WO2017105035A1 - 세포 배양 나노섬유 구조체, 이의 제조 방법 및 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치 - Google Patents

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곽종영
정영훈
김정화
김태언
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아주대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture nanofibrous construct, a method for producing the same, and a cell analysis device including the cell culture nanofibrous construct, wherein the cell culture nanofibrous construct, a method for producing the same, and a cell culture partitioned to include at least two culture regions. It relates to a cell analysis device including a nanofiber structure.
  • Cell migration plays an important role in the development of various diseases, which occur through several stages of cellular interaction.
  • Cell migration typically includes cell invasion, chemotaxis, contact chemotaxis, and the like.
  • Immune cells migrate in time and space, recognizing the concentration gradient of chemotactic factors.
  • the migration of cells such as immune cells is measured by measurement methods such as Boyden chamber assay, migration gap closure assay, Dunn chemotaxis chamber assay, under-agarose assay, and time-lapse video microscopy assay. It is only a method of measuring the cell migration, and the measurement of cell movement is an end-point, and it is difficult to measure the cell movement in real time, and a large number of assays are required for the real time measurement.
  • tissue structure affects gene expression patterns and cell functions
  • biosimilar systems should be developed to measure the effects between several factors, including genotype, phenotype, and cell-extrinsic factors.
  • Three-dimensional culture systems are also available for high-throughput experiments. Spheroid culture, hanging drop culture, extracellular matrix gel culture, and scaffold culture are being developed. In vitro studies have been carried out mainly with two-dimensional or three-dimensional spheroids, but these systems differ significantly from in vivo.
  • scaffold cultivation is a technique of culturing in a scaffold having pores using a natural / synthetic polymer.
  • Three-dimensional culture scaffolds should be constructed to allow oxygen, nutrients, and cell migration in addition to cell attachment.
  • Korean Patent No. 10-1446687 discloses a technology for making dams using plastic or polydimethylsiloxane (PDMS) as an assay chip in order to divide and culture two or more different cells in three-dimensional cell culture using a nanofiber support. Is disclosed. In this case, there is a need for a technology that overcomes the disadvantages at the nano level, which requires technical supplementation such as assembly or leaking of the culture medium and the gap between the fractions containing each cell.
  • PDMS plastic or polydimethylsiloxane
  • micropatterns using lithography or mechanical micromachining on electrospun nanofiber scaffolds is a very difficult process.
  • Fabrication of microchannels using femtosecond laser-ablation on polycaprolactone (PCL) nanofibrous layers based on nanofibers has been reported (Lee et al., Ann Biomed Eng. 2011; 39 (12): 3031-3041).
  • the microchannels were made 100 ⁇ m wide, 100 ⁇ m deep, 10 mm long.
  • smooth muscle cells were injected using a micro-pump, the cells were well distributed in the microchannels and cell clogging did not appear in the channel, so it was developed as a technique that can be used as a vascular model, but there are limitations in culturing multiple cells.
  • micropatterned nanofiber fabrication technique was made by making microwells using PDMS templates and attaching nanofibers and hydrogels to them (Song et al., Applied Materials Interface, 2014; 6 (10): 7034-7044). .
  • the nano-fiber in the microwell is easy to attach the cells and cell culture technology in the encapsulation format, the manufacturing process is complicated and difficult disadvantages.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1446687
  • Patent Document 2 2. Republic of Korea Patent Registration No. 10-0953366
  • Patent Document 3 3. Republic of Korea Patent Registration No. 10-0968231
  • Non-Patent Document 1 Lee et al., Fabrication of patterned nanofibrous mats using a direct-write electrosinning, Langmuir, 2012; 28 (18): 7267-7275
  • Non-Patent Document 2 Lee et al. Vascular wall engineering via femtosecond laser ablation: scaffolds with self-containing smooth muscle cell populations. Ann Biomed Eng. 2011; 39 (12): 3031-41.
  • Non-Patent Document 3 Song et al. Nanofibrous microposts and microwells of controlled shapes and their hybridization with hydrogels for cell encapsulation. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6 (10), pp 7038-7044.
  • One object of the present invention is to provide a cell culture nanofiber structure having partition walls having mass transfer channels while being partitioned into at least two culture regions.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the cell culture nanofiber structure having a simple process.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell analysis device including the cell culture nanofiber structure.
  • Cell culture nanofiber structure for one purpose of the present invention is a cell culture layer formed of nanofibers, protruding upward from the surface of the cell culture layer partitioning the cell culture layer into at least two or more culture areas, the cell It includes a partition wall formed of the same nanofibers as the culture layer to be a mass transfer channel.
  • the bottom of the partition wall portion is connected to the cell culture layer, the width may decrease from the bottom to the top of the partition wall portion. At this time, the bottom width of the partition wall portion may be less than 100 ⁇ m 1 mm.
  • the partition wall portion may have a double partition structure including two protrusions spaced apart from each other.
  • the partition wall may include a recessed portion recessed downward from the surface of the cell culture layer between the two protrusions.
  • the separation distance between the two protrusions may be between 300 ⁇ m and 500 ⁇ m, and the bottom width of each of the protrusions may be between 200 ⁇ m and 400 ⁇ m.
  • the width may decrease from the bottom to the top of each of the protrusions.
  • the nanofiber density of the cell culture layer may be denser than the nanofiber density of the partition portion.
  • the partition wall portion may be arranged in the form of a single closed curve along the edge of the culture zone.
  • Method for producing a cell culture nanofiber structure for an object of the present invention by electrospinning the nanofibers in a state in which a mold partitioned into at least two regions by the recesses embedded therein, the surface of the mold
  • the cell culture layer covering and the partition wall portion which is connected to the cell culture layer and disposed in the recess to partition the cell culture layer into at least two culture regions and are formed of the same nanofibers as the cell culture layer and become a mass transfer channel.
  • Forming a cell culture nanofiber structure comprising; and separating the cell culture nanofiber structure from the mold.
  • the method may further comprise the step of heat-treating in a state in which the nanofiber is radiated on the mold before separating the cell culture nanofiber structure.
  • the partition wall has a double partition wall structure including two protrusions spaced apart from each other, and may further include a recess recessed downward from the surface of the cell culture layer between the two protrusions.
  • the width of the recess of the mold may be 1 mm or more and 2 mm or less.
  • Cell analysis device for another object of the present invention is a cell culture layer formed of nanofibers, and protrudes upward from the surface of the cell culture layer partitioning the cell culture layer into at least two or more culture areas, the cell culture A cell culture nanofiber structure including a partition portion formed of the same nanofiber as a layer to be a mass transfer channel, and culturing different cells in each of the culture regions of the cell culture nanofibrous structure to provide a material for the partition portion. Measure the movement.
  • the partition wall portion is made of the same nanofibers as the culture layer Intercellular movement or molecules generated in cells may diffuse through the partition wall, which is a mass transfer channel. Due to the formation of two or more culture regions by the partition, the cell culture nanofiber structure of the present invention may be a cell culture chamber including two or more culture regions.
  • Such cell culture nanofiber constructs are provided in a cell analysis apparatus for measuring and analyzing cell culture and / or cell migration, and can simultaneously measure the movement of various types of cells in real time. Accordingly, cell analysis can be performed in real time.
  • FIG. 1 is a perspective view for explaining a cell culture nanofiber structure according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line II ′ of FIG. 1.
  • FIG. 3 is an enlarged view illustrating an enlarged portion A of FIG. 2.
  • FIGS. 4 is a view showing photographs for explaining the nanofibers constituting the cell culture nanofiber structure of FIGS.
  • 5 to 7 are views for explaining the method for producing a cell culture nanofiber structure described in Figures 1 to 4.
  • FIG. 8 and 9 are views for explaining the cell culture nanofiber structure of the different form from FIG.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view for explaining a cell culture nanofiber structure according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a perspective view illustrating a cell culture nanofiber structure according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a cross-sectional view taken along the line II 'of FIG.
  • the cell culture nanofiber structure 100 includes a cell culture layer 110 and a partition wall part 120.
  • the cell culture layer 110 is formed of nanofibers and may have a three-dimensional matrix structure. Since the cell culture layer 110 is formed of nanofibers, the effective surface area is very large and high in durability, and is easy to handle and can be manufactured in various forms. In addition, various materials may be chemically coupled to the cell culture layer 110.
  • the nanofibers constituting the cell culture layer 110 may be made of various materials such as synthetic polymers and biocompatible polymers.
  • Examples of the compound forming the nanofibers constituting the cell culture layer 110 include chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (polyethylene-oxide), Polycaprolactone (PCL), polylactic acid, polyglycol acid (PGA), poly [(lactic-co-glycolic acid), polyl (( 3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvaleric acid), polydioxanone, poly [(lactide)-(caprolactone)] (polylactidecaprolacton), Polyesterurethan, poly [(L-lactide)-(D-lactide)] (polylactide-lactide), poly [ethylene- (vinyl alcohol)] (polyethylenevinylalcohol), polyacrylic acid , Polyvinylal
  • the nanofibers may be used alone or in combination of two or more, respectively. Combinations of two or more may be copolymers or in the form of simple mixtures.
