JPH04267830A - 非ヒトキメラ哺乳動物 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】発明の分野
本発明は、長期に安定な、異種好ましくはヒト造血細胞
系統を有する非ヒトキメラ哺乳動物、およびその作成方
法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトドナーお
よび重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスからの骨髄
細胞の二重移植によって得られる、長期に安定なヒトＢ
およびＴ細胞を有するキメラマウスに関し、これはヒト
モノクローナル抗体の製造に使用できる。
系統を有する非ヒトキメラ哺乳動物、およびその作成方
法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトドナーお
よび重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスからの骨髄
細胞の二重移植によって得られる、長期に安定なヒトＢ
およびＴ細胞を有するキメラマウスに関し、これはヒト
モノクローナル抗体の製造に使用できる。
【０００２】背景技術の説明
免疫不全動物は、造血疾患の研究のための実験モデルと
して使用されている。異種骨髄の移植は、たとえばラッ
トとマウスのような近縁関係の種の間でのみ成功してい
る（ｖａｎ Ｂｅｋｋｕｍ，Ｄ．Ｗ． ＆ Ｌｏ
ｗｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．：Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８５の総説参照）。最近、ヒト起源の
免疫系を有するマウスの作成が試みられている。このよ
うな動物は、ヒト造血細胞やヒト免疫系の研究に使用で
きる。一例としては、ヒト免疫系からの細胞を「重症複
合免疫不全症」（ＳＣＩＤ）と呼ばれる遺伝状態を有す
る自然変異株マウスへ移植することによって得られるＳ
ＣＩＤ−ｈｕマウスがある（ＭｕＣｕｎｅ，Ｊ．Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，１６３２−１６３
９，１９８８；Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ：
Ｎａｔｕｒｅ ３３５，２５６−２５９，１９８８）
。これらのモデルにおけるヒト細胞の移植ははじめてマ
ウスへのＨＩＶの感染を可能にしたが（Ｎａｍｉｋａｗ
ａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，
１０５５，１９９０）ヒト細胞の生存は極度に限られて
いた。移植後２〜３カ月を過ぎるとマウスの末梢血には
、有意な数のヒトリンパ球は検出されなかった。しかも
、ＭｃＣｕｎｅのモデルでは、ＳＣＩＤマウスに移植さ
れたヒト胎児肝からの造血幹細胞は、腎線維膜下に移植
できるヒト胎児胸腺上皮の移植を補充しないことには、
接木されないかまたはＴ細胞に分化されない（ＭｃＣｕ
ｎｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌおよびＮａｍｉｋａｗａ，
Ｒ．ｅｔ ａｌ、いずれも前出）。他のマウスモデル
は、ヒト造血幹細胞の、遺伝的な免疫不全Ｂｇ／Ｎｕ／
Ｘｉｄマウスへの移植に基づくものである。この場合も
、ヒトリンパ球は移植片対宿主病を誘導しなかった（Ｋ
ａｍｅｌ−Ｒｅｉｄ，Ｓ．＆ Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．：
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１７０６，１９８８）。
して使用されている。異種骨髄の移植は、たとえばラッ
トとマウスのような近縁関係の種の間でのみ成功してい
る（ｖａｎ Ｂｅｋｋｕｍ，Ｄ．Ｗ． ＆ Ｌｏ
ｗｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．：Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８５の総説参照）。最近、ヒト起源の
免疫系を有するマウスの作成が試みられている。このよ
うな動物は、ヒト造血細胞やヒト免疫系の研究に使用で
きる。一例としては、ヒト免疫系からの細胞を「重症複
合免疫不全症」（ＳＣＩＤ）と呼ばれる遺伝状態を有す
る自然変異株マウスへ移植することによって得られるＳ
ＣＩＤ−ｈｕマウスがある（ＭｕＣｕｎｅ，Ｊ．Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，１６３２−１６３
９，１９８８；Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ：
Ｎａｔｕｒｅ ３３５，２５６−２５９，１９８８）
。これらのモデルにおけるヒト細胞の移植ははじめてマ
ウスへのＨＩＶの感染を可能にしたが（Ｎａｍｉｋａｗ
ａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，
１０５５，１９９０）ヒト細胞の生存は極度に限られて
いた。移植後２〜３カ月を過ぎるとマウスの末梢血には
、有意な数のヒトリンパ球は検出されなかった。しかも
、ＭｃＣｕｎｅのモデルでは、ＳＣＩＤマウスに移植さ
れたヒト胎児肝からの造血幹細胞は、腎線維膜下に移植
できるヒト胎児胸腺上皮の移植を補充しないことには、
接木されないかまたはＴ細胞に分化されない（ＭｃＣｕ
ｎｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌおよびＮａｍｉｋａｗａ，
Ｒ．ｅｔ ａｌ、いずれも前出）。他のマウスモデル
は、ヒト造血幹細胞の、遺伝的な免疫不全Ｂｇ／Ｎｕ／
Ｘｉｄマウスへの移植に基づくものである。この場合も
、ヒトリンパ球は移植片対宿主病を誘導しなかった（Ｋ
ａｍｅｌ−Ｒｅｉｄ，Ｓ．＆ Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．：
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１７０６，１９８８）。
【０００３】以前の臨床研究において、ヒトＳＣＩＤ（
Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ． ｅｔ ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，
６１，３４１，１９８３）または白血病患者（Ｋｅｅｖ
ｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，７３，１３
４０，１９８９）へのＴ細胞枯渇骨髄の移植後、ヒト幹
細胞からの成熟Ｔ細胞の分化は遅く、１〜４カ月を要す
ることが示唆されている。マウスでのこのようなＴ細胞
の分化は致死全身照射（ＴＢＩ）後１４〜２１日ごろに
起こる。再構築の速度におけるこれらの差を考慮すると
、マウスの微小環境内では、マウスおよびヒトサイトカ
イン間、ならびに細胞認識に関与する他の分子間の貧弱
な交差反応性により、ヒト幹細胞の分化は非効率的で、
実質的に遅いと考えることは理にかなっている。
Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ． ｅｔ ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，
６１，３４１，１９８３）または白血病患者（Ｋｅｅｖ
ｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，７３，１３
４０，１９８９）へのＴ細胞枯渇骨髄の移植後、ヒト幹
細胞からの成熟Ｔ細胞の分化は遅く、１〜４カ月を要す
ることが示唆されている。マウスでのこのようなＴ細胞
の分化は致死全身照射（ＴＢＩ）後１４〜２１日ごろに
起こる。再構築の速度におけるこれらの差を考慮すると
、マウスの微小環境内では、マウスおよびヒトサイトカ
イン間、ならびに細胞認識に関与する他の分子間の貧弱
な交差反応性により、ヒト幹細胞の分化は非効率的で、
実質的に遅いと考えることは理にかなっている。
【０００４】免疫および造血系の重篤な抑制後には、致
死ＴＢＩ後と同様、骨髄が提供されないとマウスは２週
以内に死亡する。このようなマウスでヒト幹細胞が理論
的に生育し、マウスの造血系を再構築したとしても、成
熟免疫担当リンパ球または他のリンパ球への分化の速度
が遅いことから、マウスを感染から保護するのに十分な
数に達するのが阻害され、さらに、造血コンパートメン
トの不適当な補充は造血不全による死からマウスを保護
できない。他方、実質的な数の造血およびリンパ系細胞
が残る亜致死条件のプロトコール（たとえば、亜致死Ｔ
ＢＩ）では、内因性のマウス細胞が移植ヒト細胞と効果
的に競合できて、結局はヒト移植片を拒絶することにな
る。したがって、致死照射正常マウスへのヒト骨髄の移
植による安定なヒト−マウスキメラ動物の作成は不可能
と考えられてきた。
死ＴＢＩ後と同様、骨髄が提供されないとマウスは２週
以内に死亡する。このようなマウスでヒト幹細胞が理論
的に生育し、マウスの造血系を再構築したとしても、成
熟免疫担当リンパ球または他のリンパ球への分化の速度
が遅いことから、マウスを感染から保護するのに十分な
数に達するのが阻害され、さらに、造血コンパートメン
トの不適当な補充は造血不全による死からマウスを保護
できない。他方、実質的な数の造血およびリンパ系細胞
が残る亜致死条件のプロトコール（たとえば、亜致死Ｔ
ＢＩ）では、内因性のマウス細胞が移植ヒト細胞と効果
的に競合できて、結局はヒト移植片を拒絶することにな
る。したがって、致死照射正常マウスへのヒト骨髄の移
植による安定なヒト−マウスキメラ動物の作成は不可能
と考えられてきた。
【０００５】発明の要約
有用なヒト−マウスキメラ動物モデルの作成のため、一
方では迅速な造血系の再構築と他方ではヒトＴおよびＢ
細胞系統の遅い分化速度の必要性の間の対立は、本発明
において、ＳＣＩＤマウスを骨髄レシピエントではなく
、骨髄ドナーとして使用することによって解決された。 これは、ＳＣＩＤ骨髄細胞が、ＳＣＩＤマウスの抗原受
容体再配列不全（Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ：
Ｃｅｌｌ４６，９６３，１９８６）によりＳＣＩＤ多能
性幹細胞からは分化できないＴおよびＢ細胞系統を除い
て、すべての造血細胞系統を迅速に再構築するという仮
説に基づくものである。得られた胸腺の「中空スペース
」と骨髄が正常ヒトＴおよびＢ細胞で占拠され、その集
団を形成するかどうかを試験するため、ＳＣＩＤマウス
を骨髄をＴおよびＢ細胞が枯渇したヒト骨髄と混合し、
致死照射マウスに移植した。ヒト骨髄のＴおよびＢ細胞
枯渇は、大豆凝集素による分別凝集、ついでヒツジ赤血
球によるＥ−ロゼッティングによって行い、ＳＢＡ−
Ｅ− と呼ばれるヒトＢＭ細胞（Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．
ｅｔ ａｌ：Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ，３２７，１９８
１）を得た。
方では迅速な造血系の再構築と他方ではヒトＴおよびＢ
細胞系統の遅い分化速度の必要性の間の対立は、本発明
において、ＳＣＩＤマウスを骨髄レシピエントではなく
、骨髄ドナーとして使用することによって解決された。 これは、ＳＣＩＤ骨髄細胞が、ＳＣＩＤマウスの抗原受
容体再配列不全（Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ：
Ｃｅｌｌ４６，９６３，１９８６）によりＳＣＩＤ多能
性幹細胞からは分化できないＴおよびＢ細胞系統を除い
て、すべての造血細胞系統を迅速に再構築するという仮
説に基づくものである。得られた胸腺の「中空スペース
」と骨髄が正常ヒトＴおよびＢ細胞で占拠され、その集
団を形成するかどうかを試験するため、ＳＣＩＤマウス
を骨髄をＴおよびＢ細胞が枯渇したヒト骨髄と混合し、
致死照射マウスに移植した。ヒト骨髄のＴおよびＢ細胞
枯渇は、大豆凝集素による分別凝集、ついでヒツジ赤血
球によるＥ−ロゼッティングによって行い、ＳＢＡ−
Ｅ− と呼ばれるヒトＢＭ細胞（Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．
ｅｔ ａｌ：Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ，３２７，１９８
１）を得た。
【０００６】本発明において、長期に安定なヒト−マウ
スキメリズムの作成は、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの致
死照射、それらへのＴおよびＢ細胞枯渇ヒト骨髄細胞の
移植ついで１日後、ＳＣＩＤマウスからのＴ細胞枯渇骨
髄細胞の移植によって達成された。上述のように、Ｔお
よびＢ細胞系統を除くすべての造血細胞系統が迅速に再
構築されるように、ＳＣＩＤマウスを骨髄ドナーとして
使用した。表現型成熟ヒトＴおよびＢ細胞は、最初、移
植マウスの末梢血中に移植２〜４カ月後に検出され、移
植後９カ月以上も検出が続いた。明らかな移植片対宿主
病を認めない末梢血中における同様のリンパ系キメリズ
ムは、非操作（すなわち、ＴおよびＢ細胞が枯渇してい
ない）ヒト骨髄を静脈内または腹腔内のいずれかに移植
したときも見出された。
スキメリズムの作成は、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの致
死照射、それらへのＴおよびＢ細胞枯渇ヒト骨髄細胞の
移植ついで１日後、ＳＣＩＤマウスからのＴ細胞枯渇骨
髄細胞の移植によって達成された。上述のように、Ｔお
