター系は典型的には、導入遺伝子を運ん
でいるレプリコン欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６９２７−６９３１（１９
８５）；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃｅｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））。割球をウ
イルス産生細胞の単層上で培養することにより感染が容易におよび効率的に得ら
れる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ，上記文献；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ
．ＥＭＢＯ Ｊ．６：３８３−３８８（１９８７））。もしくは、感染をより遅
い段階でも実施できる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を割腔内へ注入できる
（Ｊａｈｈｅｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８（
１９８２））。レシピエント哺乳類を形成する細胞の一部のみしか取り込みが起
こらないので、最初のもののほとんどはモザイクであろう。さらに、最初のもの
はゲノム中の異なった位置に導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入物を含んで
おり、それは一般的に子孫で分離するであろう。加えて、中期妊娠胚の子宮内レ
トロウイルス感染により、たとえ低効率だとしても、生殖細胞内へ導入遺伝子を
導入することも可能である（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．上記文献）。
【００６５】 導入遺伝子導入のための、標的細胞の第四の型は、胚幹細胞（ＥＳ）である。
ＥＳ細胞はインビトロで培養され、および胚と融合された着床前胚から得られる
（Ｅｖａｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６（１９８１
）；Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８（１
９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９（１９８６）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４８（１９８６））。導入遺
伝子はＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス仲介形質導入によりＥ
Ｓ細胞内へ効率的に導入される。そのような形質転換ＥＳ細胞はその後非ヒト動
物からの胚盤胞と混合できる。その後ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、生じるキメ
ラレシピエント哺乳類の生殖細胞系に寄与する。例えば、総説としてＪａｅｎｉ
ｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４（１９８８）；Ｂｒａｄ
ｌｅｙ，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０（５）：５３４
−９（１９９２）；およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａ ｎｓｐｌａｎｔ ５（３）：１４１−４（１９９０）を参照されたい。
【００６６】 本発明の実際の導入遺伝子はドナー特異的機能性免疫系の成熟および維持に必
要な蛋白質をコードしている配列を含んでいる。当業者は必要とされるサイトカ
インが所望の機能性に依存して変化することを認識するであろう。そのようなサ
イトカインにはＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦ、ＬＩＦ、Ｍ−
ＣＳＦおよびＯＭが含まれるが、それらに限定されるわけではない。加えてまた
は代わりに、同じ種からのＭＨＣ遺伝子およびドナーＨＳＣのそれとしてのハプ
ロタイプがレシピエント哺乳類内へ導入でき、内因的にＭＨＣ分子を発現する組
織で発現される。この場合、ドナー胸腺細胞はトランスジェニックＭＨＣ分子と
の相互作用を経て、レシピエント組織（特に、胸腺）の発生の間に“制限される
”ようになる。このことは、宿主哺乳類と同じハプロタイプのトランスジェニッ
クＭＨＣ分子を示している、ドナーＢリンパ球と同種の相互作用を持つことがで
きるＴ細胞の成熟を導く。例えば、ＨＳＣドナーと同一のハプロタイプのヒトＨ
ＬＡ−ＤＲ、−ＤＱおよび／または−ＤＰ遺伝子がマウス組織で発現される。ト
ランスジェニックＭＨＣ発現の発現は、ＲＡＧ−２またはＲＡＧ−１遺伝子の突
然変異を持つ株よりほかのマウス株において最も有益である。
【００６７】 好適な態様において、サイトカイン遺伝子はヒトまたはヒト細胞株に由来する
。しかしながら、ブタ、ヒツジまたはラットのような他の哺乳類源を使用しても
よい。代わりの態様において、同一種、しかしドナーには同種異系の哺乳類がサ
イトカイン源である。
【００６８】 本発明のサイトカインをコードしているＤＮＡ配列を単離する、多くの他の方
法が存在する。例えば、ＤＮＡは既知のサイトカイン配列と相補的な配列を持っ
ている標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムまたはｃＤＮＡライ
ブラリーからＤＮＡが単離できる。例えば、完全長ｃＤＮＡプローブを使用して
もよいし、または既知の配列の副配列から成るオリゴヌクレオチドプローブを使
用してもよい。そのようなプローブは、サイトカインをコードするＤＮＡを単離
するために、ハイブリダイゼーションアッセイで直接的に使用できる。代わりの
プローブがＰＣＲのような増幅技術で使用するために設計でき、サイトカインを
コードするＤＮＡがＰＣＲのような方法を用いて単離できる。
【００６９】 ｃＤＮＡライブラリーを調製するため、ｍＲＮＡが組織または細胞源から単離
される。例えば、ＩＬ−７が骨髄間質により発現されるので、これらの細胞はＩ
Ｌ−７をコードしているｍＲＮＡの適した供給源であろう。ｃＤＮＡが本分野で
よく知られている方法に従ってｍＲＮＡから逆転写され、細菌クローニングベク
ター内へ挿入される。繁殖、スクリーニングおよびクローニングのため、ベクタ
ーは組換え宿主内へ形質転換される。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法およびス
クリーニングはよく知られている。Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎ ｅ ２５：２６３−２６９，（１９８３）およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ
．を参照されたい。
【００７０】 ゲノムライブラリーから、全ＤＮＡが宿主組織または細胞から抽出され、機械
的剪断または酵素的消化によりＤＮＡが小片に切断され、例えば、約１２−５０
ｋｂの断片が得られた。所望のサイズの断片が濃度勾配遠心分離により分離され
、バクテリオファージラムダベクターまたは他のベクター内へ挿入される。これ
らのベクターおよびファージは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．に記載されて
いるようにインビトロでパッケージングされた。組換え体ファージはＡｕｓｕｂ
ｅｌに記載されているように、プラークハイブリダイゼーションによりサイトカ
イン核酸の存在が分析できる。
【００７１】 ５０ｋｂを超えるゲノムＤＮＡ配列を含んでいるライブラリーは、例えば、Ｙ
ＡＣ、ＢＡＣ、Ｐ１およびＰＡＣベクターのような種々のクローニングベクター
を使用して調製される。これらのライブラリーを発生するための技術はよく知ら
れている。Ｍａｒｋｉｅ編（ＹＡＣＳに対して）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５４（１９９７），Ｒａｍｓａｙ（ＹＡＣＳに
対して），Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １（２）：１８１−２０１（１９９
４），Ｍｏｎａｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１
２：２８０−６（１９９４），およびＳｈｅｐｈｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ ｅｔ Ｅｎｇ （ＮＹ）１６：２１３−２８（１９９４）を参照されたい。
【００７２】 本発明で有用なハイブリダイゼーションプローブには、問題とするサイトカイ
ンをコードする既知の配列、または別の種からの相同的サイトカインをコードす
る配列、例えば、相同的配列でヒトｃＤＮＡライブラリーを探査するためのマウ
ス配列に由来するプローブ、が含まれる。当業者は、もし相同的配列がプローブ
として使用されるなら、洗浄条件のストリンジェンシーは低くしなければならな
いことを認識するであろう。
【００７３】 導入遺伝子として使用されるべきサイトカインのコード配列の発生させるのに
加え、本発明に必要なサイトカインをコードする多くの核酸が商業的に入手可能
である。そのような供給元にはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓおよびＣＥＰＨが含まれる。
【００７４】 必要なサイトカインを発現するトランスジェニック哺乳類を作製する好適な方
法は以下のようである。動物およびインビトロ両方の研究から、ＩＬ−３、ＩＬ
−６、ＩＬ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＬＩＦ、およびオン
コスタチンＭは造血に役割を果たし、骨髄または胸腺で発現され、またはマウス
蛋白質はマウスｖｓヒト細胞に特異性を示す、それ故、レシピエント哺乳類に植
え付けられたヒトＨＳＣは天然の哺乳類サイトカインを認識しないことを示唆し
ている。これらのヒト遺伝子のためのゲノムクローンを得ることができ、ＥＳ細
胞内へ導入された。ＥＳ細胞は、レシピエント哺乳類の生殖細胞内へドナー導入
遺伝子を移すため胚盤胞内へ導入された。ゲノムクローンの単離 好適な方法において、ＰＣＲプライマー組は、遺伝子を含んでいる構築物がＰ
ＣＲにより同定できるように、ゲノム配列の５’または３’末端に対して設計さ
れる。加えて、これらのプライマー組は、天然の哺乳類遺伝子がトランスフェク
トされたＥＳ細胞または疑われるレシピエント哺乳類のゲノムまたは転写スクリ
ーニングの間に間違って同定されないように、マウスおよびヒト遺伝子を区別す
るように設計できる。
【００７５】 ヒトゲノムライブラリーは遺伝子特異的プライマー組を使用してスクリーニン
グする（実施例２およびゲノムライブラリースクリーニングの一般的説明にはＡ
ｕｓｕｂｅｌを参照されたい）。必要に応じ、陽性クローンは同一の遺伝子に対
する他のプライマー組かまたはサザンブロット分析によりさらに確認できる。遺
伝子のサイズに依存して、クローニングベクターの異なった型およびライブラリ
ーが容易に利用可能である。約１５ｋｂまでの遺伝子はラムダライブラリーから
得られる。５０ｋｂまでの遺伝子はコスミドライブラリーから同定できる。５０
ｋｂを超えるより大きな遺伝子はＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐ１、ＹＡＣ、ＭＡＣまたは
他のそのようなライブラリーから同定できる。ゲノム構築物からのインビトロ転写の例示 導入遺伝子は哺乳類宿主から発現されるであろうので、とても貴重なＥＳ細胞
内へのトランスフェクション前に、ヒト以外の哺乳類細胞（好適にはマウス）に
より転写されるヒト配列の能力を決定するのが望ましい。未消化または消化ゲノ
