KR101477106B1

KR101477106B1 - 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법

Info

Publication number: KR101477106B1
Application number: KR20140088474A
Authority: KR
Inventors: 곽종영; 정영훈; 김창근; 윤식; 진송완; 김태언
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2014-07-14
Publication date: 2014-12-29
Also published as: WO2016010228A1

Abstract

본 발명은 나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고, ⑴ 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계; ⑵ 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계; ⑶ 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤분리되는 단계; 및 ⑷ 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법이 개시된다.

Description

나노-마이크로 하이브리드 섬유 기반의 미성숙 수지상세포 배양방법 및 분석방법{CULTURE METHOD AND ANALYSES OF IMMATURE DENDRITIC CELLS IN NANO-MICRO HYBRID NANOFIBER-BASED}

본 발명은 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 한 미성숙 수지상세포의 배양방법 및 분석방법에 관한 것으로, 구체적으로는 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 한 세포배양용 구조물을 이용하여 비장에서 분리한 수지상세포를 수지상세포의 비활성형을 유지하는 상태로 안정적으로 배양할 수 있는, 미성숙 수지상세포의 배양방법 및 미성숙 수지상세포의 분석방법에 관한 것이다.

살아있는 유기체 내에서 세포는 동적으로 시스템이 변화하고, 일정한 지놈(genome)을 유지하면서 세포를 분화하는 능력과 함께 복잡한 형태를 가지고 있다. 따라서 세포의 배양과 분석을 위해서는, 종래 2차원적 세포 배양의 단점을 극복하고, 생체내부의 공간적(spatial), 시간적(temporal) 조건을 정교하게 모사(mimicking)함으로써, 복잡한 생화학적 생체 내(in vivo) 환경을 제공하여 3차원적으로 세포를 배양 및 분석하는 것이 중요하다. 이에 최근 나노공학 기반의 나노/마이크로 기술의 개발로 세포의 배양 및 분석기술이 개발되고 있다. 그러나 아직까지 면역세포의 배양 및 분석에 있어서 면역세포들이 가지는 면역반응의 특성으로 인하여 나노공학 기반의 생체재료를 다양하게 활용하지는 못하고 있는 실정이다.

한편, 수지상세포(Dendritic cell)는 외부항원 뿐만 아니라 체내의 손상/변형된 세포에 대한 선천면역과 적응면역을 연결하는 기능을 가진 항원제시세포로서, 외부항원을 인식할 뿐만 아니라 T 세포반응 조절한다. 수지상세포가 외부항원을 탐식하고 활성화가 되어 T 세포로 항원을 제시하는 능력은 생체 면역반응 조절에 중요하며 수지상세포의 이러한 기능 저하나 손상은 암, 자가면역질환 및 만성염증 등 여러 면역성 질환의 발생을 초래한다.

마우스 수지상세포는 세포 표면에서 CD11c의 발현 정도에 따라 CD11c⁺CD45RA⁺이동형 혈장성 수지상세포(migratory plasmacytoid DC, pDC)와 CD11c⁺CD45RA^-전형성 수지상세포(lymphoid tissue resident conventional DC, cDC)로 크게 나누고 전형성 수지상세포는 CD4^-CD8^-,CD4⁺CD8^-및CD4^-CD8⁺세포로 구분되는데 CD4^-CD8⁺세포는 IL-12를 분비하여 Th1 반응을 일으키고 CD4⁺CD8^- 세포는 Th2 반응을 일으킨다. 따라서 마우스 CD4^-CD8⁺수지상세포는 CD8⁺세포성 T 세포를 활성화시키는 세포로 알려져 있으며 외부 항원을 획득하여 처리하고 MHC-I을 통하여 제시하는 교차제시 능력을 가지고 있다.

이러한 수지상세포는 분화 단계별로 크게 미성숙 (immature) 및 성숙(mature) 수지상세포 둘로 나누어 볼 수 있다. 미성숙 수지상세포는 말초조직에서 항원을 획득하고 성숙형의 수지상세포는 림프조직에서 이들 항원을 T 세포에 제시한다. 자극을 받지 않은 수지상세포는 미성숙 상태로 존재하며 T 세포 활성을 유도하지 못한다. 이 경우 수지상세포에는 보조자극 인자가 거의 발현되지 않고 있지만 미성숙 수지상세포는 세포표면에 항원 포획에 필요한 다양한 수용체 분자들을 다량 발현하고 있어 매우 효과적으로 항원을 포획함으로써 면역의 초기단계를 담당한다. 또한 자극을 받지 않은 수지상세포(steady-state DC)는 비록 적은 양의 MHC-I이나 II를 발현하고 있지만 자극을 받게 되면 세포 표면에서 이들의 발현이 현저히 증가된다.

특히, 비장에 존재하는 수지상세포는 대부분 미성숙형으로서 면역관용(tolerance)를 유지하는데 관여하는 것으로 보인다. 이러한 수지상세포는 비장의 전체 세포수의 1% 미만으로 비율로 존재한다. 비장의 수지상세포는 반감기가 2일 이내로 대부분은 미성숙상태 (immature state)로 세포사멸한다. 비장에 존재하는 CD11c⁺ 전형성 수지상세포는 감염이 없고 자극을 받지 않은 상태에서는 탐식능이 높고 보보활성인자의 발현이 낮은 미성숙의 형으로 존재한다[Wilson, 2003]. 다양한 분리법을 사용하여 비장이나 림프절에 존재하는 수지상세포는 비장의 다른 세포들로부터 순수하게 분리하는 기술은 확립되어 있으나 [Vremec, 2013] 이들 조직으로부터 분리한 수지상세포들을 단독으로 배양할 경우 어떠한 자극이 없이도 매우 짧은 시간의 배양 후에 자가활성(Spontaneous activation)이 된다[Vremec, 1997]. 따라서 현재까지 이차 림프조직으로부터 분리한 수지상포를 이용한 면역학적인 연구가 수행되지 못하고 있는 실정이다. 자가활성화된 수지상세포는 항원의 탐식이나 제시 능력이 세균에 의하여 활성화된 수지상세포보다 떨어지는 등 면역기능을 정확하게 알 수 없게 된다. 배양 중 자가활성이 되는 원인을 규명하려는 연구가 진행되었으나 아직 정확한 기전이나 자가활성이 일어나지 않고 배양을 할 수 있는 기술은 개발되어 있지 않다[Vremec, 2011].