よびＢ細胞系統を除くすべての造血細胞系統が迅速に再
構築されるように、ＳＣＩＤマウスを骨髄ドナーとして
使用した。表現型成熟ヒトＴおよびＢ細胞は、最初、移
植マウスの末梢血中に移植２〜４カ月後に検出され、移
植後９カ月以上も検出が続いた。明らかな移植片対宿主
病を認めない末梢血中における同様のリンパ系キメリズ
ムは、非操作（すなわち、ＴおよびＢ細胞が枯渇してい
ない）ヒト骨髄を静脈内または腹腔内のいずれかに移植
したときも見出された。
【０００７】Ｔ細胞枯渇ヒト骨髄を移植したマウスの胸
腺には、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 表現型が優勢な
ヒトリンパ球集団が形成された。循環ヒト免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）がＴおよびＢ細胞枯渇ヒト骨髄移植マウスの
７／２０に、また非処置ヒト骨髄のレシピエント８／２
２に検出された。長期キメラの２／４では、ジニトロフ
ェノール（ＤＮＰ）連結キーホールリンペットヘモシア
ニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ）による一次および二次免疫後に
、ＤＮＰ抗原に特異的なヒト抗体が検出された。これら
結果は、実質的な程度のヒトリンパ系キメリズムを生じ
るヒト骨髄の移植が正常マウスで達成され、長期間にわ
たって持続されることを証明している。これらの結果は
また、ヒトＴ細胞が、胸腺上皮細胞の補充を必要とせず
、マウス胸腺内で分化できることを示している。
腺には、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 表現型が優勢な
ヒトリンパ球集団が形成された。循環ヒト免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）がＴおよびＢ細胞枯渇ヒト骨髄移植マウスの
７／２０に、また非処置ヒト骨髄のレシピエント８／２
２に検出された。長期キメラの２／４では、ジニトロフ
ェノール（ＤＮＰ）連結キーホールリンペットヘモシア
ニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ）による一次および二次免疫後に
、ＤＮＰ抗原に特異的なヒト抗体が検出された。これら
結果は、実質的な程度のヒトリンパ系キメリズムを生じ
るヒト骨髄の移植が正常マウスで達成され、長期間にわ
たって持続されることを証明している。これらの結果は
また、ヒトＴ細胞が、胸腺上皮細胞の補充を必要とせず
、マウス胸腺内で分化できることを示している。
【０００８】これらの所見は、適当に処理された正常非
ヒト哺乳動物において多様なヒト細胞集団の移植および
形成を可能にする他の遺伝的に不全な非ヒト哺乳動物ド
ナーまたは他のトランスジェニックな遺伝子欠失哺乳動
物を含めたレシピエントを用いることにより、長期に安
定なヒト造血細胞系統を有する非ヒトキメラ哺乳動物の
作成への、より一般的なアプローチの基盤として役立つ
ものである。
ヒト哺乳動物において多様なヒト細胞集団の移植および
形成を可能にする他の遺伝的に不全な非ヒト哺乳動物ド
ナーまたは他のトランスジェニックな遺伝子欠失哺乳動
物を含めたレシピエントを用いることにより、長期に安
定なヒト造血細胞系統を有する非ヒトキメラ哺乳動物の
作成への、より一般的なアプローチの基盤として役立つ
ものである。
【０００９】本発明は、したがって、その造血細胞が少
なくとも２つの異なる起源からの造血細胞により実質的
に抑制または破壊、および置換された哺乳動物Ｍ１から
なり、この場合、上記の異なる起源からの造血細胞の少
なくとも一つは哺乳動物Ｍ１以外の種、哺乳動物Ｍ３に
由来する造血細胞であり、少なくとも第二の上記造血細
胞は哺乳動物Ｍ３以外の種で、遺伝的に決定された造血
細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する造血細胞であ
る、長期に安定な異種造血細胞を有する非ヒトキメラ哺
乳動物Ｍ４を目的とするものである。
なくとも２つの異なる起源からの造血細胞により実質的
に抑制または破壊、および置換された哺乳動物Ｍ１から
なり、この場合、上記の異なる起源からの造血細胞の少
なくとも一つは哺乳動物Ｍ１以外の種、哺乳動物Ｍ３に
由来する造血細胞であり、少なくとも第二の上記造血細
胞は哺乳動物Ｍ３以外の種で、遺伝的に決定された造血
細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する造血細胞であ
る、長期に安定な異種造血細胞を有する非ヒトキメラ哺
乳動物Ｍ４を目的とするものである。
【００１０】本発明はまた、内因性造血細胞が２種の異
なるソースの外因性造血細胞で置換され、その置換造血
細胞系統の少なくとも一つはヒト起源であり、他の造血
細胞系統は遺伝的に決定された造血細胞不全を有する哺
乳動物Ｍ２に由来する造血細胞系統を有する非ヒトキメ
ラ哺乳動物Ｍ４に関する。
なるソースの外因性造血細胞で置換され、その置換造血
細胞系統の少なくとも一つはヒト起源であり、他の造血
細胞系統は遺伝的に決定された造血細胞不全を有する哺
乳動物Ｍ２に由来する造血細胞系統を有する非ヒトキメ
ラ哺乳動物Ｍ４に関する。
【００１１】本発明はまた、非ヒト哺乳動物Ｍ１の免疫
系を破壊し、この処置された哺乳動物Ｍ１にヒト起源の
造血細胞の適当なソースと、遺伝的に決定された造血細
胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する造血細胞の適当
なソースとの混合物を移植して、上述の非ヒトキメラ哺
乳動物Ｍ４を作成する方法に関する。
系を破壊し、この処置された哺乳動物Ｍ１にヒト起源の
造血細胞の適当なソースと、遺伝的に決定された造血細
胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する造血細胞の適当
なソースとの混合物を移植して、上述の非ヒトキメラ哺
乳動物Ｍ４を作成する方法に関する。
【００１２】本発明の好ましい実施態様によれば、非ヒ
ト哺乳動物レシピエントＭ１はマウスであり、非ヒト哺
乳動物ドナーＭ２はＳＣＩＤマウスであり、哺乳動物ド
ナーＭ３はヒトである。
ト哺乳動物レシピエントＭ１はマウスであり、非ヒト哺
乳動物ドナーＭ２はＳＣＩＤマウスであり、哺乳動物ド
ナーＭ３はヒトである。
【００１３】他の実施態様においては、本発明は、（ａ
）長期に安定なヒトＢおよびＴ細胞を有する本発明のキ
メラ非ヒト哺乳動物Ｍ４を抗原で免疫処置し、（ｂ）こ
の免疫処置非ヒト哺乳動物Ｍ４の適当な抗体形成細胞を
適当な融合パートナーと融合してハイブリドーマを生成
させ、（ｃ）ハイブリドーマの上澄液について所望の抗
原の存在をスクリーニングし、（ｄ）所望の抗体を産生
するハイブリドーマをクローン化し、ついで（ｅ）これ
らのクローンの上澄液から抗体を回収することからなる
ヒトモノクローナル抗体の作成方法を提供する。
）長期に安定なヒトＢおよびＴ細胞を有する本発明のキ
メラ非ヒト哺乳動物Ｍ４を抗原で免疫処置し、（ｂ）こ
の免疫処置非ヒト哺乳動物Ｍ４の適当な抗体形成細胞を
適当な融合パートナーと融合してハイブリドーマを生成
させ、（ｃ）ハイブリドーマの上澄液について所望の抗
原の存在をスクリーニングし、（ｄ）所望の抗体を産生
するハイブリドーマをクローン化し、ついで（ｅ）これ
らのクローンの上澄液から抗体を回収することからなる
ヒトモノクローナル抗体の作成方法を提供する。
【００１４】図面の簡単な説明
図１は、移植マウスの末梢血におけるヒトＣＤ３＋ 細
胞の分化を示すグラフである。ヒトＣＤ３＋ 細胞の分
化は抗−ＣＤ３（Ｌｅｕ４）による細胞蛍光測定法で分
析した。データの点に付した１〜７の数字は最初の一連
の実験における生存マウスを示す（表１参照）。挿入図
は、移植後４９日に実施した代表的な実験の結果を示し
ている。正常ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の抗−ＣＤ
３による染色（上図）を、Ｎｏ．３マウスからのＰＢＬ
（中図）およびＳＣＩＤ骨髄単独を移植された対照マウ
スからのＰＢＬ（下図）の染色と比較する。正常マウス
ＰＢＬの染色は対照マウスの場合と同一であった。
胞の分化を示すグラフである。ヒトＣＤ３＋ 細胞の分
化は抗−ＣＤ３（Ｌｅｕ４）による細胞蛍光測定法で分
析した。データの点に付した１〜７の数字は最初の一連
の実験における生存マウスを示す（表１参照）。挿入図
は、移植後４９日に実施した代表的な実験の結果を示し
ている。正常ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の抗−ＣＤ
３による染色（上図）を、Ｎｏ．３マウスからのＰＢＬ
（中図）およびＳＣＩＤ骨髄単独を移植された対照マウ
スからのＰＢＬ（下図）の染色と比較する。正常マウス
ＰＢＬの染色は対照マウスの場合と同一であった。
【００１５】図２は、ヒト骨髄を移植されたマウスから
の胸腺細胞の抗−ヒトＣＤ４（赤）および抗−ヒトＣＤ
８（緑）による二重染色を示す。パネルＡ：Ｎｏ．７マ
ウスの胸腺を移植５カ月後に摘出し、胸腺細胞をリン酸
緩衝食塩溶液で２回洗浄し、直接標識フィコエリトリン
−接合Ｔ４モノクローナル抗体およびフルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−接合Ｔ８モノクローナ
ル抗体（いずれもＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｌｕｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で同時に染色した
。 次に、細胞を２回、緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ−Ｓｃａ
ｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｅｒｅｍｂｏ
ｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて細胞蛍光測定法
で分析した。パネルＢ：正常ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細
胞と同じモノクロナール抗体を用いた対照実験。Ｎｏ．
７マウスの胸腺におけるヒトＣＤ４＋ ＣＤ８＋ ，Ｃ
Ｄ４＋ ＣＤ８− およびＣＤ４− ＣＤ８− の百分
率（対照実験におけるバックグランド染色を差し引いた
値）は、それぞれ４１．３％、３．７％および３．１％
であった（Ｎｏ．１マウスの胸腺におけるこれらの百分
率は、それぞれ４２％、１１．７％および８．２％であ
った）。Ｎｏ．１およびＮｏ．７マウスの胸腺における
ヒトＣＤ２細胞の百分率は、それぞれ３５．０％および
４７．１％で、ヒトＣＤ３細胞の百分率は、それぞれ３
２．０％および４３．０％であった。
の胸腺細胞の抗−ヒトＣＤ４（赤）および抗−ヒトＣＤ
８（緑）による二重染色を示す。パネルＡ：Ｎｏ．７マ
ウスの胸腺を移植５カ月後に摘出し、胸腺細胞をリン酸
緩衝食塩溶液で２回洗浄し、直接標識フィコエリトリン
−接合Ｔ４モノクローナル抗体およびフルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−接合Ｔ８モノクローナ
ル抗体（いずれもＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｌｕｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で同時に染色した
。 次に、細胞を２回、緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ−Ｓｃａ
ｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｅｒｅｍｂｏ
ｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて細胞蛍光測定法
で分析した。パネルＢ：正常ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細
胞と同じモノクロナール抗体を用いた対照実験。Ｎｏ．
７マウスの胸腺におけるヒトＣＤ４＋ ＣＤ８＋ ，Ｃ
Ｄ４＋ ＣＤ８− およびＣＤ４− ＣＤ８− の百分
率（対照実験におけるバックグランド染色を差し引いた
値）は、それぞれ４１．３％、３．７％および３．１％
であった（Ｎｏ．１マウスの胸腺におけるこれらの百分
率は、それぞれ４２％、１１．７％および８．２％であ
った）。Ｎｏ．１およびＮｏ．７マウスの胸腺における
ヒトＣＤ２細胞の百分率は、それぞれ３５．０％および
４７．１％で、ヒトＣＤ３細胞の百分率は、それぞれ３
２．０％および４３．０％であった。
【００１６】図３は、移植マウスの末梢血および脾臓に
おけるヒトＢ細胞の染色を示すグラフである。Ｎｏ．７
マウスのＰＢＬ（左Ａ図）および脾臓細胞（右Ａ図）は
移植５カ月後にＦＩＴＣ−接合抗−ヒトＣＤ２０モノク
ローナル抗体で染色し、図２の説明の記載と同様にして
分析し、正常ヒトＰＢＬ（左Ｂ図）、正常マウスＰＢＬ
（左Ｃ図）および正常マウス脾臓細胞（右Ｂ図）と比較
した。
おけるヒトＢ細胞の染色を示すグラフである。Ｎｏ．７
マウスのＰＢＬ（左Ａ図）および脾臓細胞（右Ａ図）は
移植５カ月後にＦＩＴＣ−接合抗−ヒトＣＤ２０モノク
ローナル抗体で染色し、図２の説明の記載と同様にして
分析し、正常ヒトＰＢＬ（左Ｂ図）、正常マウスＰＢＬ
（左Ｃ図）および正常マウス脾臓細胞（右Ｂ図）と比較
した。
【００１７】図４は、ヒト−マウスキメラ脾臓細胞の、
ＩＬ−２含有培地中での７日間培養後の抗−ヒトＣＤ３
による染色を示す。Ａ）：ＳＣＩＤ骨髄単独を移植され
た対照マウスから脾臓細胞、Ｂ）正常ヒトＰＢＬ、Ｃ）
ヒト−マウスキメラ（最初の一連の実験のマウスＮｏ．
２、移植９カ月後）の脾臓細胞（２５×１０／ウエル）
