KR101446687B1 - 나노섬유기반 세포배양 나노구조체 및 이를 포함하는 에세이 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노섬유기반 세포배양 나노구조체와, 이를 포함하는 에세이 칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 나노섬유층 및 상기 나노섬유층 상에 지지대에 의하여 구획이 형성된 다(多)채널 배양챔버로 이루어지는 세포배양층을 포함하고, 상기 구획은 1종 이상의 세포가 각각 부착·배양되며, 상기 지지대는 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리가능하도록 고정되어 상기 배양된 세포간 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 세포배양 및 세포이동이 가능한 나노섬유기반 세포배양 나노구조체와, 이를 포함하는 에세이칩에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 구획이 형성된 다채널 배양챔버를 포함함으로써 1종 이상의 세포를 동시에 배양할 수 있고, 구획을 형성하는 지지대가 분리가능하도록 고정되어 있어 세포간 이동이 가능한 나노구조체를 제공할 수 있게 되어, 세포배양 및 세포이동의 실시간 측정·분석이 가능한 에세이칩으로 이용될 수 있다. 또한 상기 에세이칩을 이용하면, 면역세포와 암세포를 동시에 배양하고 세포이동을 측정함으로써 면역 세포의 활성 및 이동을 실시간으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포의 손상, 사멸 및 증식을 실시간으로 분석할 수 있는 효과가 있다.

Description

나노섬유기반 세포배양 나노구조체 및 이를 포함하는 에세이 칩{NANOFIBER-BASED NANOSTRUCTURES FOR CELL CULTURE AND ASSAY CHIP COMPRISING THE SAME}

본 발명은 나노섬유기반 세포배양 나노구조체와, 이를 포함하는 에세이 칩에 관한 것으로, 1종 이상의 세포의 동시배양이 가능한 나노섬유 기반의 세포배양 나노구조체와 이를 포함하는 에세이칩 및 상기 에세이칩을 이용한 세포분석방법에 관한 것이다.

면역세포는 외부항원을 인식하는 역할을 수행할 뿐만 아니라, 손상된 자가세포를 인식하는 중요한 역할도 한다. 현재까지 주로 연구된 면역반응은 외부항원에 의해 유발되는 면역반응에 관한 것이지만, 최근 손상된 자가세포에 의해서도 강력한 면역반응이 유발되며 그 중요성이 매우 크다는 사실이 인식되고 있다. 그러나 이러한 반응을 측정하는 방법에 관해서는 연구가 잘 이루어져 있지 않다.

또한 현재까지는 이미 개발된 항암제에 대한 많은 연구를 통하여, 이들 약물의 작용기작은 비교적 잘 알려져 있으나, 최근 다수의 항암제가 암세포의 손상을 유발하여 면역원성을 유도한다는 새로운 사실이 발견됨으로써, 이러한 작용을 가지는 항암제를 처리한 세포들이 면역세포에는 어떠한 영향을 주는가를 측정할 필요가 있게 되었다. 그러나 아직까지는 이러한 종류의 약물들에 의해 유도되는 면역원성을 측정하기 위한 효율적인 시스템은 개발되어 있지 않은 실정이다.

또한, 국내외적으로 종양미세환경에서 암세포에 대한 면역원성을 유도하는 항암치료제 개발을 목표로 하는 연구는 아직 거의 없는 실정이다. 이와같이 면역원성의 암세포사멸을 유도하는 항암제에 대한 기능적인 연구와 기존 항암제의 면역유도 여부에 대한 연구가 현재 스크리닝 단계의 수준에 머무르고 있는 이유는, 면역원성 치료제 개발을 위한 측정 시스템이나 플랫폼이 개발되어 있지 않은 데 그 이유가 있다. 따라서 이러한 중요성 때문에 현재 국내외적으로 미세유체역학 장치를 이용하여 세포 간 상호작용의 인터페이스 측정에 관한 연구가 진행되고 있으며, 이 연구는 부착분자에 의한 세포와 세포 사이의 직접적인 부착 정도를 측정하는 정도의 초기 개발 단계이며, 세포와 세포 사이의 상호작용이 이루어지는 인터페이스를 관찰할 수 있는 미세유체역학 장치의 개발에 대한 연구는 현재 진행 중이다.

한편, 나노섬유 및 나노입자 등의 나노구조체는 연질 조직의 세포 지지를 위한 효과적인 구조체 중 하나로써, 자체의 구조적 장점으로 인해 세포의 증식 및 생성, 분화에 긍정적인 영향을 준다는 많은 보고가 있으나, 현재까지 연질 조직에 대한 나노구조체로서 세포 지지체는 그 형상 제어가 곤란하여 다양한 조직으로 구성된 연질조직의 제작에는 어려움을 가지고 있다. 또한, 현재 사용되고 있는 나노섬유 지지체는 주로 조직재생용으로 개발된 것이 보고되어 있으며, 주로 피부 및 골조직 재생을 위한 차폐막을 제작하기 위한 것이다.

