WO2015065005A1

WO2015065005A1 - 다공성 구조체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: WO2015065005A1
Application number: PCT/KR2014/010171
Authority: WO
Inventors: 김상경; 최낙원; 이동진; 정승원
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2014-10-28
Publication date: 2015-05-07
Also published as: EP3064568B1; EP3064568A4; US20160265028A1; KR101670232B1; KR20150048964A; US10648024B2; CN105992815A; EP3064568A1

Abstract

본 발명에 따른 다공성 구조체는 기공의 내부에 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머가 존재하므로, 일반적인 구조체의 경우 표면만이 증폭 및 검출에 사용되는 것과 달리 구조체의 내부까지 이용할 수 있어 반응성을 극대화시킬 수 있다. 또한, 각 구조체 내에 포함된 프라이머의 종류를 달리함으로써 동시에 여러 종류의 표적핵산을 검출하고 이를 동시에 실시간으로 분석할 수 있어, 실시간 다중 핵산 증폭 (multiplex real-time PCR) 에 유용하다.

Description

다공성 구조체 및 이의 제조방법

본 명세서에 기재된 내용은 프라이머를 포함하는 다공성 구조체, 이의 제조방법 및 이를 사용하는 실시간 다중 핵산 증폭방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR) 방법은 핵산의 염기서열을 복제하여 증폭시키는 기술로서, 그 종류에는 endpoint PCR과 real-time PCR이 있다. 종래에는 endpoint PCR을 많이 사용하였으나 이 방법은 PCR 반응이 완전히 완료된 이후에 증폭된 핵산의 양을 검출하거나 정량할 수 있어, 실험 이후 전기영동과 같은 별도의 결과분석단계와 장치가 필요하고, 2시간의 이상의 긴 시간이 요구되며, 실시간으로 증폭되는 핵산을 검출하고 정량할 수 없다는 문제가 있었다. 예를 들면 최초의 핵산의 양을 정량하려면 반응이 완료된 PCR 산물의 양으로부터 정량해야 하는데, 형광염색 등을 통해 정량을 하더라도 이러한 방법은 분석에 영향을 미치는 여러 인자들로 인해 정확한 분석이 어렵다. 정확한 핵산의 양을 측정하려면 지수기(exponential phase)에서 측정해야 하지만, endpoint PCR로는 실시간으로 측정할 수가 없으므로 이를 분석하기가 어렵다는 문제가 있다.

이에 반해 real-time PCR은 증폭되는 핵산의 양이 각 사이클에서 측정되고, 특히 증폭이 일어나는 구간인 지수기(exponential phase)에서의 반응을 모니터로 실시간으로 확인할 수 있으므로 표적핵산의 최초의 양을 정확하게 정량할 수 있다는 장점이 있다. 특히 실시간 다중 핵산 증폭방법(Multiplex real-time PCR)는 다양한 바이오 마커들을 한 챔버(chamber) 내에서 한번의 실험으로 확인이 가능하고 실시간으로 정량적 분석이 가능하므로, 질병의 진단분야에서 많이 쓰이고 있다.

그러나 실시간 다중 핵산 증폭을 위해 가장 보편적으로 사용되는 방법인 프로브(probe)의 색과 프라이머(primer)의 녹는점을 이용하는 방법은 측정하고자 하는 표적(target)의 개수가 늘어날 경우 서로간의 간섭이 커서 정확한 측정이 힘들다. 따라서, 현장현시검사(Point-of-care technology, POCT)와 같이 서로 다른 여러 종류의 핵산을 동시에 신속하게 분석하여 질병의 정확한 진단을 요하는 분야에는 사용하기는 어렵다는 문제가 있다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

(특허문헌 1) 대한민국 등록특허공보 제10-0794699호

(특허문헌 2) 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0103548호

본 발명은 실시간 다중 핵산 증폭 (Multiplex real-time PCR)을 위한 구조체로서, 다공성 구조체와 이의 제조방법, 그리고 상기 구조체를 사용하여 여러 종류의 핵산을 동시에 실시간으로 정확하게 분석할 수 있는 실시간 다중 핵산 증폭 방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 기공을 포함하는 다공성 구조체로서,

기공 내부에 고정된 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향 이상의 프라이머를 포함하는 다공성 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 다공성 구조체를 제조하는 방법으로서,

프레폴리머(pre-polymer), 기공유도중합체 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향 이상의 프라이머를 포함하는 구조체 형성 용액을 제조하는 단계;

직교하는 구간을 포함하는 두 개의 채널을 포함하는 마이크로 채널의 한 채널에 오일을 통과시키고 다른 한 채널에 상기 제조된 구조체 형성 용액을 통과시켜, 상기 직교하는 구간에서 상기 구조체 형성 용액을 오일 상에 분산시켜 액적(droplet) 형태의 구조체를 형성하는 단계;

상기 형성된 구조체를 고형화시키는 단계;및

상기 고형화된 구조체에서 기공유도중합체를 제거하여 구조체 내에 기공을 형성하는 단계;

를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 실시예는 다공성 구조체를 제조하는 방법으로서,

어레이(array)에 상기 제조된 구조체 형성 용액을 떨어뜨려 액적(droplet)형태의 구조체를 형성하는 단계;

상기 구조체를 고형화시키는 단계;및

를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예로서 하나 이상의 상기 다공성 구조체; 및

상기 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well) 형태로 표면이 패터닝된 어레이(array);

를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치를 제공한다.