  • the compound forming the nanofibers is a biocompatible polymer, since the cells include a plurality of pores through which the cells can pass, there is an advantage of easier attachment and culture of the cells.
  • the compound forming the nanofibers may have a number average molecular weight of 10,000 to 1,000,000.
  • the number average molecular weight of the compound forming the nanofibers may be 50,000 to 500,000.
  • the diameter of the nanofibers may be 100 nm to 900 nm
  • the cell culture layer 110 may be a single layer having a thickness (Th) of 50 ⁇ m to 70 ⁇ m randomly integrated nanofibers.
  • the partition wall 120 protrudes upward from the surface of the cell culture layer 110 to partition the cell culture layer 110 into at least two culture regions.
  • the partition wall 120 is formed of the same nanofibers as the cell culture layer 110 to become a material movement channel. When cells are disposed in each of the culture regions, the cells may move through the partition wall 120.
  • the mass transfer channel by the partition wall 120 is formed by irregular accumulation of nanofibers and pores of the nanofibers themselves.
  • the partition wall part 120 extends in one direction on the cell culture layer 110 to define a culture area, extends in one direction, and has a first width W1.
  • partition wall 120 will be described in more detail with reference to FIGS. 3 and 4 along with FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 3 is an enlarged view illustrating an enlarged portion A of FIG. 2.
  • the height H of the partition wall part 120 is defined as the distance from the surface of the cell culture layer 110 to the highest point of the partition wall part 120.
  • the lower end of 120 is connected to the cell culture layer 110 and the highest point is included in the upper end of the partition wall 120.
  • the ratio of the height H of the partition 120 to the thickness Th of the cell culture layer 110 may be 1: 1.2 to 1: 1.5.
  • the ratio of the height (H) of the partition wall portion 120 and the thickness (Th) of the cell culture layer 110 is 1: 1
  • the cell culture nanofiber structure 100 becomes a structurally stable form. Cells can be cultured stably in the culture area, respectively.
  • the height H of the partition 120 may be 50 ⁇ m to 70 ⁇ m.
  • the first width W1 of the partition wall part 120 is defined as the bottom width of the partition wall part 120, and the width of the partition wall part 120 may gradually decrease from the bottom of the partition wall part 120 to the top.
  • an upper end of the partition wall part 120 may have a rounded shape of an apex portion.
  • the height (H) of the partition wall portion 120 may be substantially the same as the thickness (Th) of the cell culture layer (110) or thinner than the thickness (Th) of the cell culture layer (110).
  • the first cell (shown in green) is attached to the cell culture layer 110 on one side of the cell wall 120, and the second cell of a different species is different from the first cell on the cell culture layer 110 on the other side.
  • Cells (shown in red) can be attached and cultured. In this case, different types of fluorescent dyes may be injected into each culture region.
  • the first cell may be a disease cell or bacteria
  • the second cell may be an immune cell.
  • the movement and activity of immune cells, and damage, death, and proliferation of diseased cells can be directly measured.
  • Cell migration can be easily observed with a fluorescence microscope by the color of the fluorescent dye in each culture region.
  • the immune cells may include neutrophils, macrophages, dendritic cells, NK cells, T cells, B cells and the like.
  • the immune cells may be human or mouse derived cells, specifically, may be obtained by differentiating bone marrow cells isolated from human blood or mouse bone marrow into immune cells in immune cell culture medium.
  • the disease cell may be a disease-induced cell, and may be a cancer cell.
  • the cancer cells include liver cancer cells, colon cancer cells, gastric cancer cells, lung cancer cells, uterine cancer cells, breast cancer cells, thyroid cancer cells, pancreatic cancer cells, and the like.
  • the disease cells may be E. coli, staphylococcus, Salmonella, dysentery, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Yeast, Staphylococcus, or Tetanus.
  • FIGS. 4 is a view showing photographs for explaining the nanofibers constituting the cell culture nanofiber structure of FIGS.
  • each of the cell culture layer 110 and the partition wall 120 includes a matrix having a structure in which nanofibers are irregularly entangled as shown in the electron micrograph of FIG. 4. do.
  • the left picture is the 100 ⁇ m scale and the right picture is the 50 ⁇ m scale.
  • the density of the cell culture layer 110 is denser than that of the partition wall 120. That is, the density of the partition wall portion 120 is lower than the density of the cell culture layer 110, so that the material movement passage is wider, so that the partition wall portion 120 is the material movement channel compared to the cell culture layer 120 even with the same material. As the material can move.
  • a difference in density may be achieved by forming the cell culture nanofiber structure 100 by electrospinning the nanofibers using a mold (see FIGS. 5 and 6).
  • 5 to 7 are views for explaining the method for producing a cell culture nanofiber structure described in Figures 1 to 4.
  • the cell culture nanofiber structure 100 is manufactured using an electrospinning apparatus.
  • a syringe containing a polymer solution injects a polymer solution through a needle, and an electrospinning jet is applied by applying an electric field between the syringe and the collector.
  • an electrospinning jet is applied by applying an electric field between the syringe and the collector.
  • the mold 200 has a shape opposite to that of the cell culture nanofiber structure 100 to be manufactured, and includes a recess 210 recessed into the mold 200 from the surface of the mold 200.
  • the recessed part 210 the part which protruded relatively more than the recessed part 210 is defined as a convex part.
  • the recess 210 is a portion forming the partition wall 120 of the cell culture nanofiber structure 100, and the cell culture layer 110 covering the surface of the mold 200 as a whole is connected to the partition wall 120. Can be formed.
  • the width SP of the recess 210 may be substantially the same as the bottom width W1 of the partition wall 120. When the width SP of the recess 210 is 100 ⁇ m or more and less than 1 mm, the cell culture nanofiber structure 100 described with reference to FIGS. 1 to 4 may be formed.
  • the mold 200 may be formed of silicon, quartz, ceramic, alumina, titania, glass, or the like.
  • the mold 200 may also be manufactured from a silicon wafer using a general wet and / or dry etching process.
  • an electrospinning process may be performed by applying an electric field between the mold 200 and the syringe without using a separate integrated plate.
  • the electrospinning process is performed in a state in which the mold 200 is disposed on the integrated plate.
  • the diameter, pore size, and integration density of the nanofibers may be controlled by adjusting the concentration, voltage, and spinning distance of the polymer solution in the electrospinning process.
  • nanofibers are integrated in the recess 210 of the mold 200 through the electrospinning process, and nanofibers are also integrated on the surface of the mold 200.
  • the partition wall part 120 is formed to correspond to the recess 210, and a cell culture layer 110 having a layered structure covering the mold 200 as a whole is formed.
  • the bottom width W1 of the partition 120 may be substantially the same as the width SP of the recess 210.
  • the upper end of the partition portion 120 disposed inside the recess 210 may be formed to be narrower than the lower end so as not to completely fill the recess 210.
  • the density of the nanofibers integrated on the surface of the mold 200 by electrospinning is formed more densely than the density of the nanofibers integrated in the recess 210.
  • the heat treatment in a state in which the mold 200 and the nanofiber structure 100 are combined, and after the heat treatment process to separate the nanofiber structure 100 from the mold 200 nanofibers described in FIGS. 1 to 4 The structure 100 can be manufactured.
  • the heat treatment process may be performed at 50 °C to 70 °C.
  • the cell culture nanofiber structure 100 may be disposed on the base substrate as a support.
  • a polymer coating layer may be disposed between the base substrate and the cell culture layer 110.
  • the polymer coating layer may increase the adhesion between the cell culture nanofiber structure 100 and the base substrate.
  • the material for forming the polymer coating layer include polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), polymethyl methacrylate (PMMA), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene (PE), polyurethane (PU), Cellulose, silicone rubber, and the like.
  • the polymer coating layer may be coated on the base substrate by spin coating, and may be formed of substantially the same material as the nanofibers constituting the cell culture nanofiber structure 100, but the polymer coating layer may be The film is uniformly formed on the base substrate, and the cell culture layer 110 and the partition wall 120 have a structure in which nanofibers form a matrix.
  • FIG. 8 and 9 are views for explaining the cell culture nanofiber structure of the different form from FIG.
  • FIG. 8 and 9 illustrate a cell culture nanofiber structure including at least three culture regions. As shown in (a), (b), and (c) of FIG. 8, two partition walls are formed in one direction or different from each other. It can be designed to extend in the direction to form a cell culture nanofiber structure comprising a plurality of culture regions.
  • the cell culture nanofiber structure having such a plurality of culture regions is provided in a cell analysis device, and can observe the movement of several kinds of cells at the same time, and even many experiments can be performed simultaneously with the same species.