또한, 바이오칩은 점차 그 형태가 세포칩, 조직칩, 나아가 장기칩으로 발전해 나가고 있는데, 이러한 칩들은 생체내부의 공간적(spatial), 시간적(temporal) 조건을 정교하게 모사(mimicking)함으로써, 복잡한 생화학적 생체 내(in vivo) 환경을 이해할 수 있는 새로운 기회를 제공하고는 있으나, 면역세포 분야의 생체재료의 적용은 면역세포들이 가지는 재료 및 화학적 특성에 대한 반응성의 중요성으로 인하여 공학적인 접근으로 많은 제한이 동반되고 있어서, 제한적인 수준에서만 나노공학 기반의 생체재료를 활용하고 있는 실정이다. 현재까지 주로 개발된 것은 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체에 관한 것이다.

면역세포가 손상된 세포를 인식하는 면역 네트워크 칩을 개발하기 위해서는, 면역세포(혹은 조직) 및 암세포(암 조직) 등 다수의 조직이 연관되어 있기 때문에, 조직칩을 개발하는 동시에, 다수의 조직 사이 네트워크를 구성하고, 모사하는 측정이 필요하고, 이 경우 특히 나노섬유 기반 나노구조체를 3차원 인공 지지체로 적용하기 위해서는, 나노구조체 내부에 세포의 이동이 가능하도록 제작되는 것이 요구된다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 요구에 착안하여, 나노섬유기반의 나노구조체로서 1종 이상의 세포가 부착·배양되고, 세포의 이동이 가능한 나노구조체 및 에세이칩을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 특허등록 제10-0564366호 2. 대한민국 특허등록 제10-0953366호 3. 대한민국 특허등록 제10-0968231호

Jongwan Lee et al., Fabrication of patterned nanofibrous mats usong a direct-write electrosinning, Langmuir, Vol. 28 (18), pp7267-7275

따라서 본 발명은 나노섬유를 기반으로 하여 세포의 부착이 용이하고, 1종 이상의 세포가 부착·배양될 수 있도록 지지대로 구획된 다채널 배양챔버를 포함하는, 세포배양 및 세포이동이 가능한 나노섬유기반 세포배양 나노구조체를 제공하는 것을 제1 해결과제로 한다.

또한, 본 발명은 상기 나노섬유기반 세포배양 나노구조체를 포함하는 에세이칩을 제공하는 것을 제2 해결과제로 한다.

또한 본 발명은 에세이칩의 제조방법을 제공하는 것을 제3 해결과제로 한다.

또한 본 발명은 상기 에세이칩을 이용한 분석방법으로서 세포배양 및 세포이동의 측정을 통한 세포분석방법을 제공하는 것을 제4 해결과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따르면,

나노섬유층 및 상기 나노섬유층 상에 지지대에 의하여 구획이 형성된 다(多)채널 배양챔버로 이루어지는 세포배양층을 포함하고,

상기 구획은 1종 이상의 세포가 각각 부착·배양되며,

상기 지지대는 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리가능하도록 고정되어 상기 배양된 세포간 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 세포배양 및 세포이동이 가능한 나노섬유기반 세포배양 나노구조체가 제공된다.

또한 본 발명의 제2 측면에 따르면,

상기 나노구조체를 하나 이상 포함하여, 세포배양 및 세포이동의 측정·분석이 가능한 것을 특징으로 하는 에세이 칩이 제공된다.

또한 본 발명의 제3 측면에 따르면,

기판 상에 나노섬유층을 형성하는 단계;

상기 나노섬유층 상에 배양챔버를 부착하여 세포배양층을 형성하는 단계; 및

상기 배양챔버 내에 지지대를 고정하여 구획함으로써 다채널 배양챔버를 형성하는 단계를 포함하고,

상기 구획은 1종 이상의 세포가 각각 부착·배양되며,

상기 지지대는 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리가능하도록 고정하여 상기 배양된 세포간 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 에세이칩의 제조방법이 제공된다.

또한 본 발명의 제4 측면에 따르면,

상기 에세이칩을 이용한 분석방법으로서,

1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 상기 다채널 배양챔버의 각 구획에 주입하여 각 구획된 나노섬유층 상에 상기 세포를 부착하고 배양하는 제1 단계;

상기 다채널 배양챔버 내의 지지대를 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리하는 제2 단계; 및