그리고 본 발명은 일 실시예로서 실시간 다중 핵산 증폭 방법으로서,

하나 이상의 상기 다공성 구조체를 웰(well) 형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)를 포함하는 챔버에 주입하여 상기 다공성 구조체를 상기 어레이에 배열하는 단계;

하나 이상의 표적(target) 핵산을 포함하는 용액을 상기 챔버에 주입하여 상기 다공성 구조체 기공 내로 유입시키는 단계; 및

상기 표적 핵산을 중합효소 연쇄반응(PCR) 시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계;를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다공성 구조체는 기공의 내부에 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머가 존재하므로, 일반적인 구조체의 경우 표면만이 증폭 및 검출에 사용되는 것과 달리 구조체의 내부까지 이용할 수 있어 반응성을 극대화시킬 수 있다.

또한, 각 구조체 내에 포함된 프라이머의 종류를 달리함으로써 동시에 여러 종류의 표적핵산을 검출하고 이를 동시에 실시간으로 분석할 수 있어, 실시간 다중 핵산 증폭 (multiplex real-time PCR) 에 사용되며, 현장현시검사(Point-of-care technology, POCT)와 같이 서로 다른 여러 종류의 핵산을 동시에 신속하게 분석하여 질병의 정확한 진단을 요하는 분야에 유용하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체의 내부구조를 나타낸 것으로, 왼쪽의 구체는 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체의 개략도이다. 구체적으로, 오른쪽 4개의 박스 중 왼쪽 상단은 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향의 프라이머(primer, 붉은색)가 고정된 모습을 나타낸 것이고, 오른쪽 상단은 이 프라이머와 결합된 표적 핵산의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 일어나는 형상, 왼쪽 하단은 전방향과 역방향 중 한 방향의 프라이머가 고정되어 있되, 이 프라이머가 링커(linker, 짙은 파란색)로 고정되어 있는 형상, 오른쪽 하단은 전방향 프라이머(forward primer, 붉은색) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 옅은 파란색)가 모두 링커로 고정되어 있는 형상을 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 다공성 구조체를 제조하는 방법(왼쪽 상단), 상기 방법으로 제조된 서로 다른 종류의 표적을 갖는 다공성 구조체를 어레이에 배열한 다음(오른쪽 상단) 핵산을 증폭시키면서 실시간으로 이를 검출(오른쪽 하단) 및 분석(왼쪽 하단)하는 것을 나타낸 모식도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 다공성 구조체를 제조하는 방법을 나타낸 모식도로서, 구체적으로 다공성 구조체를 형성하는 용액을 어레이에 떨어뜨려 액적(droplet) 형태로 제조하는 단계; 액적 형태로 제조된 서로 다른 종류의 표적을 갖는 다공성 구조체를 경화하고 기공유도중합체(porogen)을 제거하는 단계; 및 핵산을 증폭시켜서 실시간으로 이를 동시에 검출하는 단계를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 따라 마이크로 채널을 사용하여 액적 형태의 구조체를 제조하는 과정을 나타낸 모식도(a) 및 이를 실제로 촬영한 사진(b)을 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 따라 어레이에 구조체 형성 용액을 떨어뜨려 액적 형태의 구조체를 제조하는 방법을 나타낸 모식도로서, 이때 구조체들의 다양한 색깔은 각 구조체 내에 서로 다른 종류의 프라이머가 포함되어 있음을 의미한다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 사용되는 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)를 포함하는 챔버를 도시한 것이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 따라 제조한 다공성 구조체를 정량 PCR한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 정량 PCR전후의 다공성 구조체를 CCD 카메라로 촬영한 사진을 나타낸 도이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체 Ch1-3을 채널 1-3에 순서대로 전기영동하여 측정한 사진(왼쪽)과 각 사이클에서 형광강도를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체 Ch1-3의 (a)qPCR 전, (b)qPCR 중(42 사이클), (c)qPCR 후를 CCD 카메라로 촬영한 사진을 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체 Ch1-3의 매 사이클마다 형광강도를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예는 기공을 포함하는 다공성 구조체로서,