ム構築物は、各々のサイトカインの内因性形を発現するマウス細胞株内へ、リポ
フェクションによりトランスフェクトできる。市販品リポフェクション試薬は広
範囲に入手可能であり、過渡的アッセイでの適当なトランスフェクション効率を
得るために特定の細胞型への最適化が必要である。トランスフェクト細胞からの
ｍＲＮＡが続いて構築物の転写のために分析される。当業者の好みに依存して、
ｍＲＮＡは標準法に従って電気泳動でき、次にノーザンブロットで探査でき、ま
たは最初に鎖ｃＤＮＡが標準逆転写法により合成できる。生じたｃＤＮＡは次に
標識プローブおよびサザンブロットまたはＰＣＲ法により分析できる。ヒトサイトカイン遺伝子を含んでいるＥＳ細胞の選択 二つの等しく好適な実施態様が、すべての望まれる遺伝子を一つの株内へ結合
するために使用できる。第一の方法において、遺伝子の群はＥＳ細胞内へネオマ
イシン耐性のための選択可能マーカーとともに同時にトランスフェクトされる。
例えば、遺伝子の一つの群はＩＬ−７、ＳＣＦおよびＬＩＦ構築物を含むことが
でき、第二はＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−６構築物を含んでいる。第
二の方法において、すべての望まれる遺伝子は一緒に同時トランスフェクトされ
る。もし、必要な導入遺伝子のすべてが一つのトランスジェニック哺乳類の生殖
細胞中に存在しないなら、哺乳類は、その生殖細胞に必要な導入遺伝子を含んで
いる哺乳類と繁殖でき、すべての必要な導入遺伝子を持つ子孫を創造する。
【００７６】 ＥＳ細胞内へ導入遺伝子を導入するため、ＤＮＡ構築物は、もし環状なら、Ｄ
ＮＡを直鎖状化する望ましい制限エンドヌクレアーゼで消化する。各々の群内で
、ＤＮＡ構築物は等モル量で混合されるのが好適である。しかしながら、当業者
はもし一つの遺伝子のより多くのコピーが望まれるなら、その遺伝子のＤＮＡ構
築物を過剰に提供しなければならないことを認識するであろう。陽性選択のため
、マーカー含有プラスミドをこれらのＤＮＡと約４：１のモル比で混合できる。
【００７７】 ＤＮＡは次にリポフェクションまたは他の適した技術によりＥＳ細胞内へ導入
できる。好適なトランスフェクションプロトコールはリポフェクション試薬の製
造元により提供されているプロトコールと同様であり、実施例２に詳細に説明さ
れている。選択培地で適当な時間後（好適には、５−２０日後およびより好適に
は１０−１４日後）、個々のトランスフェクトされたＥＳ細胞コロニーはクロー
ニングおよび拡張のために９６−ウェルディッシュ内へ移される。
【００７８】 一つの方法がここにおよび実施例２に記載されているが、当業者は哺乳類の生
殖細胞中へ導入遺伝子を挿入する他の方法が既知であり、また利用できることを
認識するであろう。これらの方法のいくつかは、米国特許第４，８７３，１９１
、５，４３４，３４０、４，４６４，７６４、５，４８７，９９２、５，８１４
，３１８号；ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ ９７／２００４３、ＷＯ ９９／０７８
２９、ＷＯ ９９／０８５１１；およびＰｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２８４：１１８０（１９９９）に見ることができる。
【００７９】 ＥＳ細胞内へ挿入された導入遺伝子に依存して、導入遺伝子を検出するために
異なった技術が使用できる。例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ転写体から作製
されたｃＤＮＡを検出するためにＰＣＲが使用でき、導入遺伝子の遺伝子産物が
ＥＳ細胞で合成されるか、または細胞外に存在するかどうかを決定するためには
ＥＬＩＳＡおよび他の抗体に基づいたアッセイが使用でき、およびそのようなア
ッセイが利用可能ならば、機能性アッセイが遺伝子産物を検出するために使用で
きる。免疫系の再構築 ヒト造血幹細胞の生物学を研究する共通の方法は、それらを免疫不全マウス内
へ導入することである。ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびベージュ／ヌード／
ｘｉｄマウスのような自発的突然変異を運んでいるマウスの近交系が最も広く使
用されている宿主である。遺伝子標的化の出現は非常に多様な免疫不全動物を導
き、それらは現在この目的のために評価されている。動物は通常致死量以下の照
射により条件付けされ、しばしば骨髄移植のレベルを増加させるためおよび前駆
および／または成熟細胞の拡大のためにヒト成長因子の注射で補われている。Ｓ
ＣＩＤ突然変異を持つマウスでの研究において、Ｂ６／１２９マウスに優性遺伝
子型が存在しているようであり、このマウスに突然変異が位置されていると、突
然変異で観察される表現型のいくつかを無効にするように働いている。より少な
い効果がＢａｌｂ／ｃバックグラウンドで観察される。さらにより少ない効果が
ＮＯＤバックグラウンドで観察される。従って、ＲＡＧ突然変異のための好適な
マウスバックグラウンドはＮＯＤ／ＳＣＩＤである。なぜ特定の遺伝子バックグ
ラウンドが他よりも良好であるのか、または補給成長因子が有益であるのかどう
かはよく理解されていない。例えば、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３
のヒト遺伝子を発現するトランスジェニックＳＣＩＤマウスは、非トランスジェ
ニックＳＣＩＤマウスよりも有効に移植されるが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスより
は良好ではない。ヒト遺伝子は内因性調節配列よりもむしろウイルスプロモータ
ーにより駆動されており、多分、発現の異常なパターンおよびレベルを持ってい
た（Ｂｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：２０３７−２０４３
）。
【００８０】 ＳＣＩＤ、ＲＡＧおよびＮＯＤ突然変異に加え、他の突然変異も本発明のレシ
ピエント哺乳類に有益である。例えば、ＳＣＩＤ突然変異での実験で、γcノッ
クアウト突然変異またはβ−２マイクログロブリンノックアウト突然変異は異種
ＨＳＣの植え付けを改良することが示された。移植された造血幹細胞 造血幹細胞源には臍帯血（ＣＢ）、骨髄（ＢＭ）および動員末梢血（ＭＰＢ）
が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８１】 ヒトＣＢは例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｃ Ｒｅｓｏｕｒ
ｃｅｓ Ｉｎｃ（ＡＢＲ），Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰｕｒｅｃｅｌｌ，Ｓ
ａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから得ることができる。ＣＢは地方病院からＡＢＲによ
り集められ、２４時間内に出荷されおよび現場で処理される。もしくは、ヒトＢ
Ｍ、ＣＢおよび／またはＭＰＢ細胞は、新鮮または凍結細胞、および分画または
未分画細胞としてＰｕｒｅｃｅｌｌから得られる。使用前に、すべての試料はＢ
型およびＣ型肝炎およびＨＩＶが試験された。ウイルス陽性であることが観察さ
れた試料を含んでいる実験材料は即座に廃棄され、動物は除去され、印を付け、
汚染動物死体廃棄のための方法に従って廃棄された。実験進行を通して、すべて
の試料は、それらが病原体を運んでいるヒト血液で汚染されているかもしれない
という仮定の下で処理されるべきである（生物安全性レベル２、ＢＬ−２）。ヒ
ト血液細胞を持つマウスを扱うすべての人はＢ型肝炎ワクチンを受けるべきであ
る。
【００８２】 移植のための好適な年齢は誕生後直ぐか（約７２時間）またはガンマ−照射で
条件付けられている成体動物（４−８週齢）であるが、他の型の条件付けも知ら
れており構想されている。ドナー造血幹細胞のハプロタイプは、特異的抗原に対
する特定個体の応答性を決定するため、問題とする試験集団に基づいて選択され
る（例えば、集団内の蛋白質またはペプチドのアレルゲン性を決定する目的のた
め）。
【００８３】 移植するには、造血幹細胞源からのリンパ球が、好適には密度分離により単離
され、および計数される。基準として、成体マウスは０．１−１０7総細胞を受
けることができる。もしくは、動物はまた、例えば、Ｄｙｎａｌ Ｄｅｔａｃｈ
−ａ−Ｂｅａｄ研究用分離システムを使用して、またはＦＡＣＳ選別により、例
えば臍帯血から純化されたＣＤ３４+細胞も移植される。臍帯血から純化された
ＣＤ３４+細胞は次に、新生児または成体動物へ注射された。マウスにおいて、
子供には約１０5細胞が、成体には約５ｘ１０5細胞が注射された。
【００８４】 ＨＳＣ集団は静脈内に（ｉｖ）注射できる。必要に応じ、成体哺乳類はＮＫ細
胞の活性を減少させるため、ウサギポリクローナル抗アシアロ抗体で、マイナス
１日目に処理する。もしくは、レシピエント哺乳類（特にマウス）は、ペルフォ
リン欠損マウスのようなＮＫ細胞機能がバックグラウンド欠損マウスと交配され
る。新生児動物はＮＫ活性をほとんどから全く持っていず、それ故、それらを処
理する必要はない。
【００８５】 典型的には、成体マウスがレシピエント哺乳類である。それらは常法により尾
静脈内へ注射される。それらはまた眼窩後方洞を通して注射され、この場合、動
物は最初に麻酔される。典型的には、腹腔内または筋肉内へ送達されるケタミン
およびキシラジンの混合物が使用される。動物は暖かく保たなければならず、眼
は過程中湿らせて、それらが回復するまでモニターしなければならない。マウス
新生児の眼窩後方洞内へ細胞を注射するには、眼静脈がよく見えるように光源下
に子供が固定された。針を静脈と平行に保ち、皮膚表面直下にねらいを定めなが
ら挿入する。細胞はゆっくり注入し、その間血液が針の所の下流で清澄化されて
いること、および静脈の周辺で膨潤が起こっていないことを決定するために凝視
する。注射後、細胞が循環系に入るのを可能にするため、針はその場所で短時間
保つ。必要に応じ、子供はその活動を減少させるために氷上で短時間冷却される
。
【００８６】 代わりの態様において、レシピエント哺乳類は確立された実験プロトコールに
従ってガンマ−照射を受ける（Ｂｉｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４９：３
２９−３３１（１９９１）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．９０：２７７９−２７８３（１９９３））。例として
マウスを使用すると、Ｍａｒｋ Ｉ Ｍｏｄｅｌ ３０シールドＣｓ−照射機ま
たは類似の装置が使用プロトコールに従って、１００−１０００ｃＧｙ／動物の
線量範囲での投与に使用される。ナチュラルキラー細胞の減少を改良するため、
照射の致死レベルが分割線量として投与される（例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに
対して２ｘ５００Ｒ）。照射はヒト造血細胞の注射２−２４時間前に実施される
。
【００８７】 植え付けが起こったかどうかを決定するための方法は本分野でよく知られてお
り、Ｐｆｌｕｍｉｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ８８：３７３１−３７４０（１
９９６）；Ｄｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ Ｓｕｐｐｌ
ｌ：１９９−２０３（１９９７）；Ｒａｍｉｒｅｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅ ｍａｔｏｌ ．２６：３３２−３４４（１９９８）；Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂ ｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３：２３６−２４