  • the partition wall may be arranged in a single closed curve along the edge of the culture area to partition the culture area.
  • 9 (a) and 9 (b) show a structure that is a culture chamber including four culture regions, which are arranged in a single closed curve along the edge of each of the culture regions.
  • the width of the partition wall may be uniformly formed in all parts, and in the center portion where the partition wall intersects, as in (a), the width of the partition wall may be relatively wider than that of other parts.
  • the structure divided into four culture regions is illustrated, but the nanofiber structure having at least two culture regions may be variously designed by adjusting the design of the partition wall 120.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view for explaining a cell culture nanofiber structure according to another embodiment of the present invention.
  • the cell culture nanofiber structure shown in FIG. 10 is substantially the same as described in FIGS. 1 to 4 except for the structure of the partition wall. Therefore, overlapping detailed description will be omitted and differences will be described.
  • the partition wall 120 includes two protrusions 122 and 124 spaced apart from each other and a recess therebetween.
  • Each of the two protrusions 122, 124 protrudes from the surface of the cell culture layer 112, and the depression is recessed inward from the surface of the cell culture layer 112.
  • Two protrusions are formed by the recess, that is, the first protrusion 122 and the second protrusion 124.
  • Each of the first and second protrusions 122 and 124 also has a structure in which the lower widths Ws1 and Ws2 are formed wider than the upper width as described above with reference to FIG. 3 so that the width gradually decreases from the lower end to the upper end.
  • Bottom widths Ws1 and Ws2 of each of the first and second protrusions 122 and 124 may be 200 ⁇ m to 400 ⁇ m, the width of the recess, and between the first and second protrusions 122 and 124.
  • the separation distance SG may be 300 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the bottom width W2 of the partition wall 120 which is the sum of the bottom widths Ws1 and Ws2 and the separation distance SG of each of the first and second protrusions 122 and 124 may be 1 mm or more.
  • the bottom width W2 of the partition wall part 120 including the two protrusions 122 and 124 may be 1 mm or more and 2 mm or less.
  • the two protrusions 122 and 124 serve as a substantial partition wall for partitioning the culture areas, cells moved to the indents disposed therebetween can accumulate, so that the movement of the cells can be more accurately confirmed. That is, the cells disposed in one culture region may be disposed through the first protrusion 122 to be disposed in the recess, and the mobility of the cells may be analyzed by measuring the number of cells accumulated in the recess.
  • the structure of the partition wall 120 having two protrusions 122 and 124 and the recessed portion may include the width SP of the recess 210 of the mold 200 during the manufacturing process using the electrospinning described with reference to FIGS. 5 to 7. ) Can be formed by adjusting it to 1 mm or more.
  • the width SP of the recess 210 is 1 mm or more, the nanofibers are preferentially integrated at the edges of the recess 210 in the electrospinning process rather than being entirely integrated in the recess 210.
  • the nanofiber density difference is generated, and as the mold 200 and the nanofiber structure are separated, two protrusions 122 and 124 and a partition wall part 120 having a double partition structure having the recesses may be formed.
  • the width of the partition wall 120 is preferably 1 mm or more and 2 mm or less.
  • the cell culture nanofiber structure 100 includes at least two culture regions, but the partition wall portion 120 is made of the same nanofibers as the cell culture layer 110 to form a material transfer channel ( 120), intercellular transport or molecules produced in cells can be diffused. Due to the formation of two or more culture zones by the partition wall 120, the cell culture chamber in which the cell culture nanofiber structure 100 of the present invention includes two or more culture zones can simultaneously culture two or more cells. Can be.
  • the cell culture nanofiber structure 100 may be provided in a cell analysis device for measuring and analyzing cell culture and / or cell migration, and may simultaneously measure movement of various types of cells in real time. Accordingly, cell analysis can be performed in real time.
  • a thin aluminum sheet was prepared, and the aluminum tape was cut in a square shape and then attached to each other on the aluminum thin film in a matrix form. Accordingly, a mold having a structure substantially the same as that of the mold 200 described with reference to FIGS. 5 and 6, in which a portion to which the aluminum tape is attached is a convex portion and a spaced portion between the aluminum tapes is a recess is prepared. At this time, the width of the recess was 1 mm.
  • the nanofibers were electrospun toward the mold in a state where the prepared mold was disposed on the integrated plate of the electrospinning apparatus.
  • the spinning distance was 10 cm and the voltage was 10 to 15 kV.
  • electrospinning was carried out by moving a biaxial stage so that the nanofibers can be spun onto a uniform thickness on the mold, polycaprolactone (PLC) was used as the nanofibers, and the average diameter of the nanofibers was 500 nm. It was.
  • PLC polycaprolactone
  • a cell culture nanofiber structure was prepared according to one embodiment of the present invention.
  • the thickness of the cell culture layer of the prepared cell culture nanofiber structure was about 50 ⁇ m, and the partition wall part was formed as a double partition wall structure.
  • the height of each of the two protrusions was about 50 ⁇ m and the width of each was 300 ⁇ m, and the separation distance between the protrusions was 400 ⁇ m (see FIGS. 10 and 11).
  • Dendritic cells obtained by differentiating granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4) from bone marrow were mixed with 10,000 cells in 10 ⁇ l of phosphate buffered saline (PBS) solution. After placing in the culture region of the cell culture nanofiber construct, it was left for 4 hours. The result is shown in FIG.
  • GM-CSF granulocyte macrophage-colony stimulating factor
  • IL-4 interleukin-4
  • FIG 11 is an electron micrograph of the cell culture sample 1. Referring to this, it can be seen that dendritic cells are attached to one side of the partition wall, that is, the nanofibers constituting the cell culture layer.
  • Dendritic cells used in the preparation of colorectal cancer cell line CT-26 and cell culture sample 1 were stained with PKH67 (green fluorescence) and PKH26 (red fluorescence), respectively, and 10,000 cells in 10 ⁇ l phosphate buffered saline (PBS) solution. After mixing, and placed in the culture region of the cell culture nanofiber structure prepared as described above, it was left for 4 hours. It photographs with a fluorescence microscope and shows the result in A of FIG.
  • colon cancer cells were stained with red fluorescence and blue fluorescence in the culture region of the cell culture nanofiber structure prepared as described above and placed together with dendritic cells stained with green fluorescence, and then left for 4 hours. It photographs with a fluorescence microscope and shows the result in A of FIG.
  • the left picture of A shows green / red fluorescence
  • the right picture of A shows green / blue / red fluorescence.
  • cell culture sample 3 was prepared in substantially the same manner as the preparation of cell culture sample 2, except that bone marrow cells were isolated from mice and then used to induce differentiation into dendritic cells. Dendritic cells were prepared as follows.
  • Bone marrow cells were isolated from the thighs and calves of Balb / c mice at 5-6 weeks of age. Isolated bone marrow cells (1 ⁇ 10 6 cells / ml) were treated at 37 ° C. with 10% CO 2 in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. 15 ng / ml granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 15 ng / ml of interleukin-4 (IL-4) were incubated together for 7 days to induce differentiation into dendritic cells.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 interleukin-4
  • Differentiated dendritic cells were differentiated using specific protein surface factors, CD11c and major histocompatibility complex (MHC) -II, and isolated using CD11c microbeads. It photographs with a fluorescence microscope and shows the result in B of FIG.
  • MHC major histocompatibility complex
  • FIG. 12B shows fluorescence micrographs taken at magnifications of 10, 20, and 50 times, with reference to this, dendritic cells stained with green fluorescence and colorectal cancer cells stained with blue and red fluorescence, respectively, in the culture region. It can be seen that the culture is stable.
  • Neutrophils were isolated from mice as immune cells, and cell culture sample 4 was prepared using staphylococci as disease cells. Dendritic cells and staphylococci were each obtained by the following method.
  • 3 ml of 3% Thioglycollate solution was injected into the abdominal cavity of 5-6 week old Balb / c mice using a 26G needle. After 6 hours, the skin was removed by cervical distal bone, and the peritoneum was cut with scissors, and the solution in the abdominal cavity was collected using a Pasteur pipette. 2 ml of erythrocyte lysate was added and mixed, and then reacted for 2 minutes, and the collected solution was centrifuged at 4 ° C. at 1700 rpm. After centrifugation, the cells were reacted with 500 ⁇ l of EDTA-BSS solution and 10 ⁇ l of Ly6-G biotin antibody at 4 ° C. for 20 minutes.
  • the EDTA-BSS solution was added and centrifuged, and then, 500 ⁇ l of EDTA-BSS solution was treated with 10 ⁇ l of biotin-bound microbeads and reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • Microbead-coupled neutrophil cells were isolated using MS coloum of MACS.
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, was grown in LB medium.