이때 상기 프라이머는 10~100 염기쌍(base pair; bp), 보다 구체적으로 20~50 염기쌍일 수 있으나, 프라이머의 서열종류와 서열길이는 표적핵산에 따라 제한없이 변형이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 다공성 구조체는 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)이 모두 고정된 것일 수 있고, 또는 이 중 한 방향의 프라이머만이 고정된 것일 수 있다. 상기 전방향 및 역방향 프라이머 중 한 방향의 프라이머만이 고정된 경우, 나머지 다른 한 종류는 상기 다공성 구조체를 이용하는 실시간 다중 핵산 증폭 (multiplex real-time PCR) 장치에 별도로 넣어줌으로써 다른 한 종류의 프라이머가 다공성 구조체 내의 기공에서 자유롭게 이동할 수 있어 반응성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 다공성 구조체는 예를 들어 10 ㎛ 내지 500 ㎛의 입경크기를 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 100 ㎛ 내지 300 ㎛의 입경을 가질 수 있다. 형태는 내부에 기공을 가질 수 있는 3차원의 구조체라면 제한되지 않으며, 보다 구체적으로는 구형을 예로 들 수 있다. 다공성 구조체의 재료는 고형화가 가능한 폴리머(pre-polymer)라면 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜-디아크릴레이트(Polyethylene Glycol-Diacrylate, PEG-DA) 또는 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PA)와 같은 친수성 폴리머를 사용할 수 있다. 또한, 일 실시예로서 상기 다공성 구조체의 기공율은 다공성 구조체의 총 부피에 대하여 10부피% 내지 80부피%, 보다 구체적으로 50 부피% 내지 70부피%이다. 상기 범위를 벗어날 경우 다공성이 떨어지거나 구조체의 안정도가 불안정해질 수 있는 문제가 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 다공성 구조체는 상기 말단에 아크릴기(acryl group)를 포함하는 프라이머를 포함함으로써 상기 아크릴기가 다공성 구조체에 화학적으로 결합함으로써 프라이머를 다공성 구조체에 고정시킨 것일 수 있다. 또한, 일 실시예로서 상기 프라이머는 다공성 구조체와 링커(linker)로 연결된 것일 수 있으며, 이 경우 링커에 의해 프라이머가 기공내에 움직일 수 있는 자유도가 높아지므로 반응성이 향상된다. 상기 링커는 예를 들어 5nm~100nm 또는 20 내지 50nm의 길이를 갖는다. 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리머나 알킬사슬(alkylchain)과 같은 폴리머사슬이 링커로 사용될 수 있으나, 프라이머 및 다공성 구조체와 화학적으로 결합할 수 있는 것이면 그 종류가 제한되지 않는다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 일 실시예로서 상기 다공성 구조체는 고정된 프라이머 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식인자 중 하나 이상을 기공 내에 더 포함할 수 있다. 상기 인코더는 색이나 모양 등으로 각 다공성 구조체내에 고정된 프라이머가 무엇인지를 구분지어주는 물질을 의미하며, 예를 들어 여러 색깔의 형광을 내는 양자점이나 특정 모양을 지닌 금속, 플라스틱, 유리, 실리콘 등을 사용할 수 있다. 혹은 인코더를 사용하지 않고, 서로 크기가 다른 상기 다공성 구조체를 사용하거나, 각 다공성 구조체의 어레이내 위치를 특정함으로써 각 다공성 구조체 내의 프라이머를 구분할 수 있다.

상기 형광 표식 인자는 표적핵산에 결합하여 형광 시그널을 제공하여 표적 핵산을 실시간으로 검출할 수 있게 한다. 이는 상기 다공성 구조체에 고정될 수 있으며, 상기 표적핵산이 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭될 경우 이 형광강도도 함께 증가하게 되므로, 형광강도를 검출함으로써 증폭되는 표적핵산을 정량할 수 있다. 상기 형광 표식 인자는 표적 핵산에 상보적으로 결합하여 형광성을 나타내는 것이면 종류에 한정되지 않고 사용할 수 있다. 예를 들어 SYBR ® Green I와 같은 시아닌(cyanine) 계열의 염색약, EtBr 등 이중가닥 핵산에 결합하여 증폭과 함께 형광을 나타내는 시약(Interchelator), 5'말단을 형광물질(FAM 등)로, 3'말단을 쿠엔처 (quencher) 물질(TAMRA 등)로 수식한 핵산인 TaqMan^TM probe 등을 사용할 수 있다. 이때 TaqMan^TM probe는 어닐링 단계(annealing step)에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화 결합하지만, 프로브상에 쿠엔처(quencher)에 의해 형광 발생이 억제되고, 신장(Extension) 반응시에 Taq DNA 폴리머레이즈가 갖는 5'→3' exonuclease 활성으로 주형에 혼성화 결합한 TaqMan^TM probe가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로서 쿠엔처에 의한 억제가 해제되어 형광을 발현된다. 또는, 예를 들어 핵산의 양 말단을 형광물질(FAM, TAMRA 등)과 쿠엔처 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고핵산 프로브(oligo-nucleotide probe; Molecular Beacon probe)를 사용할 수도 있다. 이때, 분자 비컨 프로브(Molecular Beacon probe)는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하고 형광물질과 쿠엔처 물질이 근접해 있어 형광발생이 억제된다. 프로브는 어닐링 단계에서 주형과 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화 결합하고 이 때 형광물질과 쿠엔처 물질과의 거리가 멀어져 쿠엔처 물질에 의한 억제가 해소되어 프로브상의 형광색소가 형광을 나타낸다. 한편 혼성화 결합하지 않은 분자 비컨 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않는다.