６（１９９７）；Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９０：８５−９６（１
９９７）；およびＬａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ７５：６
６４−６７３（１９９７）を含んでいる。
【００８８】 当業者は、移植されたＨＳＣが植え付けられたかどうかを決定する多くの方法
が存在することを理解するであろう。好適な方法において、レシピエント哺乳類
からのリンパ球が取り出され、ヒト細胞表面抗原の存在が調べられる。ＣＤ４５
が好適である。この決定は典型的には、ＢおよびＴリンパ球の両方で観察され、
マウスＣＤ４５には存在しない、ヒトＣＤ４５へ結合する抗体へコンジュゲート
された色素で細胞を染色することにより実施される。Ｃｏｌａｓ，ｅｔ ａｌ．
，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６７：９８４（１９９９）を参照されたい
。他の方法には、リンパ球からのヒトＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅が含まれる。 ＩＩＩ．本発明の哺乳類の使用 本発明の哺乳類は種々に使用される。例えば、本発明のレシピエント動物は非
ドナー（例えば、非ヒト）高分子のアレルゲン性を決定するためのモデルとして
使用できる。これらの高分子には蛋白質、炭水化物、脂質および他の化合物が含
まれる。蛋白質には細菌プロテアーゼ、真菌セルラーゼなどのような商業的に重
要な酵素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。前に説明したように
、モデルとして、動物は試験化合物に暴露でき、動物の免疫応答がモニターされ
る。動物モデルの応答に基づいて、免疫応答が、例えば、アレルゲン性を減少さ
せるためには少なくなるように、例えば、もし化合物がワクチンとして使用され
るならば大きくなるように、化合物は修飾できる。
【００８９】 もしくは、本発明のモデルはヒト免疫系に影響する化合物を決定するために使
用できる。明らかな倫理的理由で、実験化合物はヒト患者には使用できない。機
能性ヒト免疫系を持つマウスは、このより意味のある前臨床試験を行うことを可
能にする。
【００９０】 本発明の別の使用において、レシピエント哺乳類は特定の抗原に対して、十分
にヒトポリクローナルまたはモノクローナル抗体を発生する。本分野で入手可能
な現在のヒト抗体と異なり、他種抗体の遺伝子操作（例えば、ヒト化）は必要と
されないであろうし、抗原への偶発的暴露でヒトから精製された抗体が持つよう
な、同じ生物学的危険性を持っていないであろう。本発明のマウスが、ヒト化ま
たは他のモノクローナル抗体がヒト免疫系の応答を上昇させるかどうかを決定す
るために使用できることも企図されている。
【００９１】 体液性応答に加え、本発明のマウスは、病原体および免疫調節化合物に対する
ヒト細胞仲介応答を調べるためにも使用できる。例えば、病原体中に存在する蛋
白質のＴ細胞エピトープが決定できる。病原体に加え、自己免疫応答に関与する
蛋白質のような他の蛋白質がＴ細胞エピトープの存在で試験できる。
【００９２】 本発明のさらに別の使用において、ヒト造血細胞の発生および機能の調節に関
与する因子が決定できる。これらの因子は、これらの因子の生物学的特性を同定
するために、および前臨床モデルにおいて治療分子としての有効性を試験するた
めの両方に役に立つことができる。特に興味を持たれることは、造血再構築（例
えば、骨髄移植後または免疫不全の他の状態）を増大する因子は、細胞性対体液
性エフェクターに対する免疫応答の標的化を指示でき、有害な炎症性または自己
免疫応答を抑制し、感染性因子または癌性組織の免疫仲介クリアランスを刺激す
る。 実施例 以下の実施例は例示の目的のみで提示され、本発明を制限していると解釈して
はならない。実施例１．ＲＡＧ−２変異体マウスの同種異系再構成 骨髄（ＢＭ）由来リンパ球前駆体の発生を支えるＣＢ１７．ＳＣＩＤ（ＳＣＩ
Ｄ；Ｈ−２d）およびＲＡＧ２-/-変異体（ＲＡＧ；Ｈ−２b）マウスの能力を比
較するため、誕生後約７２時間に、１０7Ｔ細胞枯渇ＢＭ細胞が静脈内で動物に
植え付けられた。ＲＡＧマウスは同遺伝子型（Ｈ−２b）Ｃ５７Ｂｌ／６または
（１２９ｘＣ５７Ｂ１／６）Ｆ１ ＢＭ（ＲＡＧ−（ｓｙｎ）；Ｈ−２b−＞Ｈ
−２b）または完全同種異系Ｂａｌｂ／ｃ ＢＭ（ＲＡＧ−（ａｌｌｏ）； Ｈ
−２d−＞Ｈ−２b）を植え付けられた。ＳＣＩＤマウスは同遺伝子型（ＳＣＩＤ
−（ｓｙｎ）；Ｈ−２d−＞Ｈ−２d）または完全に同種異系Ｃ５７Ｂ１／６ Ｂ
Ｍ（ＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）；Ｈ−２b−＞Ｈ−２d）を植え付けられた。
【００９３】 後肢骨（大腿骨および脛骨）が安楽死させた４から８週齢の健康なドナーマウ
スから取り出され、冷ＤＰＢＳを満たした３ｍｌの注射筒に付けられた２５ゲー
ジ針を使用して水洗し、単一細胞懸濁液中に細胞を得た。細胞はＤＰＢＳで洗浄
し、ペレット化した。骨髄試料は機能性成熟Ｔ細胞を含んでいるので、Ｔ細胞は
２−５ｘ１０7細胞／ｍｌに対して１０μｇ／ｍｌの抗−Ｔｈｙ−１ ｍＡｂ（
３０Ｈ１２）を、氷上３０分間使用して枯渇させた。細胞は遠心分離し、抗−ラ
ットＩｇＧ（ＭＡＲ１８．５）培養上清に約２−５ｘ１０7細胞／ｍｌで再懸濁
した。モルモットおよびウサギ補体を各々１：２０まで加え、３７℃で４５分間
インキュベートした。細胞は遠心分離し、３ｍｌの室温ＤＰＢＳに再懸濁し、３
ｍｌの室温Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度＝１．１１９を下に敷き、８００ｇで１０
分間遠心分離した。界面から生存細胞を集め、２％ＦＣＳ／ＤＰＢＳで洗浄し、
計数し、ＦＣＳを含まないＤＰＢＳに３ｘ１０8細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁し
た。
【００９４】 マウスは注射可能ケタミン／キシラジン（各々、１００および２０ｍｇ／ｋｇ
）（平均的マウスに対して〜２００μｌ）溶液を使用して麻酔した。３ｘ１０7
（１００μｌ）Ｔ−枯渇骨髄細胞は眼窩後方洞を経て適したドナー内へ静脈内で
注射された（同一の性、５から６週齢）。新生児マウスは１０7骨髄細胞を含ん
でいる５０μｌを超えない注射液を、注射可能麻酔なしで、ただ氷で体温を低下
させて眼窩後方静脈から受けた。同遺伝子型（同一ＭＨＣハプロタイプ）および
同種異系（ＭＨＣハプロタイプ非一致）マウスの両方が移植された。マウスは８
週間放置して骨髄の植え付けを可能にし、その時点でマウス（通常各々の群に３
匹）を安楽死させ、研究のために臓器を取り除いた。胸腺、脾臓、腸間膜リンパ
節（いくつかの場合）および末梢血（ＭＢ）の詳細な細胞分析（ＦＡＣＳ）が実
施された。これらの領域で、蛍光−結合細胞型特異的抗体を使用してＴ細胞、Ｂ
細胞および顆粒球が評価された。表１参照。
【００９５】
【表１】
【００９６】 みてとれるように、ＳＣＩＤ動物はＲＡＧ動物よりもＢ細胞をより高いパーセ
ントで植え付ける傾向がある。このことは多くの異なった時間点に渡って正しい
ことが観察された。８週齢動物の胸腺はよく植え付けし、ＣＤ４+およびＣＤ８+ 単一陽性細胞の正常なパーセントを示した。加えて、胸腺フローサイトメトリー
プロフィールはＣＤ３+細胞のパーセントを含んで同等であった。示されている
ＲＡＧ（ａｌｌｏ）キメラはわずかにより未成熟な二重陰性（ＤＮ）胸腺細胞を
持っていた；しかしながら、ＤＮ胸腺細胞の濃縮は、本研究の過程で試験された
ＲＡＧ−（ａｌｌo）マウスのＸ数に渡って、再現性のある発見ではなかった。
【００９７】 キメラ研究がうまくいった残存マウスは次に５０μｇのＫＬＨを含むＣＦＡで
腹腔内に免疫し、２週間後にＫＬＨを含むＩＦＡで追加免疫した。免疫マウスは
１週間後に血液を採り、血清試料のＩｇＧならびにＩｇＧ１（いくつかの場合）
をＥＬＩＳＡにより試験した。下記図２および表２を参照されたい。
【００９８】
【表２】
【００９９】 以前に報告されているように、ＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）マウスは応答が悪く、
抗原特異的同源Ｔ−Ｂ相互作用の欠如を示している。このことは宿主胸腺上皮に
よるドナーＣＤ４+Ｔ細胞の陽性選択によるものであると推定されており、ドナ
ーＭＨＣ発現Ｂ細胞と相互作用できないＴ細胞を生じている。対照的に、ＲＡＧ
−（ａｌｌｏ）マウスは、ＲＡＧ−（ｓｙｎ）動物と等しいレベルの抗原特異的
ＩｇＧを産生した（図２Ａ）。出血前血清は通常バックグランドに等しい吸光度
を示した。加えて、血清ＩｇＧは、オブアルブミン（ＯＶＡ）被覆プレートで試
験した場合、交差反応的ではない。抗原特異的ＩｇＭ応答は気付かれなかった。
この現象は第二の抗原ＫＬＨについて調べられた。図２Ｂに示されているように
、２匹の独立したＲＡＧ−（ａｌｌｏ）動物について、抗原特異的血清ＩｇＧ応
答は対照ＲＡＧ−（ｓｙｎ）応答の次数であることが観察され、類似の速度論で
発生した。すべてのマウスからの血清は無関係な抗原で被覆されたＥＬＩＳＡプ
レート上で交差反応しないことが観察された。この結果は、ドナー由来ＢＭ細胞
はＣＤ４+Ｔ細胞を陽性選択でき、それは次に末梢でドナー由来抗原特異的Ｂ細
胞と相互作用でき、アイソタイプのＩｇＧへのスイッチが生じることを示唆して
いる。
【０１００】 キメラ動物からの末梢リンパ球についての機能性分析もまた実施された。ＣＤ
４+Ｔ細胞は、植え付けした動物のリンパ節から単離され、混合リンパ球培養（
ＭＬＲ）で反応性が試験された。図１ＡおよびＣは、Ｃ５７Ｂ１／６、Ｂａｌｂ
／ｃおよび第三者Ｈ−２k発現マウスからのＬＰＳ誘導脾臓芽細胞に対するＲＡ
Ｇ−（ｓｙｎ）（Ａ）およびＳＣＩＤ−（ｓｙｎ）（Ｃ）ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖
応答を示している。ＲＡＧ−（ｓｙｎ）およびＳＣＩＤ−（ｓｙｎ）の両方とも
自己には陰性であったが、異抗原には応答性であった。ＲＡＧ−（ａｌｌｏ）マ
ウスはＣ５７Ｂ１／６およびＢａｌｂ／ｃの両方に陰性であったが、第三者Ｈ−
２k同種異系抗原には応答性であった。しかしながら、ＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）
は機能的に傷つけられており、自己ＭＨＣに不完全な陰性を示している。加えて
、第三者Ｈ−２k発現刺激剤への応答が害されている。ＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）
への注射と同一のＢＭ接種物で作製された対照ＲＡＧ−（ｓｙｎ）がパネルＤに
示されている。従って、ＲＡＧ−（ａｌｌｏ）マウスはドナーおよび宿主ＭＨＣ
へは陰性であり、および第三者へは応答性であること観察されたが、ＳＣＩＤ−
（ａｌｌｏ）は機能的にそこなわれている。加えて、脾細胞およびリンパ節の分
裂促進反応性が試験された。ＲＡＧ−（ａｌｌｏ）脾細胞は正常にＴ細胞分裂促
進剤ＰＨＡに応答したが、一方、ＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）Ｔ細胞は低応答性であ
った。すべての植え付け動物の脾細胞はＬＰＳに対して対照レベルの応答を示し
た。
【０１０１】 明白なドナー制限Ｔ細胞応答をさらに調べるため、ＲＡＧ−（ａｌｌｏ）動物
が後肢足蹠に免疫され、その後ドレイニング（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節から
ＣＤ４+Ｔ細胞が精製された。初回抗原刺激を受けたＣＤ４+Ｔ細胞は抗原パルス
ＬＰＳ誘導脾臓芽細胞と一緒に培養され、増殖が評価された。図３は二つの異な
ったＲＡＧ−（ａｌｌｏ）動物からのＫＬＨ初回抗原刺激を受けたドレイニング
ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖応答を示している。ＫＬＨパルスＣ５７Ｂ１／６刺激剤へ