  • Neutrophils and staphylococci were fluorescently stained with PKH67 and PKH26, respectively, and electron micrographs attached to the nanofiber structures are shown in FIG. 13, and fluorescence micrographs after standing for 12 hours are shown in FIG. 14.
  • A is a photograph with neutrophils attached
  • B is a photograph with staphylococci attached. Referring to Figure 13, it can be seen that each of the immune cells and disease cells are stably attached to the nanofibers of the culture region.
  • FIG. 14 shows a state in which the neutrophils are attached to A, and Staphylococcus aureus is attached to B and C in the nanofiber structure including the A, B, and C culture regions. Notice that the region between is defined as region 1 and the region between A and B is defined as region 2. In this case, the upper two photographs of (b) represent regions 1 and 2, respectively, and the lower two photographs represent photographs after 12 hours have elapsed.
  • the neutrophils move to the partition wall disposed between the two culture regions. As such, it can be seen that the movement of cells can be observed through a fluorescence microscope with time using the nanofiber structure according to the present invention.

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Abstract

세포 배양 나노섬유 구조체, 이의 제조 방법 및 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치에서, 세포 배양 나노섬유 구조체는 나노섬유로 형성된 세포 배양층과, 세포 배양층의 표면으로부터 상부를 향해 돌출되어 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하되, 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함한다.

Description

세포 배양 나노섬유 구조체, 이의 제조 방법 및 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치
본 발명은 세포 배양 나노섬유 구조체, 이의 제조 방법 및 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치에 관한 것으로, 적어도 2 이상의 배양 영역을 포함하도록 구획된 세포 배양 나노섬유 구조체, 이의 제조 방법 및 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치에 관한 것이다.
세포 이동은 여러 가지 질병의 발생에 있어서 중요한 역할을 하는데, 여러 단계의 세포작용을 거쳐서 일어난다. 세포 이동은 대표적으로 세포 인베이젼(cell invasion), 주화성(chemotaxis), 접촉 주성(haptotaxis) 등이 있다. 면역세포는, 화학 주성 인자의 농도 구배를 인식하여 시간적 공간적으로 이동한다.
세포 배양 상태에서, 면역세포 등과 같은 세포의 이동은 Boyden chamber assay, migration gap closure assay, Dunn chemotaxis chamber assay, under-agarose assay, time-lapse video microscopy assay 등의 측정 방법으로 측정하고 있는데, 이들은 2차원적인 세포 이동을 측정하는 방법에 불과하고, 세포 이동의 측정이 end-point로서, 실시간의 세포 이동을 측정하는데 어려움이 있으며 실시간 측정을 위해서는 많은 수의 에세이(assay)를 필요로 한다.
조직구조가 유전자 발현 양상이나 세포의 기능에 영향을 주므로 생체유사 시스템은 genotype, phenotype, 및 cell-extrinsic factors 등의 여러 인자간의 영향을 측정할 수 있도록 개발되어야 한다. 3차원 배양 시스템은 high-throughput 실험으로도 가능하며 그 종류로는 spheroid 배양, hanging drop 배양, 세포외기질 겔 배양, 스캐폴드 배양 등이 개발되고 있다. In vitro 연구는 주로 2차원적으로나 3차원 spheroid를 사용하여 이루어졌으나 이러한 시스템은 in vivo와는 큰 차이를 나타낸다.
이 중에서, 스캐폴드 배양은 천연/합성 폴리머를 사용하여 공극을 가지는 스캐폴드에서 배양하는 기술이다. 3차원 배양 스캐폴드는 세포 부착 이외 산소, 영양분 및 세포 이동이 가능하도록 제작되어야 한다. 한국 등록특허 제10-1446687호에서는 나노섬유 지지체를 이용한 3차원적 세포 배양에서 서로 다른 두 가지 이상의 세포를 구획지어 배양하기 위하여 플라스틱이나 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 둑을 만들어서 에세이칩으로 활용하는 기술이 개시되어 있다. 이 경우 조립을 하거나 배양액이 새는 등의 기술적인 보완이 필요하고 각 세포를 포함하는 분획 사이의 간격도 차이가 나는 단점을 나노 수준에서 극복할 기술이 필요하다.
또한, 전기방사된 나노섬유 스캐폴드에 lithography나 mechanical micromachining을 사용하여 마이크로패터닝을 제작하는 것은 매우 어려운 공정이다. 나노섬유기반으로 polycaprolactone(PCL) 나노섬유층에 femtosecond laser-ablation을 이용하여 마이크로채널을 제작하는 것이 보고되어 있다(Lee 등, Ann Biomed Eng. 2011;39(12):3031-3041). 마이크로채널은 100 ㎛ 폭, 100 ㎛ 깊이, 10 mm 길이로 만들어졌으며. 마이크로-펌프를 사용하여 평활근세포를 주입하였을 때 마이크로채널에 잘 분포하였으며 채널에서 세포가 막히는 현상이 나타나지 않아서 혈관 모델로 활용할 수 있는 기술로 개발되었으나 다종의 세포를 배양하는 데는 한계가 있다.
또 다른 마이크로패터닝 나노섬유를 제작하는 기술로서 PDMS 주형을 이용하여 마이크로 웰을 만들고 여기에 나노섬유와 하이드로젤을 붙여서 제작하였다(Song 등, Applied Materials Interface, 2014;6(10):7034-7044). 마이크로 웰에 나노섬유가 있어서 세포가 부착하기 쉽고 encapsulation 형식으로 세포 배양이 가능한 기술이기는 하지만, 제작 공정이 복잡하고 까다로운 단점이 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 1. 대한민국 특허등록 제10-1446687호
(특허문헌 2) 2. 대한민국 특허등록 제10-0953366호
(특허문헌 3) 3. 대한민국 특허등록 제10-0968231호
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)Lee et al., Fabrication of patterned nanofibrous mats using a direct-write electrosinning, Langmuir, 2012;28(18):7267-7275
(비특허문헌 2)Lee et al. Vascular wall engineering via femtosecond laser ablation: scaffolds with self-containing smooth muscle cell populations. Ann Biomed Eng. 2011;39(12):3031-41.
(비특허문헌 3)Song et al. Nanofibrous microposts and microwells of controlled shapes and their hybridization with hydrogels for cell encapsulation. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6 (10), pp 7038-7044.
본 발명의 일 목적은 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획되면서도 물질 이동 채널을 갖는 격벽부을 갖는 세포 배양 나노 섬유 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간단한 공정을 갖는 상기 세포 배양 나노 섬유 구조체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 배양 나노 섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 세포 배양 나노섬유 구조체는 나노섬유로 형성된 세포 배양층과, 상기 세포 배양층의 표면으로부터 상부를 향해 돌출되어 상기 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하되, 상기 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 격벽부의 하단이 상기 세포 배양층과 연결되고, 상기 격벽부의 하단에서 상단으로 갈수록 너비가 감소할 수 있다. 이때, 상기 격벽부의 하단 너비는 100 ㎛ 이상 1 mm 미만일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 격벽부는 서로 이격된 2개의 돌출부들을 포함하는 이중 격벽 구조를 가질 수 있다. 이때, 상기 격벽부는 2개의 돌출부들 사이에서 상기 세포 배양층의 표면에서 하부를 향해 함입된 함입부를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 2개의 돌출부들 사이의 이격 거리는 300 ㎛ 내지 500 ㎛이고, 상기 돌출부들 각각의 하단 너비는 200 ㎛ 내지 400 ㎛일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 돌출부들 각각의 하단에서 상단으로 갈수록 너비가 감소할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세포 배양층의 나노섬유 밀도는 상기 격벽부의 나노섬유 밀도보다 조밀할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 격벽부는 배양 영역의 가장자리를 따라 단일폐곡선 형태로 배치될 수 있다.
본 발명의 일 목적을 위한 세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법은, 내부로 함입된 오목부에 의해 적어도 2개의 영역으로 구획된 몰드가 배치된 상태로 나노섬유를 전기방사하여, 상기 몰드의 표면을 커버하는 세포 배양층 및 상기 세포 배양층과 연결되어 상기 오목부에 배치되어 상기 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하고 상기 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함하는 세포 배양 나노섬유 구조체를 형성하는 단계와, 상기 몰드로부터 상기 세포 배양 나노섬유 구조체를 분리하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포 배양 나노섬유 구조체를 분리하는 단계 전에, 상기 몰드 상에 나노섬유가 방사된 상태에서 열처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 격벽부는 서로 이격된 2개의 돌출부들을 포함하는 이중 격벽 구조를 갖고, 2개의 돌출부들 사이에서 상기 세포 배양층의 표면에서 하부를 향해 함입된 함입부를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 몰드의 오목부의 너비는 1 mm 이상 2 mm 이하일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 위한 세포 분석 장치는 나노섬유로 형성된 세포 배양층과, 상기 세포 배양층의 표면으로부터 상부를 향해 돌출되어 상기 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하되, 상기 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함하는 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하고, 상기 세포 배양 나노섬유 구조체의 배양 영역들 각각에서 서로 다른 세포를 배양하여 상기 격벽부에 대한 물질 이동을 측정한다.