본 발명의 다른 일 실시예는 상기와 같은 다공성 구조체를 제조하는 방법으로서,

직교하는 구간을 포함하는 두 개의 채널을 포함하는 마이크로 채널의 한 채널에 오일을 통과시키고 다른 한 채널에 상기 제조된 구조체 형성 용액을 통과시켜, 상기 직교하는 구간에서 상기 구조체 형성 용액을 오일상에 분산시켜 액적(droplet)형태의 구조체를 형성하는 단계;

상기 형성된 구조체를 고형화시키는 단계;및

를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법을 제공한다(도 2 참조).

일 실시예로서 상기 액적(droplet)형태의 구조체를 형성하는 단계는 채널에 오일은 연속적으로 통과시키고 다른 한 채널에서 상기 제조된 구조체 형성 용액은 불연속적으로 통과시킴으로써 상기 직교하는 구간에서 상기 구조체 형성 용액을 오일상에 효과적으로 분산시킬 수 있다. 이때 상기 오일의 유량은 구체적으로 50 내지 1500㎕/hr 또는 100 내지 1200㎕/hr, 보다 구체적으로는 200 내지 400 ㎕/hr 이며, 구조체 형성 용액의 유량은 구체적으로 5 내지 1000㎕/hr 또는 10 내지 500 ㎕/hr, 보다 구체적으로 50 내지 150㎕/hr로 조절할 수 있다. 상기 오일과 구조체 형성 용액의 각 유량과 그 비율을 조절함으로써, 채널을 통과하는 액적의 입자크기를 조절할 수 있으므로, 이에 따라 제조되는 다공성 구조체의 입경의 조절이 가능하다. 예를 들면, 상기 각 유량의 범위 내로 채널을 통과시킬 경우 10 내지 500㎛, 보다 구체적으로 42 내지 200㎛의 입경을 갖는 액적을 제조할 수 있다. 또한, 상기와 같이 유량을 조절하여 다양한 입경을 갖는 다공성 구조체들을 용이하게 제조할 수 있으므로, 인코더를 사용하지 않고도 입경의 차이를 이용하여 다공성 구조체 내 포함되는 프라이머를 구분 또는 식별하는 것이 가능하다.

이때 오일은 분산상(disperse phase)인 다공성 구조체 형성 용액의 흐름에 전단력을 가하여 액적(droplet) 형태로 성형하고, 이 액적이 다시 뭉치지 않도록 안정화시켜준다. 일 실시예에 따른 상기 구조체 형성 용액에 통과하는 채널은 직교하는 구간 직후 통로가 좁아진 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 용액이 통과되면서 효과적으로 액적형태가 제조된다(도 6의 (b)참조).

일 실시예로서 오일은 FC(Fluorocarbon Oil), 미네랄 오일, 실리콘 오일, 헥사데칸(hexadecane), 헥산(hexane), 톨루엔(toluene), 벤젠(benzene), N,N-디메틸포마이드(N,N-dimethylformamide; DMF), 디클로로메탄(dichloromethane; DCM), 디에틸 에테르(diethyl ether) 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 다공성 구조체를 제조하는 방법으로서,

상기 구조체를 고형화시키는 단계; 및

를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법을 제공한다(도 3 참조).

보다 구체적으로 상기 어레이는 상기 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이를 사용할 수 있다. 일 실시예에 의하면, 상기 다공성 구조체들을 어레이의 일정한 위치에 각각 떨어뜨려 제조할 수 있으므로, 별도로 인코더를 사용하지 않고도 어레이의 각 위치로 각각 다공성 구조체에 포함하는 각기 다른 프라이머를 구분하는 것이 가능하다.

이때 상기 "프레폴리머(pre-polymer)"란 폴리머의 성형가공을 용이하게 하기 위해 중합 또는 중축합 반응을 적당한 단계에서 정지한 예비 중합물을 의미하는 것으로, 본 발명의 경우 고형화되기 이전의 성형가공이 용이한 상태의 폴리머를 의미한다.

일 실시예에 따른 상기 구조체 형성 용액은 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향의 프라이머만을 포함하며, 이 경우 나머지 다른 한 종류의 프라이머는 상기 다공성 구조체를 이용하는 실시간 다중 핵산 증폭 (multiplex real-time PCR) 장치에 별도로 넣어줄 수 있다.

그리고 상기 본 발명의 제조방법을 사용하여 표적핵산의 종류에 따라 프라이머의 종류의 달리하여 주입함으로써, 서로 다른 프라이머를 포함하는 복수 개의 다공성 구조체를 제조할 수 있다. 또한, 상기 구조체 형성 용액은 고정된 프라이머 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식인자 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

일 실시예로서 상기 구조체 형성 용액의 제조단계는 용액에 포함된 기공유도중합체의 크기를 변형시킴으로써 다공성 구조체내에 형성되는 기공의 크기를 조절하는 것을 더 포함한다. 이때 상기 기공유도중합체는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)을 사용할 수 있으며, 구체적으로 PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG12000, PEG20000, PEG35000, PEG40000 등(제조사: Sigma Aldrich)을 사용할 수 있다.