상기 배양챔버 내에 세포배양용 조성물을 주입하여 상기 부착·배양된 세포를 추가배양하여 세포간 이동을 측정하는 제3 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양 및 세포이동의 측정을 통한 세포분석방법이 제공된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 나노섬유기반의 세포배양 나노구조체는 구획이 형성된 다채널 배양챔버를 포함함으로써 1종 이상의 세포를 동시에 배양할 수 있고, 구획을 형성하는 지지대가 분리가능하도록 고정되어 있어 세포간 이동이 가능한 효과가 있다. 따라서 본 발명에 따른 상기 나노구조체는 세포배양 및 세포이동의 측정·분석이 가능한 에세이칩으로 이용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 에세이칩을 이용하여 세포배양 및 세포이동의 측정을 통한 실시간 세포분석이 가능한 효과가 있다. 즉, 본 발명에 따른 에세이칩을 이용하여 여러 종류의 면역세포와 질환 세포의 상호작용 및 결합을 세포이동의 측정을 통해 실시간으로 측정할 수 있게 되어 실시간으로 세포분석이 가능하게 된다. 특히 본 발명에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석방법의 경우, 면역세포와 암세포를 동시배양함으로써 면역세포의 이동을 측정함으로써 면역세포의 활성, 암세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 실시간으로 측정할 수 있다. 측정할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 나노섬유의 제작을 위한 전기방사법의 모식도(A)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 나노섬유(B)의 모양을 제공한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 나노섬유에 면역세포 및 암세포를 부착 및 배양한 사진(A)과, 실시예 3의 방법에 따라 실시한 나노섬유의 절단면의 세포를 확인한 그림(B)의 데이터를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스로부터 골수 세포 분리, 수지상세포로의 분화 및 성숙화의 유도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 제작된 나노섬유에 부착되어 있는 CT-26 대장암세포의 전자현미경 SEM 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩의 제작 및 이를 이용한 세포분석 방법을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩의 실제 모형의 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩의 고정용 플라스틱으로 제작한 다채널 배양챔버의 모형과 크기를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩의 나노섬유에서 구획 내 세포 배양을 위한 고정클립을 사용하는 경우의 그림을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 면역세포의 암세포 분획으로의 이동 측정 결과를 나타낸 것이다.
도10은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 적색형광으로 염색한 세포 쪽으로 이동하는 것을 확인한 데이터를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 암세포 분획으로 이동한 수지상세포를 고배율 형광현미경으로 관찰한 데이터를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 항암제를 처리한 암세포로 수지상세포가 이동한 세포 수를 측정한 데이터로서 면역원성 항암제와 비면역원성항암제 처리 비교데이터를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노구조체를 절단한 후 이동한 수지상세포를 측정한 데이터를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포이동 측정방법을 달리한 경우의 세포이동정도를 비교한 데이터를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 나노섬유에서 활성형 수지상세포의 이동을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 에세이칩을 이용한 세포분석에 있어서 나노섬유에서 림프조직 유래 세포의 암세포로의 이동을 측정한 데이터를 나타낸 것이다(●:NT, ▲: ETP, ■: MTX).
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포사멸의 정도를 측정한 데이터를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포손상의 정도를 측정한 데이터를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 제1 측면에 따르면,

나노섬유층 및 상기 나노섬유층 상에 지지대에 의하여 구획이 형성된 다(多)채널 배양챔버로 이루어지는 세포배양층을 포함하고,

상기 구획은 1종 이상의 세포가 각각 부착·배양되며,

상기 지지대는 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리가능하도록 고정되어 상기 배양된 세포간 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 세포배양 및 세포이동이 가능한 나노섬유기반 세포배양 나노구조체를 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 나노섬유는 나노섬유의 집합체가 3차원적 매트릭스를 형성하고 있는 구조를 갖는 것으로, 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하고, 다양한 형태로 제작이 가능하며 또한, 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하다는 특징이 있다. 특히, 생체적합성 고분자를 이용하여 제작되는 생체적합성 고분자 나노섬유의 경우 세포의 통과가 가능할 정도로 다수의 포어를 형성하고 있어 세포의 부착 및 배양이 가능하게 된다.

따라서 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 나노구조체에 사용되는 나노섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 수평균 분자량이 10,000 내지 1,000,000, 예컨대, 50,000 내지 500,000의 범위인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이 중 PCL을 이용하여 나노섬유를 제작하였다.

이 때, 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 나노섬유는 전기방사법에 의해 형성될 수 있다.

상기 전기방사법은 통상의 나노섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조한 후, 상기 고분자 용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 생체적합성 고분자 나노섬유를 제조한다. 상기 나노섬유의 제조를 위해 사용되는 고분자 용액의 제조시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 생제적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자 나노섬유에 있어서, 나노섬유의 직경, 공극의 크기, 공극률 등은 필요에 따라 고분자 용액의 농도, 전기방사의 조건 등을 적절히 조절함으로써 제어할 수 있는바, 본 발명에 있어서 상기 나노섬유는 100nm ~ 900nm의 직경을 가지고, 50~500㎛ 두께의 매트형상의 나노섬유인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 나노섬유는 PCL을 재료로 하여 전기방사법으로 제조된 것으로 500 nm의 평균 직경으로 70~100 μm의 두께를 가지는 매트로 제작되도록 한다.