상기에서 설명한 본 발명의 세포 배양 나노섬유 구조체, 이의 제조 방법 및 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하는 세포 분석 장치에 따르면, 적어도 2 이상의 배양 영역을 포함하되, 격벽부가 배양층과 동일한 나노섬유로 이루어져 있어 물질 이동 채널인 격벽부를 통해 세포간 이동이나 세포에서 생성되는 분자가 확산될 수 있다. 상기 격벽부에 의한 2 이상의 배양 영역의 형성으로 인해, 본 발명의 세포 배양 나노섬유 구조체가 2개 이상의 배양 영역을 포함하는 세포 배양 챔버가 될 수 있다.
이러한 세포 배양 나노섬유 구조체는 세포 배양 및/또는 세포 이동의 측정과 분석을 위한 세포 분석 장치에 구비되어, 동시에 여러 종류의 세포들의 이동을 실시간으로 측정할 수 있다. 이에 따라, 실시간으로 세포 분석을 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 나노섬유 구조체를 설명하기 위한 사시도이다.
도 2는 도 1의 I-I'라인을 따라 절단한 단면도이다.
도 3은 도 2의 A 부분을 확대한 확대도이다.
도 4는 도 1 내지 도 3의 세포 배양 나노섬유 구조체를 구성하는 나노섬유를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면이다.
도 5 내지 도 7은 도 1 내지 도 4에서 설명한 세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 도면들이다.
도 8 및 도 9는 도 1과 다른 형태의 세포 배양 나노섬유 구조체를 설명하기 위한 도면들이다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 배양 나노섬유 구조체를 설명하기 위한 단면도이다.
도 11 내지 도 14는 세포 배양 샘플 1 내지 4의 사진들을 나타낸 도면들이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 나노섬유 구조체를 설명하기 위한 사시도이고, 도 2는 도 1의 I-I' 라인을 따라 절단한 단면도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)는 세포 배양층(110)과 격벽부(120)를 포함한다.
세포 배양층(110)은 나노섬유로 형성되고, 층상의 3차원적 매트릭스 구조를 가질 수 있다. 세포 배양층(110)은 나노섬유로 형성됨으로써 유효 표면적이 매우 크고 내구성이 높으며, 취급이 용이하고 다양한 형태로 제작이 가능한 장점이 있다. 또한, 세포 배양층(110)에 다양한 물질을 화학적으로 용이하게 결합시킬 수 있다.
*세포 배양층(110)을 구성하는 나노섬유는 합성 고분자, 생체 적합성 고분자 등 다양한 재료로 제조될 수 있다. 세포 배양층(110)을 구성하는 나노섬유를 형성하는 화합물의 예로서는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene-oxide), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycol acid, PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(polylactic-co-glycolic acid), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레익산)(polyhydroxybutyreic-co-hydoxyvaleleic acid), 폴리다이옥산온(polydioxanone),폴리[(락타이드)-(카프로락톤)] (polylactidecaprolacton), 폴리(에스테르우레탄)(polyesterurethan), 폴리[(L-락타이드)-(D-락타이드)](polylactide-lactide), 폴리[에틸렌-(비닐알코올)](polyethylenevinylalcohol), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리아닐린(polyaniline) 등을 들 수 있다. 이들은 각각 단독으로 또는 2 이상이 조합되어 이용될 수 있다. 2 이상의 조합은, 공중합체이거나 단순 혼합물 형태일 수 있다. 특히, 상기 나노섬유를 형성하는 화합물이 생체적합성 고분자인 경우, 세포가 통과할 수 있는 공극을 다수 개 포함하므로 세포의 부착 및 배양이 보다 더 용이한 장점이 있다.
한편, 상기 나노섬유를 형성하는 화합물은 수평균 분자량이 10,000 내지 1,000,000일 수 있다. 예를 들어, 상기 나노섬유를 형성하는 화합물의 수평균 분자량은 50,000 내지 500,000일 수 있다.
일례로, 나노섬유의 직경은 100 nm 내지 900 nm일 수 있고, 세포 배양층(110)은 나노섬유가 랜덤하게 집적되어 50 ㎛ 내지 70 ㎛의 두께(Th)를 갖는 단일 층상일 수 있다.
격벽부(120)는 세포 배양층(110)의 표면으로부터 상부를 향해 돌출되어 세포 배양층(110)을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획한다. 이때, 격벽부(120)는 세포 배양층(110)과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 된다. 배양 영역 각각에 세포가 배치된 경우, 세포들은 격벽부(120)를 통과하여 이동할 수 있다. 격벽부(120)에 의한 물질 이동 채널은 나노섬유의 불규칙한 집적과 나노섬유 그 자체가 가지고 있는 기공에 의해서 형성된다. 평면에서 볼 때, 격벽부(120)는 세포 배양층(110) 상에서 일 방향으로 연장되어 배양 영역을 구획하는데 일 방향으로 연장되어 길이를 갖고, 제1 너비(W1)를 갖는다.
이하에서는 도 3 및 도 4를 도 1 및 도 2와 함께 참조하여 격벽부(120)에 대해서 보다 구체적으로 설명한다.
도 3은 도 2의 A 부분을 확대한 확대도이다.
도 3을 도 1 및 도 2와 함께 참조하면, 격벽부(120)의 높이(H)가 세포 배양층(110)의 표면에서부터 격벽부(120)의 최고점까지의 거리로 정의되고, 격벽부(120)의 하단이 세포 배양층(110)과 연결되고 상기 최고점은 격벽부(120)의 상단에 포함된다. 격벽부(120)의 높이(H)와 세포 배양층(110)의 두께(Th)의 비율은 1:1.2 내지 1:1.5일 수 있다. 바람직하게는, 격벽부(120)의 높이(H)와 세포 배양층(110)의 두께(Th)의 비율이 1:1인 경우, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)가 구조적으로 안정한 형태가 되고 배양 영역에서 각각 안정적으로 세포들이 배양될 수 있다. 예를 들어, 격벽부(120)의 높이(H)는 50 ㎛ 내지 70 ㎛일 수 있다.
격벽부(120)의 제1 너비(W1)는 격벽부(120)의 하단 너비로 정의되고, 격벽부(120)의 하단에서 상단으로 갈수록 격벽부(120)의 너비가 점차 감소할 수 있다. 특히, 격벽부(120)의 상단은 첨부(apex portion)가 라운드진 형상을 가질 수 있다. 이때, 격벽부(120)의 높이(H)는 세포 배양층(110)의 두께(Th)와 실질적으로 동일하거나 세포 배양층(110)의 두께(Th)보다 얇을 수 있다.
격벽부(120)를 중심으로 일측의 세포 배양층(110) 상에는 제1 세포(녹색으로 도시)를 부착하여 배양하고, 타측의 세포 배양층(110) 상에는 상기 제1 세포와 다른 종의 제2 세포(적색으로 도시)를 부착하여 배양할 수 있다. 이때, 각각의 배양 영역에는 서로 다른 종류의 형광 염색제가 주입될 수 있다.
일례로, 상기 제1 세포는 질환 세포 또는 세균 등일 수 있고, 상기 제2 세포는 면역 세포일 수 있다. 상기 제1 및 제2 세포를 1개의 세포 배양 나노섬유 구조체에서 동시에 배양함으로써 면역 세포의 이동 및 활성과, 질환 세포의 손상, 사멸, 증식 정도 등을 직접 측정할 수 있다. 각각의 배양 영역의 형광 염색제의 컬러에 의해서 세포 이동을 형광 현미경으로 용이하게 관찰할 수 있다.
이때, 상기 면역 세포는 호중구, 대식세포, 수지상세포, NK세포, T세포, B세포 등을 포함할 수 있다. 상기 면역 세포는 인간 또는 마우스 유래 세포일 수 있으며, 구체적으로는 인간 혈액으로부터 분리하거나 마우스 골수로부터 분리된 골수세포를 면역세포 배양용 배지에서 면역세포로 분화시켜 수득할 수 있다.
상기 질환 세포는 질환이 유도된 세포로서, 암세포일 수 있다. 암세포의 예로서는, 간암세포, 대장암세포, 위암세포, 폐암세포, 자궁암세포, 유방암세포, 갑상선암세포, 췌장암세포 등을 들 수 있다. 또는, 상기 질환 세포가 대장균, 포도상구균, 살모넬라균, 이질균, 결핵균, 헬리코박터 파일로리균, 효모균, 황색점액균 또는 파상풍균일 수 있다.
도 4는 도 1 내지 도 3의 세포 배양 나노섬유 구조체를 구성하는 나노섬유를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면이다.