최근 비장으로부터 분리한 CD11c+ 전형성 수지상세포의 자가활성은 세포간의 결합에 의한 활성인자의 분비에 의한다고 보고되었다[Vremec, 2011]. 이러한 자가활성은 2차원적인 세포배양에 의하여 세포간 접촉으로 수지상세포가 활성인자를 분비하는 것으로 추측된다. 따라서 이러한 세포간 결합은 여러 가지 다양한 세포가 존재하거나 조직 내 세포주위를 둘러싸고 있는 세포외기질(extracellular matrix)이 있는 in vivo에서는 일어나지 않을 것이므로 이들 세포를 in vivo-유사 환경인 3차원적 조건에서 배양할 경우 in vitro에서 steady-state의 배양 세포를 얻을 수 있을 것이다.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 안출된 것으로, 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 하여 세포를 배양함으로써 세포의 이동·침윤이 가능하도록 하여, 비장이나 림프절로부터 순수 분리한 수지상세포를 자극을 받지 않은 in vivo에서와 같이 활성화되지 않은 상태로 유지하고 배양할 수 있는 배양기술을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-1370222호

1. Vremec D, Shortman K. Dendritic cell subtypes in mouse lymphoid organs: cross-correlation of surface markers, changes with incubation, and differences among thymus, spleen, and lymph nodes. J Immunol. 1997;159(2):565-73. 2. Vremec D, et al., Factors determining the spontaneous activation of splenic dendritic cells in culture. Innate Immun. 2011;17(3):338-52. 3. Vremec D, Segura E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 2013;960:327-50. 4. Wilson NS, et al., Most lymphoid organ dendritic cell types are phenotypically and functionally immature. Blood. 2003;102(6):2187-94.

따라서 본 발명은 수지상세포의 비활성형을 유지하는 미성숙 수지상세포의 배양방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

또한 본 발명은 상기 배양된 미성숙 수지상세포를 이용하는 미성숙 수지상세포의 분석방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 일 양태로서,

내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고,

⑴ 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계;

⑵ 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계;

⑶ 상기 세포배양용 구조물에 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤·분리되는 단계; 및

⑷ 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고,

상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 전기방사법에 의해 형성된 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 ⑴ 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유 매트는, 상기 나노미터 직경의 섬유 55~85 중량%와 마이크로미터 직경의 섬유 15~45 중량%로 이루어지는 나노-마이크로 하이브리드 섬유인 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 두께가 70~100 ㎛ 인 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 ⑴ 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 및 라이신(ploy-L-lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 코팅된 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 ⑴ 단계 또는 ⑶ 단계에서 상기 하부의 나노섬유 매트는, 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 ⑵ 단계의 수지상세포는, 비장에서 분리된 수지상세포인 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 ⑶ 단계의 1차 배양은 3~5시간 동안, 상기 ⑷ 단계의 2차 배양은 10~20시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다른 양태로서,

기판 상에 고분자 코팅층을 형성하고,

상기 고분자 코팅층 상에 상기 방법에 따라 배양된 미성숙 수지상세포를 포함하는 상부의 나노섬유 매트를 부착한 후,

미성숙 수지상세포의 세포배양, 세포이동 또는 세포활성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 고분자 코팅층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명에 따르면 3차원 구조의 매트형상을 갖는 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 하여 세포를 배양함으로써 세포의 이동· 침윤이 가능하도록 하여, 비장이나 림프절로부터 순수 분리한 수지상세포를 자극을 받지 않은 in vivo에서와 같이 활성화되지 않은 상태로 유지하고 배양할 수 있는 미성숙 수지상세포를배양할 수 있다. 또한 상기 배양된 미성숙 수지상세포를 이용하여 세포분석이 가능하다.