또한 본 발명에 있어서 상기 지지대는 세포의 배양시 세포가 각 구획 내에서 배양될 수 있도록 세포가 통과하지 않는 재료로 형성되고, 배양된 세포가 이동이 가능하도록 상기 나노섬유층 및 배양챔버에 분리가능하도록 고정되는 것을 특징으로 한다. 이 때 상기 지지대는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로부터 지지대를 형성하는 것이 바람직하다.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 나노구조체는 상기 배양챔버의 구획 내에 1종 이상의 세포를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 제2 측면에 따르면,

상기 나노구조체를 하나 이상 포함하여, 세포배양 및 세포이동의 측정·분석이 가능한 것을 특징으로 하는 에세이 칩이 제공된다. 상기 에세이칩은 세포배양 및 세포이동이 가능한 나노구조체를 포함함으로써 세포의 이동 및 활성을 칩 수준에서 측정하여 실시간으로 세포분석이 가능하게 된다.

또한 본 발명의 제3 측면에 따르면,

기판 상에 나노섬유층을 형성하는 단계;

상기 나노섬유층 상에 배양챔버를 부착하여 세포배양층을 형성하는 단계; 및

상기 배양챔버 내에 지지대를 고정하여 구획함으로써 다채널 배양챔버를 형성하는 단계를 포함하고,

상기 구획은 1종 이상의 세포가 각각 부착·배양되며,

상기 지지대는 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리가능하도록 고정하여 상기 배양된 세포간 이동이 가능한 것을 특징으로 하는, 에세이칩의 제조방법이 제공된다.

바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 나노섬유층은, 기판 상에 고분자 코팅층을 형성한 후 고분자 코팅층 상에 나노섬유를 부착함으로써 형성되는 것을 특징으로 한다. 상기 기판 상에 고분자 코팅층을 형성함으로써 나노섬유와의 부착성을 증가시킬 수 있게 되는 것으로 상기 고분자 코팅층은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로부터 형성될 수 있다.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는 본 발명에 있어서, 상기 에세이칩은 상기 세포배양 및 세포이동이 가능한 나노섬유기반 세포배양 나노구조체를 하나 이상 포함하는 에세이칩인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 제4 측면에 따르면,

본 발명은 상기 에세이칩을 이용한 분석방법으로서,

1종 이상의 세포 또는 상기 세포의 배양액을 상기 다채널 배양챔버의 각 구획에 주입하여 각 구획된 나노섬유층 상에 상기 세포를 부착하고 배양하는 제1 단계;

상기 다채널 배양챔버 내의 지지대를 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리하는 제2 단계; 및

상기 배양챔버 내에 세포배양용 조성물을 주입하여 상기 부착·배양된 세포를 추가배양하여 세포간 이동을 측정하는 제3 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양 및 세포이동의 측정을 통한 세포분석방법에 관한 것이다.

상기 본 발명의 세포분석방법에 의하면 구획된 배양챔버 내의 나노섬유층에 세포를 부착·배양한 후, 구획을 형성하는 지지대를 분리하여 추가배양함으로써 세포간 이동이 가능하게 되어 세포이동을 실시간으로 측정할 수 있게 되어 세포간 상호작용에 대한 세포분석을 수행하게 된다.

이 때 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 제1단계의 각 구획에 서로 다른 종류의 형광염색제를 더 주입함으로써 각 구획에 부착·배양된 세포의 이동을 육안으로 측정할 수 있게 된다.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 제1 단계는 면역세포의 배양액과 질환 세포의 배양액을 상기 다채널 배양챔버의 각 구획에 주입하여 각 구획된 나노섬유층 상에 상기 주입된 세포를 부착·배양함으로써 각 구획에서 면역 세포와 질환 세포를 동시 배양하는 것을 특징으로 한다. 이로써 상기 면역 세포와 질환 세포의 동시 배양에 의하여 면역 세포의 이동 및 활성을 측정할 수 있게 된다.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 제1 단계는, 상기 일 구획에 부착 및 배양된 질환 세포에 상기 질환의 치료제를 처리하는 것을 특징으로 한다. 상기 질환의 치료제를 더 처리하는 것에 의하여 치료제를 처리한 세포가 면역세포에 미치는 영향 또는 치료제에 의한 면역세포의 면역원성 유도 성질을 세포이동에 의하여 실시간으로 측정 및 분석할 수 있게 된다. 이에 보다 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 세포분석은 질환 세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 분석하는 것을 특징으로 하는 바, 상기 질환의 치료제 처리에 의하여 유도되는 면역세포의 면역원성 및 상기 질환의 치료제에 의하여 질환 세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 세포의 이동으로 실시간으로 측정 및 분석할 수 있게 된다. 즉, 형광염색 등을 이용하여 면역세포의 이동수를 실시간으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 질환 세포에 형광을 붙인 항체 등을 이용하여 질환 세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 직접 측정할 수 있게 되는 것이다.

이 때, 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 세포분석방법은 면역세포와 암세포에 대한 세포분석 방법으로서, 면역세포와 1종 이상의 암세포의 배양액을 상기 배양챔버의 각 구획에 주입하여 각 구획된 나노섬유층 상에 부착·배양하고, 상기 배양된 암세포에 항암제를 더 처리하는 것일 수 있다. 항암제로는 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride)으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택하여 처리할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 항암제의 처리에 의하여 면역세포 및 암세포 상호간의 작용을, 세포이동에 따른 세포수를 측정함으로써 암세포의 손상, 사멸 및 증식 정도를 실시간으로 수치적으로 분석할 수 있게 된다.