도 4를 도 1 내지 도 3과 함께 참조하면, 세포 배양층(110) 및 격벽부(120) 각각은 도 4에 도시된 전자현미경 사진과 같이 나노섬유들이 불규칙하게 얽혀 있는 구조를 갖는 매트릭스를 포함한다. 왼쪽 사진은 100 ㎛ 스케일이고, 오른쪽 사진은 50 ㎛ 스케일이다.
나노섬유들이 집적되어 있는 상태를 나타내는 "밀도"에 있어서, 세포 배양층(110)의 밀도가 격벽부(120)의 밀도보다 조밀하다. 즉, 격벽부(120)의 밀도는 세포 배양층(110)의 밀도보다 낮아, 물질 이동 통로가 더 넓게 되고 이에 따라 동일한 물질이라도 세포 배양층(120)에 비해서 격벽부(120)가 물질 이동 채널로서 물질이 이동할 수 있다. 이러한 밀도 차이는, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)를 몰드(200, 도 5 및 도 6 참조)를 이용하여 나노섬유를 전기방사 하여 형성함으로써 구현할 수 있다.
이하에서는, 도 5 내지 도 7을 참조하여 도 1 내지 도 4에서 설명한 세포 배양 나노섬유 구조체(100)의 제조 방법에 대해서 구체적으로 설명하기로 한다.
도 5 내지 도 7은 도 1 내지 도 4에서 설명한 세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법을 설명하기 위한 도면들이다.
먼저, 도 5를 참조하면, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)는 전기방사 장치를 이용하여 제조한다. 전기방사 장치는 고분자 용액(polymer solution)을 수용하는 실린지(syringe)가 니들(needle)을 통해서 고분자 용액을 분사하되 실린지와 집적판(collector) 사이에 전기장을 걸어 전기방사(electrospinning jet)를 수행함으로써 집적판 상에 나노섬유를 집적시킬 수 있다. 이때, 집적판 상에는 몰드(200)가 배치된 상태에서 전기방사가 수행된다.
몰드(200)는 제조하고자 하는 세포 배양 나노섬유 구조체(100)의 형상과 역상 형상을 갖는 것으로서, 몰드(200)의 표면으로부터 내부로 함입된 오목부(210)를 포함한다. 오목부(210)에 의해서, 오목부(210)보다 상대적으로 돌출된 부분이 볼록부로 정의된다. 오목부(210)가 세포 배양 나노섬유 구조체(100)의 격벽부(120)를 형성하는 부분이고, 몰드(200)의 표면을 전체적으로 커버하는 세포 배양층(110)이 격벽부(120)와 연결되어 형성될 수 있다. 오목부(210)의 너비(SP)는 격벽부(120)의 하단 너비(W1)와 실질적으로 동일할 수 있다. 오목부(210)의 너비(SP)가 100 ㎛ 이상 1 mm 미만인 경우에 도 1 내지 도 4에서 설명한 세포 배양 나노섬유 구조체(100)가 형성될 수 있다.
몰드(200)는 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아, 유리(glass) 등으로 형성될 수 있다. 몰드(200)는 일반적인 습식 및/또는 건식식각 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼로도 제조할 수 있다. 뿐만 아니라, 알루미늄 박막과 알루미늄 테이프를 이용하여 요철 패턴을 갖는 몰드(200)의 제조가 가능하다. 몰드(200)가 도전성 재료로 형성되는 경우, 별도의 집적판을 이용하지 않고, 몰드(200)와 실린지 사이에 전기장을 걸어 전기방사 공정을 수행할 수 있다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 몰드(200)를 집적판 상에 배치한 상태에서 전기 방사 공정을 수행한다. 전기 방사 공정에서의 고분자 용액의 농도, 전압, 방사 거리 등을 조절하여 나노섬유의 직경, 기공의 크기, 집적 밀도 등을 조절할 수 있다.
도 7을 참조하면, 전기 방사 공정을 통해서 몰드(200)의 오목부(210)에 나노섬유가 집적되고 몰드(200)의 표면에도 나노섬유가 집적된다. 오목부(210)에 대응하여 격벽부(120)가 형성되고 몰드(200)를 전체적으로 커버하는 층상 구조의 세포 배양층(110)이 형성된다. 이때, 격벽부(120)의 하단 너비(W1)는 오목부(210)의 너비(SP)와 실질적으로 동일할 수 있다. 다만, 오목부(210)의 내부에 배치되는 격벽부(120)의 상단은 하단보다 좁게 형성되어 오목부(210)를 완전히 채우지 않은 상태로 형성될 수 있다. 또한, 전기방사에 의해서 몰드(200)의 표면에 집적된 나노섬유의 밀도가 오목부(210)의 내부에 집적되는 나노섬유의 밀도보다 조밀하게 형성된다.
전기 방사 공정 후에, 몰드(200)와 나노섬유 구조체(100)가 결합된 상태에서 열처리하고, 열처리 공정 후에 나노섬유 구조체(100)를 몰드(200)로부터 분리시킴으로써 도 1 내지 도 4에서 설명한 나노섬유 구조체(100)를 제조할 수 있다. 열처리 공정은 50℃ 내지 70℃에서 수행될 수 있다.
한편, 도 1 내지 도 7에서 도시하지 않았으나, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)는 지지체로서 베이스 기재 상에 배치될 수 있다. 이때, 베이스 기재와 세포 배양층(110) 사이에 고분자 코팅층이 배치될 수 있다. 상기 고분자 코팅층은 세포 배양 나노섬유 구조체(100)와 상기 베이스 기재 사이의 부착력을 증가시킬 수 있다. 상기 고분자 코팅층을 형성하는 물질의 예로서는, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스, 실리콘 고무 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 고분자 코팅층은 상기 베이스 기재 상에 스핀 코팅법으로 코팅될 수 있으며, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)를 구성하는 나노섬유와 실질적으로 동일한 물질로 형성될 수도 있으나, 상기 고분자 코팅층은 상기 베이스 기재 상에 균일하게 형성되는 박막이고 세포 배양층(110)과 격벽부(120)는 나노섬유가 매트릭스를 이루고 있는 구조를 갖는다.
도 8 및 도 9는 도 1과 다른 형태의 세포 배양 나노섬유 구조체를 설명하기 위한 도면들이다.
도 8 및 도 9에서는 적어도 3개 이상의 배양 영역을 포함하는 세포 배양 나노섬유 구조체를 나타낸 것으로, 도 8의 (a), (b) 및 (c)에서와 같이 격벽부를 일 방향 또는 서로 다른 2개의 방향으로 연장되도록 디자인하여 복수개의 배양 영역을 포함하는 세포 배양 나노섬유 구조체를 형성할 수 있다. 이러한 복수개의 배양 영역을 갖는 세포 배양 나노섬유 구조체는 세포 분석 장치에 구비되어, 동시에 여러 종의 세포들의 이동을 관찰할 수 있고, 같은 종이라도 동시에 많은 실험을 수행할 수 있다.
도 9를 참조하면, 격벽부는 배양 영역의 가장자리를 따라 단일폐곡선 형태로 배치되어 배양 영역을 구획할 수 있다. 도 9의 (a) 및 (b)는 4개의 배양 영역을 포함하는 배양 챔버인 구조체를 도시한 것으로, 배양 영역들 각각의 가장자리를 따라 단일 폐곡선 형태로 배치된다. 도 9의 (b)와 같이 모든 부분에서 격벽부의 너비를 일정하게 형성할 수 있고, (a)와 같이 격벽부가 교차하는 중앙부에서는 다른 부분들에 비해서 상대적으로 넓은 너비로 형성할 수도 있다. 도 9에서는 4개의 배양 영역으로 구획된 구조체를 도시하였으나, 격벽부(120)의 디자인을 조절하여 적어도 2개 이상의 배양 영역을 갖는 나노섬유 구조체를 다양하게 디자인할 수 있다.
도 8 및 도 9에 도시된 세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법 또한 도 5 내지 도 7에서 설명한 것과 실질적으로 동일하므로, 중복되는 구체적인 설명은 생략한다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 배양 나노섬유 구조체를 설명하기 위한 단면도이다.
도 10에 도시된 세포 배양 나노섬유 구조체는 격벽부의 구조를 제외하고는 도 1 내지 도 4에서 설명한 것과 실질적으로 동일하다. 따라서, 중복되는 상세한 설명은 생략하고 차이점이 있는 부분에 대해서 설명한다.