또한 본 발명에 따르면 3차원 구조의 매트형상을 갖는 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 2단 구조로 이격되게 배치될 수 있도록 하는 챔버형상의 세포배양 구조물을 이용하여 배양함으로써 상부 나노섬유 매트에 부착되지 않거나 활성화전 상태의 수지상세포를 하부 나노섬유 매트에 걸러내어 세포를 분리하고, 상부 나노섬유 매트만 추가 배양하여 미성숙 수지상세포만을 안정적으로 배양할 수 있는 효과가 있다. 이에 따라 생체조직과 유사한 상태로 부착된 비장 수지상세포의 배양조건도 확립할 수 있고, 배양된 미성숙 수지상 세포는 자가활성을 방지하고 안정화된 상태로 배양되어, 실시간 면역학적 분석이 가능한 효과가 있다. 따라서 현재까지 시험관 내에서 비장 수지상세포의 면역학적 기능을 측정할 수 없어서 골수로부터 GM-CSF와 IL-4로 분화시킨 수지상세포를 사용하여 면역학적 기능을 연구하는 기술을 대체하며 생체 내 존재하는 비장 수지상세포의 면역학적 역할 등을 규명할 수 있는 배양기술과 세포를 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포배양용 구조물의 개략적인 모식도(a)와, 세포배양용 구조물에 배치되는 고분자 나노섬유 매트의 제조를 위한 전기방사공정을 나타낸 모식도(b) 및 상기 전기방사공정으로 제조되는 나노섬유 매트의 주사현미경 사진(c)를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 배양하는 공정을 나타낸 것이고, 도 2b는 도 2a의 공정에 따라 배양한 수지상세포를 세포밀도가 높거나 낮은 상태로 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 시간별로 배양한 후 활성화된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 공촛점 형광현미경으로 세포의 모양과 세포표면에 발현되는 MHC class II의 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 주사전자현미경으로 세포의 모양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 상기 나노섬유 및 배양접시의 표면을 폴리라이신(poly-L-lysine) 및 콜라겐으로 코팅 한 후 배양한 비장 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장으로부터 분리한 전체 세포와 CD11c+ 세포만을 배양한 후 배양액에 분비된 사이토카인 및 케모카인을 측정한 후 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포의 분리시, 하부의 케모카인에 반응하여 이동한 세포를 CFSE 형광으로 확인하고 이동한 세포의 수는 flow cytometry로 측정하였고 CD86 항체로 형광염색하여 CD86⁺ 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포의 분리시, 상부의 NFS에 얹은 CFSE인 녹색형광으로 염색한 마우스 비장 CD11c⁺세포(1×10⁶)가 케모카인인 CCL-21이 있거나 없는 하부의 NFS로 시간별로 배양한 후 이동하는 것을 형광현미경으로 측정하고 그 이동한 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용하여 12시간동안 세포를 분리함으로써 상부 및 하부에 있는 비장 CD11c⁺ 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포분리에 있어서 하부 NFS로 걸러지거나 CCL-21에 반응하여 4시간 후 이동한 CD11c+ 세포의 전체 수에 대하여 적색형광을 결합시킨 CD86의 항체에 반응하는 세포를 확인한 수를 나타낸 것이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 일정시간 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 lipopolysaccharide (LPS)의 처리에 의하여 활성화되는가를 CD86 발현으로 측정한 형광현미경 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 나노-마이크로 하이브리드 섬유를 기반으로 하여 세포를 배양함으로써 세포의 이동·침윤이 가능하도록 하여, 비장이나 림프절로부터 순수 분리한 수지상세포를 자극을 받지 않은 in vivo에서와 같이 활성화되지 않은 상태로 유지하고 배양할 수 있는 배양방법과 분석방법에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 일 양태로서,

⑴ 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계; ⑵ 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계; ⑶ 상기 세포배양용 구조물에 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤·분리되는 단계; 및 ⑷ 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고, 상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법이 제공된다.

도 1은 본 발명에 따른 세포배양용 구조물의 개략적인 모식도(a)와, 세포배양용 구조물에 배치되는 고분자 나노섬유 매트의 제조를 위한 전기방사공정을 나타낸 모식도(b) 및 상기 전기방사공정으로 제조되는 나노섬유 매트의 주사현미경 사진(c)를 나타낸 것이다.

상기 도면을 참고하여 본 발명을 자세히 살펴보면, 본 발명에 따른 미성숙 수지상세포의 배양방법은, 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱(20)을 구비하고, 상기 걸림턱(20)을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물(10)을 이용하는 것이 중요하다. 이에 따라 상기 걸림턱(20)과 상기 하부의 바닥면에 세포배양을 위한 나노섬유매트가 배치·안착되어, 상부의 나노섬유매트와 하부의 나노섬유매트가 이격되게 2단으로 배치되고, 이에 따라 세포배양시 상부에서 하부로 세포의 부착 및 침윤이 이루어져 세포가 걸러짐으로써, 미성숙 수지상세포만을 분리하여 안정적으로 배양하는 것이 가능해진다.

따라서 상기 걸림턱(20)의 형상은 제한되지 않으며, 세포배양을 위한 나노섬유매트를 배치할 수 있는 형상이면 무방하다. 바람직하게는 도 1a에 나타난 바와 같이 상기 챔버형상의 세포배양용 구조물 내측면을 따라 주심방향으로 돌출형성되는 (20)을 구비할 수 있다.

먼저 ⑴ 단계는 세포배양을 위한 나노섬유를 상기 세포배양용 구조물에 배치하는 단계로, 구체적으로는 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱(20) 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트(40, 50)를 각각 배치하는 단계이다. 즉, 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱(20) 및 하부의 바닥면에 상기 고분자 나노섬유 매트(40, 50)을 배치함에 따라 상부의 나노섬유 매트(40)와 하부의 나노섬유 매트(50)가 서로 이격되게 2단 형상으로 배치된다. 이와같이 나노섬유 매트가 배치됨으로써 상기 3차원 구조의 나노섬유 매트에서 세포가 배양됨에 따라 상부 나노섬유 매트(40)에의 세포 부착 및 하부 나노섬유 매트(50)로의 세포침윤이 이루어져 상호접촉이 없이 3차원적으로 공배양하는 효과를 가져오게 된다.

이 때, 바람직하게는 상기 나노섬유 매트(40, 50)가 세포배양용 구조물(10)에 용이하게 고정될 수 있도록 상기 상기 걸림턱(20)의 상면 및 하부의 바닥면에 고분자 코팅층(30)을 형성하도록 한 후에 상기 나노섬유 매트(40, 50)를 배치하도록 한다. 상기 고분자 코팅층(30)은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성될 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리디메틸실록산으로 형성될 수 있다.

또한 상기 고분자 나노섬유 매트(40, 50)는, 마이크로 직경과 나노직경을 갖는 마이크로 섬유 및 나노섬유의 집합체로서 3차원적 매트릭스의 구조를 갖는 매트형상인 것이 특징이다. 이에 따라 상기 나노섬유 매트는 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하고, 다양한 형태로 제작이 가능하며 또한, 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하게 된다. 특히, 생체적합성 고분자를 이용하여 제작되는 생체적합성 고분자 섬유의 경우 세포의 통과가 가능할 정도로 다수의 공극(PORE)을 형성하고 있어 세포의 침윤·부착 및 이에 따른 세포배양이 가능하게 된다.