を、ウシ胎児血清（１０％）およびＩＬ−２（２０μｇ
／ウエル）含有ＲＰＭＩ培地中で７日間培養した。
ＩＬ−２含有培地中での７日間培養後の抗−ヒトＣＤ３
による染色を示す。Ａ）：ＳＣＩＤ骨髄単独を移植され
た対照マウスから脾臓細胞、Ｂ）正常ヒトＰＢＬ、Ｃ）
ヒト−マウスキメラ（最初の一連の実験のマウスＮｏ．
２、移植９カ月後）の脾臓細胞（２５×１０／ウエル）
を、ウシ胎児血清（１０％）およびＩＬ−２（２０μｇ
／ウエル）含有ＲＰＭＩ培地中で７日間培養した。
【００１８】図５は、ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫処置された
ヒト−マウスキメラ動物におけるＤＮＰ−特異的ヒト抗
体を示すグラフである。ＰＢＬがヒトＴおよびＢリンパ
球の両者に対して陽性であるヒト−マウスキメラ動物、
およびＳＣＩＤ骨髄単独を移植された対照マウスを、完
全フロインドアジュバント中に乳化したＤＮＰ−ＫＬＨ
２０μｇで皮下に免疫処置した。４８日後に、刺激マウ
スの一部ならびに非刺激マウスの一部に完全フロインド
アジュバント中に乳化したＤＮＰ−ＫＬＨ１００μｇを
皮下注射した。６日後にマウスから採血し、抗ＤＮＰ−
抗体を、マイクロタイタープレートをＤＮＰ−ＢＳＡ（
５０μｇ／ｍｌ）の１００μｇ／ウエルで被覆したほか
は表１の脚注の記載と同様にして、ＥＬＩＳＡで測定し
た。
ヒト−マウスキメラ動物におけるＤＮＰ−特異的ヒト抗
体を示すグラフである。ＰＢＬがヒトＴおよびＢリンパ
球の両者に対して陽性であるヒト−マウスキメラ動物、
およびＳＣＩＤ骨髄単独を移植された対照マウスを、完
全フロインドアジュバント中に乳化したＤＮＰ−ＫＬＨ
２０μｇで皮下に免疫処置した。４８日後に、刺激マウ
スの一部ならびに非刺激マウスの一部に完全フロインド
アジュバント中に乳化したＤＮＰ−ＫＬＨ１００μｇを
皮下注射した。６日後にマウスから採血し、抗ＤＮＰ−
抗体を、マイクロタイタープレートをＤＮＰ−ＢＳＡ（
５０μｇ／ｍｌ）の１００μｇ／ウエルで被覆したほか
は表１の脚注の記載と同様にして、ＥＬＩＳＡで測定し
た。
【００１９】○−○：第一の一連実験（２回チャレンジ
）からのＮｏ．２（上）およびＮｏ．３（下）マウスの
血清。●−●：第三の一連実験（１回チャレンジ）から
のマウスの血清。○−−−○：対照マウス（２回チャレ
ンジ）の血清、縦線付きの白丸は対照マウス（ＳＣＩＤ
骨髄単独を移植、ＤＮＰ−ＫＬＨ１回チャレンジ）から
収集した１５の血清の平均（±標準偏差）
）からのＮｏ．２（上）およびＮｏ．３（下）マウスの
血清。●−●：第三の一連実験（１回チャレンジ）から
のマウスの血清。○−−−○：対照マウス（２回チャレ
ンジ）の血清、縦線付きの白丸は対照マウス（ＳＣＩＤ
骨髄単独を移植、ＤＮＰ−ＫＬＨ１回チャレンジ）から
収集した１５の血清の平均（±標準偏差）
【００２０】
図６は、移植６カ月後のヒト−マウスキメラ動物からの
末梢血のＤＮＡ分析を示すゲルパターンである。ＰＢＬ
を蒸留水中で分解し、１０分間煮沸した。 細胞屑を遠心分離により沈降させ、上澄液中のゲノムＤ
ＮＡをＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓからのＤ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅ
ｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
，ＵＳＡ）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操
作を３０サイクル行って増幅した（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ
．ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７，１
９８８）。５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、２０ｐｍのＤＱ
ＢプライマーＧＬＰＤＱＢ１およびＧＬＰＤＱＢ２（Ｔ
ｏｄｄ，Ｊ．Ａ．，Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｉ．＆ ＭｃＤｅ
ｖｉｔｔ，ｈ．ｏ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２９，５９９，
１９８７）ならびに２ＵのＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ
を包含する反応混合物を、９４℃３０秒の変性、５６℃
３０秒のアニーリング、および７２℃３０秒の延長の反
復サイクルに付した。生成物は２％アガロースゲル電気
泳動によって分析した。ヒトＰＢＬからの対照サンプル
が独特の２４６−ｂｐバンドをもつ場合にのみ、増幅は
成功とみなされた（Ｒｏｎｎｉｎｇｅｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｉ
ｗｅ，Ｔ．Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｓｐｕｒ
ｋｌａｎｄ，Ａ．＆ Ｔｈｏｒｓｂｙ，Ｅ．：Ｈｕｍ
ａｎ Ｉｍｍｕｎ．２６，２１５，１９８９）。レー
ンＡ：正常ヒトＰＢＬ、レーンＢ：ヒトおよびマウスＰ
ＢＬの人工混合物（比１：３）、レーンＣ：ヒト骨髄を
移植されたマウス（Ｎｏ．１）からのＰＢＬ、レーンＤ
：非処置ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＰＢＬ。
図６は、移植６カ月後のヒト−マウスキメラ動物からの
末梢血のＤＮＡ分析を示すゲルパターンである。ＰＢＬ
を蒸留水中で分解し、１０分間煮沸した。 細胞屑を遠心分離により沈降させ、上澄液中のゲノムＤ
ＮＡをＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓからのＤ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅ
ｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
，ＵＳＡ）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操
作を３０サイクル行って増幅した（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ
．ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７，１
９８８）。５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、２０ｐｍのＤＱ
ＢプライマーＧＬＰＤＱＢ１およびＧＬＰＤＱＢ２（Ｔ
ｏｄｄ，Ｊ．Ａ．，Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｉ．＆ ＭｃＤｅ
ｖｉｔｔ，ｈ．ｏ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２９，５９９，
１９８７）ならびに２ＵのＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ
を包含する反応混合物を、９４℃３０秒の変性、５６℃
３０秒のアニーリング、および７２℃３０秒の延長の反
復サイクルに付した。生成物は２％アガロースゲル電気
泳動によって分析した。ヒトＰＢＬからの対照サンプル
が独特の２４６−ｂｐバンドをもつ場合にのみ、増幅は
成功とみなされた（Ｒｏｎｎｉｎｇｅｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｉ
ｗｅ，Ｔ．Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｓｐｕｒ
ｋｌａｎｄ，Ａ．＆ Ｔｈｏｒｓｂｙ，Ｅ．：Ｈｕｍ
ａｎ Ｉｍｍｕｎ．２６，２１５，１９８９）。レー
ンＡ：正常ヒトＰＢＬ、レーンＢ：ヒトおよびマウスＰ
ＢＬの人工混合物（比１：３）、レーンＣ：ヒト骨髄を
移植されたマウス（Ｎｏ．１）からのＰＢＬ、レーンＤ
：非処置ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＰＢＬ。
【００２１】好ましい実施態様の詳細な説明本発明の非
ヒト哺乳動物Ｍ１は、ウマ、ヒツジ、またはげつ歯類た
とえばウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウ
ス等、任意の哺乳動物であってよい。Ｍ１は、正常哺乳
動物でもよく、トランジェニック哺乳動物および遺伝子
欠失哺乳動物を包含する。本発明に使用できるトランス
ジェニックマウスＭ１の例には、ヒト組織適合抗原（Ｈ
ＬＡ）を有するトランスジェニックマウス、たとえば、
Ｂ７ヒトＨＬＡ遺伝子を含む（ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６）Ｆ１（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２３５−２３９，１９９０の記載に従って作
成）、または様々なヒトサイトカイン、たとえばＩＬ−
３，ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺
伝子をもつトランスジェニックマウスがある。遺伝子欠
失哺乳動物の例には、β−マイクログロブリン遺伝子を
欠き、したがって、主要組織適合抗原（Ｈ−２）を発現
できないマウスがある。場合によっては、非ヒト哺乳動
物レシピエントＭ１は、哺乳動物ドナーＭ３からの骨髄
の移植前に照射が可能な、遺伝的に決定された造血細胞
不全を有する哺乳動物であってもよい。これによれば、
現在利用できるマウス株よりも免疫を強く抑制しやすい
動物をレシピエントとして提供できる。
ヒト哺乳動物Ｍ１は、ウマ、ヒツジ、またはげつ歯類た
とえばウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウ
ス等、任意の哺乳動物であってよい。Ｍ１は、正常哺乳
動物でもよく、トランジェニック哺乳動物および遺伝子
欠失哺乳動物を包含する。本発明に使用できるトランス
ジェニックマウスＭ１の例には、ヒト組織適合抗原（Ｈ
ＬＡ）を有するトランスジェニックマウス、たとえば、
Ｂ７ヒトＨＬＡ遺伝子を含む（ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６）Ｆ１（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２３５−２３９，１９９０の記載に従って作
成）、または様々なヒトサイトカイン、たとえばＩＬ−
３，ＩＬ−６，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺
伝子をもつトランスジェニックマウスがある。遺伝子欠
失哺乳動物の例には、β−マイクログロブリン遺伝子を
欠き、したがって、主要組織適合抗原（Ｈ−２）を発現
できないマウスがある。場合によっては、非ヒト哺乳動
物レシピエントＭ１は、哺乳動物ドナーＭ３からの骨髄
の移植前に照射が可能な、遺伝的に決定された造血細胞
不全を有する哺乳動物であってもよい。これによれば、
現在利用できるマウス株よりも免疫を強く抑制しやすい
動物をレシピエントとして提供できる。
【００２２】本発明においては、遺伝的に決定された造
血細胞不全を有する、任意の非ヒト哺乳動物を、ドナー
Ｍ２として使用することができる。Ｍ２およびＭ２は同
一でも異なる種であってもよいが、同一の種であること
が好ましい。遺伝的に決定された造血細胞不全を有する
、有用なマウスの株には、免疫不全Ｂｇ／Ｎｕ／Ｘｉｄ
マウス、および赤血球系不全Ｗ／ＷＶ マウスが包含さ
れる。同じく、遺伝子欠失マウスが本発明に含まれる。 本発明における使用に適した他のマウスおよび哺乳動物
株を同定し、創製することも本分野の研究者には容易で
あろう。
血細胞不全を有する、任意の非ヒト哺乳動物を、ドナー
Ｍ２として使用することができる。Ｍ２およびＭ２は同
一でも異なる種であってもよいが、同一の種であること
が好ましい。遺伝的に決定された造血細胞不全を有する
、有用なマウスの株には、免疫不全Ｂｇ／Ｎｕ／Ｘｉｄ
マウス、および赤血球系不全Ｗ／ＷＶ マウスが包含さ
れる。同じく、遺伝子欠失マウスが本発明に含まれる。 本発明における使用に適した他のマウスおよび哺乳動物
株を同定し、創製することも本分野の研究者には容易で
あろう。
【００２３】哺乳動物Ｍ２からの造血細胞の好ましいソ
ースは、非処置またはＴ細胞枯渇、いずれかの骨髄であ
るが、他の適当なソース、たとえば脾臓、胎児肝、末梢
血液も使用できる。
ースは、非処置またはＴ細胞枯渇、いずれかの骨髄であ
るが、他の適当なソース、たとえば脾臓、胎児肝、末梢
血液も使用できる。
【００２４】哺乳動物ドナーＭ３は哺乳動物レシピエン
トＭ１以外の種であり、ヒトが好ましい。本発明で使用
されるヒト造血細胞のソースは、（ａ）非分画もしくは
分画骨髄細胞、たとえば骨髄系細胞、赤血球系細胞、巨
核球、もしくはリンパ系細胞系統のＴ細胞枯渇または異
種細胞集団、およびそれらの前駆体、ならびに／または
それらの混合物、（ｂ）非分画または分画血球、たとえ
ば異種リンパ球、マクロファージ、単球、血小板、もし
くは赤血球、およびそれらの前駆体、ならびに／または
それらの混合物、（ｃ）多能性の幹細胞および他のＢお
よびＴ細胞枯渇末梢血由来の他の造血前駆細胞、（ｄ）
臍帯血または胎児組織、たとえば胎児胸腺、胎児骨髄、
または胎児リンパ節、ならびに（ｅ）成熟ドナーからの
リンパ節または脾細胞である。
トＭ１以外の種であり、ヒトが好ましい。本発明で使用
されるヒト造血細胞のソースは、（ａ）非分画もしくは
分画骨髄細胞、たとえば骨髄系細胞、赤血球系細胞、巨
核球、もしくはリンパ系細胞系統のＴ細胞枯渇または異