도 10을 도 1과 함께 참조하면, 격벽부(120)는 서로 이격된 2개의 돌출부들(122, 124)과 그들 사이의 함입부를 포함한다. 2개의 돌출부들(122, 124) 각각은 세포 배양층(112)의 표면으로부터 돌출되고, 상기 함입부는 세포 배양층(112)의 표면으로부터 내부를 향해서 함입된다. 상기 함입부에 의해서 2개의 돌출부들, 즉 제1 돌출부(122)와 제2 돌출부(124)가 형성된다. 제1 및 제2 돌출부들(122, 124) 각각도 도 3에서 설명한 것과 같이 하단 너비(Ws1, Ws2)가 상단 너비보다 넓게 형성되어 하단에서 상단으로 갈수록 너비가 점차 감소하는 구조를 갖는다. 제1 및 제2 돌출부들(122, 124) 각각의 하단 너비(Ws1, Ws2)는 200 ㎛ 내지 400 ㎛일 수 있고, 상기 함입부의 너비이자, 제1 및 제2 돌출부들(122, 124) 사이의 이격 거리(SG)는 300 ㎛ 내지 500 ㎛일 수 있다. 제1 및 제2 돌출부들(122, 124) 각각의 하단 너비(Ws1, Ws2)와 이격 거리(SG)의 합인 격벽부(120)의 하단 너비(W2)는 1 mm 이상일 수 있다. 예를 들어, 2개의 돌출부들(122, 124)을 포함하는 격벽부(120)의 하단 너비(W2)는 1 mm 이상 2 mm 이하일 수 있다.
2개의 돌출부들(122, 124)이 배양 영역들을 구획하는 실질적인 격벽이 되지만, 이들 사이에 배치되는 함입부에 이동되는 세포가 축적될 수 있어 세포의 이동을 보다 정확하게 확인할 수 있는 장점이 있다. 즉, 일 배양 영역에 배치된 세포가 제1 돌출부(122)를 통과하여 상기 함입부에 배치될 수 있어, 상기 함입부에 축적되는 세포 수를 측정하여 세포의 이동도 등을 분석할 수 있다.
격벽부(120)가 2개의 돌출부들(122, 124) 및 상기 함입부를 갖는 구조는 도 5 내지 도 7에서 설명한 전기방사를 이용한 제조 공정 중에서 몰드(200)의 오목부(210)의 너비(SP)를 1 mm 이상으로 조절함으로써 형성할 수 있다. 오목부(210)의 너비(SP)가 1 mm 이상이 되는 경우, 전기방사 공정에서 나노섬유가 오목부(210) 내에 전체적으로 집적되지 않고 오목부(210)의 가장자리에 우선적으로 집적되어 오목부(210) 내에서도 나노섬유 밀도 차이가 발생하게 되고, 몰드(200)와 나노섬유 구조체를 분리함에 따라서 2개의 돌출부들(122, 124) 및 상기 함입부를 갖는 이중 격벽 구조의 격벽부(120)가 형성될 수 있다. 격벽부(120)의 너비가 2 mm 초과인 경우에는 세포의 이동을 관찰하기가 상대적으로 용이하지 않으므로, 격벽부(120)의 너비는 1 mm 이상 2 mm 이하인 것이 바람직하다.
상기에서 설명한 바에 따르면, 세포 배양 나노섬유 구조체(100)가 적어도 2 이상의 배양 영역을 포함하되, 격벽부(120)가 세포 배양층(110)과 동일한 나노섬유로 이루어져 있어 물질 이동 채널인 격벽부(120)를 통해 세포간 이동이나 세포에서 생성되는 분자가 확산될 수 있다. 격벽부(120)에 의한 2 이상의 배양 영역의 형성으로 인해, 본 발명의 세포 배양 나노섬유 구조체(100)가 2개 이상의 배양 영역을 포함하여 동시에 2종 이상의 세포를 배양할 수 있는 세포 배양 챔버가 될 수 있다. 이러한 세포 배양 나노섬유 구조체(100)는 세포 배양 및/또는 세포 이동의 측정과 분석을 위한 세포 분석 장치에 구비되어, 동시에 여러 종류의 세포들의 이동을 실시간으로 측정할 수 있다. 이에 따라, 실시간으로 세포 분석을 수행할 수 있다.
이하에서는, 구체적인 예들을 통해서 본 발명에 대해서 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 하기의 예들은 본 발명의 실시예들을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예: 세포 배양 나노섬유 구조체의 제조
(1) 몰드의 준비
알루미늄 박판을 준비하고, 알루미늄 테이프를 정방형으로 절단한 후 상기 알루미늄 박막 상에 서로 이격시켜 매트릭스 형태로 부착하였다. 이에 따라, 알루미늄 테이프가 부착된 부분이 볼록부가 되고 알루미늄 테이프들 사이의 이격된 부분이 오목부가 되는 도 5 및 도 6에서 설명한 몰드(200)와 실질적으로 동일한 구조를 갖는 몰드를 준비하였다. 이때, 오목부의 너비는 1 mm이었다.
(2) 전기방사
상기에서 준비된 몰드를, 전기방사장치의 집적판 상에 배치한 상태에서 상기 몰드를 향해 나노섬유를 전기방사 하였다. 방사거리는 10 cm이고, 전압은 10 내지 15 kV를 이용하였다. 이때, 전기방사는 상기 몰드 상에 나노섬유가 균일한 두께로 방사될 수 있도록 2축의 스테이지를 이동하며 수행하였으며, 나노섬유로서는 폴리카프로락톤(PLC)을 이용하였고, 나노섬유의 평균 직경은 500 nm이었다.
(3) 열처리 및 분리
나노섬유를 전기방사한 후, 나노섬유가 상기 몰드 상에 집적된 상태에서 약 60℃의 온도에서 약 5초간 열처리하였다. 열처리된 세포 배양 나노섬유 구조체를 상기 몰드로부터 분리하였다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 나노섬유 구조체를 제조하였다. 제조된 세포 배양 나노섬유 구조체의 세포 배양층의 두께는 약 50 ㎛이었고, 격벽부는 이중 격벽 구조로 형성되었다. 이중 격벽 구조에서, 2개의 돌출부들 각각의 높이는 약 50 ㎛이었으며 각각의 너비는 300 ㎛이며, 돌출부들 사이의 이격 거리는 400 ㎛이었다(도 10 및 도 11 참조).
세포 배양 샘플 1
골수로부터 granulocyte macrophage-colony stimulating factor(GM-CSF)와 interleukin-4(IL-4)로 분화시켜 얻은 수지상세포를 10 ㎕의 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 10,000개의 세포를 섞은 후 상기와 같이 준비된 세포 배양 나노섬유 구조체의 배양 영역에 배치시킨 후, 4시간 동안 방치하였다. 그 결과를 도 11에 나타낸다.
도 11은 세포 배양 샘플 1의 전자현미경 사진으로서, 이를 참조하면 격벽부의 일측, 즉 세포 배양층을 구성하는 나노섬유에 수지상 세포들이 부착된 것을 확인할 수 있다.
세포 배양 샘플 2
대장암 세포주인 CT-26 세포와 세포 배양 샘플 1의 제조에서 이용한 수지상세포를 각각 PKH67(녹색 형광)과 PKH26(적색 형광)으로 염색한 후 10 μl의 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 10,000개의 세포를 섞은 후, 상기와 같이 준비된 세포 배양 나노섬유 구조체의 배양 영역에 배치시킨 후, 4시간 동안 방치하였다. 형광 현미경으로 촬영하여 그 결과를 도 12의 A에 나타낸다.
동시에, 상기와 같이 준비된 세포 배양 나노섬유 구조체의 배양 영역에 대장암 세포를 적색 형광 및 청색 형광으로 염색하고 녹색 형광으로 염색된 수지상 세포와 함께 배치시킨 후, 4시간 동안 방치하였다. 형광 현미경으로 촬영하여 그 결과를 도 12의 A에 나타낸다.
도 12에서 A의 왼쪽 사진은 녹색/적색 형광을 나타내고, A의 오른쪽 사진은 녹색/청색/적색 형광을 나타낸다. 이들 사진을 통해서 세포 배양 나노섬유 구조체에 대장암 세포와 수지상 세포가 안정적으로 배양됨을 알 수 있다.
세포 배양 샘플 3
수지상 세포로서, 마우스로부터 골수 세포를 분리한 후 수지상 세포로 분화 유도하여 이용한 것을 제외하고는 세포 배양 샘플 2의 제조와 실질적으로 동일한 방법으로 세포 배양 샘플 3을 준비하였다. 수지상 세포는 다음과 같이 준비하였다.
5~6 주령의 Balb/c 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수 세포를 분리하였다. 분리된 골수 세포 (1×106cells/ml)는 10 % 소 태아 혈청과 100 U/ml 페니실린 그리고 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 들어있는 RPMI-1640 배지에서 10 %의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기로 배양하였으며, 수지상세포로 분화유도를 위하여 15 ng/ml 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)와 15 ng/ml의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다. 분화된 수지상세포는 특이적 단백질 표면 인자인 CD11c 및 major histocompatibility complex(MHC)-Ⅱ를 이용하여 구분하고, CD11c 마이크로비드를 이용하여 분리하였다. 형광 현미경으로 촬영하여 그 결과를 도 12의 B에 나타낸다.