상기 마이크로 채널은 웨이퍼 위에 기판을 포토리소그래피법으로 채널모양으로 패터닝한 후, 이를 모형을 떠서 제조할 수 있다. 이때 모형을 떠서 제조하는 마이크로 채널의 재료는 실리콘 기반의 고분자이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예로서 상기 다공성 구조체의 고형화는 고형화 전의 다공성 구조체의 형상을 유지하여 고형화되는 것으로, 그 형상을 유지할 수 있다면 광학적, 화학적 또는 열적 경화방법 등 그 고형화 방법은 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 실시예는 하나 이상의 상기 다공성 구조체; 및

상기 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치를 제공한다.

일 실시예에 따른 상기 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)의 재질은 유리, 플라스틱, 폴리머, 실리콘 등 종류에 제한되지 않는다. 일 실시예로서 상기 실시간 다중 핵산 증폭장치는 여러 종류의 표적 핵산을 동시에 검출하기 위하여, 각각의 웰에 서로 다른 표적 핵산에 대한 프라이머 또는 프라이머와 인코더를 각각 포함하는 복수 개의 다공성 구조체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 실시간 다중 핵산 증폭 방법으로서,

하나 이상의 상기 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)를 포함하는 챔버에 주입하여 다공성 구조체를 상기 어레이에 배열하는 단계;

하나 이상의 표적(target) 핵산을 포함하는 용액을 실시간 다중 핵산 증폭 장치의 챔버에 주입하여 상기 다공성 구조체 기공내로 유입시키는 단계; 및

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 다공성 구조체는 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향의 프라이머만을 포함하고, 다른 한 종류의 프라이머는 상기 표적 핵산을 포함하는 용액에 포함한다. 상기 표적 핵산을 포함하는 용액은 일 실시예로서 3'-locked nucleic acid primer와 같은 LNA(Locked nucleic acid)를 포함하는 프라이머, Taq 폴리머라제 등을 더 포함한다.

나아가, 본 발명은 일 실시예로서 상기 중합효소 연쇄반응시키는 단계와 동시에 중합되는 상기 하나 이상의 각 다공성 구조체 내에서 중합되는 핵산을 실시간으로 정량적 분석하는 단계를 더 포함하여, 상기와 같이 각기 다른 종류의 표적 핵산들을 동시에 증폭시키면서 실시간으로 검출하고 정량적으로 분석할 수 있다.

이하, 본 발명의 실험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 다공성 구조체의 제조 1

아래에서 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체의 제조방법에 대해 설명한다.

마이크로 채널의 제조

먼저, 실리콘 웨이퍼 위에 SU-8(제품명: 2050 제조사: MicroChem)을 포토리소그래피법(photolithography)를 이용해 두 채널이 직교하는 구간을 갖는 모양으로 채널을 패터닝을 하여 몰드를 제조했다. 그 다음 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 용액과 경화제(제품명: SYLGARD®184, 제조사: 다우하이텍실리콘)를 10:1로 혼합한 프레-폴리머 용액을 상기 SU-8을 사용하여 제조한 몰드 위에 부었다. 진공챔버에서 60분간 가스를 제거한 다음 80℃의 오븐에 90분간 경화시키고 몰드로부터 분리하여 PDMS 마이크로 채널을 제조했다. 이때 채널의 너비는 120μm, 높이는 100μm였다.

다공성 구조체 형성 용액의 제조

먼저, 증류수 94.5 mL, 100X TE 버퍼 3 mL 및 10% 트윈(tween)-20 희석용액 2.5 mL를 혼합하여 100 ml의 3X TET용액(3X TE buffer with Tween 20)을 준비했다. 그 다음, 기공유도중합체로 폴리에틸렌글리콜 600(PEG 600) 400 ㎕, PEG700DA(제조사: Sigma Aldrich) 200㎕, 광개시제로 Darocur(제조사: Sigma Aldrich) 50 ㎕, TET 350㎕를 혼합하여 총 1 mL의 하이드로겔 용액을 제조했다. 그리고 표적 핵산과 결합하는 1mM의 프라이머 6㎕, TE 버퍼 54㎕를 혼합하여 총 100μM (60㎕)이 되도록 하고, 이를 상기 하이드로겔용액 (540㎕)과 혼합하여 10μM(600㎕)의 최종 프라이머 농도를 갖는 하이드로겔 프레-폴리머 용액(Hydrogel pre-polymer solution)을 제조하였다.

이때 표적 핵산의 종류는 살모넬라 식중독균(미생물자원센터 KCTC# 2515)으로 하였으며, 따라서 프라이머로 하기의 전방향 프라이머, 역방향 프라이머를 각각 포함하는 다공성 구조체 형성용액과, 이 둘을 모두 포함하는 다공성 구조체 형성용액을 각각 제조하였다. 이때 형광 표식 인자로는 SYBR ® Green I (제조사: Invitrogen)이었다.