이와 같이 상기 본 발명에 있어서 상기 제3 단계의 세포간 이동의 측정은, 상기 부착·배양된 면역세포 및 질환세포의 추가배양에 의하여 상기 질환세포로 이동된 상기 면역세포의 수를 측정하는 것을 특징으로 한다. 이러한 면역세포의 수를 측정함으로써 면역세포의 면역원성을 수치적으로 분석할 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포는 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포 및 B세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 면역세포는 인간 또는 마우스 유래일 수 있으며 보다 바람직하게는 인간 혈액으로부터 분리하거나 마우스 골수로부터 분리된 골수세포를 면역세포 배양용 배지에서 면역세포로 분화시켜 수득할 수 있다. 구체예로서 본 발명의 일 실시예에서는 수지상 세포를 사용하였고, 상기 수지상 세포는 인간 혈액으로부터 수지상세포를 분리하거나 마우스 골수로부터 분리된 골수세포를 수지상세포 배양용 배지에서 GGM-CSF 및 IL-4 등의 사이토카인을 처리하여 수지상세포로 분화시켜 얻을 수 있다. 수지상 세포 중 성숙형 수지상 세포는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 처리하여 얻으며, 수지상세포의 성숙화는 표면 항원인 CD86의 발현 양을 통하여 확인할 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 질환 세포는 질환이 유도된 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 질환 세포는 암세포인 것을 특징으로 한다. 상기 암세포는 간암세포, 대장암세포, 위암세포, 폐암세포, 자궁암세포, 유방암세포, 갑상선암세포 및 췌장암세포 등에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대장암세포를 이용하였다.

또한 바람직하게는 상기 본 발명에 있어서 상기 면역세포의 배양액은, 상기 면역세포와 반응하여 면역세포의 이동을 촉진하는 활성성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 활성성분으로서 케모카인을 더 포함하도록 함으로써 수지상세포가 활성형으로 전환되어 케모카인에 반응하여 림프조직 등으로 이동을 촉진하도록 하였다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예 1: 전기방사법에 의한 나노섬유의 제작

전기방사법을 이용하여 전기방사기의 조건을 조절함으로써 나노섬유를 제조하였다. 상기 전기방사기의 조건은 방사거리가 7 ㎝이며, 전압이 15∼25 V로 하였다. 이 때 상기 전기방사기는 일정한 두께를 가지도록 direct-write 전기방사법을 실시하였다.

도 1에는 전기방사법(electrospinning)의 모식도와 상기 실시예에서 전기방사법으로 제작된 나노섬유의 모양을 나타내었다.

실시예 2: 나노섬유 스캐폴드에 수지상세포 및 암세포의 부착 및 배양

대장암 세포주인 CT-26 세포를 나노섬유와 일반배양 플라스크에서 각각 배양하였다. 그 결과, 나노섬유에서 배양하였을 때 세포 증식이 잘 이루어지는 것을 확인하였다.

또한 도 2는 형광염색된 대장암세포 CT-26 및 골수로부터 granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)와 interleukin-4 (IL-4)로 분화시켜 얻은 수지상세포가 나노섬유에 잘 부착한 사진(A)과, 나노섬유 속에 끼여 있는 단면(B)을 나타낸 것이다.

도 2A 위의 사진은 암세포의 나노섬유에의 부착정도를 나타낸 것으로, CT-26 세포를 적색형광 PKH-26으로 염색하여 top seeding 한 뒤, 배지로 3번 세척한 뒤에도 CT-26 세포가 강하게 부착하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 수지상세포가 암세포로 이동하는 정도를 측정하기 위해서는 수지상 세포가 나노섬유에 부착·배양되어야 하므로, 수지상세포의 부착 정도를 관찰하여 도 2B에 나타내었는바, 상기 수지상세포는 마우스 골수로부터 GM-CSF로 분화시킨 골수 유래 DCs (GM-DCs)를 녹색형광인 PKH-67로 염색한 후, 나노구조체에 top seeding하여 형광현미경으로 관찰한 결과이다. 2시간이 경과된 시점부터 잘 부착함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 나노섬유의 절단 및 나노섬유 내 세포 확인

나노섬유에 부착된 세포를 확인하기 위하여 나노섬유의 아래 및 위 면에 filter paper를 붙이고 나노섬유를 냉동시킨 후 조직절단기로 8 μl의 두께로 절단한 결과, 나노섬유 내 부착된 세포를 확인할 수 있었다(도 2B)

실시예 4: 마우스로부터 골수 세포의 분리, 수지상세포로의 분화 및 성숙화 유도

5~6 주령의 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수 세포를 분리하였다. 분리된 골수 세포 (1×10⁶cells/ml)는 10 % 소 태아 혈청과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 μg/ml 스트렙토마이신이 들어있는 RPMI-1640 배지에서 10 %의 CO₂가 공급되는 37 ℃ 배양기로 배양하였으며, 수지상세포로 분화유도를 위하여 15 ng/ml 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)와 15 ng/ml의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다.