이 때, 상기 고분자 나노섬유 매트 내 세포의 부착은 주로 나노섬유에서 이루어지고, 마이크로 섬유에 의하여 공극의 크기를 증가시킴에 따라 3차원 매트릭스 구조를 형성하게 되는 것이다. 따라서 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 고분자 나노섬유 매트는 상기 나노섬유 55~85 중량%과 마이크로 섬유 15~45 중량%로 구성되는 것이 적합하다. 상기 나노섬유가 상기 범위를 초과하여 포함하는 경우에는 공극률이 저하됨에 따라 세포의 침윤·부착이 이루어지지 않아 세포배양이 상기 지지체 상부(TOP)에서만 이루어지게 되고, 상기 범위 미만으로 포함되는 경우에는 공극률이 지나치게 높아짐에 따라 세포의 침윤에 의하여 상기 지지체 하부(BOTTOM)에서만 세포의 배양이 일어나게 되는 문제점이 있으므로 상기 범위 내에서 혼합되어 하이브리드 섬유를 구성하는 것이 바람직하다. 이 경우, 보다 바람직하게는 상부에서는 마이크로 섬유의 비율이 40% 이상으로 많이 함유되고, 하부에서는 마이크로 섬유의 비율이 30중량% 이하로 적게 함유되도록 하이브리드 섬유를 구성할 때 상부에서 하부로 세포의 침윤·부착이 잘 일어날 수 있다.

바람직하게는 상기 고분자 나노섬유 매트는 전기방사공정을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 전기방사공정은 통상의 나노섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조한 후, 상기 고분자 용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 생체적합성 고분자 나노섬유를 제조한다. 상기 고분자 나노섬유 매트의 제조를 위해 사용되는 고분자 용액의 제조시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 생제적합성 고분자 섬유의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서 보다 바람직하게는, 도 1b에 나타낸 바와 같이 전기방사 장치의 집적판 상에 피치크기를 0.5~1 mm로 하는 정사각형 그리드 모양의 금속메쉬판을 설치하고, 이 위에 0.5~1 mm 두께의 유리판을 덮어 전기장의 세기를 동시에 조절하면서 메쉬를 구성하는 금속선 주변에 고분자 섬유가 집중적으로 집적되고, 여기에 마이크로미터 직경의 고분자 섬유 발생비율 또한 높일 수 있도록 하여 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 제조하는 것이 바람직하다. 이 때, 대면적의 고분자 섬유 매트를 제작하고, 비교적 균일한 두께로 집적이 되도록 하기 위해 집적판은 지그재그 경로(raster scanning)를 따라 움직이도록 하고, 경로의 크기는 제작하고자 하는 매트의 크기에 맞춰 움직이도록 한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노섬유 매트는 100 nm ~ 2 ㎛의 직경을 가지는 나노섬유와 마이크로섬유를 이용하여 3차원 매트릭스 구조로 형성되는 것이 바람직하다. 또한 도 1b에 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고분자 나노섬유 매트의 전자현미경 사진을 나타내었는바, 직경이 500 nm에서 2 ㎛에 이르는 나노-마이크로 하이브리드 섬유가 제작되었음을 확인할 수 있다. 이 때 상기 고분자 나노섬유 매트는 그 두께가 50~500 ㎛, 보다 바람직하게는 70~100 ㎛인 것이 적합하다.

또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 전기방사가능한 고분자로서 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 수평균 분자량이 10,000 내지 1,000,000, 예컨대, 50,000 내지 500,000의 범위인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이 중 PCL을 이용하여 나노섬유를 제작하였다.

또한 바람직하게는, 상기 고분자 나노섬유 매트는, 키토산, 엘라스틴, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 및 폴리라이신(ploy-L-lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 코팅된 것을 특징으로 한다. 상기 양이온성 그룹에 속하는 물질로 코팅됨으로써 세포에의 부착성을 높일 수 있다. 보다 바람직하게는 폴리라이신을 이용하도록 한다.

다음으로 ⑵ 단계는, 상기 걸림턱(20)에 배치된 상부의 나노섬유 매트(40)에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포(60)를 도포하는 단계이다. 세포배양을 위한 수지상세포를 도포하여 배양을 준비하는 단계로, 상기 수지상세포(60)는 특히, 비장으로부터 분리된 수지상세포인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 비장으로부터 분리한 CD11c⁺ 수지상세포이다.

다음으로 ⑶ 단계는, 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양하는 단계이다. 구체적으로, 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에 도포된 수지상 세포를 배양할 수 있도록 세포배양액을 상기 세포배양용 구조물(10)에 주입하여 일정시간 배양시키는 단계이다. 상기 1차 배양에 의하여 상기 상부의 나노섬유 매트(40)에 도포된 수지상세포(60)의 일부가 부착되어 배양되고, 상기 상부의 나노섬유 매트(40)에 부착되지 않은 수지상세포 일부와, 활성화전 수지상세포는 상기 3차원 구조의 나노섬유 매트 내부의 공극을 통하여 침윤됨으로써 하부의 나노섬유 매트(50)로 이동하게 된다. 즉, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포 일부와 활성화 전 수지상세포가 하부의 나노섬유 매트에 분리되어 걸러지게 된다. 이와 같이 3차원 세포배양이 가능한 나노-마이크로 하이브리드 고분자 나노섬유 매트를 2단으로 이격되게 배치할 수 있는 세포배양 구조물을 이용함으로써, 세포의 부착 및 침윤에 의하여 세포의 분리가 이루어져 미성숙 수지상세포만 상부 나노섬유 매트에 부착· 배양될 수 있게 된다.