種細胞集団、およびそれらの前駆体、ならびに／または
それらの混合物、（ｂ）非分画または分画血球、たとえ
ば異種リンパ球、マクロファージ、単球、血小板、もし
くは赤血球、およびそれらの前駆体、ならびに／または
それらの混合物、（ｃ）多能性の幹細胞および他のＢお
よびＴ細胞枯渇末梢血由来の他の造血前駆細胞、（ｄ）
臍帯血または胎児組織、たとえば胎児胸腺、胎児骨髄、
または胎児リンパ節、ならびに（ｅ）成熟ドナーからの
リンパ節または脾細胞である。
【００２５】キメラ哺乳動物Ｍ４で発現されるヒト造血
細胞系統の型は、ヒト起源および哺乳動物Ｍ２由来の移
植造血細胞が哺乳動物Ｍ１の造血細胞系統を再構築し、
Ｍ２の造血細胞不全とＭ２骨髄細胞がその細胞系統を発
生できないために生じるその再構築集団における「中空
スペース」のみが、相当するヒト造血細胞系統の細胞で
置換されることから、哺乳動物Ｍ２の遺伝的に決定され
た造血細胞不全の性質に依存することになる。
細胞系統の型は、ヒト起源および哺乳動物Ｍ２由来の移
植造血細胞が哺乳動物Ｍ１の造血細胞系統を再構築し、
Ｍ２の造血細胞不全とＭ２骨髄細胞がその細胞系統を発
生できないために生じるその再構築集団における「中空
スペース」のみが、相当するヒト造血細胞系統の細胞で
置換されることから、哺乳動物Ｍ２の遺伝的に決定され
た造血細胞不全の性質に依存することになる。
【００２６】すなわち、本発明の好ましい実施態様にお
いては、造血機能が弱体化されたマウスにヒト骨髄細胞
とＳＣＩＤマウスの骨髄細胞が移植され、ＳＣＩＤマウ
スの多能性幹細胞からは分化できない唯一の細胞系統で
あるヒトＢおよびＴ細胞を有するマウスを導くことがで
きる。
いては、造血機能が弱体化されたマウスにヒト骨髄細胞
とＳＣＩＤマウスの骨髄細胞が移植され、ＳＣＩＤマウ
スの多能性幹細胞からは分化できない唯一の細胞系統で
あるヒトＢおよびＴ細胞を有するマウスを導くことがで
きる。
【００２７】他のヒト造血細胞系統、たとえば、赤血球
系細胞、骨髄系細胞、顆粒球、マクロファージおよび巨
核球系統が、本発明により、哺乳動物Ｍ１中で再構築さ
れ、異なる型のキメラを生成する。
系細胞、骨髄系細胞、顆粒球、マクロファージおよび巨
核球系統が、本発明により、哺乳動物Ｍ１中で再構築さ
れ、異なる型のキメラを生成する。
【００２８】本発明により安定な非ヒトキメラ哺乳動物
Ｍ４を作成する方法は以下の各工程からなる。すなわち
、（ｉ）非ヒト哺乳動物Ｍ１を、その免疫系を本質的に
破壊するように処置し、（ｉｉ）この処置哺乳動物Ｍ１
に、正常ヒト骨髄、または哺乳動物Ｍ３、好ましくはヒ
トからの任意の他の適当な造血細胞のソースもしくは特
定の造血細胞系統を移植し、（ｉｉｉ）さらに、非ヒト
哺乳動物Ｍ２、好ましくはＭ１で、遺伝的に決定された
造血細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する骨髄細胞
また任意の他の造血細胞の適当なソースを移植して、哺
乳動物ドナーＭ２由来の造血細胞を有しさらに哺乳動物
ドナーＭ３（たとえばヒト）からの１または２種以上の
造血細胞系統を有するキメラ非ヒト哺乳動物Ｍ４を得る
。一態様においては、これらのＭ３由来造血細胞系統は
上記Ｍ２の欠損造血細胞に相当する。
Ｍ４を作成する方法は以下の各工程からなる。すなわち
、（ｉ）非ヒト哺乳動物Ｍ１を、その免疫系を本質的に
破壊するように処置し、（ｉｉ）この処置哺乳動物Ｍ１
に、正常ヒト骨髄、または哺乳動物Ｍ３、好ましくはヒ
トからの任意の他の適当な造血細胞のソースもしくは特
定の造血細胞系統を移植し、（ｉｉｉ）さらに、非ヒト
哺乳動物Ｍ２、好ましくはＭ１で、遺伝的に決定された
造血細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する骨髄細胞
また任意の他の造血細胞の適当なソースを移植して、哺
乳動物ドナーＭ２由来の造血細胞を有しさらに哺乳動物
ドナーＭ３（たとえばヒト）からの１または２種以上の
造血細胞系統を有するキメラ非ヒト哺乳動物Ｍ４を得る
。一態様においては、これらのＭ３由来造血細胞系統は
上記Ｍ２の欠損造血細胞に相当する。
【００２９】キメラ哺乳動物Ｍ４中で長期間生存する造
血細胞を与える哺乳動物Ｍ３はヒトであることが好まし
いが、他の哺乳動物、たとえばウシまたはウマも使用で
きる。すなわち、本発明によれば、例えば長期に安定な
ウシＴおよび／またはＢ細胞を有するキメラマウスを作
成することができる。
血細胞を与える哺乳動物Ｍ３はヒトであることが好まし
いが、他の哺乳動物、たとえばウシまたはウマも使用で
きる。すなわち、本発明によれば、例えば長期に安定な
ウシＴおよび／またはＢ細胞を有するキメラマウスを作
成することができる。
【００３０】工程（ｉ）における哺乳動物Ｍ１の免疫系
の抑制または破壊のための処置には、照射（たとえば、
Ｘ線またはガンマ照射）、化学療法、もしくはその両者
、またはリンパ球もしくは任意の他のＭ１およびＭ２由
来する造血細胞に対するモノクローナル抗体による細胞
減弱が、その処置によりＭ１起源の造血細胞がＭ２また
はＭ３起源の移植造血細胞と競合する能力を実質的に消
失させる限り、包含する。
の抑制または破壊のための処置には、照射（たとえば、
Ｘ線またはガンマ照射）、化学療法、もしくはその両者
、またはリンパ球もしくは任意の他のＭ１およびＭ２由
来する造血細胞に対するモノクローナル抗体による細胞
減弱が、その処置によりＭ１起源の造血細胞がＭ２また
はＭ３起源の移植造血細胞と競合する能力を実質的に消
失させる限り、包含する。
【００３１】マウス骨髄移植の以前の研究から（ｖａｎ
Ｂｅｋｋｕｍ，Ｄ．Ｗ．＆ Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ
，Ｂ．：Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎ−ｔａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９８５の総説参照）、致死用量の全身照射後にも、そ
の条件付けプロトコールで生き残る宿主造血細胞のある
ことが知られている。また、大用量の照射または化学療
法にもかかわらず、分化および増殖能を残した初期の前
駆細胞の生存により、造血細胞が発生できる場合がある
。このようなキメラ動物における宿主型の造血細胞の残
存は、使用した条件付けの方法のみならず、移植に用い
た骨髄の状態にも依存する。すなわち、本発明のヒト−
正常マウスキメラ動物でも、時に、宿主型のリンパ球ま
たは他の造血細胞が見出されることがある。この理由か
ら、ヒト表現型のキメラ細胞の特性づけならびにキメラ
によって産生されるヒト起源の抗体の試験に、十分な注
意を払わなければならない。
Ｂｅｋｋｕｍ，Ｄ．Ｗ．＆ Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ
，Ｂ．：Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎ−ｔａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９８５の総説参照）、致死用量の全身照射後にも、そ
の条件付けプロトコールで生き残る宿主造血細胞のある
ことが知られている。また、大用量の照射または化学療
法にもかかわらず、分化および増殖能を残した初期の前
駆細胞の生存により、造血細胞が発生できる場合がある
。このようなキメラ動物における宿主型の造血細胞の残
存は、使用した条件付けの方法のみならず、移植に用い
た骨髄の状態にも依存する。すなわち、本発明のヒト−
正常マウスキメラ動物でも、時に、宿主型のリンパ球ま
たは他の造血細胞が見出されることがある。この理由か
ら、ヒト表現型のキメラ細胞の特性づけならびにキメラ
によって産生されるヒト起源の抗体の試験に、十分な注
意を払わなければならない。
【００３２】リンパ球以外のヒト造血細胞の移植を成功
させるためには、Ｍ２由来の短期造血細胞前駆体を用い
ることが可能である。このような細胞は、初期の照射に
よって誘発される形成不全からＭ２動物を保護し、ヒト
が前駆体が骨髄球または赤血球系細胞系統に分化するの
に必要な時間を与えることになる。この短期造血細胞前
駆体は、Ｍｉｙａｍａ−Ｉｎａｂａらの方法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４７，６８
７−６９４，１９８７）での骨髄の分画、または最初に
免疫系を本質的に破壊するため、たとえばＴＢＩで処理
され、それに遺伝的に決定された造血細胞不全を有する
ドナーまたは正常ドナーからの骨髄が移植されたマウス
の骨髄移植によって得られる。
させるためには、Ｍ２由来の短期造血細胞前駆体を用い
ることが可能である。このような細胞は、初期の照射に
よって誘発される形成不全からＭ２動物を保護し、ヒト
が前駆体が骨髄球または赤血球系細胞系統に分化するの
に必要な時間を与えることになる。この短期造血細胞前
駆体は、Ｍｉｙａｍａ−Ｉｎａｂａらの方法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４７，６８
７−６９４，１９８７）での骨髄の分画、または最初に
免疫系を本質的に破壊するため、たとえばＴＢＩで処理
され、それに遺伝的に決定された造血細胞不全を有する
ドナーまたは正常ドナーからの骨髄が移植されたマウス
の骨髄移植によって得られる。
【００３３】ヒト造血細胞系統とマウス造血細胞系統の
間の競合は、上述の、限られた自己再生能をもつ短期造
血細胞前駆体を用いることにより、またはヒト特異的サ
イトカインのおよび／またはヒト基質細胞の移植、ある
いはヒトサイトカインを発現する遺伝子を有するトラン
スジェニックレシピエント動物のＭ１の使用により、ヒ
ト細胞に優勢な結果が導かれる。
間の競合は、上述の、限られた自己再生能をもつ短期造
血細胞前駆体を用いることにより、またはヒト特異的サ
イトカインのおよび／またはヒト基質細胞の移植、ある
いはヒトサイトカインを発現する遺伝子を有するトラン
スジェニックレシピエント動物のＭ１の使用により、ヒ
ト細胞に優勢な結果が導かれる。
【００３４】本発明のキメラ哺乳動物Ｍ４は、多様なヒ
トおよび動物疾患の研究ならびに他の目的のためのモデ
ル動物として使用できる。すなわち、ヒトＴおよびＢ細
胞を移植されたキメラ哺乳動物は、１）各種の抗原、た
とえばウイルス、トキシンのような病原体、自己免疫細
胞、たとえば癌細胞のような病的細胞、たとえばリンパ
球、血小板のような病的または正常血球に伴う抗原に対
するヒトモノクローナル抗体の製造、２）白血病患者か
らの骨髄を移植したマウスにおけるヒト白血病細胞に対
する耐容性の誘導、ついでその患者白血病細胞の注入、
３）ヒト悪性腫瘍に対するヒトＴ細胞系、リンホカイン
活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、または細胞毒性Ｔリンパ
球（ＣＴＬｓ）の製造、４）現在ｉｎ ｖｉｔｒｏ系
での研究は極めて限られているヒトＴおよびＢ細胞の個
体発生の研究、ならびに、５）キメラ哺乳動物へのＨＩ
Ｖ−１または多種のウイルスの感染によるエイズおよび
他のウイルス疾患の動物モデルとしての用途がある。
トおよび動物疾患の研究ならびに他の目的のためのモデ
ル動物として使用できる。すなわち、ヒトＴおよびＢ細
胞を移植されたキメラ哺乳動物は、１）各種の抗原、た
とえばウイルス、トキシンのような病原体、自己免疫細
胞、たとえば癌細胞のような病的細胞、たとえばリンパ
球、血小板のような病的または正常血球に伴う抗原に対
するヒトモノクローナル抗体の製造、２）白血病患者か
らの骨髄を移植したマウスにおけるヒト白血病細胞に対
する耐容性の誘導、ついでその患者白血病細胞の注入、
３）ヒト悪性腫瘍に対するヒトＴ細胞系、リンホカイン
活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、または細胞毒性Ｔリンパ
球（ＣＴＬｓ）の製造、４）現在ｉｎ ｖｉｔｒｏ系
での研究は極めて限られているヒトＴおよびＢ細胞の個
体発生の研究、ならびに、５）キメラ哺乳動物へのＨＩ
Ｖ−１または多種のウイルスの感染によるエイズおよび
他のウイルス疾患の動物モデルとしての用途がある。
【００３５】以上述べた結果は、ヒトＴおよびＢ細胞の
長期持続移植が、正常マウスへの致死照射後、Ｔおよび
Ｂ細胞枯渇骨髄を移植することにより、さらにヒト胎児
胸腺上皮細胞の補充を必要とせず、達成できることを示
している。移植されたヒトＴおよびＢ細胞は、分裂誘発
性および抗原性刺激に応答を現すことができるように思
われる。ＳＣＩＤマウスの骨髄の移植により与えられる
造血細胞の死に対する保護は、骨髄同種移植を受けたヒ
ト白血病疾患での再構築ペースによく類似した移植マウ
スにおけるヒトＴおよびＢ細胞の遅い発生を考慮したも
のである。さらにまた、本明細書に記載されたように、
マウスの胸腺における未成熟ＣＤ４ ＣＤ８（二重陽
性）ヒト胸腺細胞の存在は、ヒト骨髄幹細胞のＴ細胞へ
の分化がマウス胸腺の微小環境内で起こる可能性を示唆
している。
長期持続移植が、正常マウスへの致死照射後、Ｔおよび
Ｂ細胞枯渇骨髄を移植することにより、さらにヒト胎児
胸腺上皮細胞の補充を必要とせず、達成できることを示
している。移植されたヒトＴおよびＢ細胞は、分裂誘発
性および抗原性刺激に応答を現すことができるように思
われる。ＳＣＩＤマウスの骨髄の移植により与えられる
造血細胞の死に対する保護は、骨髄同種移植を受けたヒ
ト白血病疾患での再構築ペースによく類似した移植マウ
スにおけるヒトＴおよびＢ細胞の遅い発生を考慮したも
のである。さらにまた、本明細書に記載されたように、
マウスの胸腺における未成熟ＣＤ４ ＣＤ８（二重陽
性）ヒト胸腺細胞の存在は、ヒト骨髄幹細胞のＴ細胞へ
の分化がマウス胸腺の微小環境内で起こる可能性を示唆
している。
【００３６】キメラ哺乳動物Ｍ４中で存在する異種造血
細胞系統の細胞に関連して本明細書において用いられる