분화된 수지상세포는 특이적 단백질 표면 인자인 CD11c 및 MHC-class Ⅱ를 이용하여 구분하고, CD11c 마이크로비드를 이용하여 분리하였다.

분화된 수지상세포(1×10⁵cells/100μl)에 lipopolysaccharide (100 ng/ml)을 처리하여 수지상세포의 성숙화를 유도하였다. 성숙화의 유도 확인은 수지상세포의 단백질 표면인자인 CD86가 세포 면에 발현되는 정도를 항체를 이용하여 확인하였다.

그 결과, 나노섬유에 부착한 PKH26으로 형광염색된 수지상세포는, LPS의 첨가에 따라서 CD86의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었는 바(도 3), 수지상세포의 성숙이 유도되었음을 확인할 수 있었다. 또한 이 때 PCL 나노섬유는 면역세포에 대한 활성화 반응이 없었으며 나노섬유 상에서 세포 활성화 물질에 의하여는 활성화가 잘 이루어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 나노섬유에 부착된 암세포의 주사전자현미경적(SEM) 미세구조 측정

나노섬유에서 배양한 암세포의 부착을 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)으로 촬영하였다. CT-26 세포(2×10⁴)를 나노섬유에서 24시간 동안 배양하였다. 주사전자현미경 촬영을 위한 전처리 과정으로 나노섬유에 부착된 CT-26세포는 4% 포름알데하이드로 하루 동안 고정을 하고 동결건조를 시킨 뒤 암세포가 나노섬유에 부착된 모양을 관찰하였다. CT-26 대장암세포의 전자현미경 SEM 사진은 도 4에 나타내었는 바, 암세포가 나노섬유에 부착된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 슬라이드 글라스에 부착시킨 나노섬유 기반 세포 배양 및 이동 에세이 칩 제작

본 실시예에서는 나노섬유에 암세포 및 면역세포를 부착 및 배양한 후, 각각 다른 구획으로 세포가 이동하는 것을 관찰하기 위한 세포구획 모형을 제작하고 세포분석을 실시하였다.

본 실시예에 따른 에세이칩의 제조공정 및 이를 이용한 세포분석방법을 도 5에 모식화하여 나타내었다.

먼저 슬라이드 기판 상에 나노섬유 기반의 다(多) 채널 배양 챔버(2채널 및 3채널)를 구비한 나노구조체가 형성되도록 모형을 제작하였다. 즉, 슬라이드용 유리판에 PDMS를 코팅하고, PDMS에 나노섬유를 부착하고 그 위에 고정용 플라스틱과 PDMS로 댐 형상으로 구획된 배양챔버를 고정시켜 에세이칩을 제작하였다.

다음으로, 한 종류의 면역세포(수지상세포)와 항암제를 처리한 다른 두 종류의 암세포를 배양하여 각각의 처리를 한 암세포 쪽으로 이동한 수지상세포의 수를 측정하였다. 구체적으로, 상기에서 제작된 3채널 배양챔버에 각기 다른 파장을 갖는 PKH67과 PKH26으로 형광 염색한 면역세포(수지상 세포)와 암세포를 나노섬유에 부착하고, 상기 암세포에만 다른 항암제를 처리하였다.

구획을 형성한 다채널 배양챔버를 제거하고 다시 면역세포와 암세포를 같은 배양액에서 배양할 수 있도록 단일채널 배양챔버를 고정하여 배양액을 넣고 형광 현미경으로 세포의 부착 및 이동을 관찰하였다.

본 실시예의 결과를 설명하면 다음과 같다.

도 6에 상기 제작된 에세이칩의 실제모형을 나타내었다. 도 7은 고정용 플라스틱으로 제작한 다채널 배양챔버의 모형과 크기를 나타낸 것이고, 도 8은 나노섬유에서 구획 내 세포 배양을 위한 고정클립을 사용하는 경우의 그림을 나타낸 것이다.

도 9는 상기 PKH67으로 녹색형광으로 형광염색한 수지상세포와 PKH26으로 적색형광으로 염색한 대장암 세포를 나노섬유에 부착시킨 후 암세포를 1시간 동안 약물처리하고 약물을 세척한 후 다시 18시간 배양 후 나노섬유에 부착한 세포를 나타내는 데이터로서 두 가지 다른 세포의 형광염색을 통한 면역세포의 암세포 구획으로의 이동 측정이 가능함을 확인할 수 있다.

도 10은 나노섬유가 붙은 슬라이드를 바로 형광현미경에서 관찰한 결과로 관찰의 편리성은 물론이고, 녹색형광으로 염색한 수지상세포가 적색형광으로 염색한 세포 쪽으로 이동하는 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 11은 나노섬유에 부착된 암세포 구획으로 이동한 수지상세포의 고배율 형광현미경 관찰결과를 나타낸 것이다.