바람직하게는 안정적으로 상부의 나노섬유 매트(40)에서 미성숙 수지상세포만 배양될 수 있도록, 하부의 나노섬유 매트(50)에 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 더 포함하도록 할 수 있다. 상기 활성형 수지상 세포의 이동을 유도하는 물질이 더 포함하여 세포배양을 하게 되면, 상기 상부의 나노섬유 매트에서 배양된 활성전상태 또는 활성형상태로의 수지상세포가 상기 3차원 나노섬유 매트의 공극에 의하여 중력방향으로 이동 및 침윤되고, 이에 따라 하부의 나노섬유 매트로 이동· 침윤이 이루어지게 된다. 또한 비활성형 수지상세포는 상기 이동하지 않고 상부의 나노섬유 매트에 남아 부착· 배양된다. 따라서 상부의 나노섬유 매트(40)에서 활성전 또는 활성형의 수지상세포가 걸러지게 되어, 미성숙 수지상세포가 안정적으로 배양할 수 있게 된다. 보다 바람직하게는 상기 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질로서 케모카인을 주입할 수 있다.

다음으로 ⑷ 단계는, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상세포를 2차 배양하는 단계로, 구체적으로는 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 세포배양액을 더 주입하여 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상세포만을 배양하여 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상세포가 안정적으로 배양될 수 있게 된다.

이 때, 상기 2차 배양된 세포는, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않거나 활성전상태의 수지상세포가 침윤되어 걸러지고 난 후의 수지상세포로서, 비활성형을 유지하는 미성숙 수지상세포인 것을 특징으로 한다. 관련하여 본 발명의 일 실시예에 따르면 특히 3차원 나노-마이크로 하이브리드 고분자 나노섬유 매트를 이용하여 배양할 경우 공극의 증가로 인한 세포의 밀도가 감소됨에 따라 세포의 활성화율이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참고). 즉, 상기 1차 배양에 의하여 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포의 일부와 활성전의 수지상세포가 걸러지게 되어 비활성형의 수지상세포가 상부의 나노섬유 매트에 남아있게 되고, 상기 3차원 나노섬유 매트에서의 추가 배양시 추가적으로 활성화되는 정도가 낮아, 상기 2차 배양에 의하여 비활성형인 미성숙 수지상세포가 안정적으로 배양될 수 있는 것이다.

바람직하게는 상기 상부의 나노섬유 매트에 미성숙 수지상세포가 부착· 배양되고, 상기 하부의 나노섬유 매트로 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포 일부와 활성화 전 수지상세포가 침윤에 의하여 분리되기 위해서는 상기 ⑶ 단계의 1차 배양은 3~5시간 동안, 상기 ⑷ 단계의 2차 배양은 10~20시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 배양시 주기적으로 배양액의 교체도 가능하다.

상기 방법으로 상부 나노섬유 매트에 미성숙 수지상세포가 배양되게 되면, 매트형상의 나노섬유에 미성숙 수지상세포가 배양되어 있으므로 바이오칩의 일 면에 이를 적용하여 상기 나노섬유매트에서 세포배양, 세포이동 또는 세포활성 등을 관찰함으로써 세포분석이 가능해진다.

따라서 본 발명의 다른 양태로서, 기판 상에 고분자 코팅층을 형성하고, 상기 고분자 코팅층 상에 상기 방법에 따라 배양된 미성숙 수지상세포를 포함하는 상부의 나노섬유 매트를 부착한 후, 미성숙 수지상세포의 세포배양, 세포이동 또는 세포활성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법이 제공된다.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 분석시 상기 상부의 나노섬유 매트에서 상기 하부의 나노섬유 매트로 이동된 정도 또는 3차원 배양조건에서 수지상세포의 활성화정도를 공촛점 현미경으로 관찰하여 분석할 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 상부의 나노섬유 매트에 수지상세포의 활성화 유도물질을 처리한 후, 상기 미성숙 수지상세포 표면의 수용체 발현정도, 또는 배양액에 분비되는 사이토카인의 변화를 측정 및 분석할 수 있다.

바람직하게는, 상기 고분자 코팅층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 폴리디메틸실록산으로 형성된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예>

실시예 1: 전기방사법에 의한 나노섬유의 제작

나노미터와 마이크로미터 직경의 고분자 섬유가 적절한 비율로 조절되어 있으며, 고분자 섬유간 공간의 확보를 위해 본 실시예에서는 기존의 전기방사장치에서 다음과 같은 차이점을 가지고 있는 전기방사장치를 이용하여 3차원 나노섬유 매트로서, 3차원 구조의 매트형상을 갖는 나노섬유 지지체(이하, 3D NFS(Nanofiber scaffold))를 제작하였다.

(1) 기존의 전기방사장치에서는 단순한 금속판을 집적판으로 사용하고 있으나, 본 실시예에서는 피치크기를 0.5~1 mm로 하는 정사각형 그리드 모양의 금속메쉬판을 사용하였다. 또한 그 위에 0.5~1 mm 두께의 유리판을 덮어 전기장의 세기를 동시에 조절하면서 메쉬를 구성하는 금속선 주변에 고분자 섬유가 집중적으로 집적되고, 여기에 마이크로미터 직경의 고분자 섬유 발생비율 또한 높일 수 있도록 하였다.

(2) 대면적의 고분자섬유 매트의 제작 및 비교적 균일한 두께로 집적이 되도록 집적판은 지그재그 경로(raster scanning)를 따라 움직였으며, 이때 경로의 크기는 제작하고자 하는 매트의 크기에 맞춰 움직이도록 하였다.

상기 본 실시예에서 사용된 전기방사장치 및 이에 의하여 제작된 나노섬유 매트의 전자현미경 관찰 사진을 도 1b에 나타내었다. 직경이 500 nm에서 2 ㎛에 이르는 나노-마이크로 하이브리드 섬유가 제작되었음을 확인할 수 있다.

실시예 2: 세포배양 구조물 제작 및 이를 이용한 세포배양

2-1 세포배양 구조물의 제작

본 실시예에서는 저면에 구멍이 형성된 챔버를 상부에, 저면에 구멍이 형성되지 않은 챔버를 하부에 위치하도록 적층하여 조립함으로써, 내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는 세포배양 구조물을 제작하였다.