「長期に安定な」の語は、３カ月以上生存する、前駆体
および分化細胞を含めた造血細胞系統を意味するもので
ある。このような細胞はキメラ中で６カ月以上安定に維
持されることが好ましい。このような細胞は、１年以上
理想的にはキメラ動物の寿命の間維持されることがさら
に好ましい。
細胞系統の細胞に関連して本明細書において用いられる
「長期に安定な」の語は、３カ月以上生存する、前駆体
および分化細胞を含めた造血細胞系統を意味するもので
ある。このような細胞はキメラ中で６カ月以上安定に維
持されることが好ましい。このような細胞は、１年以上
理想的にはキメラ動物の寿命の間維持されることがさら
に好ましい。
【００３７】本発明は、骨髄移植の前後を通じて滅菌環
境に置いても、ヒト−正常マウスキメラの長期にわたる
生存を可能にするものである。本発明のその他の利点は
、これらのマウスがＨＩＶ感染の標的であるヒトＴ細胞
に富み、それが長期に生存することである。
境に置いても、ヒト−正常マウスキメラの長期にわたる
生存を可能にするものである。本発明のその他の利点は
、これらのマウスがＨＩＶ感染の標的であるヒトＴ細胞
に富み、それが長期に生存することである。
【００３８】本発明の一実施態様においては、ヒトＢお
よびＴ細胞を有する非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４を抗原で
免疫処置し、免疫処置マウスから脾臓また他の適当な部
位の抗体形成細胞を摘出し、その懸濁細胞を適当な融合
なパートナーと融合してハイブリドーマを生成させ、こ
の細胞を別個の容器中で適当に希釈、培養し、ハイブリ
ドーマを含有する各容器内の上澄液について抗体の存在
をスクリーニングし、所望の抗体を産生するハイブリド
ーマを選択し、クローン化して、ヒトモノクローナル抗
体が製造される。これらの操作は、文献に記載され、よ
く知られた技術によって実施できる。
よびＴ細胞を有する非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４を抗原で
免疫処置し、免疫処置マウスから脾臓また他の適当な部
位の抗体形成細胞を摘出し、その懸濁細胞を適当な融合
なパートナーと融合してハイブリドーマを生成させ、こ
の細胞を別個の容器中で適当に希釈、培養し、ハイブリ
ドーマを含有する各容器内の上澄液について抗体の存在
をスクリーニングし、所望の抗体を産生するハイブリド
ーマを選択し、クローン化して、ヒトモノクローナル抗
体が製造される。これらの操作は、文献に記載され、よ
く知られた技術によって実施できる。
【００３９】抗原は任意の抗原でよく、たとえば、ウイ
ルス、蛋白質もしくはペプチド、正常または病的細胞等
である。ハイブリドーマ融合パートナーはヒト起源でも
非ヒト哺乳動物起源のものでもよい。好ましい実施態様
においては、それはマウス骨髄系細胞である。
ルス、蛋白質もしくはペプチド、正常または病的細胞等
である。ハイブリドーマ融合パートナーはヒト起源でも
非ヒト哺乳動物起源のものでもよい。好ましい実施態様
においては、それはマウス骨髄系細胞である。
【００４０】所望のモノクローナル抗体を製造するには
、ハイブリドーマ細胞を適当な培地中、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで培養し、上澄液から所望のモノクローナル抗体を
回収するか、またはハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔
内に注射し、これらのマウスの悪性腹水もしくは血清か
ら抗体を収穫する。
、ハイブリドーマ細胞を適当な培地中、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで培養し、上澄液から所望のモノクローナル抗体を
回収するか、またはハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔
内に注射し、これらのマウスの悪性腹水もしくは血清か
ら抗体を収穫する。
【００４１】本発明は、他の実施態様においては、ヒト
には感染するが通常マウスには感染しないエイズや他の
種類のウイルスに対する動物モデルとしての、非ヒトキ
メラ哺乳動物Ｍ４の使用に関する。これは、正常マウス
と異なり、本発明のキメラ哺乳動物Ｍ４はヒトＴ細胞を
有するからである。この目的では、キメラ哺乳動物Ｍ４
は、それらに、本技術分野において知られている方法（
Ｎａｍｉｋａｗａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４２，１６８４，１９８８）によりＨＩＶ−１ま
たは他の適当なウイルス単離体を注射することにより、
エイズの原因となるＨＩＶ−１または他のウイルス株に
感染させる。２〜３週後に、動物を試験して、その末梢
血における抗原の存在を調べる。ついで、陽性の動物は
、エイズに対する新しい薬剤の評価および／またはエイ
ズに対する旧来の薬剤たとえばＡＺＴや新しい薬剤の生
物学的利用性もしくは効果の問題の研究のための便利な
試験系として使用できる。また、哺乳動物Ｍ１における
移植に用いられるヒト骨髄細胞は、移植前に遺伝子を操
作して、ＨＩＶ−１感染に抵抗性とすることもできる。 このような遺伝子療法の効果も、キメラ哺乳動物Ｍ４モ
デルで試験できる。
には感染するが通常マウスには感染しないエイズや他の
種類のウイルスに対する動物モデルとしての、非ヒトキ
メラ哺乳動物Ｍ４の使用に関する。これは、正常マウス
と異なり、本発明のキメラ哺乳動物Ｍ４はヒトＴ細胞を
有するからである。この目的では、キメラ哺乳動物Ｍ４
は、それらに、本技術分野において知られている方法（
Ｎａｍｉｋａｗａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４２，１６８４，１９８８）によりＨＩＶ−１ま
たは他の適当なウイルス単離体を注射することにより、
エイズの原因となるＨＩＶ−１または他のウイルス株に
感染させる。２〜３週後に、動物を試験して、その末梢
血における抗原の存在を調べる。ついで、陽性の動物は
、エイズに対する新しい薬剤の評価および／またはエイ
ズに対する旧来の薬剤たとえばＡＺＴや新しい薬剤の生
物学的利用性もしくは効果の問題の研究のための便利な
試験系として使用できる。また、哺乳動物Ｍ１における
移植に用いられるヒト骨髄細胞は、移植前に遺伝子を操
作して、ＨＩＶ−１感染に抵抗性とすることもできる。 このような遺伝子療法の効果も、キメラ哺乳動物Ｍ４モ
デルで試験できる。
【００４２】次に、本発明を以下の実施例によってさら
に詳しく説明するが、これらはいかなる意味においても
本発明を限定するものではない。
に詳しく説明するが、これらはいかなる意味においても
本発明を限定するものではない。
【００４３】例
致死照射ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＴおよびＢリンパ球の
移植 （ａ）８〜１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｏｌａ
ｃ Ｆａｒｍｓ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ
から入手）を、Ｇａｍｍａｂｅａｍ １５０−Ａ６０
Ｃｏ放射装置（Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ
Ｃａｎａｄａ，Ｋａｎａｔａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）か
らの１０Ｇｙ ＴＢＩの単回照射に、焦点皮膚距離（
Ｆ．Ｓ．Ｄ．）７５ｃｍ、照射速度０．７Ｇｙ／ｍｉｎ
で暴露した。１日後、１０×１０６ 個のＴ細胞枯渇ヒ
ト骨髄細胞（大豆凝集素による分別凝集、ついでＲｅｉ
ｓｎｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ：Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ，３
２７，１９８１の記載に従い、ヒツジ赤血球によるＥ−
ロゼッティングにより調製）を各マウスのｉ．ｖ．に移
植した。２４時間後に、８〜１２週齢の雄性ＳＣＩＤマ
ウス（ＴｈｅＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅ
ｒから入手）からのＴ細胞枯渇骨髄をＲｅｉｓｎｅｒら
（Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．，Ｉｔｚｉｃｏｖｉｔｃｈ，Ｌ
．，Ｍｅｓｈｏｒｅｒ，Ａ．，＆ Ｓｈａｒｏｎ，Ｎ
．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７５，２９３３，１９７８）に従い、一部をわずかに改
良して（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．，Ｌａｐｉｄｏｔ，Ｔ
．，Ｇｏｚｅｓ，Ｄ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ｓ．＆
Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８，
４６０，１９８７）調製し、２×１０６ 個の細胞を移
植した。ヘパリン被覆ガラス毛細管を用い、様々な時間
間隔で、マウスの眼窩後静脈から採血し、単核球をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分画で精製した。ヒトＴ細胞
の存在は、直接標識モノクローナル抗体で検出した。こ
れらには、Ｔ３（抗−ＣＤ３），Ｔ４（抗−ＣＤ４），
Ｔ８（抗−ＣＤ８）およびＴ１１（抗−ＣＤ２），（す
べてＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｔ
ｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄより入手）ならびに、Ｌｅｕ４（
抗−ＣＤ３），（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ，ＵＳＡ）が包含される。ヒトＢ細胞は、直接標識Ｂ
１（抗−ＣＤ２０）およびＢ４（抗−ＣＤ１９）（Ｃｏ
ｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって検出し
た。これらのモノクローナル抗体はすべて、図１、図２
および３から明らかなように、正常マウスＰＢＬと交差
反応性を示さなかった。２％を越えるＰＢＬが適当なモ
ノクローナル抗体で染色された場合に（正常ＢＡＬＢ／
ｃマウスのＰＢＬに対するバックグランド染色を差し引
いて）陽性マウスとした。２％のカットオフは、ａ）正
常ＢＡＬＢ／ｃマウス、ｂ）２×１０６ 個のＴ細胞枯
渇ＳＣＩＤドナー骨髄細胞を移植されたＢＡＬＢ／ｃマ
ウス、およびｃ）ヒト、からのＰＢＬに対して適当なモ
ノクローナル抗体を試験した予備実験に基づいて確立さ
れた。群（ａ）からの細胞で認められたバックグランド
染色を差し引いたのち、２％のカットオフを使用すると
群（ｂ）の「偽陽性」は効率的に回避されることが明ら
かになった。
移植 （ａ）８〜１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｏｌａ
ｃ Ｆａｒｍｓ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ
から入手）を、Ｇａｍｍａｂｅａｍ １５０−Ａ６０
Ｃｏ放射装置（Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ
Ｃａｎａｄａ，Ｋａｎａｔａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）か
らの１０Ｇｙ ＴＢＩの単回照射に、焦点皮膚距離（
Ｆ．Ｓ．Ｄ．）７５ｃｍ、照射速度０．７Ｇｙ／ｍｉｎ
で暴露した。１日後、１０×１０６ 個のＴ細胞枯渇ヒ
ト骨髄細胞（大豆凝集素による分別凝集、ついでＲｅｉ
ｓｎｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ：Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ，３
２７，１９８１の記載に従い、ヒツジ赤血球によるＥ−
ロゼッティングにより調製）を各マウスのｉ．ｖ．に移
植した。２４時間後に、８〜１２週齢の雄性ＳＣＩＤマ
ウス（ＴｈｅＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅ
ｒから入手）からのＴ細胞枯渇骨髄をＲｅｉｓｎｅｒら
（Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．，Ｉｔｚｉｃｏｖｉｔｃｈ，Ｌ
．，Ｍｅｓｈｏｒｅｒ，Ａ．，＆ Ｓｈａｒｏｎ，Ｎ
．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７５，２９３３，１９７８）に従い、一部をわずかに改
良して（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．，Ｌａｐｉｄｏｔ，Ｔ
．，Ｇｏｚｅｓ，Ｄ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ｓ．＆
Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８，
４６０，１９８７）調製し、２×１０６ 個の細胞を移
植した。ヘパリン被覆ガラス毛細管を用い、様々な時間
間隔で、マウスの眼窩後静脈から採血し、単核球をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分画で精製した。ヒトＴ細胞
の存在は、直接標識モノクローナル抗体で検出した。こ