の応答は優性であることが観察され、胸腺上皮細胞ＭＨＣについては抗原の認識
でのＣＤ４+Ｔ細胞の優先選択を示している。しかしながら、ＫＬＨパルスＢａ
ｌｂ／ｃ芽細胞に対する抗原特異的応答は、対照応答の約３０％であった。この
実験は５回繰り返され、同様のレベルのドナー拘束応答が認められた（範囲＝宿
主応答の２０から５０％）。同様の結果が成体植え付けマウスで得られた。
【０１０２】 これらの結果は非照射新生児ＲＡＧ宿主において作られた完全同種異系Ｈ−２ d −＞Ｈ−２d組み合わせに対しては、ドナー由来ＢＭ細胞はＣＤ４+Ｔ細胞を陽
性選択したことを示唆している。胸腺上皮細胞は胸腺で起こる陽性選択の大部分
に影響することは広く受け入れられている。しかしながら、他の細胞型によるお
よびＭＨＣ障壁を超えた選択はＣＤ８+Ｔ細胞にのみ観察されている。ＭＨＣク
ラスＩ拘束（Ｐａｗｌｏｗｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６４：６４２
−５（１９９３））およびクラスＩＩ拘束（Ｈｕｇｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．９０：１０３３５−１０３３９（１９９３））
Ｔ細胞両方の陽性選択は、胸腺内に注射されたトランスフェクト線維芽細胞に起
こることが示されている。ＭＨＣクラスＩＩ拘束細胞の選択は、胸腺細胞が胸腺
上皮細胞および注射された線維芽細胞両方のＭＨＣハプロタイプを共有している
場合に示されている。この制約は、ＭＨＣクラスＩ拘束細胞の選択では明らかで
はない。ＣＤ４+Ｔ細胞に対するＢＭ細胞による胸腺陽性選択はＢＭ植え付け照
射成体ＭＣクラスＩＩ欠損マウスでは起こらないが、他の人たちは親からＦ１へ
の骨髄キメラを使用してドナーＭＨＣへの機能性拘束を示している。一方、ＢＭ
由来細胞による陽性選択を示している、ドナーＭＨＣへのＣＤ４+Ｔ細胞の機能
性制限は完全同種異系キメラでは示されていないが、いくつかの例外が存在する
（Ｌｏｎｇｏ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４４４７（１９８０）；Ｌ
ｏｎｇｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３０：２５２５−２５２８（１
９８３）；およびＬｏｎｇｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ．８２：５９００−５９０４（１９８５））。これらのデータを一緒にす
ると、胸腺上皮細胞およびＢＭ由来細胞は有効な陽性選択を達成するにはＭＨＣ
ハプロタイプを共有していなければならず（Ｚｉｎｋ，およびＥｌｌｉｏｔ）、
ＣＤ４+Ｔ細胞の選択に対する要求は、ＣＤ８+Ｔ細胞の選択に対する要求よりも
より厳密であろう。
【０１０３】 ここに示された結果は、ＲＡＧ２-/-変異体株は、ＢＭ由来細胞選択が有効に
、および胸腺上皮細胞によるハプロタイプ共有なしで起こることを可能にする環
境を提供するので独特であることを示唆している。ＲＡＧマウスの独特さは突然
変異の非漏出性によるものであろう。ＳＣＩＤマウスは時折、機能性抗原レセプ
ターを持つ細胞を発生させることがよく知られている。たとえ少なくとも抗原レ
セプター陽性細胞の発生は、陽性選択ができるドナーＢＭ由来細胞の動員および
／または機能性を不可能にする機能性変化を胸腺微小環境に誘導するには十分な
信号であろう。新生児および成体ＳＣＩＤマウスの両方がこれらの実験で使用さ
れ、両者ともドナー同種異系ＢＭ拘束を支える能力を示さなかった。それ故、Ｒ
ＡＧマウスはそのリンパ球生成微小環境が、胸腺表現型により示唆されるように
、機能的に胎児発生段階で凍結されているモデルを代表するものである。もしＲ
ＡＧマウスが“胎児”モデルを表すとすると、ＢＭ由来細胞に対する選択は胸腺
では正常なことであり、この現象はＳＣＩＤマウスの使用による、または照射の
二次効果による他の系では日常的には観察されていない。実施例２．ヒトサイトカイン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの発生 動物およびインビトロ両方の研究に基づくと、以下の組の導入遺伝子は造血に
役割を果たし、骨髄または胸腺で発現され、またはマウス蛋白質がマウスｖｓヒ
ト細胞に特異性を示している：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＬＩＦ、およびオンコスタチンＭ。ヒト遺伝子のこの
組のゲノムクローンが得られ、トランスジェニックマウスを誘導するためのＥＳ
細胞クローンを選択するために使用された。ゲノムクロ−ンの単離 遺伝子を含んでいる構築物が容易にＰＣＲにより同定できるように、ゲノム配
列の５’または３’末端に対してＰＣＲプライマー組が設計された。加えて、こ
れらのプライマー組はマウスおよびヒト遺伝子を区別するように設計された。ヒ
トクローンの同定に以下のプライマーおよび条件が使用された。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】 ヒトゲノムＰ１（ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＬＩＦに対する）、ＢＡＣ（Ｉ
Ｌ−７およびＳＣＦに対する）およびＰＡＣ（ＧＭ−ＣＳＦに対する）ライブラ
リー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）が上記遺伝子特異的プライマー
組を使用してスクリーニングされた。ＩＬ−３およびＯＭは各々ＧＭ−ＣＳＦお
よびＬＩＦに密接して並んでおり、最初の回はスクリーニングされなかった。陽
性クローンは同じ遺伝子の他のプライマー組かまたはサザンブロットにより確認
された。以下のプライマーがＰＣＲ確認に使用された：
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
【表５】
【０１０８】 Ｐ１、ＢＡＣ、またはＰＡＣクローンからのプラスミドＤＮＡはＫＢ−１０
０ Ｍａｇｎｕｍカラム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用して
調製された。詳細な実験法は製造元から供給される使用説明書に詳細に記載され
ている。ＤＮＡ濃度を定量するため、ＤＮＡ構築物はＥｃｏＲＩで消化され、続
いて０．８％アガロースゲル上、既知の濃度のＤＮＡ標品とともに電気泳動され
た。プラスミドＤＮＡ濃度は標品との比較により決定された。
【０１０９】 以下のＤＮＡ構築物が、コード領域の５’−および３’−末端両方の存在に基
づいて標的遺伝子の完全構造配列を持っていると同定された：
【０１１０】
【表６】
【０１１１】 クローンのサイズ（括弧内）はＮｏｔＩによる制限消化、続いてのパルスフィ
ールドゲル電気泳動により決定された。ゲル泳動条件は以下の組であった： 初期スイッチ時間：１秒 最終スイッチ時間：６秒 全運転時間：１２時間 電圧：６ｖ／ｃｍ 角度：１２０°ゲノム構築物からのインビトロ転写の例示 マウス細胞により転写されるべきヒトゲノムクローンの能力を決定するため、
未消化ゲノム構築物が、使用説明書に従い、Ｔｆｘ５０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使
用するリポフェクションによりＭＭ５４細胞（各々のサイトカインの内因性形を
発現するマウス細胞株、ＡＴＣＣ＃６４３４−ＣＲＬ）内へトランスフェクトさ
れた。細胞は、ｍＲＮＡ分析のため４８時間後に採取した。全ＲＮＡはＵｌｔｒ
ｓｐｅｃTM ＲＮＡ単離システム（Ｂｉｏｔｅｃｘ）を使用して調製された。Ｒ
ＮＡ収量を高めるため、エタノール沈殿に先立って１０ｍｇのゼラチンキャリア
蛋白質が加えられた。第一鎖ｃＤＮＡは標準逆転写法により合成された。簡単に
は、ＲＮＡを２９．５ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、１０ｍｌの５ｘ第一鎖緩衝液、
２．５ｍｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５ｍｌの１Ｍ ＤＴＴ、１ｍｌの０．５ｍｇ
／ｍｌランダムプライマー、および２ｍｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。反応液は３７℃で１時間インキュベー
トし、ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出により精製された。生じたＤＮ
Ａは次に２０ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。ヒト特異的転写体は入れ子状態−ＰＣ
Ｒ法により分析した。１ｍｌのｃＤＮＡ試料は最初に第一のＰＣＲプライマー組
で３０サイクル増幅した。その後、反応混合物から５μｌを採り、さらに３０サ
イクル、入れ子状態−ＰＣＲプライマー組で２回目のＰＣＲにかけた。ＤＮＡ試
料は１％アガロースゲルで分離した。 入れ子状態−ＰＣＲのためのプライマー組：
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
【表９】
【０１１５】 以下のゲノムクローンはヒト特異的転写体を産生し、ＥＳ細胞トランスフェク
ションでの使用に選ばれた。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】ヒトサイトカイン遺伝子を含むＥＳクローンの選択 マウス胚幹（ＥＳ）細胞（ＲＡＧ-/-ＥＳ細胞または１２９ｖ／Ｊ野生型ＥＳ
細胞）はヒト造血成長因子の３組の遺伝子でトランスフェクトした。リポソーム
試薬、Ｔｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ）が使用説明書に従って使用された。遺伝
子の各々の組は等モル濃度の３つの直鎖状化成長因子ＤＮＡを含んでいた。第一
のＤＮＡ組（ＧＭ−ＣＳＦ組）はＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含
んでいた。第二のＤＮＡ組（ＩＬ−７組）はＩＬ−７、ＳＣＦおよびＬＩＦを含
んでいた。第三のＤＮＡ組は６つすべての導入遺伝子を含んでいた。ＰＧＫ−Ｈ
ｙｇ（ＲＡＧ-/-ＥＳ細胞に対する）かまたはＰＧＫ−Ｎｅｏ（１２９ｖ／Ｊ野
生型ＥＳ細胞に対する）の選択可能マーカーを持つプラスミドＤＮＡが陽性選択
に使用された。
【０１１８】 簡単には、成長因子ＤＮＡはＮｏｔ１による消化により直鎖状化された。成長
因子ＤＮＡ混合物（２．１８μｇ）および直鎖状化選択可能マーカーＤＮＡ（０
．４２μｇ）を１ｍｌの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で混合し、１７０．６μ
ｇ（９７．５μｌ）のＴｆｘ−５０と１５分間、室温でインキュベートした。マ
ーカー対ＤＮＡ混合物のモル比は４：１であり、Ｔｆｘ−５０対全ＤＮＡ（マー
カーおよび成長因子ＤＮＡ）は２５：１であった。次に、５ｍｌの無血清Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭ培地中の６−９ｘ１０6ＥＳ細胞をＤＮＡ／リポソーム混合物へ加え
、３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞を
採取し、ウェル当たり２．５ｘ１０5ＥＳ細胞濃度で６ウェルプレートへ再プレ
ートした。ヒグロマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）またはＧ４１８（４００μｇ／
ｍｌ）選択はトランスフェクション２４時間後に開始した。薬剤耐性ＥＳコロニ
ーを１０から１４日の選択後に拾い上げた。トランスジェニックＥＳクローンのサザン分析および遺伝子コピー数の決定 遺伝子のすべてのＤＮＡプローブはヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ試料から