이를 위해, 먼저 상면이 개방된 폴리스티렌 세포배양 챔버의 저면을 PDMS로 코팅하고 PDMS에 상기 실시예 1에서 제작한 하이브리드 나노섬유 매트를 부착하여 세포배양 구조물의 하부를 제작한다. 저면에 구멍이 형성되고 상면이 개방된 폴리스티렌 세포배양 챔버를 준비하고 챔버의 저면을 PDMS로 코팅한 다음, PDMS에 상기 실시예 1에서 제작한 하이브리드 나노섬유 매트를 부착하여 세포배양 구조물의 상부를 제작한다. 이를 상기 세포배양 구조물의 하부의 위에 상부를 적층하여 조립함으로써 세포배양 구조물이 제작된다.

상기와 같이 제작됨으로써 제작된 모형은 도 1a에 나타내었다.

2-2 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포배양

본 실시예에서는 상기 제작된 세포배양 구조물의 상부에 배치된 상부 나노섬유 매트에 비장으로부터 분리한 CD11c+ 수지상세포를 부착시킨 후, 4시간 정도 세포 배양을 실시하였다.

상기 상부 나노섬유매트가 배치된 배양챔버를 분리하여 하부의 배양챔버에서 하부 나노섬유매트를 제거하고, 다시 세포배양액을 첨가하여 일정시간 배양하였다.

본 실시예에 따른 세포배양 공정은 도 2a 및 도 13에 모식화하여 나타내었다.

실시예 3: 비장으로부터 CD11c ⁺ 수지상세포의 분리

비장에서 CD11c⁺ 수지상세포를 제외한 세포는 바이오틴(biotin)에 결합된 CD19(ID3), CD3(145-2C11), TER-119(TER-119), 및 Ly-6G(RB6-8C5) 항체를 이용하여 계통 음성 세포(lineage-negative cell)를 결합시키고 항 바이오틴 마이크로비드(anti-biotin microbeads)를 사용하여 제거하였다. 고순도의 CD11c+ 세포를 분리하기 위하여 CD11c⁺ 항체를 이용하여 CD11c+ 수지상세포를 positive-selection으로 분리하였다.

실시예 4: 골수유래 수지상세포의 제작

5~6 주령의 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수세포를 분리하였다. 분리된 골수세포(1×10⁶cells/ml)는 10% 소 태아 혈청과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 μg/ml 스트렙토마이신이 들어있는 RPMI-1640 배지에서 10%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기로 배양하였으며, 수지상세포로 분화유도를 위하여 15 ng/ml 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)와 15 ng/ml의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다. 분화된 수지상세포는 특이적 단백질 표면 인자인 CD11c 및 MHC-class Ⅱ를 이용하여 구분하고, CD11c 마이크로비드를 이용하여 분리하였다.

실시예 5: 나노섬유와 수지상세포의 주사전자현미경(SEM) 관찰

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 나노섬유 지지체에, 상기 실시예 3에서 분리한 비장 수지상세포(Spleen DC, SDC) 및 상기 실시예 4에서 제작한 골수로부터 분화시킨 수지상세포(bone marrow-derived DC, BMDC)를 넣고 12시간 동안 배양하였다. 주사전자현미경 촬영을 위한 전 처리과정으로 각각의 섬유에 부착된 수지상세포는 4% 포름알데하이드로 하루 동안 고정을 하고 동결건조를 시킨 뒤 부착된 모양을 관찰하였다. 그 결과는 도 1b 및 도 5에 도시하였다.

실시예 6: 비장 수지상세포의 배양 및 flow cytometry로 활성화 정도 측정

2D 배양접시나 3D 나노섬유 지지체 (NFS)에서 적당한 시간 동안 배양한 비장 수지상세포의 활성정도를 세포표면에 발현되는 CD86가 측정되는 세포수로서 측정하였다. 배양한 수지상세포는 FITC가 결합된 CD11c 항체와 PE가 결합된 CD86 항체로 반응시킨 다음 flow cytometry를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 2b, 도 3 및 도 6에 도시하였다.

실시예 7: 활성화된 비장 수지상세포의 분석 - 공촛점 현미경 측정, 배양후 사이토카인 측정

수지상세포는 자가적으로나 자극에 의하거나 활성형으로 전환되면 세포막에 CD80, CD86 및 MHC class II의 발현이 증가되고 케모카인에 반응하여 이동을 한다. 이에 본 실시예에서는 비장의 수지상세포나 골수로부터 분화시켜 제작된 골수유래 수지상세포가 자가적이거나 lipopolysaccharide (LPS)에 의하여 활성화되는 정도를 측정하였다. 비장 수지상세포(1×10⁵cells)를 CFSE로 형광 염색한 후 나노섬유 지지체에 부착시키고 12 시간 혹은 18시간 동안 배양하여 수지상세포가 활성화되는가를 유도하였다. 성숙화의 유도 확인은 수지상세포의 단백질 표면인자인 CD86 및 MHC class II가 세포 면에 발현되는 정도를 항체를 이용하여 공촛점 현미경으로 확인하였다. 전체 CFSE-positive 세포 수에 대하여 CD86-positive 세포수를 %로 표시하였다. 그 결과는 도 4, 도 10 및 도 11에 도시하였다.

또한 나노섬유 지지체 배양챔버에서 배양 후 사이토카인을 측정하여 그 결과를 도 7에 도시하였다.