れらには、Ｔ３（抗−ＣＤ３），Ｔ４（抗−ＣＤ４），
Ｔ８（抗−ＣＤ８）およびＴ１１（抗−ＣＤ２），（す
べてＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｔ
ｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄより入手）ならびに、Ｌｅｕ４（
抗−ＣＤ３），（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ，ＵＳＡ）が包含される。ヒトＢ細胞は、直接標識Ｂ
１（抗−ＣＤ２０）およびＢ４（抗−ＣＤ１９）（Ｃｏ
ｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって検出し
た。これらのモノクローナル抗体はすべて、図１、図２
および３から明らかなように、正常マウスＰＢＬと交差
反応性を示さなかった。２％を越えるＰＢＬが適当なモ
ノクローナル抗体で染色された場合に（正常ＢＡＬＢ／
ｃマウスのＰＢＬに対するバックグランド染色を差し引
いて）陽性マウスとした。２％のカットオフは、ａ）正
常ＢＡＬＢ／ｃマウス、ｂ）２×１０６ 個のＴ細胞枯
渇ＳＣＩＤドナー骨髄細胞を移植されたＢＡＬＢ／ｃマ
ウス、およびｃ）ヒト、からのＰＢＬに対して適当なモ
ノクローナル抗体を試験した予備実験に基づいて確立さ
れた。群（ａ）からの細胞で認められたバックグランド
染色を差し引いたのち、２％のカットオフを使用すると
群（ｂ）の「偽陽性」は効率的に回避されることが明ら
かになった。
【００４４】（ｂ）移植マウスの血清中の総ヒト１ｇ含
量は、移植３〜８カ月後に、二重抗体ＥＬＩＳＡを用い
て評価した。マイクロタイタープレートは、１００μｌ
のアフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＦａｂ′抗体（５０
μｇ／ｍｌ）（ＢｉｏＭａｋｏｒ，Ｎｅｓ Ｚｉｏｎ
ａ，Ｉｓｒａｅｌ）で被覆した。蛋白質の非特異的結合
は、ＰＢＳ中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）７％溶液内
で２時間インキュベートして除去した。移植マウスから
の希釈（１：１）血清（５０μｌ）を各ウエルに４℃で
１６時間適用した。ウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼ
−ヤギ抗−ヒト１ｇ（ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＨ）（Ｚｅ
ｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）と３７℃で２時間インキュベートし、それを、最終
希釈の前に同容量の正常マウス血清とインキュベートし
た（マウス１ｇとの交差反応性を回避するため）。さら
に洗浄したのち、基質溶液〔２，２−アジノジ−（３−
エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアゾニウム塩（
ＡＹＢＳ）〕（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を適用した。６２
０ｎｍにおける光学密度をＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉ
ｓｃａｎ−ＭＬ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。総Ｉｇ濃度は、精
製ヒトＩｇによる標準曲線を用いて計算した。２０ｎｇ
／ｍｌを越える値に相当する読みを陽性として記録した
。この閾値は、ＳＣＩＤ骨髄単独を移植されたマウスの
血清が陰性であった対照実験に基づくものである。ヒト
ＩｇＧおよびＩｇＭは、一部のマウスで（本文参照）、
第二の抗体、ペルオキシダーゼ−ウマ抗−ヒト（ＩｇＧ
）Ｆｃ（ＢｉｏＭａｋｏｒ）およびペルオキシダーゼ−
ヤギ抗−ヒトＩｇＭ（μ）（ＢｉｏＭａｋｏｒ）を用い
て、上述のように測定した。 （ｃ）非分離骨髄（８０×１０６ 細胞／マウス、Ｉ．
Ｖ．） （ｄ）非分離骨髄（２００×１０６ 細胞／マウス、Ｉ
．Ｐ．） （ｅ）非分離骨髄（１５×１０６ 細胞／マウス、Ｉ．
Ｖ．） 結果は表１にまとめる。
量は、移植３〜８カ月後に、二重抗体ＥＬＩＳＡを用い
て評価した。マイクロタイタープレートは、１００μｌ
のアフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＦａｂ′抗体（５０
μｇ／ｍｌ）（ＢｉｏＭａｋｏｒ，Ｎｅｓ Ｚｉｏｎ
ａ，Ｉｓｒａｅｌ）で被覆した。蛋白質の非特異的結合
は、ＰＢＳ中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）７％溶液内
で２時間インキュベートして除去した。移植マウスから
の希釈（１：１）血清（５０μｌ）を各ウエルに４℃で
１６時間適用した。ウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼ
−ヤギ抗−ヒト１ｇ（ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＨ）（Ｚｅ
ｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）と３７℃で２時間インキュベートし、それを、最終
希釈の前に同容量の正常マウス血清とインキュベートし
た（マウス１ｇとの交差反応性を回避するため）。さら
に洗浄したのち、基質溶液〔２，２−アジノジ−（３−
エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアゾニウム塩（
ＡＹＢＳ）〕（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を適用した。６２
０ｎｍにおける光学密度をＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉ
ｓｃａｎ−ＭＬ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。総Ｉｇ濃度は、精
製ヒトＩｇによる標準曲線を用いて計算した。２０ｎｇ
／ｍｌを越える値に相当する読みを陽性として記録した
。この閾値は、ＳＣＩＤ骨髄単独を移植されたマウスの
血清が陰性であった対照実験に基づくものである。ヒト
ＩｇＧおよびＩｇＭは、一部のマウスで（本文参照）、
第二の抗体、ペルオキシダーゼ−ウマ抗−ヒト（ＩｇＧ
）Ｆｃ（ＢｉｏＭａｋｏｒ）およびペルオキシダーゼ−
ヤギ抗−ヒトＩｇＭ（μ）（ＢｉｏＭａｋｏｒ）を用い
て、上述のように測定した。 （ｃ）非分離骨髄（８０×１０６ 細胞／マウス、Ｉ．
Ｖ．） （ｄ）非分離骨髄（２００×１０６ 細胞／マウス、Ｉ
．Ｐ．） （ｅ）非分離骨髄（１５×１０６ 細胞／マウス、Ｉ．
Ｖ．） 結果は表１にまとめる。
【表１】
致死照射ＢＡＬＢ／ｃマウスａ へのヒト
ＴおよびＢリンパ球の移植─────────────
────────────────────── 移
植後週 生存数 末
梢血にヒトリンパ球を有するマウス─────────
─────────────────────────
─ 実験１
Ｔ細胞 Ｂ細胞 Ｔ＋Ｂ細胞 ヒ
トＩｇｂ ７週 ７／１０
１／７ Ｎ．Ｔ． １０週
７／１０ ４／７ Ｎ．Ｔ． １
６週 ７／１０ ７／７ Ｎ．
Ｔ． ２２週 ７／１０ ６／
６ ６／６ ６／６ ３／
６ 実験２ ７週 ３／６ ０／
３ Ｎ．Ｔ． １８週 ３／６
２／３ １／３ １／３
０／３ 実験３ ９週 ７／８ ４／
７ ４／７ ４／７ ３／
７ 実験４ １１週 ４／７ ３／４
４／４ ３／４ １／４
実験５ｃ １１週 ７／８ ６／７
５／７ ５／７ ２／７
実験６ｄ １１週 ８／１４ ３／８
７／８ ２／７ ５／８
実験７ｅ １１週 ７／７ ５／７
７／７ ５／７ １／７
─────────────────────────
──────────
ＴおよびＢリンパ球の移植─────────────
────────────────────── 移
植後週 生存数 末
梢血にヒトリンパ球を有するマウス─────────
─────────────────────────
─ 実験１
Ｔ細胞 Ｂ細胞 Ｔ＋Ｂ細胞 ヒ
トＩｇｂ ７週 ７／１０
１／７ Ｎ．Ｔ． １０週
７／１０ ４／７ Ｎ．Ｔ． １
６週 ７／１０ ７／７ Ｎ．
Ｔ． ２２週 ７／１０ ６／
６ ６／６ ６／６ ３／
６ 実験２ ７週 ３／６ ０／
３ Ｎ．Ｔ． １８週 ３／６
２／３ １／３ １／３
０／３ 実験３ ９週 ７／８ ４／
７ ４／７ ４／７ ３／
７ 実験４ １１週 ４／７ ３／４
４／４ ３／４ １／４
実験５ｃ １１週 ７／８ ６／７
５／７ ５／７ ２／７
実験６ｄ １１週 ８／１４ ３／８
７／８ ２／７ ５／８
実験７ｅ １１週 ７／７ ５／７
７／７ ５／７ １／７
─────────────────────────
──────────
【００４５】表１から明らかなよ
うに、このアプローチは、ＳＣＩＤ骨髄ドナーとＨ−２
同一性である、致死照射正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの末梢
血に、ヒトＴおよびＢ細胞の分化を誘導した。４群の実
験で、合計３１匹のマウスが、静脈内経路により、１０
×１０６ 個のＳＢＡ− Ｅ− ヒト骨髄細胞の移植を
受け、１日後に、ＳＣＩＤマウスからのＴ細胞枯渇骨髄
細胞２×１０６ 個を静脈内に移植された。移植を受け
た３１匹のマウス中、２０匹が少なくとも３カ月、８カ
月以上まで生存した。感染による脂肪（３１匹中１０匹
）は、主として、移植後３週の間に観察された。１匹の
マウスは、眼窩後静脈からの採血後、移植５カ月目に感
染で死亡した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のヒトリン
パ球の移植の結果を評価するため、マウスから定期的に
採血を行った。生存動物２０匹中１６匹で、ヒトＴ細胞
および／またはヒトＢ細胞の移植が認められた。生存動
物２０匹中１４匹で、有意な数のヒト起源ＴおよびＢ細
胞の両者が、移植７週後以降９カ月まで、検出された。
うに、このアプローチは、ＳＣＩＤ骨髄ドナーとＨ−２
同一性である、致死照射正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの末梢
血に、ヒトＴおよびＢ細胞の分化を誘導した。４群の実
験で、合計３１匹のマウスが、静脈内経路により、１０
×１０６ 個のＳＢＡ− Ｅ− ヒト骨髄細胞の移植を
受け、１日後に、ＳＣＩＤマウスからのＴ細胞枯渇骨髄
細胞２×１０６ 個を静脈内に移植された。移植を受け
た３１匹のマウス中、２０匹が少なくとも３カ月、８カ
月以上まで生存した。感染による脂肪（３１匹中１０匹
）は、主として、移植後３週の間に観察された。１匹の
マウスは、眼窩後静脈からの採血後、移植５カ月目に感
染で死亡した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のヒトリン
パ球の移植の結果を評価するため、マウスから定期的に
採血を行った。生存動物２０匹中１６匹で、ヒトＴ細胞
および／またはヒトＢ細胞の移植が認められた。生存動
物２０匹中１４匹で、有意な数のヒト起源ＴおよびＢ細
胞の両者が、移植７週後以降９カ月まで、検出された。
【００４６】移植後の期間におけるＴ細胞の移植成立の
定量的評価は、６カ月以上にわたって観察された第一の
マウス群で最もよく例示されている（図１）。移植マウ
スの末梢血へのＣＤ３Ｔ細胞の出現は、１匹のマウス（
Ｎｏ．３）では、移植７週後にはじめて認められた（図
１挿入図）。このマウスでは、正常ヒトＰＢＬの場合の
６６％に対し、ＰＢＬの２５％がヒトＣＤ３特異的モノ
クローナル抗体に結合した。ＳＣＩＤマウス骨髄単独の
移植を受けたマウスからのＰＢＬでは、この検定で、こ
の試剤によりわずかに０．９％が標識されたにすぎなか
った。
定量的評価は、６カ月以上にわたって観察された第一の
マウス群で最もよく例示されている（図１）。移植マウ
スの末梢血へのＣＤ３Ｔ細胞の出現は、１匹のマウス（
Ｎｏ．３）では、移植７週後にはじめて認められた（図
１挿入図）。このマウスでは、正常ヒトＰＢＬの場合の
６６％に対し、ＰＢＬの２５％がヒトＣＤ３特異的モノ
クローナル抗体に結合した。ＳＣＩＤマウス骨髄単独の
移植を受けたマウスからのＰＢＬでは、この検定で、こ
の試剤によりわずかに０．９％が標識されたにすぎなか
った。
【００４７】移植後１０週までに、試験されたマウスの
７匹中４匹に、少ないが有意な数の、６．５％から１０
．８％（平均７．９％）のＴ細胞が見出された。移植後
４カ月の末までには、著しいＴ細胞数の増加が認められ
、この時点では、７匹のすべてにヒトＣＤ３Ｔ細胞の移
植が成立した。試験されたマウスの７匹中６匹で、末梢
血中に存在するＴ細胞の百分率は１０％以上で、１１．
１％から５４．１％（平均２７．１％）であった。 ヒトＣＤ２に特異的なモノクローナル抗体を用いても、
類似した数のＴ細胞が記録された（データは示していな
い）。
７匹中４匹に、少ないが有意な数の、６．５％から１０
．８％（平均７．９％）のＴ細胞が見出された。移植後
４カ月の末までには、著しいＴ細胞数の増加が認められ
、この時点では、７匹のすべてにヒトＣＤ３Ｔ細胞の移
植が成立した。試験されたマウスの７匹中６匹で、末梢
血中に存在するＴ細胞の百分率は１０％以上で、１１．
１％から５４．１％（平均２７．１％）であった。 ヒトＣＤ２に特異的なモノクローナル抗体を用いても、
類似した数のＴ細胞が記録された（データは示していな
い）。
【００４８】ヒトＣＤ８およびＣＤ４に特異的なモノク
ローナル抗体を用いて、移植が成立したＴ細胞の表現型
をさらに調べたところ、Ｔ細胞枯渇骨髄により骨髄移植
に成功したのちの初期に白血病患者に共通して認められ
るＣＤ３ ＣＤ２ＣＤ４ＣＤ８リンパ球のような異常