ＰＣＲにより発生させ、続いてｐＣＲR２．１−ＴＯＰＯベクター内へクローン
化した。ＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドからＰＣＲ断片が回収され、例えば、
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製さ
れた。
【０１１９】 ヒトＩＬ−７：３５０ｂｐゲノム断片は、全ヒトＤＮＡからプライマー組５１ ＩＬ７Ｆ／５１ ＩＬ７Ｒ（配列番号：３および１４）で増幅された。 ヒトＳＣＦ：１１７３ｂｐ ｃＤＮＡ断片はヒト胚性腎臓細胞株２９３から抽
出されたｃＤＮＡから、プライマー組ｈＳＣＦＳＦ３／ｈＳＣＦＢ−Ｒ（配列番
号：３９および４０）で増幅された。この断片は続いてｐＣＲR２．１−ＴＯＰ
Ｏベクター内へクローン化した。ＥｃｏＲＩ消化後、８０８ｂｐ ＤＮＡ断片は
ゲルから精製され、ＳＣＦを同定するためのプローブとして使用された。
【０１２０】 ヒトＬＩＦ：３８８ｂｐ ＰＣＲ断片（ｈＬＩＦ−３Ｆ／ｈＬＩＦ−３Ｒ）は
サブクローン化され、プローブとして使用された（ｈＬＩＦ−３Ｆ／ｈＬＩＦ−
３Ｒ；配列番号：２１および２２）。
【０１２１】 ヒトＧＭ−ＣＳＦ：ヒト２９３細胞ｃＤＮＡ試料から、４２４ ｃＤＮＡ断片
がプライマー組ＣＴ−ｈＧＭＣＳＦ−Ｆ／ＣＴ−ｈＧＭＣＳＦ−Ｒ（配列番号：
４７および４８）によるＰＣＲにより発生した。
【０１２２】 ヒトＭ−ＣＳＦ：ＰＣＲプライマー組３１ＨＵ−ＭＣＳＦ−Ｆ／３１ＨＵ−Ｍ
ＣＳＦ−Ｒ（配列番号：９および１０）を用いて４００ｂｐプローブを発生させ
た。
【０１２３】 ヒトＩＬ−６：プライマー組５１−ＢＳＦ２−Ｆ／５１−ＢＳＦ２−Ｒ（配列
番号：１１および１２）を用いて２９８４００ｂｐプローブを発生させた。 ＥＳクローンはゲノム配列の存在を確認するため、およびヒトＤＮＡ対照と比
較した相対コピー数を決定するため、サザンブロッティングにより分析された。
各々のＥＳ細胞クローンからの１０・ｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ＩＬ−７および
ＳＣＦに対して）、ＢａｍＨＩ（ＬＩＦおよびＩＬ−６に対して）またはＨｉｎ
ｄＩＩＩ（ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦに対して）で消化し、１％アガロース
ゲルで分離した。ＤＮＡはアルカリ性移送によりナイロン膜へ移した（使用説明
書、Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ）。膜は標準ホルムアミド含有緩衝液（Ａ
ｕｓｕｂｅｌ）を用い、４２℃で一夜プリハイブリダイズした。各々のプローブ
はＰｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して標識さ
れ、膜へ加えられた。ハイブリダイゼーションは回転させながら４２℃で一夜実
施された。膜を２回、各々低ストリンジェンシー緩衝液（２ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ）で１０分間、室温で洗浄した。膜は次に２層のＷｈａｔｍａｎ濾紙で吸
い取って乾燥させ、ホスホスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ
）へ暴露した。イメ−ジはＳＴＯＲＭ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄ
ｙｎａｍｉｃｓ）により定量された。各々の導入遺伝子のコピー数はヒト対照と
比較することにより誘導された。
【０１２４】 ３４００を超える薬剤耐性コロニーが拾い上げられ、これらの内、２６４クロ
ーンがさらに調べられた。これらのコロニーから、１７９ＥＳクローンが注射に
適していることが見出された。これらの注射可能ＥＳクローンの間で、２つは６
遺伝子、１８は５遺伝子および９５クローンは３導入遺伝子を持っていた。
【０１２５】 同一遺伝子のコピー数は異なったクローンで変化した。例えば、クローン６は
ＩＬ−６遺伝子を１コピーを持っていたのに、クローン１５は同じ遺伝子を２コ
ピー持っていた。一方、同一のクローン内で、一つの遺伝子のコピー数は他の遺
伝子とは異なっていた。例えば、クローン１８はＩＬ−７遺伝子の１コピーを持
っており、ＳＣＦ遺伝子を２コピー、およびＬＩＦ遺伝子の３コピーを持ってい
た。トランスジェニックマウスの発生 ヒトサイトカイン遺伝子を含んでいるＥＳ細胞クローンが、Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ（編），Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ−ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７
），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓに記載されているようにトランスジェニックマウスを誘
導するために使用される。ＥＳ細胞は３．５日ｐ．ｃ．Ｃ５７ＢＬ／６胚内へ注
射され、擬妊娠メスの子宮内へ移植され、誕生まで発育させた。オスキメラは野
生型Ｃ５７Ｂｌ／６メスと交配し、生殖系トランスジェニック系統を得た。ヒト導入遺伝子を持つマウスの同定 取り込まれたヒト導入遺伝子を持つマウスを同定するには２つの方法がある：
サザンブロットおよびＰＣＲ分析。その速さおよび実験法の容易さのためマウス
の遺伝子型を決定するためにＰＣＲを使用するのが好適である。しかしながら、
ＰＣＲ結果の正当性には心配があり、結果を確認するためにサザンブロットを実
施すべきである。簡単には、ＤＮＡ試料はマウス尾の先端から標準プロトコール
に従って単離された（Ｑｉａｇｃｎマニュアル，ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｋｉｔ）。ヒト特異的プライマー組を使用するＰＣＲ分析（ゲノムクロー ンの単離 を参照されたい）が各々の導入遺伝子に対して実施された。ヒトＤＮＡ
を含んでいる陽性対照試料およびマウスＤＮＡを含んでいる陰性対照試料もまた
、ＰＣＲ生成物の特異性を確かにするために同時に実施された。予期されたヒト
導入遺伝子を含むマウスのみがさらなる交配および実験のために選択された。
【０１２６】 トランスジェニックマウスの７つの独立した系統がこれまでに確立された。ク
ローン１２およびクローン７１はＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを持
っている。クローン７４およびクローン７５はＩＬ−７、ＳＣＦおよびＬＩＦを
持っている。クローン１８２およびクローン１８５は生殖細胞に６つすべての導
入遺伝子を持っているのに、クローン２０１はＬＩＦを除くそれぞれの遺伝子を
持っている。同一の方法が、マウスの遺伝子型を確認するために繁殖工程を通し
て行われた。ゲノム構築物からのインビボ転写の例示 脾臓、胸腺、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、肺、脳および骨髄を含む各々のトラン
スジェニックマウスからの９つの組織から全ＲＮＡ試料が調製された（ＲＮｅａ
ｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。総ｃＤＮＡは前に説明したように調
製された（ゲノム構築物からのインビトロ転写の例示）。各々の導入遺伝子の遺
伝子発現分析は入れ子状態−ＰＣＲ（前を参照されたい）により実施された。結
果の再現性を確かにするため、各々の遺伝子型で少なくとも２匹のマウスがこの
方法により分析された。
【０１２７】 クローン７１、ヒトＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを持っている、
からのマウスは異なった組織において３つすべての導入遺伝子の発現を示した。
ヒトＩＬ−６は主として脾臓および胸腺で発現された。ヒトＧＭ−ＣＳＦ発現は
胸腺に限定されていた。一方、ヒトＭ−ＣＳＦはより広範囲の組織分布を持って
おり、脾臓、胸腺、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、肺および脳が転写体を持っていた
。クローン７５、ヒトＩＬ−７、ＳＣＦおよびＬＩＦを持っている、からのマウ
スも組織において３つすべての導入遺伝子の発現を示した。ヒトＩＬ−７および
ＳＣＦはＭ−ＣＳＦと類似の広範囲な分布パターンを持っていたが、ヒトＬＩＦ
発現は脳に限定されていた。
【０１２８】 ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ、またはヒトＩＬ−７、ＳＣＦおよ
びＬＩＦを含む他のＥＳ細胞からのマウスも同じ方法で分析された。ある組織で
は発現パターンが異なっていたが、全体のパターンは同様であった。この変異は
、導入遺伝子の挿入部位、および各々の遺伝子のコピー数の相違によるものであ
ろう。マウス内因性遺伝子もまた入れ子状態−ＰＣＲにより分析された。ある種
の特異的組織での相違にも関わらず、発現パターンはヒト導入遺伝子のパターン
と大部分は一致していた。
【０１２９】 血清中および注射マウスから誘導された骨髄間質細胞培養上清液中の蛋白質発
現がＥＬＩＳＡにより試験された。 導入遺伝子発現パターンおよびレベルはクローン、同腹子、同腹子仲間、およ
び同一のマウスからの間質細胞間さえも変化していた。下記の表は４ＥＳ細胞ク
ローンを注射したマウスからのＥＬＩＳＡ結果を提供している。
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】 導入遺伝子転写および翻訳に加え、造血を支える間質細胞の能力が試験された
。 ヒト造血に対するトランスジェニックマウス造血微小環境の効果を試験するた
め、トランスジェニックまたは野生型同腹子に誘導された長期骨髄培養が組織培
養フラスコに準備された。
【０１３２】 培養２週間後、骨髄間質細胞の単層が形成されフラスコの底に付着するであろ
う。造血幹／前駆体細胞が次に間質層に付着する。造血細胞は増殖および分化す
るにつれて、それらは非付着性となり、培養上清に自由に浮いている。造血幹細
胞の増殖および分化の程度を決定するため、分化した細胞の細胞数が計数および
染色できる。
【０１３３】 間質層が形成されたら、マウス造血を除くためおよび間質細胞の増殖を停止さ
せるために培養物は照射された。しかしながら、照射はインビトロでヒト造血を
支える間質細胞の能力は維持されている。照射後、ヒト臍帯血単核細胞が培養物
に加えられた。細胞計数は週に１回行われ、培地の５０％が換えられた。毎週、
非付着細胞が計数され、ＦＡＣＳにより分析された。
【０１３４】 クローン７１トランスジェニックマウスからの間質細胞は、インビトロにおい
てクローン１２およびクローン７５よりも良好にヒト造血を支えた。トランスジ
ェニック同時培養から採取された非付着細胞は、クローン７１同腹子から確立さ
れた野生型同時培養よりも、数が多かった。クローン７１および７５トランスジ
ェニックマウスからの間質細胞の混合物は、インビトロにおいて、クローン７１
またはクローン７５単独よりも、非付着細胞性において、より良好にヒト造血を
支えた。
【０１３５】 マウス造血に対するヒト導入遺伝子の効果もまた試験された。ヒトトランスジ
ェニックの発現はクローン７１および７５マウスのトランスジェニック同腹子に
おいて、骨髄Ｂ細胞前駆細胞産生を増加させた。実施例３：機能性植え付けを支える照射Ｈ−２b−＞Ｈ−２dＣ１Ｄ／ＲＡＧ−２ およびＨ−２bＣ２Ｄ／ＲＡＧ−２骨髄キメラの能力 ＭＨＣが同種異系の植え付けを容易にするために必要かどうかを評価するため
に、ＭＨＣクラスＩ欠損（Ｃ１Ｄ）／ＲＡＧ−２およびクラスＩＩ欠損（Ｃ２Ｄ
）／ＲＡＧ−２マウスが試験された。非照射同種異系Ｃ１Ｄ／ＲＡＧ−２キメラ
は、キメラが末梢血に１０％より多いドナーＢリンパ球を含んでいる場合、抗原
特異的ＩｇＧ抗体を産生した。比較して、Ｃ１Ｄ／ＲＡＧ−２宿主の照射（８０