실시예 8: 비장 수지상세포의 안정화 및 세포 배양

비활성형 수지상세포의 이동을 증가시키는 것으로 알려진 케모카인 CCL2, CCL3, 및 CCL4( 200 ng/ml)을 아래층의 나노섬유 지지체에 적시고 12시간 방치하여 말린 후 위층에는 비장으로부터 분리한 CD11c+ 세포를 1×10⁵개로 부착시켰다. 또한 활성형 수지상세포의 이동을 증가시키는 것으로 알려진 케모카인 CCL21( 200 ng/ml)을 아래층의 나노섬유 지지체에 적시고 12시간 방치하여 말린 후 위층에는 비장으로부터 분리한 CD11c+ 세포를 1×10⁵개로 부착시켰다. 두층으로 구성된 배양챔버를 위층에서 부착되지 않은 세포나 케모카인에 반응하는 세포를 아래층의 나노섬유 지지체로 내려오도록 하였다. 방치하고 4시간 후에 아래층의 세포지지체를 구성하는 배양챔버를 제거하고 위층의 배양챔버를 12 시간에서 18시간 동안 배양하면서 CD86의 발현 정도를 측정하였다.

그 결과는 도 8, 도 12 및 도 13에 도시하였다.

이하, 도면을 참고하여 상기 실시예의 결과를 설명하기로 한다.

도 1b는 상기 실시예 1에서 제작된 매트형상의 나노섬유 지지체(왼쪽)와, 상기 실시예 5에서 상기 나노섬유 지지체 상에 부착된 수지상세포(오른쪽)을 나타내었는바 이를 참고하면 나노섬유 지지체 상에 세포의 부착 및 침윤을 확인할 수 있다.

도 2a는 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 배양하는 공정을 나타낸 것이고, 도 2b는 상기 공정에 의하여 배양한 수지상세포를 세포밀도가 높거나 낮은 상태로 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 2b를 참고하면 12시간 배양한 경우 2D 배양접시에서의 배양시보다 3D 나노섬유 지지체 상에서 배양시 2배 정도 활성이 감소함(60.1 -> 34.0)을 확인할 수 있다. 나노섬유와 마이크로섬유가 하이브리드 됨에 따라 공극이 형성됨에 따라 공간적 여유가 있어 활성이 감소하였음을 의미한다. 또한 세포배양시 밀도를 높게 할 경우에도 세포활성은 증가하였으나 2D 배양접시에 비하여 세포활성이 상당히 감소하는 것으로 나타남을 확인할 수 있다.

도 3은 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 비장의 수지상세포를 시간별로 배양한 후 활성화된 세포의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 2D 배양접시에서 배양한 경우 시간이 경과함에 따라 활성화된 세포의 수가 선형으로 증가하는 것을 확인할 수 있으나, 3D 나노섬유 지지체에서 배양한 경우 6시간 배양시까지는 활성화된 세포의 수가 증가하다가 점차 그 증가폭이 둔화되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 3차원 나노-마이크로 섬유 매트를 이용함으로써 세포의 활성을 감소시킬 수 있는 것으로 확인된다.

도 4는 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 공촛점 형광현미경으로 세포의 모양과 세포표면에 발현되는 MHC class II의 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)에서 배양한 경우 및 LPS를 넣지 않은 경우에 세포표면에 발현되는 MHC class II의 정도가 상대적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.

도 5는 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 LPS를 넣거나 넣지 않은 상태에서 12시간 배양한 후 주사전자현미경으로 세포의 모양을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 골수에서 분화된 수지상세포 및 LPS를 주입한 경우에는 활성형의 수지상세포가 배양됨을 확인할 수 있었으나, 비장으로부터 분리한 수지상 세포의 경우 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)에서 배양하고, LPS를 넣지 않은 경우에 미성숙한 수지상세포가 배양되었음을 확인할 수 있었다. 비장 수지상세포를 이용하고, 3차원의 나노섬유 매트를 이용하여 미성숙한 수지상세포의 배양이 가능함을 확인할 수 있다.

도 6은 3차원 나노섬유 매트(3D NFS)와 2차원 배양접시(2D dish)에서 상기 나노섬유 및 배양접시의 표면을 폴리라이신(poly-L-lysine) 및 콜라겐으로 코팅 한 후 배양한 비장 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 폴리라이신 또는 콜라겐 코팅시 배양접시 또는 나노섬유에의 부착이 증가되어 세포의 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있다.

도 7는 2차원 배양접시(2D dish)에서 12시간 CD11c+ 비장 수지상세포를 배양한 배양액과 3차원 나노섬유 지지체(3D NFS)에서 프로토콜에 따라 CD11c+ 비장 수지상 세포를 배양한 배양액을 각각 준비한 후 사이토카인 어레이 키트를 사용하여 차이를 알아본 결과를 나타낸 것으로, 아래의 표는 각각 차이나는 팩터를 비교한 것이다. 3D NFS에서 배양했을 때 2D dish에서보다 낮은 활성화를 나타내어 사이토카인이 분비되는 정도도 적은 것을 확인할 수 있다.

도 8은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용하고, 상부 NFS에 마우스 비장으로부터 분리한 모든 세포를(total spleen cells, 5×105) 배양한 후 하부에 CCL2, CCL3, CCL4 케모카인을 주입하여 침윤 및 분리하여 세포를 거르도록 하고, 하부의 케모카인에 반응하여 이동한 세포를 CD11c-FITC와 CD86-PE 항체로 형광 염색하여 현미경으로 촬영한 결과를 나타낸 것이다. 이 결과로부터 세포배양 구조물을 이용하여 비장으로부터 분리한 세포가 케모카인의 주입에 의하여 하부 NFS로 분리되었음을 확인할 수 있다.

도 9는 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포의 분리시, 상부의 NFS에 얹은 CFSE인 녹색형광으로 염색한 마우스 비장 CD11c⁺세포(1×10⁶)가 케모카인인 CCL-21이 있거나 없는 하부의 NFS로 시간별로 배양한 후 이동하는 것을 형광현미경으로 측정하고 그 이동한 세포의 수를 나타낸 것이다. 시간이 경과에 따라 하부 NFS로 이동한 세포의 수는 증가하나, 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 CCL-21이 없는 경우에는 4시간 경과후부터 거의 이동하지 않는 것으로 나타났다. 이를 통해 구조물의 하부에 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 포함하게 되면 상부 NFS에서 안정적으로 미성숙 수지상세포가 배양될 수 있음을 확인할 수 있다.