もしくは未成熟表現型（Ｋｅｅｖｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ
ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，７９，１３４０，１９８９）が見
出された。移植５カ月後の移植成立マウスの末梢血にお
ける総ヒトＴ細胞中のこれらの細胞の百分率は、４９％
〜８４％であった。しかしながら、末梢血中の残りのヒ
トＴ細胞は、正常末梢血中に共通して認められる成熟表
現型、たとえばＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ８− および
ＣＤ３＋ ＣＤ４− ＣＤ８＋ であった。
ローナル抗体を用いて、移植が成立したＴ細胞の表現型
をさらに調べたところ、Ｔ細胞枯渇骨髄により骨髄移植
に成功したのちの初期に白血病患者に共通して認められ
るＣＤ３ ＣＤ２ＣＤ４ＣＤ８リンパ球のような異常
もしくは未成熟表現型（Ｋｅｅｖｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ
ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，７９，１３４０，１９８９）が見
出された。移植５カ月後の移植成立マウスの末梢血にお
ける総ヒトＴ細胞中のこれらの細胞の百分率は、４９％
〜８４％であった。しかしながら、末梢血中の残りのヒ
トＴ細胞は、正常末梢血中に共通して認められる成熟表
現型、たとえばＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ８− および
ＣＤ３＋ ＣＤ４− ＣＤ８＋ であった。
【００４９】すなわち、移植後最初の月にのみ一過性の
ヒトＴ細胞の移植成立が検出された研究（ＭｃＣｕｎｅ
，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，１
６３２，１９８８）とは異なり、本発明の実験モデルで
は、移植後７週から始まり移植後４〜５カ月でプラトー
に達する、遅いが着実な末梢血におけるヒトＴ細胞の増
加が証明された（図１）。これらの結果は、ＳＢＡ
Ｅ骨髄の移植後にヒトＳＣＩＤ患者および白血病患者に
みられる遅いＴ細胞分化（Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．ｅｔ
ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，６１，３４１，１９８３）と一致
するものである。
ヒトＴ細胞の移植成立が検出された研究（ＭｃＣｕｎｅ
，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，１
６３２，１９８８）とは異なり、本発明の実験モデルで
は、移植後７週から始まり移植後４〜５カ月でプラトー
に達する、遅いが着実な末梢血におけるヒトＴ細胞の増
加が証明された（図１）。これらの結果は、ＳＢＡ
Ｅ骨髄の移植後にヒトＳＣＩＤ患者および白血病患者に
みられる遅いＴ細胞分化（Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ．ｅｔ
ａｌ：Ｂｌｏｏｄ，６１，３４１，１９８３）と一致
するものである。
【００５０】移植後５カ月（図２）または６カ月（ＰＢ
Ｓ 中胸腺細胞懸濁液の調製後に、約１〜２×１０６
個の生存細胞を収集できた）の移植マウスからの胸腺
細胞の細胞蛍光測定法による検査では、正常ヒト胸腺細
胞の表現型をもつ有意な数のヒト細胞が認められた。正
常ヒト胸腺の場合と同様に、主要な胸腺細胞亜集団は、
ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 表現型をもつことが見出された。 少数のＣＤ４＋ ＣＤ８− およびＣＤ４− ＣＤ８＋
リンパ球集団も検出された（図２）。
Ｓ 中胸腺細胞懸濁液の調製後に、約１〜２×１０６
個の生存細胞を収集できた）の移植マウスからの胸腺
細胞の細胞蛍光測定法による検査では、正常ヒト胸腺細
胞の表現型をもつ有意な数のヒト細胞が認められた。正
常ヒト胸腺の場合と同様に、主要な胸腺細胞亜集団は、
ＣＤ４＋ ＣＤ８＋ 表現型をもつことが見出された。 少数のＣＤ４＋ ＣＤ８− およびＣＤ４− ＣＤ８＋
リンパ球集団も検出された（図２）。
【００５１】
移植ヒトＴ細胞のマイトジエンに対する応答性移植ヒト
Ｔ細胞のマイトジエンに対する応答性は、移植後５カ月
のヒト−マウスキメラ（第三群の実験から）の脾臓細胞
を、骨髄移植後のＳＣＩＤまたは白血病患者における免
疫再構築の試験に用いられる条件下、特異的抗−ヒトＣ
Ｄ３抗体で刺激して評価した（ＯＫＴ３／ＡＴＣＣ，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，１〜２
μｇ／ウエル）。このマイトジエンは、ヒトＴ細胞を選
択的に刺激し、マウス細胞と交差反応しない。したがっ
て、ヒト−マウスキメラの評価には、植物マイトジエン
より適している。
Ｔ細胞のマイトジエンに対する応答性は、移植後５カ月
のヒト−マウスキメラ（第三群の実験から）の脾臓細胞
を、骨髄移植後のＳＣＩＤまたは白血病患者における免
疫再構築の試験に用いられる条件下、特異的抗−ヒトＣ
Ｄ３抗体で刺激して評価した（ＯＫＴ３／ＡＴＣＣ，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，１〜２
μｇ／ウエル）。このマイトジエンは、ヒトＴ細胞を選
択的に刺激し、マウス細胞と交差反応しない。したがっ
て、ヒト−マウスキメラの評価には、植物マイトジエン
より適している。
【００５２】マイトジエンと７日間培養すると、正常ヒ
トＰＢＬの場合の２．２、正常マウス脾臓細胞での０．
８に対し、試験された２匹のキメラマウスにおける刺激
係数は、３．１および２．２であった。しかしながら、
ヒト−マウスキメラの脾臓細胞の応答の大きさ（抗−Ｏ
ＫＴ３０．８の存在下と不存在下におけるチミジン取り
込みの平均の間の差）は、正常ヒトＰＢＬの場合（３２
，７０７ｃｐｍ）の、それぞれ、わずか１０％（３１７
８ｃｐｍ）および７％（２４４０ｃｐｍ）であった。
トＰＢＬの場合の２．２、正常マウス脾臓細胞での０．
８に対し、試験された２匹のキメラマウスにおける刺激
係数は、３．１および２．２であった。しかしながら、
ヒト−マウスキメラの脾臓細胞の応答の大きさ（抗−Ｏ
ＫＴ３０．８の存在下と不存在下におけるチミジン取り
込みの平均の間の差）は、正常ヒトＰＢＬの場合（３２
，７０７ｃｐｍ）の、それぞれ、わずか１０％（３１７
８ｃｐｍ）および７％（２４４０ｃｐｍ）であった。
【００５３】上述のキメラからの脾臓細胞をＩＬ−２含
有培地中でインキュベートし培養７日後に抗−ヒトＣＤ
３抗体で染色して試験すると、生存集団中にはヒトＴ細
胞が多く（５５％）、ＳＣＩＤマウス骨髄単独の移植を
受けた対照マウスからの脾臓細胞について得られた結果
（１％）と異なり、正常ヒトＰＢＬをこれらの刺激下に
培養した場合に認められるＴ細胞の優勢（８３％）に類
似していた（図４）。これは、このようなヒト−マウス
キメラからヒトＴ細胞をクローン化し、ついで刺激抗原
に対するそれらの特異性を試験することが可能であるこ
とを示している。
有培地中でインキュベートし培養７日後に抗−ヒトＣＤ
３抗体で染色して試験すると、生存集団中にはヒトＴ細
胞が多く（５５％）、ＳＣＩＤマウス骨髄単独の移植を
受けた対照マウスからの脾臓細胞について得られた結果
（１％）と異なり、正常ヒトＰＢＬをこれらの刺激下に
培養した場合に認められるＴ細胞の優勢（８３％）に類
似していた（図４）。これは、このようなヒト−マウス
キメラからヒトＴ細胞をクローン化し、ついで刺激抗原
に対するそれらの特異性を試験することが可能であるこ
とを示している。
【００５４】ヒトＢ細胞の存在の試験
移植マウスの末梢血におけるヒトＢ細胞の存在は、第一
の群の動物で移植５カ月後に、最初に試験した。ヒト−
マウスキメラ中のヒトＢ細胞の識別には、ヒトＢ細胞分
化抗原ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な直接標識モノ
クローナル抗体を用いた。この試験は、移植後５カ月お
よび６カ月の間に実施した。末梢血中のヒトＣＤ１９＋
およびＣＤ２０＋ 細胞の比率は、移植後５カ月には
ＣＤ１９に対しては４．５％〜１６．３％、ＣＤ２０に
対しては３．５％〜３３．０であった。６カ月後、これ
らの値はそれぞれ、９．０％〜３０．４％、および２．
１％〜２０．６％の範囲となった。移植マウスの末梢血
および脾臓細胞中ヒトＢ細胞の、抗−ＣＤ２０による典
型的な染色を、正常ＢＡＬＡ／ｃマウスの末梢血および
脾臓細胞中のマウスＢ細胞の染色と比較して図３に示す
。
の群の動物で移植５カ月後に、最初に試験した。ヒト−
マウスキメラ中のヒトＢ細胞の識別には、ヒトＢ細胞分
化抗原ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な直接標識モノ
クローナル抗体を用いた。この試験は、移植後５カ月お
よび６カ月の間に実施した。末梢血中のヒトＣＤ１９＋
およびＣＤ２０＋ 細胞の比率は、移植後５カ月には
ＣＤ１９に対しては４．５％〜１６．３％、ＣＤ２０に
対しては３．５％〜３３．０であった。６カ月後、これ
らの値はそれぞれ、９．０％〜３０．４％、および２．
１％〜２０．６％の範囲となった。移植マウスの末梢血
および脾臓細胞中ヒトＢ細胞の、抗−ＣＤ２０による典
型的な染色を、正常ＢＡＬＡ／ｃマウスの末梢血および
脾臓細胞中のマウスＢ細胞の染色と比較して図３に示す
。
【００５５】第二および第三群の骨髄レシピエントでの
ＢＡＬ中におけるＢ細胞の存在は、移植後の比較的早い
時期に試験した（表１）。最も早いＢ細胞の存在は、第
三実験群のマウス７匹中４匹で、移植９週後に記録され
た。この時点でのこれらのマウスのＰＢＬ中のＣＤ１９
＋ ヒトＢ細胞の百分率は、２．４〜１４．３８％の範
囲であった。
ＢＡＬ中におけるＢ細胞の存在は、移植後の比較的早い
時期に試験した（表１）。最も早いＢ細胞の存在は、第
三実験群のマウス７匹中４匹で、移植９週後に記録され
た。この時点でのこれらのマウスのＰＢＬ中のＣＤ１９
＋ ヒトＢ細胞の百分率は、２．４〜１４．３８％の範
囲であった。
【００５６】移植が成立したヒトＢリンパ球の機能は、
血清中ヒト免疫グロブリンのレベルの試験により、ＤＮ
Ｐ−ＫＬＨに応答して生成したヒト抗体の力価を調べて
評価した。ＳＢＡ Ｅヒト骨髄を移植されたマウス（
ＴおよびＢ細胞の両者が枯渇）中、移植が成立したマウ
ス２０匹中７匹がヒトＩｇに陽性であった。ヒトＩｇに
陽性を示したマウス４匹からの血清をさらに試験したと
ころ、ヒトＩｇＭが２例に、またヒトＩｇＧが他の２例
に検出された。以後の実験で、マウスには、非処置骨髄
も移植した（表１参照）。これらのマウス２２例中８例
がヒトＩｇに対して陽性で、ヒトＩｇＭは２例に、ヒト
ＩｇＧは他の６例の動物に検出された。
血清中ヒト免疫グロブリンのレベルの試験により、ＤＮ
Ｐ−ＫＬＨに応答して生成したヒト抗体の力価を調べて
評価した。ＳＢＡ Ｅヒト骨髄を移植されたマウス（
ＴおよびＢ細胞の両者が枯渇）中、移植が成立したマウ
ス２０匹中７匹がヒトＩｇに陽性であった。ヒトＩｇに
陽性を示したマウス４匹からの血清をさらに試験したと
ころ、ヒトＩｇＭが２例に、またヒトＩｇＧが他の２例
に検出された。以後の実験で、マウスには、非処置骨髄
も移植した（表１参照）。これらのマウス２２例中８例
がヒトＩｇに対して陽性で、ヒトＩｇＭは２例に、ヒト
ＩｇＧは他の６例の動物に検出された。
【００５７】ヒトＩｇに陽性を示したキメラマウス（第
一実験群からの２匹および第三実験群からの２匹で、そ
れぞれ移植８および６カ月後）のＤＮＰ−ＫＬＨによる
免疫処置は、４例中２例の動物に、ＤＮＰに特異的な一
次および二次応答の両者を誘導した（図５）。二次免疫
処置後には、２匹のマウス中１匹に特異的なヒトＩｇＧ
およびＩｇＭの両者を検出することができた。これらの
結果は、移植ヒトリンパ球はマウス環境内で機能できる
ことを示している。
一実験群からの２匹および第三実験群からの２匹で、そ
れぞれ移植８および６カ月後）のＤＮＰ−ＫＬＨによる
免疫処置は、４例中２例の動物に、ＤＮＰに特異的な一
次および二次応答の両者を誘導した（図５）。二次免疫
処置後には、２匹のマウス中１匹に特異的なヒトＩｇＧ
およびＩｇＭの両者を検出することができた。これらの
結果は、移植ヒトリンパ球はマウス環境内で機能できる
ことを示している。
【００５８】マウスＢＡＬは、本研究に使用した特定の
モノクローナル抗体とは交差反応性を示さなかった（図
１〜３）。したがって、ここに示した細胞蛍光分析は、
ヒトＴおよびＢ細胞が、移植された正常ＢＡＬＡ／ｃマ
ウス中で生育し、増殖できることの強力な証拠を提供す
るものである。しかしながら、さらにこれを確証するた
め、本発明者らは、移植されたマウスの末梢血液中にお
けるヒトリンパ球の存在をＤＮＡ分析で確認した。図６
から明らかなように、ヒト（ＨＬＡ−ＤＱＢ）遺伝子の
ＤＮＡがマウスＮｏ．１の血清中に検出された。しかし
、非処置マウスからの正常ＢＡＬの試験では、完全に陰
性の結果が得られた。マウスＮｏ．１からのＢＡＬの同
じサンプル（移植６カ月後に採取）では、抗−ＣＤ３お
よび抗−ＣＤ１９モノクローナル抗体を用いた細胞蛍光
分析により、６０％のＴおよびＢ細胞の存在が明らかに
された。一方、抗Ｈ２ｄ モノクローナル抗体による染
色では、わずか６．２％のマウス単核球細胞が検出され
たのみであった。
モノクローナル抗体とは交差反応性を示さなかった（図
１〜３）。したがって、ここに示した細胞蛍光分析は、
ヒトＴおよびＢ細胞が、移植された正常ＢＡＬＡ／ｃマ
ウス中で生育し、増殖できることの強力な証拠を提供す
るものである。しかしながら、さらにこれを確証するた
め、本発明者らは、移植されたマウスの末梢血液中にお
けるヒトリンパ球の存在をＤＮＡ分析で確認した。図６