도 12의 B은 10배, 20배 및 50배의 배율로 촬영한 형광 현미경 사진을 나타내고, 이를 참조하여 녹색 형광으로 염색된 수지상 세포와 청색 및 적색 형광으로 염색된 대장암 세포가 각각 배양 영역에서 안정적으로 배양됨을 알 수 있다.
세포 배양 샘플 4
면역 세포로서 마우스로부터 호중구를 분리하여 이용하고, 질환 세포로서 포도상 구균을 이용하여 세포 배양 샘플 4를 준비하였다. 수지상 세포 및 포도상 구균 각각은 다음과 같은 방법으로 수득하였다.
5~6 주령의 Balb/c 마우스의 복강에 3% Thioglycollate 용액 3 ml을 26G 주사바늘을 사용하여 주사하였다. 6시간 후에 마우스를 경추탈골을 하여 피부를 벗겨낸 후에 복막을 가위로 잘라 파스퇴르 피펫을 이용하여 복강 내의 용액을 수거하였다. 적혈구 용해액을 마리당 2 ml 씩 첨가하여 섞어준 뒤 2분간 반응시킨 후 수거한 용액을 1700 rpm에 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후 나온 세포는 500 ㎕의 EDTA-BSS 용액에 10 ㎕의 Ly6-G biotin 항체를 처리하여 20분간 4℃에서 반응시켰다. EDTA-BSS 용액을 첨가하여 원심분리하고, 다시 500 ㎕의 EDTA-BSS 용액에 10 ㎕의 biotin에 대한 항체가 결합된 마이크로비드를 처리하여 20분간 4℃에서 반응시켰다. 마이크로비드가 결합된 호중구세포는 MACS의 MS coloum을 사용하여 분리하였다.
포도상구균인 Staphylococcus aureus는 LB 배지에서 배양하여 증식시켰다.
호중구와 포도상구균은 각각 PKH67과 PKH26로 형광 염색하였고, 나노섬유 구조체에 부착시킨 전자 현미경 사진을 도 13에 나타내고, 12시간동안 방치한 후의 형광 현미경 사진을 도 14에 나타낸다.
도 13에서 A는 호중구가 부착된 사진이고, B는 포도상구균이 부착된 사진이다. 도 13을 참조하면, 면역세포와 질환세포 각각이 배양 영역의 나노섬유에 안정적으로 부착되어 있는 것을 확인할 수 있다.
도 14에서 (a)는 A, B 및 C 배양 영역을 포함하는 나노섬유 구조체에서 A에는 호중구가, B 및 C에는 포도상구균이 부착된 상태를 나타내며, (a)의 우측 하단 그림에서 A와 C 사이의 영역이 region 1로, A와 B 사이의 영역이 region 2로 정의된 것을 알 수 있다. 이때, (b)의 상부 2개의 사진들은 region 1 및 2 각각을 나타내며 하부 2개의 사진들은 12시간이 경과한 후의 사진을 나타낸다.
도 14의 (b)를 참조하면, 12시간이 경과한 후에 호중구가 2개의 배양 영역들 사이에 배치된 격벽부로 이동하는 것을 확인할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 나노섬유 구조체를 이용하여 시간에 따라 형광 현미경을 통해서 세포의 이동을 관찰할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
[부호의 설명]
100: 세포 배양 나노섬유 구조체
110: 세포 배양층
120: 격벽부
200: 몰드
210: 오목부
122, 124: 제1, 제2 돌출부

Claims (14)

  1. 나노섬유로 형성된 세포 배양층; 및
    상기 세포 배양층의 표면으로부터 상부를 향해 돌출되어 상기 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하되, 상기 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 격벽부의 하단이 상기 세포 배양층과 연결되고,
    상기 격벽부의 하단에서 상단으로 갈수록 너비가 감소하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 격벽부의 하단 너비는 100 ㎛ 이상 1 mm 미만인 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 격벽부는 서로 이격된 2개의 돌출부들을 포함하는 이중 격벽 구조를 갖는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 격벽부는
    2개의 돌출부들 사이에서 상기 세포 배양층의 표면에서 하부를 향해 함입된 함입부를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  6. 제4항에 있어서,
    2개의 돌출부들 사이의 이격 거리는 300 ㎛ 내지 500 ㎛이고,
    상기 돌출부들 각각의 하단 너비는 200 ㎛ 내지 400 ㎛인 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 돌출부들 각각의 하단에서 상단으로 갈수록 너비가 감소하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양층의 나노섬유 밀도는 상기 격벽부의 나노섬유 밀도보다 조밀한 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 격벽부는 배양 영역의 가장자리를 따라 단일폐곡선 형태로 배치되는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체.
  10. 내부로 함입된 오목부에 의해 적어도 2개의 영역으로 구획된 몰드가 배치된 상태로 나노섬유를 전기방사하여, 상기 몰드의 표면을 커버하는 세포 배양층 및 상기 세포 배양층과 연결되어 상기 오목부에 배치되어 상기 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하고 상기 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함하는 세포 배양 나노섬유 구조체를 형성하는 단계; 및
    상기 몰드로부터 상기 세포 배양 나노섬유 구조체를 분리하는 단계를 포함하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포 배양 나노섬유 구조체를 분리하는 단계 전에, 상기 몰드 상에 나노섬유가 방사된 상태에서 열처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 격벽부는 서로 이격된 2개의 돌출부들을 포함하는 이중 격벽 구조를 갖고, 2개의 돌출부들 사이에서 상기 세포 배양층의 표면에서 하부를 향해 함입된 함입부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 몰드의 오목부의 너비는 1 mm 이상 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는,
    세포 배양 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  14. 나노섬유로 형성된 세포 배양층과, 상기 세포 배양층의 표면으로부터 상부를 향해 돌출되어 상기 세포 배양층을 적어도 2 이상의 배양 영역으로 구획하되, 상기 세포 배양층과 동일한 나노섬유로 형성되어 물질 이동 채널이 되는 격벽부를 포함하는 세포 배양 나노섬유 구조체를 포함하고,
    상기 세포 배양 나노섬유 구조체의 배양 영역들 각각에서 서로 다른 세포를 배양하여 상기 격벽부에 대한 물질 이동을 측정하는 것을 특징으로 하는,
    세포 분석 장치.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810895B (zh) * 2019-02-27 2021-12-03 西北工业大学 基于等高微柱的开放式三维细胞培养芯片及其制备技术
WO2023043660A1 (en) * 2021-09-15 2023-03-23 Corning Incorporated Polystyrene coated cell culture substrates, fixed bed bioreactors, and related methods

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100753116B1 (ko) * 2004-12-22 2007-08-29 경북대학교 산학협력단 세포 배양용 나노섬유 지지체
KR20100000289A (ko) * 2008-06-24 2010-01-06 한국기계연구원 나노섬유사 형태의 세포배양지지체 및 그 제조방법
KR20120097948A (ko) * 2011-02-28 2012-09-05 금오공과대학교 산학협력단 생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법
KR101446687B1 (ko) * 2014-02-10 2014-10-06 동아대학교 산학협력단 나노섬유기반 세포배양 나노구조체 및 이를 포함하는 에세이 칩
KR101484996B1 (ko) * 2014-07-07 2015-01-21 경북대학교 산학협력단 나노섬유가 충진된 미세채널부를 구비하는 미세채널 바이오칩 및 이의 제조방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7579077B2 (en) * 2003-05-05 2009-08-25 Nanosys, Inc. Nanofiber surfaces for use in enhanced surface area applications
JP2008519598A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 細胞培養デバイス
KR100953366B1 (ko) 2007-12-28 2010-04-20 한양대학교 산학협력단 조직재생용 나노섬유 지지체 및 이의 제조방법
KR100968231B1 (ko) 2007-12-28 2010-07-06 한양대학교 산학협력단 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법
KR101407605B1 (ko) * 2011-11-24 2014-06-16 포항공과대학교 산학협력단 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기와 그 제조 방법
KR101468001B1 (ko) * 2014-05-21 2014-12-02 경북대학교 산학협력단 삼차원 다공성 나노섬유구조체를 포함한 미소유체 기반 조직칩 및 그 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100753116B1 (ko) * 2004-12-22 2007-08-29 경북대학교 산학협력단 세포 배양용 나노섬유 지지체
KR20100000289A (ko) * 2008-06-24 2010-01-06 한국기계연구원 나노섬유사 형태의 세포배양지지체 및 그 제조방법
KR20120097948A (ko) * 2011-02-28 2012-09-05 금오공과대학교 산학협력단 생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법
KR101446687B1 (ko) * 2014-02-10 2014-10-06 동아대학교 산학협력단 나노섬유기반 세포배양 나노구조체 및 이를 포함하는 에세이 칩
KR101484996B1 (ko) * 2014-07-07 2015-01-21 경북대학교 산학협력단 나노섬유가 충진된 미세채널부를 구비하는 미세채널 바이오칩 및 이의 제조방법

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