- 전방향 프라이머(Forward primer): AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA (서열번호 1),

- 역방향 프라이머(Reverse primer): TCA ATA ATA CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC (서열번호 2)

다공성 구조체의 제조

상기 제조한 마이크로 채널의 직교하는 두 채널 중 한 채널에는 1.8 %의 크라이톡스®계면활성제(Krytox®surfactant, 제조사:Dupont)을 포함하는 FC(Fluorocarbon) 오일을 연속적으로 주입하고, 다른 한 채널에는 상기에서 제조한 하이드로겔 프레-폴리머 용액(Hydrogel pre-polymer solution)을 불연속적으로 주입하여 직교하는 구간에서 상기 오일에 분산되도록 하는 플로우-포커싱(Flow-focusing) 방법으로 액적(droplet)형태의 구조체를 제조하였다.

이때 상기 FC 오일(Continuous Phase)과 하이드로겔 프레-폴리머 용액(Disperse phase)의 유량을 하기 표 1과 같이 조절하여 각 구조체가 71~131μm의 다양한 입경을 갖도록 하였다.

표 1

FC 오일의 유량(μl/hr)	하이드로겔 프레-폴리머 용액 유량(μl/hr)	액적 사이즈(μm)
200	100	129
300	100	120
400	100	106
500	100	81
300	200	131
500	200	113
600	200	88
1200	400	71

도 4는 상기 방법에 따라 마이크로 채널을 사용하여 액적 형태의 구조체를 형성하는 모식도(a) 및 FC 오일의 유량이 300㎕/hr, 하이드로겔 프레-폴리머 용액의 유량이 100㎕/hr 일 때의 제조과정을 실제로 촬영한 사진(b)을 나타낸 것이다.

그 다음, 상기 제조된 액적(droplet)형태의 구조체를 6~8 mW/cm²로 20분 동안 자외선(UV)을 조사하여 고형화(curing)했다. 순수한 200 ㎕의 FC 오일로 2번, 200 ㎕의 TET 버퍼(TE buffer with Tween 20)로 5번 씻어내어(rinsing) 기공유도복합체를 제거하여 구조체 내에 60%의 기공율을 갖는 기공이 형성된 다공성 구조체를 제조하였다.

[실시예 2] 다공성 구조체의 제조 2

다음은, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 다공성 구조체의 제조에 관한 설명이다.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 구조체 형성 용액인 하이드로겔 프레-폴리머 용액(Hydrogel pre-polymer solution)을 제조했다. 그 다음, 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)의 각 웰에 상기 각각 다른 프라이머(전방향, 역방향, 전방향 및 역방향 프라이머)를 포함하는 하이드로겔 프레-폴리머 용액을 떨어뜨려(spotting) 액적 형태의 구조체를 형성했다.

그리고 상기 제조된 액적(droplet)형태의 구조체를 190.6 mW/cm²로 5초 동안 자외선(UV)을 조사하여 고형화했다. 200 ㎕의 TET 버퍼(TE buffer with Tween 20)로 5번 씻어내어(rinsing) 기공유도복합체를 제거하여 구조체 내에 기공이 형성된 입경이 120μm인 다공성 구조체를 제조했다.

[실시예 3] 다공성 구조체를 이용한 실시간 다중 핵산 증폭

아래에서 본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 구조체를 사용하여 표적 핵산을 실시간으로 증폭하는 방법에 대해 설명한다.

먼저, 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)를 포함하는 챔버를 준비한다(도 6). 그 다음, 상기 실시예 1 또는 2의 방법으로 제조한 각각 다른 프라이머(전방향, 역방향, 전방향 및 역방향 프라이머)를 포함하는 다공성 구조체들을 챔버에 주입하여 각 웰에 안착되도록 주입했다. 이때 각 웰에 안착되지 못하고 남은 구조체들은 씻어내었다. 그리고 상기 챔버에 PCR 마스터믹스(Mastermix, 중합효소, 뉴클레오티드가 포함됨, 제조사:나노바이오시스) 8 ㎕, 증류수(D.I. Water) 5.4 ㎕, 살모넬라 DNA 주형 (1x10⁶ copies of plasmid DNA) 1 ㎕를 넣고, 다공성 구조체가 전방향 및 역방향 프라이머 중 하나만을 포함하는 경우, 그 나머지 프라이머를 포함하는 PCR 용액을 주입하였다.

그 다음, 하기의 온도사이클에 따라 총 중합효소 연쇄반응(PCR)을 진행하여 핵산을 증폭하였다. 이때 PCR 반응은 총 40 사이클로 진행하고, 매 사이클이 끝날때마다 증폭된 핵산의 형광표식인자에 의해 나타나는 형광강도를 5초간 측정하여 정량분석하였다.

- 전변성(Pre-denaturation): 95℃, 8sec,

- 변성(Denaturation): 95℃, 3sec,

- 어닐링(Annealing) 및 신장(Extension): 72℃, 6sec

도 7은 이 중 전방향 프라이머만을 고정하여 실시예 1의 제조방법과 동일한 방법으로 제조하고, 입경은 120μm인 다공성 구조체의 정량 PCR(qPCR) 결과로서, 그래프에 나타난 바와 같이, PCR이 정상적으로 잘 일어남을 확인할 수 있다.