０ラド）は、末梢血中のＢ細胞のより高いパーセントを伴う、ドナー細胞植え付
けレベルの相対的増加を導いた。これらのキメラのすべてがＫＬＨに対する良好
な抗原特異的ＩｇＧ抗体を産生した。同種異系Ｃ１Ｄ／ＲＡＧ−２キメラの機能
性植え付けに、照射条件付けが絶対的な要求であることは観察されていないが、
照射宿主は細胞性および機能性植え付けをより広範に支えた。
【０１３６】 同種異系Ｃ１Ｄ／ＲＡＧ−２キメラと対照的に、非照射Ｃ２Ｄ／ＲＡＧ−２マ
ウスは細胞性同種異系の植え付けを支えることができず、従って、照射による前
条件付けが使用された。８００Ｒの照射を受けたＨ−２b−＞Ｈ−２bＣＣ２Ｄ／
ＲＡＧ−２マウスは有意に良好であった。ＣＤ４＋細胞の相対パーセントはＣ１
Ｄ／ＲＡＧ−２キメラと比較して減少しているが（それは宿主発現ＭＨＣクラス
ＩＩ分子の不在と相関している）、ＣＤ４発育が存在していた。これらのキメラ
は免疫後に抗ＫＬＨ抗体応答を惹起し、これらのマウスの機能性植え付けを示し
ている。このことは、ＲＡＧ−２マウスの機能性植え付けには、クラスＩまたは
クラスＩＩのどちらもレシピエントで絶対的には必要とされないことを示唆して
いる。ドナーＭＨＣ拘束免疫性を支えることにおけるＭＨＣハプロタイプ依存性の評価 以下の実験が実施され、ＲＡＧ−２突然変異は同種異系のＨＳＣの機能性発育
を支えるための“普遍的”特性を与えるという結論が導かれた。
【０１３７】 以下の同種異系および同遺伝子型骨髄キメラが製造された： （ｉ）Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２d）−＞Ｂａｌｂ／ｃ ＲＡＣ−２（Ｈ−２d）宿
主 （ｉｉ）Ｃ５７Ｂ１／６（Ｈ−２b）−＞Ｂａｌｂ／ｃ ＲＡＧ−２（Ｈ−２d ）宿主 （ｉｉｉ）Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２d）−＞１２９ ＲＡＧ−２（Ｈ−２b）宿主 （ｉｖ）Ｃ５７Ｂ１／６（Ｈ−２b）−＞１２９ ＲＡＧ−２（Ｈ−２b）宿主 （ｖ）Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２d）−＞Ｃ５７Ｂ１／６ ＳＣＩＤ（Ｈ−２b）宿
主 （ｖｉ）Ｃ５７Ｂ１／６（Ｈ−２b）−＞Ｃ５７Ｂ１／６ ＳＣＩＤ（Ｈ−２b ）宿主 第一の組のキメラ（ｉ−ｉｖ）は、Ｈ−２ｄバックグラウンドのＲＡＧ−２変
異体マウスが同種異系ドナー特異的免疫性を支える能力を持っているかどうかを
決定するために設計された。これらのキメラのすべてが機能性植え付けを支持し
た。
【０１３８】 第二の組のキメラ（ｖ−ｖｉ）は、同種異系ドナー特異的免疫性を支えるため
のＳＣＩＤ変異体マウス、Ｈ−２ｂバックグラウンド、の能力を試験するために
製造された。同種異系キメラは同遺伝子型群と比較して植え付けは非常に悪く（
胸腺は試料としては小さすぎた）、それは報告されているＨ−２bＳＣＩＤ内へ
のＨ−２dの結果と非常に類似している。これらの結果は、ＭＨＣハプロタイプ
のＴリンパ球非依存性の細胞発生を支えることに対してＳＣＩＤおよびＲＡＧ−
２間には著しい相違が存在することを示唆している。
【０１３９】 ＲＡＧ−２宿主が関連のないハプロタイプを持つドナーからの機能性植え付け
を支えることができるかどうかを評価するため、Ｈ−２k ＡＫＲ−＞Ｈ−２b
ＲＡＧ−２キメラが製造された。これらのマウスはドナー由来免疫性を支えた。
【０１４０】 一緒にすると、これらの結果は、ＲＡＧ−２突然変異はハプロタイプに関係な
く、異なったドナー系統からの骨髄の同種異系の植え付けを支えることを示して
いる。このことは、これらのマウスは任意のドナーからの造血を支えることがで
きることを示唆している。ドナー由来免疫性に対する他の突然変異の評価 ＲＡＧ−２マウスは、ＲＡＧ−１およびＴＣＲβ／δマウスにおける移植研究
（宿主Ｂ細胞を除去するために照射）が実施されるまで、ドナー拘束免疫性を支
えることにおいて、他の免疫不全系統と比較して独特であるようであった。非照
射ＲＡＧ−１キメラは同種異系ドナーからの植え付けを支えていないが、照射（
８００ラド）ＲＡＧ−１マウスは機能性植え付けを支えた。ＲＡＧ−１およびＲ
ＡＧ−２遺伝子の両方ともＴおよびＢリンパ球レセプター再配置を開始するため
に必要とされている。加えて、照射ＴＣＲβ／δマウスもまたドナー由来免疫性
を支えることを研究で示された。チトクローム−ｃ特異的ＴＣＲトランスジェニック（Ｈ−２kクラスＩＩ拘束）
−＞Ｈ−２bＲＡＧ−２骨髄キメラは同起源ＭＨＣクラスＩＩ分子の宿主発現不
在下でドナーＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞性植え付けを支える ドナー由来免疫性の機構を決定するために、ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＴｃｒＡＮＤ）
５３ＨｅｄマウスがＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られ、ＡＫＲ
（Ｈ−２k）マウスへ戻し交雑して、ＴＣＲ−トランスジェニック（ＴＣＲ−ｔ
ｇ）Ｔ細胞（Ｉ−Ｅk状況下でｃｙｔ−ｃを認識する）の陽性選択のために適し
たＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉ−Ｅk）が提供される。これらのマウスからの骨髄
は、トランスジェニックＴ細胞のための同起源ＭＨＣクラスＩＩレセプターを発
現しないＨ−２bＲＡＧ−２マウスを植え付けるのに使用される。このことはト
ランスジェニック骨髄細胞のための宿主微小環境を作り出し、それはクラスＩＩ
ノックアウトバックグラウンドと機能的に等価である。ドナーＴ細胞発育は従っ
て、ドナー由来抗原提示細胞に依存するようになり、ＴＣＲ−ｔｇ Ｔ細胞を陽
性に選択する。
【０１４１】 ＴＣＲｔｇｘＡＫＲ−＞ＲＡＧ−２キメラ中の胸腺細胞パーセンテージは野生
型ＡＫＲ−＞ＲＡＧ−２マウスと同様であった。これらのキメラの両方とも、Ｔ
ＣＲｔｇｘＡＫＲドナーマウスと比較すると全体で低いＴ細胞のパーセンテージ
を持っており、同種異系ＲＡＧ−２キメラの他のハプロタイプ組み合わせと一致
している。Ｂ細胞再構成のレベルは比較的高かった（１０％を超える）。ＴＣＲ
ｔｇｘＡＫＲ−＞ＲＡＧ−２およびＡＫＲ−＞ＲＡＧ−２の両方が、抗原特異的
ＩｇＧ抗体を産生するそれらの能力を決定するためにチトクロームｃで免疫され
た。実施例４．ヒトＨＬＡクラスＩＩ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの 開発 本発明の別の態様は、マウスのＭＨＣクラスＩＩ−運搬組織におけるヒトＨＬ
ＡクラスＩＩ分子の発現を含んでいる。この実施例において、ドナーＨＳＣが導
入され、それはトランスジェニックＨＬＡクラスＩＩ分子と同じＨＬＡハプロタ
イプを発現する。この組み合わせは、宿主組織（特に胸腺）上で発現されたトラ
ンスジェニックＨＬＡクラスＩＩ分子環境で発育したドナーＴリンパ球、および
ドナー由来Ｂリンパ球間の同起源の相互作用を提供する。ＤＲ３ハプロタイプの
ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子を発現するトランスジェニックマウスを作製するため
の方法が教えられるが、これらの方法は、集団中の他の個体を表している応答を
評価する目的で、クラスＩ遺伝子のものを含む任意の望まれるＨＬＡハプロタイ
プへ応用できる。リポフェクションのためのＹＡＣ ＤＮＡ調製 はＨＬＡクラスＩＩ領域の約５５０ｋｂに及んでいる（Ｒａｊｇｏｕｓｓｉｓ
ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：３１３
５−３１３８（１９９２）およびＲａｇｏｕｓｓｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｓｕｊ
ｉ，ｅｔ ａｌ．（編）ＨＬＡ １９９１，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９２））。それは一つの末端がＲＩＮＧ３遺伝子に接しており、および
反対の末端はＤＲａに接している。それはＤＲ３ハプロタイプのＤＲａ、ＤＲｂ
、ＤＱａおよびＤＱｂ鎖を含んでいる。
【０１４２】 ４Ｄ１ ＹＡＣを含んでいる酵母培養物をＡＨＣ培地で増殖させた。約３ｘ１
０９細胞／ｍｌを含んでいる、１％低融点アガロース中にアガロースブロックを
形成させた。ＹＡＣは１％低融点アガロースでのパルスフィールドゲル電気泳動
により酵母染色体から分離された。泳動条件は：２００Ｖ、４０時間持続、５０
秒スイッチ時間であった。電気泳動後、外側縁および真ん中で、ゲルを縦に切断
した。三つのスライスはエチジウムブロミドで染色し、宿主染色体に関して４Ｄ
１ ＹＡＣの位置を可視化した。４Ｄ１ ＹＡＣの位置を刻み目で印を付け、マ
ーカー片を、非染色ゲル部分で再整列させた。４Ｄ１ ＹＡＣを含んでいる水平
バンドを、刻み目の位置に基づいて切り出した。
【０１４３】 ４Ｄ１ゲルスライスは回転するプラットフォーム上、各々１Ｘゲラーゼ緩衝液
（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１時間、２回平衡化した
。二回目のゆすぎ後に緩衝液を交換し、４℃で一夜放置した。酵母ＤＮＡ注入量
に基づくと、全ゲル中の４Ｄ１ ＤＮＡの見積もり量は約８ｍｇであった。次の
日、ゲルスライスを各々約１グラムの重量の２０ブロックに切断し、個々のチュ
ーブ内に置いた。ゲル断片は７０℃、２０分で溶け、４５℃で１５分間平衡化し
た。チューブ当たり１０単位のゲラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，１単位／ｍｌ）を加え、４５℃で４５分間インキュベートした。ゲ
ラーゼ工程は繰り返された。ＥＳ細胞内へのＹＡＣ ＤＮＡのトランスフェクション 各々のアガロースブロックは約４００ｎｇのＹＡＣ ＤＮＡを含んでいる（ま
たは４００ｎｇ／ｍｌ）。ネオマイシン耐性プラスミド（ＰＧＫｎｅｏ）を約４
：１のモル比で加えた（ゲルブロックｍｌ当たり２０ｎｇ）。Ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔａｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ ロット３１８４０２）を５０：１ 重量：重量比で
加え（ゲルブロックｍｌ当たり１９ｍｇ）、混合物は室温で１時間放置した。Ｅ
Ｓ細胞は前の日に１：２に分割されており、１００ｍｍプレートへ播種されてい
る。細胞はトランスフェクション当日にトリプシン処理されており、無血清ＥＳ
培地に３ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁されている。１ｍｌのＥＳ細胞を８ｍｌの
無血清ＥＳ培地を含む６０ｍｍディッシュに置いた。１ｍｌのＤＮＡ／脂質混合
物を加え、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。その後、リポフェクショ
ン／ＥＳ細胞混合物を１００ｍｍディッシュ当たり１ｘ１０6ＥＳ細胞でフィー
ダーセル上に置いた。Ｇ４１８（４００ｍｇ／ｍｌ）を次の日に加え、クローン
が現れるまで９−１２日の間、１日おきに培地を交換した。個々のクローンを拾
い上げ、９６ウェルで増殖させた。細胞は二重の９６ウェルプレート内へ１：２
に分割した。一つのプレートはその場所で凍結し、他方はＤＮＡ分析のために採
取した。４Ｄ１−陽性クローンの特徴付け 全ＹＡＣの存在は、全５５０ｋｂに及ぶ６つの遺伝子のためのＰＣＲプライマ
ーを使用して決定された：ＴＡＰ−１、ＴＡＰ−２、ＤＱｂ、ＤＱａ：ＤＲｂお
よびＤＲａ。最初のスクリーニングはＴＡＰ−１およびＤＲａプライマー組を含
んでいる。これら二つの末端領域遺伝子に二重陽性であるクローンは４つのプラ
イマー組の残りでさらにスクリーニングした。
【０１４４】
【表１２】
【０１４５】 すべての生成物サイズは３００ｂｐである。
