WO2016013770A1 - 멀티플렉스 ｐｃｒ 칩 및 이를 포함하는 멀티플렉스 ｐｃｒ 장치 - Google Patents

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pcr chip
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김덕중
전승현
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Definitions

  • the present invention relates to a multiplex PCR chip and a multiplex PCR device comprising the same, more specifically, multiplex PCR chip for simultaneously detecting a plurality of nucleic acid molecules different from each other based on the position between a plurality of probes and comprising the same A multiplex PCR device.
  • the present invention is derived from a study conducted with the support of the Health and Medical Research and Development Project of the Ministry of Health and Welfare, Korea Health Industry Development Institute. [Task unique number: HI13C2262, Project title: "Lap chip-based for ultra-fast diagnosis of malaria field tests.” Development of automated real-time PCR system for multi-channel simultaneous detection process "].
  • PCR Polymerase chain reaction
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the diagnosis through the nucleic acid amplification or a specific gene search technique has a limitation in that it searches for one template at a time.
  • amplifying each one at a time is a cumbersome and time consuming task.
  • cancer and genetic defects are known to be caused by complex mutations of various genes. Genetic polymorphisms or mutations require additional screening of zygotes due to changes in loci of various genes. Since the amount of nucleic acid that can be extracted from a limited sample in a general environment is finite, it is often impossible to repeat the diagnosis through nucleic acid amplification using a limited amount of nucleic acid.
  • multiplex PCR there is a need for a technique for analyzing nucleic acids of many templates from the same sample at the same time, which may be referred to as multiplex PCR.
  • 1 illustrates an exemplary process of conventional multiplex PCR.
  • the conventional multiplex PCR may perform PCR by injecting a plurality of primer sets into one reaction vessel (or tube). Multiple sets of primers can be specifically hybridized to various sequences of nucleic acid molecules, so that multiple target nucleic acid sequences can be amplified at the same time. That is, multiplex PCR can identify / diagnose a plurality of genes and diseases in one experiment, thereby reducing the number of experiments and labor, and providing cost saving effects.
  • the monitoring of the amplification products of multiplex PCR can be performed by irradiating excitation light and detecting the emission light generated during the amplification reaction, where the amplification for fluorescence is generated.
  • Oligonucleotides i.e., primers or probes
  • fluorescent dyes that can generate a signal indicative of the presence of the target nucleic acid sequence during the reaction are used, particularly in multiplex PCR to distinguish between multiple different nucleic acid sequences that can be amplified.
  • oligonucleotides specific to each nucleic acid sequence can be used. That is, in conventional multiplex PCR, multiple fluorescent dyes must be labeled for the detection of multiple target nucleic acid sequences, and also for detection of multiple fluorescences from the multiple fluorescent dyes, each in a separate wavelength band. There is a need for multiple wavelength light sources and filters that are optimized for the detection of fluorescent dyes. This requires multiple wavelength-specific measurement times to increase the time spent detecting nucleic acid sequences, increase the overall size and complexity of the PCR device, and consequently can be cost-effective.
  • the present invention has been made to solve the problem, and an object thereof is to provide a multiplex PCR device for simultaneously detecting a plurality of nucleic acid molecules different from each other based on positions between a plurality of probes.
  • a multiplex PCR chip includes a plurality of hybridization reaction probes that specifically hybridize with different amplified sequences of the nucleic acid molecules so as to simultaneously detect a plurality of different nucleic acid molecules. It may be characterized by being spaced apart from each other.
  • a multiplex PCR device includes the multiplex PCR chip; A light providing unit configured to irradiate excitation light toward the probe in the multiplex PCR chip; And a light detector for detecting emission light generated by a plurality of probes by the excitation light beam, wherein the light providing unit and the light detector detect light using a single wavelength of light. can do.
  • a multiplex PCR device includes the multiplex PCR chip; And at least one heat block in contact with the multiplex PCR chip to transfer heat for multiplex PCR to the multiplex PCR chip.
  • the sequences of nucleic acid molecules hybridized by the probes can be distinguished based on the positions between the probes.
  • the need for different fluorescent dyes for labeling can be eliminated.
  • the sequence of the nucleic acid molecule hybridized with the probe is distinguishable based on the position between the probes, detection of the multiplex PCR product is possible using only one light source and a filter. This can not only reduce the size of the optical equipment and reduce the cost of the equipment, but also improve the efficiency of the operation of the multiplex PCR apparatus, such as reducing the time required for detection.
  • a plurality of probes can be bonded through a predetermined adhesive material on the surface of the multiplex PCR chip, thereby providing a more firm binding force, which will prevent the distorted results occurring during separation and hybridization and washing of the bonds. Can be.
  • the adhesive material may form a porous structure, and by bonding the probe to the surface of the porous structure, the contact area between the probe and the multiplex PCR product may be increased, thereby improving reactivity.
  • FIG. 1 illustrates an exemplary process of conventional multiplex PCR.