[실험예 1] 다공성 구조체에 고정되는 프라이머 종류에 따른 정량 PCR의 효율 비교

다공성 구조체에 고정되는 프라이머 종류에 따른 정량 PCR의 효율 비교하기 위하여 하기의 실험을 실시하였다.

Ch1-3은 상기 실시예 2의 제조방법으로 제조한 다공성 구조체로서, Ch1은 다공성 구조체에 전방향 프라이머(forward primer)만을 고정, Ch2는 전방향 및 역방향 프라이머를 모두 고정한 점을 제외하고는 동일하게 제조하였으며, Ch3은 본 발명의 다공성 구조체를 넣지않고 PCR 용액만을 넣어 대조군으로 하였다. 이때 하나의 다공성 구조체에 포함된 프라이머의 양은 100 μM였으며 입경은 600 μm다.

그리고 상기 실시예 3의 방법으로 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 총 40사이클 실시하였으며 도 8에 qPCR 전후의 다공성 구조체를 CCD(charge-coupled device) 카메라로 촬영한 사진을 나타내었다. 그리고 도 9에는 상기 다공성 구조체 Ch1-3을 채널1-3에 순서대로 전기영동하여 측정한 사진(왼쪽)과 각 사이클에서 형광강도를 측정하여 분석한 그래프를 나타낸 것이다.

상기 실험 결과, 도 8 및 도 9의 그래프에 나타난 바와 같이 다공성 구조체에 전방향 프라이머(forward primer) 하나만이 고정된 Ch1이 상기 두 프라이머가 모두 고정된 Ch2보다 형광강도가 현저히 높게 나타나, 핵산 증폭율이 매우 우수하다는 것을 알 수 있다. 이는 하나의 프라이머가 고정된 경우가 두 프라이머가 고정된 경우보다 프라이머의 자유도가 높아서 반응성이 크다는 것을 의미한다.

또한 도 9의 왼쪽에 나타난 전기영동 결과에서는 Ch 1, 2에는 밴드가 없지만 Ch 3에는 밴드가 있는 것을 확인할 수 있다. 이는 Ch 1, 2에는 프라이머가 다공성 구조체에 고정화되어 있기 때문에 겔에 로딩할 때 밴드가 나오지 않았기 때문이다.

[실험예 2] 다공성 구조체에 고정되는 프라이머 조건(링커의 유무)에 따른 정량 PCR의 효율 비교

다공성 구조체에 고정되는 프라이머조건에 따른 정량 PCR의 효율을 비교하기 위하여 하기의 실험을 실시하였다.

Ch1, Ch2는 기공유도중합체를 16 l의 TET 버퍼로 5회 씻어내어 제거하였다는 것을 제외하고는 상기 실시예 2의 제조방법과 동일한 방법으로 제조한 다공성 구조체로서, Ch1는 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 고정, Ch2은 링커로 연결된 전방향 및 역방향 프라이머를 고정한 점을 제외하고는 동일하게 제조하였으며, 이때 하나의 다공성 구조체에 포함된 프라이머의 양은 100 μM, 입경은 600μm였다. Ch3은 본 발명의 다공성 구조체를 넣지않고 PCR 용액만을 넣어 대조군으로 하였다.

상기 Ch2의 전방향 및 역방향 프라이머에 고정된 링커는 PEG(poly ethylene glycol, n=50)이며, 이 링커가 고정된 전방향 및 역방향 프라이머는 아래와 같다.

- 링커가 연결된 전방향 프라이머(Long Forward primer): 5’-Acrydite-PEG(poly ethylene glycol, n=50)-DNA(AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA)-3,’

- 링커가 연결된 역방향 프라이머(Long reverse primer): 5’-Acrydite-PEG(poly ethylene glycol, n=50)-DNA(TCA ATA ATA CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC)- 3’

그리고 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 총 90 사이클 실시한 것을 제외하고는 상기 실시예 3 동일한 방법으로 qPCR을 실시하였다. 도 10에 (a)qPCR 전, (b)qPCR 중(42 사이클), (c)qPCR 후의 다공성 구조체를 CCD 카메라로 촬영한 사진을 나타내었다. 사이클이 진행함에 따라 형광이미지가 나타나므로 qPCR이 진행되고 있음을 확인할 수 있다. 그리고 매 사이클마다 형광강도를 측정한 그래프는 도 11에 나타내었다.

도 11의 결과를 보면, qPCR 결과 다공성 구조체에 링커로 연결된 Ch2의 경우는 형광강도가 Ch1보다 더 높게 나왔으며, 이는 링커로 연결되지 않은 Ch1보다 다공성 구조체 내에서의 자유도가 높아지기 때문이다.

본 발명에 따른 다공성 구조체는 동시에 여러 종류의 표적핵산을 검출하고 이를 동시에 실시간으로 분석할 수 있어, 실시간 다중 핵산 증폭 (multiplex real-time PCR) 에 사용되며, 현장현시검사(Point-of-care technology, POCT)와 같이 서로 다른 여러 종류의 핵산을 동시에 신속하게 분석하여 질병의 정확한 진단을 요하는 분야에 유용하다.