【０１４６】
【表１３】
【０１４７】トランスジェニックマウスの発生 クローン４Ｄ１．１８が、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（編），ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣ
ＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ−Ａ ＰＲ
ＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（１９８７）．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、に記載
されているようにトランスジェニックマウスを誘導するために使用される。ＥＳ
細胞は３．５日ｐ．ｃ．Ｃ５７ＢＬ／６胚内へ注射され、擬妊娠メスの子宮内へ
移植され、誕生まで発育させた。キメラオスは野生型Ｃ５７Ｂｌ／６メスと交配
し、生殖系トランスジェニック系統を得た。トランスジェニックマウスの抗体応答 ４匹のＤ１／Ｃ２Ｄ／ＲＡＧ−２（ＨＬＡ−トランスジェニック）マウスから
血液を採り、それらの血清はＦＡＣＳ分析を使用して、Ｉ−Ｅアルファ、Ｉ−Ｅ
ベータおよびＤＲアルファ発現が試験された。表面ＤＲを発現するが、Ｉ−Ｅア
ルファを発現しないことが確認されたマウスが機能性試験に選ばれた。これらの
マウスは足蹠に５０μｇ／ｍｌで免疫された。３つの蛋白質が免疫原として使用
された。２つは真菌プロテアーゼであり、三番目のものはインビトロヒトＴ細胞
エピトープアッセイで減少したアレルゲン性であることが観察されている２つの
蛋白質のハイブリッドであった。蛋白質は足蹠当たり１００μｌの総容量のＣＦ
Ａで乳化し、２週間後、別の足蹠に同じ濃度のＩＦＡで追加免疫した。免疫マウ
スは１週間後に血液を採り、血清試料の適切な蛋白質に対する抗体をＥＬＩＳＡ
で試験した。動物の第二の組は抗体応答のために免疫されたが、異なったプロト
コールが使用され、それは以下のようである：マウス当たり１００μｌの総容量
のＣＦＡで乳化された同じ３つの蛋白質の５０μｇ／マウスで腹腔内で免疫され
、２週間後に同じ濃度のＩＦＡで追加免疫された。マウスは１週間後に血液を採
り、血清試料の抗体を試験した。
【０１４８】 これらのトランスジェニックマウス中のＴ細胞が正常に機能しているかどうか
を評価するために、主要なＴ細胞エピトープであることが知られている陽性対照
免疫原性ペプチド（ＨＳＰ６５１−２０）が使用された。マウスはＧｅｌｕｋ
ｅｔ．ａｌ．により以前に報告されているプロトコールに従って免疫された。膝
窩リンパ節をとり、Ｔ細胞増殖アッセイ（またＧｅｌｕｋ ｅｔ．ａｌ．により
報告されている）を使用してＴ細胞増殖を評価した。
【０１４９】 一連の実験の要約は以下のようである。
【０１５０】
【表１４】
【０１５１】 この結果は、これらのトランスジェニックマウスにおける免疫系は機能的に無
傷であり、ＤＲ３特異的免疫応答を評価するために使用してもよいことを示唆し
ている。実施例５．ヒト造血幹細胞でのトランスジェニック免疫不全マウスの植え付け ヒトＩＬ−３、ＩＬ−７、ＳＣＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ、ＯＭおよ
びＧＭ−ＣＳＦを発現するトランスジェニック免疫不全マウスはヒト造血幹細胞
源で植え付けされる。植え付けのための年齢は誕生後約７２時間である。好適な
ドナー細胞源は臍帯血である。この実施例のためには、ドナー細胞のハプロタイ
プは特異的抗原に対する特定個体の応答性を決定するため（例えば、集団内の蛋
白質またはペプチドのアレルゲン性を決定する目的のため）、問題とする試験集
団に基づいて選択される。移植のための材料源 ヒト臍帯血（ＣＢ）はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｃ Ｒｅｓｏｕｒ
ｃｅｓ Ｉｎｃ（ＡＢＲ），Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰｕｒｅｃｅｌｌ，Ｓ
ａｎ Ｍａｔｅｏ，ＣＡから得ることができる。ＣＢは地方病院からＡＢＲによ
り集められ、２４時間内に出荷されおよび現場で処理される。もしくは、ヒト骨
髄（ＢＭ）、ＣＢおよび／またはＭＰＢ細胞は、新鮮または凍結細胞、および分
画または未分画細胞としてＰｕｒｅｃｅｌｌから得られる。使用前に、すべての
試料はＢ型およびＣ型肝炎およびＨＩＶが試験された。ウイルス陽性であること
が観察された試料を含んでいる実験材料は即座に廃棄され、動物は除去され、印
を付け、汚染動物死体廃棄のための方法に従って廃棄された。実験進行を通して
、すべての試料は、それらが病原体を運んでいるヒト血液で汚染されているかも
しれないという仮定の下で処理されるべきである（生物安全性レベル２、ＢＬ−
２）。ヒト血液細胞を持つマウスを扱うすべての人はＢ型肝炎ワクチンを受ける
べきである。
【０１５２】 ＣＢ−１７／ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは現在の所、本分野で働
いている研究者が選択すべき系統であるから、それらは実験対照として移植を受
ける（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９４：５３２０−５３２５（１９９７），Ｃａｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏ ｏｄ ８９：４３０７−４３１６（１９９７），Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌ
ｏｏｄ ９０（１）：８５−９６（１９９７），Ｖｏｒｍｏｏｒ，ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ８３：２４８９−２４９７（１９９４）およびＷａｎｇ，ｅｔ ａ
ｌ．Ｂｌｏｏｄ ８９：３９１９−３９２４（１９９４））。
【０１５３】 最後に、ヒトサイトカイン遺伝子を発現しているヒトＨＬＡ ＤＲトランスジ
ェニックマウスが移植を受ける。マウス組織におけるヒト主要組織適合抗原遺伝
子産物の発現は、胸腺細胞発生の代わりの発生経路を提供する。マウスに注射するための方法 ＨＳＣ濃縮集団は静脈内に注射される（ｉ．ｖ．）。新生児マウスは５０μＬ
以上の細胞を受けるべきではない。眼静脈がよく見えるように光源下に子供が固
定される。針は静脈と平行に保ち、皮膚表面直下にねらいを定めながら挿入する
。細胞はゆっくり注入し、その間血液が針の所の下流で清澄化されていること、
および静脈の周辺で膨潤が起こっていないことを決定するために凝視する。注射
後、細胞が循環系に入るのを可能にするため、針はその場所で１０−３０秒保つ
。動物は温かく保ち、眼は回復するまで湿らせる。必要に応じ、子供はその活動
を減少させるために氷上で短時間冷してもよい。マウスの分析 ２週間から数ヶ月の種々の時間間隔で、マウスはヒト免疫細胞の再構築が分析
される。末梢血が眼窩洞または尾静脈から抜かれ、ヒト造血細胞細胞に特異的な
モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーにより分析される。動物を
殺し、その末梢免疫系器官がフローサイトメトリーにより、ヒト細胞の存在が試
験される（Ｐｆｌｕｍｉｏ，ｅｔ ａｔ．Ｂｌｃｏｄ ８８：３７３１−３７４
０（１９９６）；Ｄｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ Ｓｕｐ
ｐｌ Ｉ：１９９−２０３（１９９７）；Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ ．Ｈｅｍａｔｏｌ ．２６：３３２−３４４（１９９８）；Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａ
ｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３：２３６
−２４６（１９９７）；Ｈｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９０：８５−９
６（１９９７）；およびＬａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ７
５：６６４−６７３（１９９７））。有糸分裂刺激、同種異系または異種細胞へ
の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、およびイムノグロブリンの異なったクラスを誘
導する能力のような、成熟ヒト細胞の機能性特徴が決定される。特異的蛋白質、
ペプチドまたは糖蛋白質による免疫化が、抗体の特定のサブクラスおよび抗原特
異的Ｔ細胞応答を誘導する能力を決定するために実施される。実施例６．機能性ヒト免疫細胞を得るための方法 四つの型のヒトＨＳＣキメラが本発明により描かれた。宿主マウスの系統はす
べて、ヒトドナーＨＳＣを支えるために必要な種特異的因子を提供するヒト成長
因子導入遺伝子を含んでいる。宿主系列はその免疫不全性の性質により、および
それらがＨＬＡ分子のトランスジェニック発現を含んでいるかどうかで変化する
。
【０１５４】 キメラの第一の型は、ヒトＣＴＧを含むＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２変異体マ
ウスから成っている。実施例１に示したように、同種異系ＲＡＧキメラはドナー
拘束免疫応答を支える能力を示す。それ故、ＣＴＧ ＲＡＧマウスは、臍帯血か
らのヒトＨＳＣで植え付けられ、抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を提供すること
で機能するヒトＴおよびＢリンパ球を発生する。新生児または成体マウス両方の
植え付けは、造血誘導抗原提示細胞の宿主およびドナーの両方が存在する混合骨
髄キメラを導く。混合キメラ化の主たる生物学的効果は、ドナーおよび宿主起源
のＡＰＣにより仲介される、“宿主”−反応性Ｔ細胞の陰性選択である。このこ
とはドナーおよび宿主ＭＨＣハプロタイプの両方に陰性であるＴ細胞の発生を導
くが、ＭＬＲにおいて同種異系または異種抗原の両方と反応する可能性がある。
胸腺と独立して発生したＴ細胞もまたＣＴＧ宿主により支持される。これらには
主として小腸および大腸の腸管上皮リンパ球、および他の腸関連リンパ球組織（
ＧＡＬＴ）が含まれる。
【０１５５】 ＲＡＧマウスはドナーハプロタイプ拘束Ｔ細胞の発生を支えるが、胸腺細胞の
主発生経路には胸腺上皮細胞上に発現されたＭＨＣ分子環境での陽性選択が含ま
れる。第二の型のキメラはそれ故、内因的にＭＨＣ分子を発現する宿主組織中で
ヒトＨＬＡ遺伝子をまた発現するヒトＣＴＧ ＲＡＧマウスから成っている。こ
のことは、ドナーヒトＨＳＣがＲＡＧ変異体宿主中で発生する追加の経路を提供
し、導入遺伝子のＨＬＡハプロタイプに拘束されているいくつかのＴ細胞を生じ
る。成熟Ｔ細胞が続いて同起源のＴ細胞レセプター：ＨＬＡ相互作用を通してド
ナー由来Ｂリンパ球と相互作用するように、ドナーＨＳＣのＨＬＡハプロタイプ
とトランスジェニックＨＬＡ分子のハプロタイプが一致するのが好ましい。
【０１５６】 キメラの第三の型は、ＲＡＧ遺伝子中の突然変異以外の手段により遺伝子的に
免疫不全であり、ドナーＨＳＣ源として同一のハプロタイプのヒトＨＬＡ導入遺
伝子を発現するマウスで製造される。例えば、ヒトＧＦＴＧ ＳＣＩＤマウスは
ＤＲ３クラスＩＩトランスジェニックマウスと交配され、ＨＬＡ ＤＲ３ハプロ
タイプＨＳＣを植え付けるために使用される。ヒトＴリンパ球のいくつかはＨＬ
Ａ ＤＲ３クラスＩＩ分子環境下で陽性に選択され、ＤＲ３ドナーＢリンパ球と
相互作用できて抗原特異的抗体を産生する。
【０１５７】 キメラの第四の型は、ドナーＨＳＶ源として同一のハプロタイプのヒトＨＬＡ
導入遺伝子を発現する免疫適格ヒトＣＴＧマウスにおいて製造される。ヒトＨＳ