또한 도 12는 슬라이드에 부착한 나노섬유 에세이 칩에서 항암제를 처리한 암세포로 수지상세포가 이동한 세포 수를 측정한 데이터를 나타낸 것이다. 면역원성 항암제인 mitoxanthrone의 처리는 비면역원성 항암제인 etoposide 처리에 비교하여 수지상세포의 이동 수를 3배 정도 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

본 실시예를 통해 세포의 동시배양 및 이동이 가능한 다채널 배양챔버를 이용하여 동일한 조건에서 다른 약물의 효능이나 여러 다른 종류의 세포를 동시에 측정할 수 있는 장점을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 6: Transwell을 이용한 수지상세포의 이동 측정

나노섬유에서 이동하는 수지상세포의 이동정도를 비교 측정을 위해 세포이동을 측정하는 일반적인 방법인 트랜스웰(Transwell)을 이용하는 방법으로 세포의 이동을 측정하였다. 트렌스웰 세포 이동 측정 키트는 Coring사의 8 μm의 pore size를 가지는 막을 사용하였다. 막의 위층에는 GM-DC를 100 μl의 배지에 1×10⁴수로 얹고 아래층에는 CT-26 세포를 배양한 후 얻은 배양액(600 μl)을 넣었다. 그 후 4시간 동안 37^oC에서 방치한 후 아래쪽으로 이동한 수지상세포의 수를 flow cytometer를 이용하여 측정하였다. 막의 아래쪽 면으로 이동하여 부착되어 있는 수지상세포는 Giemsa 용액으로 염색을 한 후 부착된 세포의 수를 측정하였다. 이 때 CT-26 대장암 세포의 배양은 MTX나 etoposide를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 1시간 배양한 후 다시 이들 세포를 2번 세척한 후 18시간 더 배양한 후 얻은 배양액을 사용하였다.

도 13은 슬라이드에 PDMS로 부착시킨 나노섬유를 종적인 면으로 절단한 후 대장암세포 쪽으로 이동한 수지상세포를 측정한 데이터를 나타낸 것이고, 도 14는 항암제를 처리하고 배양한 암세포의 배양액에 대한 세포이동을 transwell migration chamber로 측정한 결과와 이를 나노섬유 에세이 칩에서 얻은 결과와 비교한 데이터로, 나노섬유를 이용할 경우 세포이동이 잘 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 나노섬유에서 활성형 수지상세포의 이동 측정

수지상세포는 활성형으로 전환되어 케모카인에 반응하여 림프조직 등으로 이동을 한다. 이에 본 실시예에서는 수지상세포가 케모카인에 반응하여 이동하는 것을 나노섬유에서 측정하였다.

활성형 수지상세포 GM-DC의 이동을 증가시키는 것으로 알려진 케모카인 CCL21을 200 ng/ml과 500 ng/ml로 하여 10% 콜라겐 겔에 혼합하여 나노섬유의 한쪽 면에 얹었으며 반대편에 LPS (100 ng/ml)로 처리하여 활성화된 GM-DC를 1×10⁴개로 부착시켰다. 콜라겐 내의 케모카인의 확산 정도는 FITC를 부착시킨 알부민을 CCL21과 같은 농도로 혼합하여 면역형광현미경 하에서 확산의 정도를 측정하고 콜라겐 겔 쪽으로 이동한 세포의 수를 측정하였다.

도 15는 상기 나노섬유에 수지상세포를 부착시키고 24시간 동안 LPS로 활성화시킨 다음 케모카인 CCL21을 넣은 콜라겐 분획 쪽으로 이동하는 수지상세포 수와 콜라겐에 들어 있는 FITC-conjugated 알부민의 확산 데이터를 나타낸 것으로 이동하는 세포의 수가 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 나노섬유에서 림프조직 유래 세포의 암세포로의 이동 측정

상기 실시예들에서 수지상세포는 골수로부터 분화시킨 GM-DC를 사용하였는데 또한 면역조직에 존재하는 세포들도 항암제를 처리한 암세포에 반응하여 이동하는가를 측정하였다.

이를 위해 본 실시예에서는 C57B 마우스의 림프조직을 절제하여 collagenase (7 mg/ml)와 DNase (0.14 mg/ml)를 함유하는 용액에 30분간 반응시킨 후 림프조직에 존재하는 면역세포를 얻었다. 이들 림프조직의 세포들은 DAPI로 염색하고 PKH26으로 염색한 GM-DC와 5:1의 비율로 혼합하였다. 혼합된 세포(1×10⁴)는 나노섬유에 부착시키고 다른 편에는 CT-26 대장암세포를 부착시켰다(도 16).