から明らかなように、ヒト（ＨＬＡ−ＤＱＢ）遺伝子の
ＤＮＡがマウスＮｏ．１の血清中に検出された。しかし
、非処置マウスからの正常ＢＡＬの試験では、完全に陰
性の結果が得られた。マウスＮｏ．１からのＢＡＬの同
じサンプル（移植６カ月後に採取）では、抗−ＣＤ３お
よび抗−ＣＤ１９モノクローナル抗体を用いた細胞蛍光
分析により、６０％のＴおよびＢ細胞の存在が明らかに
された。一方、抗Ｈ２ｄ モノクローナル抗体による染
色では、わずか６．２％のマウス単核球細胞が検出され
たのみであった。
【００５９】ＳＣＩＤマウスの骨髄には、正常な骨髄系
および赤血球系細胞前駆体が存在するので、ヒトＳＢＡ
Ｅ骨髄細胞をマウスＳＣＩＤ骨髄細胞と一緒に移植
すると、ヒト骨髄系細胞の移植成立は無視できるものと
期待される。しかしながら、移植後様々な時間で屠殺し
たヒト−マウスリンパ球キメラから得られた骨髄プレパ
レーションは、抗Ｈ２ｄ 抗体（マウスのＳＣＩＤおよ
びＢＡＬＡ／ｃ株の染色に特異的）で染色して分析した
場合、ヒト骨髄系分化抗原（抗−ＣＤ１３および抗−Ｃ
Ｄ３３）に対する抗体と反応する細胞が繰り返しＰＢＬ
中に見出され（１〜１０％）、また時に、骨髄および脾
臓サンプル中にも認められた。検出された細胞には、自
己再生および分化の有意な能力をもつクローン由来前駆
細胞が包含されるものと思われる。
および赤血球系細胞前駆体が存在するので、ヒトＳＢＡ
Ｅ骨髄細胞をマウスＳＣＩＤ骨髄細胞と一緒に移植
すると、ヒト骨髄系細胞の移植成立は無視できるものと
期待される。しかしながら、移植後様々な時間で屠殺し
たヒト−マウスリンパ球キメラから得られた骨髄プレパ
レーションは、抗Ｈ２ｄ 抗体（マウスのＳＣＩＤおよ
びＢＡＬＡ／ｃ株の染色に特異的）で染色して分析した
場合、ヒト骨髄系分化抗原（抗−ＣＤ１３および抗−Ｃ
Ｄ３３）に対する抗体と反応する細胞が繰り返しＰＢＬ
中に見出され（１〜１０％）、また時に、骨髄および脾
臓サンプル中にも認められた。検出された細胞には、自
己再生および分化の有意な能力をもつクローン由来前駆
細胞が包含されるものと思われる。
【００６０】非処置骨髄による移植
Ｔ細胞の枯渇が行われていないヒト骨髄単核細胞集団の
移植を、同じ移植方法を用いて実施した。ただし、さら
に大用量の（８０×１０６ 細胞／マウス）非処置骨髄
を用いた（前駆体細胞と比較的に相当する数を与える）
。 移植成立率はＴ細胞枯渇骨髄を用いた場合（表１）と同
様で、移植片−宿主病の発症も認められなかった。
移植を、同じ移植方法を用いて実施した。ただし、さら
に大用量の（８０×１０６ 細胞／マウス）非処置骨髄
を用いた（前駆体細胞と比較的に相当する数を与える）
。 移植成立率はＴ細胞枯渇骨髄を用いた場合（表１）と同
様で、移植片−宿主病の発症も認められなかった。
【００６１】要約すれば、本発明は、ヒトＢおよびＴ細
胞を有する「正常な」マウスを提供するものである。
胞を有する「正常な」マウスを提供するものである。
【００６２】本明細書の以上の記載は、本技術分野に属
する熟練者による本発明の実施を可能にする十分な情報
を提供するものであると考える。ここに示したＢおよひ
Ｔ細胞を有する正常マウスの例は、本発明の一実施態様
を例示するものであって、本発明の範囲を限定するもの
ではない。本発明に様々な改変が可能なことは、以上の
記述から、本技術分野に属する熟練者には自明であろう
。このような改変は、すべて、本特許請求の範囲に包含
されるものである。
する熟練者による本発明の実施を可能にする十分な情報
を提供するものであると考える。ここに示したＢおよひ
Ｔ細胞を有する正常マウスの例は、本発明の一実施態様
を例示するものであって、本発明の範囲を限定するもの
ではない。本発明に様々な改変が可能なことは、以上の
記述から、本技術分野に属する熟練者には自明であろう
。このような改変は、すべて、本特許請求の範囲に包含
されるものである。
【図１】本発明の移植マウスの末梢血におけるヒトＣＤ
３細胞の分化を示すグラフ。
３細胞の分化を示すグラフ。
【図２】ヒト骨髄を移植されたマウスからの胸腺細胞の
抗−ヒトＣＤ４および抗−ヒトＣＤ８による二重染色。
抗−ヒトＣＤ４および抗−ヒトＣＤ８による二重染色。
【図３】移植マウスの末梢血および脾臓におけるヒトＢ
細胞の染色を示すグラフ。
細胞の染色を示すグラフ。
【図４】ヒト−マウスキメラ脾臓細胞の、ＩＬ−２含有
培地中での培養後の抗−ヒトＣＤ３による染色。
培地中での培養後の抗−ヒトＣＤ３による染色。
【図５】ＤＮＰ−ＫＬＨで免疫処置されたヒト−マウス
キメラにおけるＤＮＰ−特異的ヒト抗体を示すグラフ。
キメラにおけるＤＮＰ−特異的ヒト抗体を示すグラフ。
【図６】ヒト−マウスキメラからの末梢血のＤＮＡ分析
を示すゲルパターン。
を示すゲルパターン。
Claims (24)
- 【請求項１】 少なくと２つの異なるソースからの造
血細胞により、造血細胞が実質的に抑制または破壊およ
び置換された哺乳動物Ｍ１からなり、この場合、上記ソ
ースの少なくとも一つは哺乳動物Ｍ１以外の種の哺乳動
物Ｍ３に由来する造血細胞であり、上記ソースの少なく
とも第二は哺乳動物Ｍ３以外の種で、遺伝的に決定され
た造血細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する造血細
胞である、長期に安定な異種造血細胞を有する非ヒトキ
メラ哺乳動物Ｍ４。 - 【請求項２】 哺乳動物Ｍ３はヒトである「請求項１
」記載の非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４。 - 【請求項３】 哺乳動物Ｍ２および哺乳動物Ｍ１は同
じ哺乳動物種である「請求項２」記載の非ヒトキメラ哺
乳動物Ｍ４。 - 【請求項４】 哺乳動物Ｍ２および哺乳動物Ｍ１はい
ずれもマウスである「請求項３」記載の非ヒトキメラ哺
乳動物Ｍ４。 - 【請求項５】 ヒトＴリンパ球を有する「請求項２」
記載の非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４。 - 【請求項６】 ヒトＴリンパ球およびヒトＢリンパ球
有する「請求項２」記載の非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４。 - 【請求項７】 ヒト赤血球系細胞系統の細胞を有する
「請求項２」記載の非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４。 - 【請求項８】 ヒト骨髄系細胞系統の細胞を有する「
請求項２」記載の非ヒトキメラ哺乳動物Ｍ４。 - 【請求項９】 マウスＭ１の造血細胞はヒトＴ細胞で
置換され、哺乳動物Ｍ２は重症複合免疫不全症（ＳＣＩ
Ｄ）マウスである「請求項４」記載の非ヒトキメラマウ
ス。 - 【請求項１０】 哺乳動物Ｍ１の造血細胞はヒトＴお
よびＢ細胞で置換され、哺乳動物Ｍ２は重症複合免疫不
全症（ＳＣＩＤ）マウスである「請求項４」記載の非ヒ
トキメラマウス。 - 【請求項１１】 哺乳動物Ｍ１はＢＡＬＢ／ｃマウス
である「請求項１０」記載の非ヒトキメラマウス。 - 【請求項１２】 哺乳動物Ｍ１はトランスジェニック
マウスである「請求項４」記載の非ヒトキメラマウス。 - 【請求項１３】 （ａ）非ヒト哺乳動物Ｍ１を、その
免疫系を本質的に破壊するように処置し、（ｂ）この処
置哺乳動物Ｍ１に哺乳動物Ｍ１以外の種の哺乳動物Ｍ３
由来の造血細胞を移植し、（ｃ）工程（ｂ）の処理動物
にさらに、哺乳動物Ｍ３以外の種の、遺伝的に決定され
た造血細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２に由来する造血細
胞を移植して、哺乳動物ドナーＭ２由来の造血細胞を有
しさらに哺乳動物ドナーＭ３からの１または２種以上の
造血細胞系統を有するキメラ非ヒト哺乳動物Ｍ４を得る
ことを特徴とする「請求項１」記載の非ヒトキメラ哺乳
動物Ｍ４を作成する方法。 - 【請求項１４】 哺乳動物Ｍ３由来の造血細胞系統は
、遺伝的に決定された造血細胞不全により哺乳動物Ｍ２
が欠く細胞系統に相当する「請求項１３」記載の方法。 - 【請求項１５】 哺乳動物Ｍ１はマウス、哺乳動物Ｍ
２はマウス、哺乳動物Ｍ３はヒトである「請求項１３」
記載の方法。 - 【請求項１６】 工程（ｂ）において移植されるヒト
造血細胞は、（ｉ）非分画または分画骨髄細胞、（ｉｉ
）非分画または分画血球、（ｉｉｉ）多能性の幹細胞お
よび／またはＢおよびＴ細胞枯渇末梢血由来の他の造血
前駆細胞、（ｉｖ）臍帯血または胎児組織、ならびに（
ｖ）成熟ドナーからのリンパ節または脾細胞からなる群
より選ばれる「請求項１５」記載の方法。 - 【請求項１７】 工程（ｂ）においてヒト非分画骨髄
細胞がマウスＭ１に移植される「請求項１６」記載の方
法。 - 【請求項１８】 工程（ｃ）における哺乳動物Ｍ２由
来の造血細胞は、限られた自己再生能を有する短期造血
細胞前駆体である「請求項１３」記載の方法。 - 【請求項１９】 短期造血細胞前駆体は哺乳動物Ｍ２
の骨髄の分画によって得られる「請求項１８」記載の方
法。 - 【請求項２０】 短期造血細胞前駆体は、まずその免
疫系を本質的に破壊するように処置し、ついでそれに遺
伝的に決定された造血細胞不全を有する哺乳動物Ｍ２の
骨髄を移植した哺乳動物に由来する「請求項１８」記載
の方法。 - 【請求項２１】 （ａ）レシピエントマウスＭ１にそ
の免疫系を本質的に破壊するように致命的照射処置を行
い、（ｂ）この照射処置マウスに非処置またはＴ細胞枯
渇ヒト骨髄を移植し、（ｃ）工程（ｂ）の移植マウスに
さらにＴ細胞枯渇ＳＣＩＤマウスＭ３骨髄細胞を移植し
て、長期に安定なヒトＢおよびＴ細胞を有するキメラマ
ウスＭ４を得ることを特徴とする、長期に安定なヒトＢ
およびＴ細胞、ならびにＳＣＩＤマウスＭ２由来の造血
細胞を有する「請求項１０」記載のキメラマウスＭ４を
作成する方法。 - 【請求項２２】 キメラマウスＭ４は長期に安定なヒ
トＢおよびＴ細胞を有するＢＡＬＢ／ｃマウスである「
請求項２１」記載の方法。 - 【請求項２３】 ヒトモノクローナル抗体を製造する
にあたり、（ａ）「請求項１０」記載のキメラマウスＭ
４を抗原で免疫処置し、（ｂ）免疫処置マウスの脾臓、
胸腺またはリンパ節細胞を適当な培養融合パートナー細
胞と融合してハイブリドーマ細胞を得、（ｃ）このハイ
ブリドーマ細胞の上澄液を上記ヒト抗体の存在について
スクリーニングし、（ｄ）上記ヒト抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択し、クローン化し、（ｅ）選択され、
クローン化されたハイブリドーマを適当な培地中で培養
し、その上澄液から抗体を回収することを特徴とする上
記抗体の製造方法。 - 【請求項２４】 エイズまたは任意の他の特定ヒトウ
イルス疾患に対する薬剤の効果を評価するにあたり、（
ａ）「請求項１０」記載のキメラマウスＭ４にエイズま
たは他の特定ヒトウイルス疾患の原因となるウイルス株
を感染させ、（ｂ）評価すべき薬剤を感染キメラマウス
に注射し、（ｃ）この感染キメラマウスの血清または組
織中のウイルス特異的抗原を試験することにより感染キ
メラマウスの処置における薬剤の効果を評価することを
特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61830390A | 1990-11-26 | 1990-11-26 | |
| US618303 | 1990-11-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04267830A true JPH04267830A (ja) | 1992-09-24 |
| JP2647292B2 JP2647292B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=24477161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3309255A Expired - Fee Related JP2647292B2 (ja) | 1990-11-26 | 1991-11-25 | 非ヒトキメラ哺乳動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2647292B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003508038A (ja) * | 1999-08-31 | 2003-03-04 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | ドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることができるトランスジェニック哺乳類 |
| CN107773573A (zh) * | 2016-08-30 | 2018-03-09 | 张超 | 白血病疾病模型及其构建方法 |
-
1991
- 1991-11-25 JP JP3309255A patent/JP2647292B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003508038A (ja) * | 1999-08-31 | 2003-03-04 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | ドナー特異的機能性免疫の産生を容易にすることができるトランスジェニック哺乳類 |
| CN107773573A (zh) * | 2016-08-30 | 2018-03-09 | 张超 | 白血病疾病模型及其构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2647292B2 (ja) | 1997-08-27 |
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