Ｃを植え付けるため、これらの宿主はその内因性免疫系を枯渇させなければなら
ない（例えば、致死線量の照射または他の方法で）。リンパ球発生のパターンは
上記第三の型のキメラと類似している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は同種異系の骨髄植え付けＲＡＧマウスがドナーおよび宿主
ＭＨＣには陰性であるが、第三者同種異系抗原へは応答性であることを示してい
る。ＣＤ４+Ｔ細胞は、クラスＩＩ+およびＣＤ８+細胞の細胞毒性除去により、
同遺伝子型移植ＲＡＧマウス（ＲＡＧ−（ｓｙｎ），Ａ）；同種異系移植ＲＡＧ
マウス（ＲＡＧ−（ａｌｌｏ），Ｂ）；同遺伝子型移植ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩ
Ｄ−（ｓｙｎ），Ｃ）；同種異系移植ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）
，Ｄ）；およびＲＡＧマウス，Ｅ）パネルＤに示されたＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）
マウス中に置かれたものと同一の骨髄調製物を移植、骨髄接種の陽性対照として
、のリンパ節から単離された。 ＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｂａｌｂ／Ｃ（ダイヤ型）；Ｃ５７Ｂｌ／６（四角）；Ｃ
ＢＡ（丸、パネルＡおよびＢ）または（Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＣＢＡ）Ｆ１マウス（
丸、パネルＣ、ＤおよびＥ）からの照射されたＬＰＳ誘導脾臓芽細胞と共培養さ
れた。増殖は日（ｄ）＝５に比色法で評価され（Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ；Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）、ｙ軸にＯＤ490ｘ１０００として報告されている。バックグラウンド
吸収は差し引かれている。
【図２】 図２はＲＡＧ−（ａｌｌｏ）マウスによる抗原特異的ＩｇＧ応答
を示している。図２Ａにおいて、対照Ｂａｌｂ／ｃマウス（白三角）、ＲＡＧ−
（ａｌｌｏ）（黒四角；マウス＃３０）、ＲＡＧ−（ｓｙｎ）マウス（白四角；
マウスＲＮ０００３）およびＳＣＩＤ−（ａｌｌｏ）マウス（黒丸；二匹ＳＮ０
０５およびＳＮ００６が示されている）、は後肢足蹠に、完全フロイントアジュ
バント（ＣＦＡ）に乳化した総量で５０μｇのニワトリ卵白色リゾチーム（ＨＥ
Ｌ）で免疫した。２週間後、動物は同量のＨＥＬを含む不完全フロイントアジュ
バント（ＩＦＡ）を用いｉ．ｐ．で追加免疫した。追加免疫１週間後、動物から
血液を採り、血清でのＨＥＬ−特異的ＩｇＧの存在をＥＬＩＳＡにより試験した
。ｙ軸はＯＤ490ｘ１０００を表している。図２Ｂにおいて、ＲＡＧ−（ｓｙｎ
）マウス（縞のある棒線；マウス＃６１および６２）およびＲＡＧ−（ａｌｌｏ
）マウス（小さなはん点のついた棒線；マウス＃４６および５１）はｄ＝０にＣ
ＦＡに乳化した総計で５０μｇのＫＬＨを用いて後肢足蹠に免疫した。動物は２
週間後皮下にＩＦＡ中のＫＬＨで追加免疫した。血清試料はｄ＝０、１４および
２１日に採取し、ＫＬＨ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより試験した。グラフ上の
無地の棒線は個々の対照マウスを表している：（Ｃ５７Ｂ１／６ｘｌ２９）Ｆ１
マウスは白い棒線により表され、Ｂａｌｂ／ｃマウスは灰色の棒線により表され
ている。ｙ軸は血清の１：１０００希釈のＯＤ415-490ｘ１０００を表している
。ｘ軸は初回免疫化後の日数を表している。特異性はＨＥＬ被覆プレート上での
ＥＬＩＳＡにより試験された；交差反応性は観察されなかった。
【図３】 図３は抗原特異的Ｔ細胞増殖応答が、新生児で構築されたＲＡＧ
−（ａｌｌｏ）キメラにおいては、ドナーおよび宿主ＭＨＣの両方で拘束されて
いることを表している。ＲＡＧ−（ａｌｌｏ）マウス＃１３５（Ａ）および１３
６（Ｂ）はＣＦＡ中のＫＬＨを用いて後肢足蹠に免疫された。１０日後、ドレイ
ニングリンパ節を取り出し、細胞毒性除去によりＢ細胞およびマクロファージを
枯渇させた。得られたリンパ節Ｔ（ＬＮＴ）細胞はＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂ
ｌ／６マウスからのマイトマイシンＣ固定、抗原パルス処理ＬＰＳ−芽細胞と２
：１の比で３日間共培養した。増殖性応答は比色アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
；Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量された。バックグラウンド応答は差し引かれ
ている。免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウスからのＬＮＴは抗原パルス処理Ｂａｌｂ／ｃ
芽細胞へ応答してＯＤ490ｘ１０００＝５４７を与えた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハーディング，フィオナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95050， サンタ・クララ，ルイス・ストリート 772 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA26 BA30 BA80 CA02 CA09 CA20 DA02 FA10 GA13 GA27 GA30 HA11 HA13 HA14 HA20

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 レシピエント哺乳類であって 免疫系を維持することができる外因性サイトカイン；および 造血幹細胞特性を持つドナー特異的細胞に由来する細胞を含んでいる哺乳類；
    ここでレシピエント哺乳類はドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることが
    できる。
  2. 【請求項２】 該哺乳類がマウスである、請求項１に記載の哺乳類。
  3. 【請求項３】 該サイトカインが該造血幹細胞特性を持つドナー特異的細胞
    に由来する細胞と同一の種からのものである、請求項１に記載の哺乳類。
  4. 【請求項４】 該サイトカインがＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｍ−ＣＳ
    Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＬＩＦ、およびオンコスタチン−Ｍから成る群より
    選択される、請求項１に記載の哺乳類。
  5. 【請求項５】 該サイトカインがＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｍ−ＣＳ
    Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦから成る、請求項４に記載の哺乳類。
  6. 【請求項６】 該サイトカインが該哺乳類にトランスジェニック的に導入さ
    れる、請求項１に記載の哺乳類。
  7. 【請求項７】 造血幹細胞特性を持つ細胞に由来する該細胞が哺乳類には異
    種である、請求項１に記載の哺乳類。
  8. 【請求項８】 該細胞がヒト細胞である、請求項７に記載の哺乳類。
  9. 【請求項９】 該細胞が造血幹細胞である、請求項１に記載の哺乳類。
  10. 【請求項１０】 該造血幹細胞が臍帯血に由来する、請求項９に記載の哺乳
    類。
  11. 【請求項１１】 該細胞が胚性幹細胞である、請求項１に記載の哺乳類。
  12. 【請求項１２】 造血幹細胞特性を持つ細胞に由来する細胞が分化されてい
    る、請求項１に記載の哺乳類。
  13. 【請求項１３】 分化した細胞が骨髄系系列のものである、請求項１２に記
    載の哺乳類。
  14. 【請求項１４】 分化した細胞がリンパ球系系列のものである、請求項１２
    に記載の哺乳類。
  15. 【請求項１５】 分化した細胞が赤血球系系列のものである、請求項１２に
    記載の哺乳類。
  16. 【請求項１６】 ドナー免疫系を持つ哺乳類を作製する方法であって、以下
    の工程を含んでいる： ＶＤＪ組換えが欠損している哺乳類に導入遺伝子を導入し、ここで該導入遺伝
    子はドナー由来造血細胞の維持および成熟に必要なサイトカインをコードしてい
    る； 該哺乳類に造血幹細胞特性を持つ細胞を導入する。
  17. 【請求項１７】 該ドナー免疫系が異種免疫系である、請求項１６に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】 該ドナー免疫系がヒト免疫系である、請求項１７に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 導入遺伝子を導入する工程が前核移植を通したものである
    、請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 導入遺伝子が胚性幹細胞にある、請求項１６に記載の方法
    。
  21. 【請求項２１】 導入遺伝子を導入する工程が該哺乳類と導入遺伝子を含む
    哺乳類との繁殖を通したものである、請求項１６に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 哺乳類がＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２マウスである、請求
    項１６に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該サイトカインがＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｍ−Ｃ
    ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＬＩＦ、およびオンコスタチン−Ｍから成る群よ
    り選択される、請求項１６に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該サイトカインがＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｍ−Ｃ
    ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦから成る、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該ドナー由来造血細胞がヒトからのものである、請求項１
    ６に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該哺乳類がさらにＭＨＣ導入遺伝子を含む、請求項１に記
    載の哺乳類。
  27. 【請求項２７】 該ＭＨＣ導入遺伝子がヒトＨＬＡ導入遺伝子である、請求
    項２６に記載の哺乳類。
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Renshaw Humoral Immune Responses in CD40 Ligand-deficient Mice By Blair R. Renshaw,* William C. Fanslow III,* Richard J. Armitage,* Kim A. Campbell,* Denny Liggitt,~ Barbara Wright,* Barry L. Davison,* and Charles R. Maliszewski

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