암세포를 항암제로 1시간 처리하고 세포를 세척한 후 다시 18시간 동안 반응한 후 면역세포와 암세포간의 댐을 제거하고 시간 경과 별로 암세포 쪽으로 이동한 DAPI로 염색된 림프조직 세포의 수를 측정하였다.

도 16에 본 실시예에 따른 림수지상세포 뿐만 아니라 림프절의 면역세포도 항암제를 처리한 암세포 쪽으로 이동하는 가를 측정하기 위하여 림프절의 세포를 분리하여 염색한 후 분획의 한쪽에 부착시키고 암세포 쪽으로 이동한 세포의 수를 나타내었다.

실시예 8: 나노섬유 및 일반 배양에서 세포사멸의 측정

본 실시예에서는 나노섬유에서 배양한 암세포를 항암제로 처리하였을 때 세포손상이 일어나는 정도를 세포사멸로 측정하였다. 세포사멸의 정도는 Annexin-V의 염색으로 측정하였다. CT-26세포(1×10⁴)를 PKH26으로 염색하고 나노섬유에 부착시킨 후 항암제를 1시간 정도 처리하거나 19시간 동안 처리한 후 Annexin V-FITC (5 ml)로 30분간 반응시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다(도 17A).

일반 배양 플라스크에서 항암제로 반응시킨 세포(1×10⁶/ml)는 Annexin V-FITC로 염색한 후 flow cytometer로 측정하였다(도 17B).

도 17을 참고하면 세포 사멸의 정도를 육안으로도 실시간 측정이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 항암제 처리에 의한 heat shock protein 발현 측정

CT-26 대장암세포(2×10⁶)에 세포사멸이 일어나지 않는 각 시간대 별로 항암제를 처리하였을 때, 세포의 손상이 일어나는 정도는 heat shock protein70 (HSP70)의 발현 변화로 측정하였다. 세포를 수집한 후 cell lysis buffer (Sigma 사)와 protease inhibitor cocktail (Sigma 사)을 첨가하여 단백질을 분리하였다. 단백질의 정량은 BCA (Pierce 사) 법을 사용하였다. 분리한 단백질 발현의 양은 Western blot 법으로 측정하였으며 HSP70 항체는 Mouse monoclonal antibody (Gift from PIBOC)를 1:250으로 사용하였다.

도 18에 본 실시예에 따라 CT26 대장암세포를 mitoxanthrone (MTX)과 etoposide (Etopo)을 시간 별로 처리하였을 때 세포 내 발현되는 HSP70 단백질 양의 변화를 측정한 데이터를 나타내었다. 면역원성 항암제인 mitoxanthrone의 처리는 비면역원성 항암제인 etoposide 처리에 비교하여 손상된 단백질인 HSP70 단백질 양이 증가함을 확인할 수 있었다.

Claims (22)

1. 기판 상에 배양챔버로 이루어지는 세포배양층을 포함하는 에세이칩을 이용하는 세포분석방법에 있어서,
   상기 세포배양층은 배양챔버의 저면에 형성된 나노섬유층과, 상기 나노섬유층 상에 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리가능하게 형성된 지지대를 포함하여, 상기 지지대에 의하여 배양구획이 형성된 다채널 배양챔버로 이루어지고,
   상기 나노섬유층은 직접주사(direct-write) 전기방사공정으로 70~100㎛의 균일한 두께를 갖는 3차원 나노섬유 매트로 형성되며,
   면역세포 및 질환세포를 상기 다채널 배양챔버의 각각 다른 배양구획에 주입하여 면역세포 및 질환세포를 부착·배양하여, 면역세포와 질환세포를 서로 다른 배양구획의 나노섬유층에서 동시에 부착·배양하는 제1 단계;
   상기 지지대를 상기 나노섬유층 및 배양챔버로부터 분리하는 제2 단계;
   상기 제2 단계를 거친 후, 상기 각 구획의 나노섬유층에 각각 부착 및 배양된 세포를 추가배양하는 제3 단계; 및
   상기 추가배양된 면역세포 및 질환세포의 세포수 또는 세포이동을 측정하는 제4 단계;를 포함하는,
   나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 나노섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 생체적합성 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 지지대는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 제1 단계는, 상기 각 배양구획에 서로 다른 종류의 형광염색제를 더 주입하는 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 제1 단계는, 상기 면역세포를 배양하는 배양구획에 상기 면역세포와 반응하여 면역세포의 이동을 촉진하는 활성성분을 더 처리하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 제1 단계는, 상기 질환세포를 배양하는 배양구획에 상기 질환의 치료제를 더 처리하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 면역세포는 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포 및 B세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 질환 세포는 질환이 유도된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 질환 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
10. 제 6 항에 있어서,
    상기 질환 세포는 암세포이고, 상기 질환의 치료제는 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 암사크린(amsacrine), 에피루비신(epirubicin), 메르바론(merbarone) 및 피로잔트론하이드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제인 것을 특징으로 하는, 나노섬유 기반 에세이칩을 이용한 면역세포의 인체조직간 네트워크의 모사 및 면역원성 분석방법.
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