Claims

기공을 포함하는 다공성 구조체로서,

기공 내부에 고정된 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향 이상의 프라이머를 포함하는 다공성 구조체.
제1항에 있어서, 상기 다공성 구조체는 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향의 프라이머만이 고정된 다공성 구조체.
제1항에 있어서, 상기 다공성 구조체의 기공율은 다공성 구조체의 총 부피에 대하여 10 부피% 내지 80 부피%인 다공성 구조체.
제1항에 있어서, 상기 다공성 구조체의 입경은 10 ㎛ 내지 500 ㎛ 인 다공성 구조체.
제1항에 있어서, 상기 다공성 구조체의 기공 내부에 고정된 프라이머는 말단에 아크릴기(acryl group)를 포함하고, 상기 아크릴기가 다공성 구조체에 화학적으로 고정된 것인 다공성 구조체.
제1항에 있어서, 상기 다공성 구조체의 기공 내부에 고정된 프라이머 중 하나 이상은 다공성 구조체와 링커(linker)로 연결된 다공성 구조체.
제6항에 있어서, 상기 링커의 길이는 5 내지 100nm인 다공성 구조체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 구조체는 고정된 프라이머 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식인자 중 하나 이상을 기공 내에 더 포함하는 다공성 구조체.
다공성 구조체를 제조하는 방법으로서,

프레폴리머(pre-polymer), 기공유도중합체 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향 이상의 프라이머를 포함하는 구조체 형성 용액을 제조하는 단계;

직교하는 구간을 포함하는 두 개의 채널을 포함하는 마이크로 채널의 한 채널에 오일을 통과시키고 다른 한 채널에 상기 제조된 구조체 형성 용액을 통과시켜, 상기 직교하는 구간에서 상기 구조체 형성 용액을 오일상에 분산시켜 액적(droplet)형태의 구조체를 형성하는 단계;

상기 형성된 구조체를 고형화시키는 단계;및

상기 고형화된 구조체에서 기공유도중합체를 제거하여 구조체 내에 기공을 형성하는 단계;

를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법.
다공성 구조체를 제조하는 방법으로서,

프레폴리머(pre-polymer), 기공유도중합체 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향 이상의 프라이머를 포함하는 구조체 형성 용액을 제조하는 단계;

어레이(array)에 상기 제조된 구조체 형성 용액을 떨어뜨려 액적(droplet)형태의 구조체를 형성하는 단계;

상기 구조체를 고형화시키는 단계;및

상기 고형화된 구조체에서 기공유도중합체를 제거하여 구조체 내에 기공을 형성하는 단계;

를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 구조체 형성 용액은 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향의 프라이머만을 포함하는 다공성 구조체의 제조방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 구조체 형성 용액은 고정된 프라이머 정보를 제공하는 인코더(encoder) 및 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식인자 중 하나 이상을 더 포함하는 다공성 구조체의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 액적 형태의 구조체를 형성하는 단계는 오일과 구조체 형성 용액의 각 유량을 조절함으로써 형성되는 상기 액적의 크기를 조절하는 단계를 포함하는 다공성 구조체의 제조방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 구조체 형성 용액의 제조단계는 용액에 포함된 기공유도중합체의 크기를 변형시킴으로써 다공성 구조체내에 형성되는 기공의 크기를 조절하는 것을 더 포함하는 다공성 구조체의 제조방법.
하나 이상의 제1항의 다공성 구조체; 및

상기 다공성 구조체가 배열되도록 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array);

를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치.
제15항에 있어서, 상기 실시간 다중 핵산 증폭장치는 서로 다른 표적 핵산에 대한 프라이머를 각각 포함하는 복수 개의 다공성 구조체를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭장치.
제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 다공성 구조체는 포함된 프라이머의 종류에 따라 서로 다른 입자크기를 가지는 실시간 다중 핵산 증폭장치.
실시간 다중 핵산 증폭 방법으로서,

하나 이상의 제1항의 다공성 구조체를 웰(well)형태로 표면이 패터닝된 어레이(array)를 포함하는 챔버에 주입하여 상기 다공성 구조체를 상기 어레이에 배열하는 단계;

하나 이상의 표적(target) 핵산을 포함하는 용액을 실시간 다중 핵산 증폭 장치의 챔버에 주입하여 상기 다공성 구조체 기공내로 유입시키는 단계; 및

상기 표적 핵산을 중합효소 연쇄반응(PCR) 시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계;를 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
제18항에 있어서, 상기 다공성 구조체는 중합효소 연쇄반응 프라이머로 표적(target) 핵산의 전방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer) 중 한 방향의 프라이머만을 포함하고, 다른 한 종류의 프라이머는 상기 표적 핵산을 포함하는 용액에 포함되는 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
제18항에 있어서, 하나 이상의 상기 다공성 구조체는 서로 다른 프라이머를 각각 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법.
제18항에 있어서, 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계와 동시에 중합되는 상기 하나 이상의 각 다공성 구조체 내에서 중합되는 핵산을 실시간으로 분석하는 단계를 더 포함하는 실시간 다중 핵산 증폭 방법.