도 10은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용하여 12시간동안 세포를 분리함으로써 상부 및 하부에 있는 비장 CD11c⁺ 수지상세포가 활성화되는 정도를 측정한 것으로 CD86의 발현을 형광현미경으로 측정하고 CD86⁺ 세포의 수를 그 상부에 남아 있는 전체 세포의 수에 대한 백분율(%)로 나타낸 것이다. 상부 NFS의 경우에는 남아있는 수지상세포의 활성화정도가 20% 전후로 나타났는바, 미성숙 수지상세포가 배양되었음을 확인할 수 있었다. 하부 NFS의 경우에는 CCL-21이 있는 경우 수지상세포의 활성화정도가 42.2%에 이르는 것으로 나타났는바 CCL-21에 의하여 활성형 수지상세포가 하부 NFS로 많이 이동되었음을 의미한다. 또한 CCL-21이 없는 경우 하부 NFS의 수지상세포 활성화정도는 11.4%에 불과한 것으로 나타났다.

도 11은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포분리에 있어서 CCL-21이 있거나 없는 하부의 NFS로 4시간 후 이동한 CD11c+ 세포의 전체 수에 대하여 적색형광을 결합시킨 CD86의 항체에 반응하는 세포를 확인한 수를 나타낸 것이다. 하부 NFS에 CCL-21이 없는 경우 수지상세포의 활성화정도가 27.3%에 이르고 CCL-21이 있는 경우 활성형 수지상세포가 64.9%에 이르는 것으로 나타났는바 활성형 수지상세포가 하부 NFS로 많이 이동하여 상부 NFS로부터 분리되었음을 의미한다.

도 12은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 일정시간 배양한 후 활성화정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 상부 NFS에 세포를 부착한 후 1시간이 경과되었을 때 세포의 활성화 정도는 7.8%이고, CCL-21이 없는 경우에는 1차 세포배양에 의한 세포분리시 21.4%, 2차 배양시 23.4%의 활성화정도를 나타내었다. 그러나 CCL-21이 있는 경우에는 1차 세포배양에 의한 세포분리시 11.8%이고, 2차 배양시 13.4%에 불과한 것으로 나타나 세포의 활성화 정도가 거의 증가되지 않은 것으로 확인되었는바, 이러한 결과로부터 CCL-21을 하부 NFS에 도입할 경우에는 비활성형의 미성숙 수지상세포가 보다 안정적으로 배양될 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 13은 상기 실시예 2에서 제작된 세포배양 구조물을 이용한 세포 활성화 분석에 있어서 상부 NFS에 부착한 세포를 하부 NFS로부터 분리한 후 lipopolysaccharide (LPS)의 처리에 의하여 활성화되는가를 CD86 발현으로 측정한 형광현미경 결과를 나타낸 것이다. 상부 NFS의 미성숙한 수지상세포는 LPS 처리에 의하여 91.5%의 활성화정도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉 상부 NFS에 수지상세포의 활성화 유도물질을 처리함으로써 상기 미성숙 수지상세포 표면의 수용체 발현정도를 측정 및 분석할 수 있다.

이상 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims

내측면에 중심방향으로 돌출형성된 걸림턱을 구비하고, 상기 걸림턱을 기준으로 상부와 하부가 분리가능하게 형성되는, 챔버형상의 세포배양용 구조물을 이용하고,
⑴ 상기 세포배양용 구조물 상부의 걸림턱 및 상기 하부의 바닥면에 나노-마이크로 하이브리드 섬유로 형성된 3차원 구조의 고분자 나노섬유 매트를 각각 배치하는 단계;
⑵ 상기 상부의 걸림턱에 배치된 나노섬유 매트에, 면역조직으로부터 분리된 수지상 세포를 도포하는 단계;
⑶ 상기 도포된 수지상 세포를 1차 배양함으로써, 상기 상부의 나노섬유 매트에 상기 수지상세포를 부착시키고, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착되지 않은 수지상세포와 활성화전 수지상세포가 상기 하부의 나노섬유 매트에 침윤·분리되는 단계; 및
⑷ 상기 하부의 나노섬유 매트를 제거한 후, 상기 상부의 나노섬유 매트에 부착된 수지상 세포를 2차 배양하는 단계를 포함하여 이루어지고,
상기 상부의 나노섬유 매트에서 2차 배양된 세포는 수지상세포의 비활성형을 유지하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자 나노섬유 매트는, 전기방사법에 의해 형성된 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ⑴ 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유 매트는, 상기 나노미터 직경의 섬유 55~85 중량%와 마이크로미터 직경의 섬유 15~45 중량%로 이루어지는 나노-마이크로 하이브리드 섬유인 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자 나노섬유 매트는, 두께가 70~100 ㎛ 인 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ⑴ 단계에서 배치된 상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 5 항에 있어서,
상기 고분자 나노섬유는, 키토산, 엘라스틴, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스 및 라이신(ploy-L-lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 코팅된 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ⑴ 단계 또는 ⑶ 단계에서 상기 하부의 나노섬유 매트는, 활성형 수지상세포의 이동을 유도하는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ⑵ 단계의 수지상세포는, 비장에서 분리된 수지상세포인 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 배양방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ⑶ 단계의 1차 배양은 3~5시간 동안, 상기 ⑷ 단계의 2차 배양은 10~20시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 배양방법.
기판 상에 고분자 코팅층을 형성하고,
상기 고분자 코팅층 상에 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 배양된 미성숙 수지상세포를 포함하는 상부의 나노섬유 매트를 부착한 후,
미성숙 수지상세포의 세포배양, 세포이동 또는 세포활성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법.
제 10 항에 있어서,
상기 고분자 코팅층은, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상세포의 분석방법.