  • FIG. 2 illustrates a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 illustrates a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 illustrates a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 illustrates an example of using a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 9A-9D illustrate a thermal block in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • 11A and 11B show a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 illustrates a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 shows an experimental example of a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • the multiplex PCR device is a device for performing a multiplex polymerase chain reaction (PCR) to amplify various nucleic acids having a specific base sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the multiplex PCR apparatus heats a double strand of DNA by heating a sample solution containing a double strand of DNA to a specific temperature, for example, about 95 ° C.
  • a denaturing step of separating single-stranded DNA, an oligonucleotide primer having a sequence complementary to the specific nucleotide sequence to be amplified in the sample solution, and providing a specific temperature with the isolated single-stranded DNA For example, an annealing step in which a primer is attached to a specific base sequence of a single strand of DNA by cooling to 55 ° C. to form a partial DNA-primer complex, and the sample solution is subjected to an appropriate temperature, for example, after the annealing step.
  • the multiplex PCR apparatus refers to an apparatus including modules for performing steps, and detailed modules not described herein are disclosed and apparent in the prior art for performing PCR. It is assumed that it is equipped with all in the range.
  • the multiplex PCR device can perform the multiplex PCR and at the same time measure and analyze the presence and extent of the multiplex PCR product generation.
  • the fluorescent material is added to the multiplex PCR chip, and the fluorescent material emits light by light of a specific wavelength in accordance with the generation of the PCR product, thereby causing an optical signal that can be measured and analyzed.
  • FIG. 2 illustrates a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • the multiplex PCR chip 200 is for performing amplification (amplification reaction) of nucleic acid molecules, detection of a target sequence (hybridization reaction), and the like. It may include.
  • the fluid is a nucleic acid such as double stranded DNA, an oligonucleotide primer having a sequence complementary to the specific nucleotide sequence to be amplified, DNA polymerase, deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP), PCR reaction buffer (PCR). sample buffer, including a reaction buffer).
  • At least a part of the multiplex PCR chip 200 may be implemented with a light transmissive material, and may preferably include a light transmissive plastic material.
  • Multiplex PCR chip 200 using a plastic material can increase the heat transfer efficiency only by adjusting the thickness of the plastic, it is possible to reduce the manufacturing cost because the manufacturing process is simple.
  • the multiplex PCR chip 200 may have a light transmitting property as a whole, direct light irradiation is possible in a state in which it is disposed on one surface of the heat block, thereby measuring and analyzing nucleic acid amplification and amplification degree in real time. can do.
  • the multiplex PCR chip 200 contacts the thermal block, the heat of the thermal block is transferred to the multiplex PCR chip 200 and included in the reaction region 224 of the multiplex PCR chip 200.
  • the heated fluid may be heated or cooled to maintain a constant temperature.
  • the multiplex PCR chip 200 may have a planar shape as a whole, but is not limited thereto.
  • the multiplex PCR chip 200 may include a probe 240 fixed therein for the hybridization reaction.
  • Probe 240 is a labeled oligonucleotide capable of generating a signal indicative of the presence of a target nucleic acid sequence during an amplification reaction to detect nucleic acid to be amplified by PCR, and may specifically hybridize with the amplified sequence of the nucleic acid molecule.
  • Each probe 240 may hybridize to different amplified sequences of nucleic acid molecules.
  • Each probe 240 may be coupled to be spaced apart from each other on the surface of the multiplex PCR chip 200. This bonding is performed by applying the probe 240 onto the surface of the multiplex PCR chip 200 using, for example, a spotter, an arrayer, an ink-jet, or the like. Can be. According to an embodiment, each probe 240 may be covalently bound on the surface of the multiplex PCR chip 200 or coupled through an adhesive material.
  • the adhesive material may be at least one of hydrogel, agarose and paraffin. The adhesive materials can provide a stronger bond compared to the covalent bond between the conventional probe 240 and the multiplex PCR chip 200, which can prevent distorted results during separation and hybridization and washing of the bond. . In addition, the adhesive materials may form a porous structure.
  • the contact area between the probe 240 and the multiplex PCR product may be formed by binding the probe 240 to the surface of the porous structure.
  • the probe 240 may be disposed on an upper surface of the reaction region 224 (or an upper inner surface of the multiplex PCR chip 200 or a lower surface of the third plate 230). Bubbles may occur during the PCR reaction, and these bubbles may cause interference in measuring the PCR reaction product. However, as shown in FIG. 2, the probe 240 is disposed on the upper surface of the reaction zone 224. The bubble is moved around the probe 240, thereby eliminating such interference to improve measurement efficiency.
  • the same fluorescent dye may be used for the plurality of probes 240.
  • probes 240 labeled with fluorescent dyes having different colors should be used to distinguish sequences of nucleic acid molecules hybridized by a plurality of probes 240, but in the present invention, Even if the same fluorescent dye is used, a plurality of probes 240 are spaced apart at predetermined intervals, and thus the sequence of nucleic acid molecules hybridized by the probes 240 can be distinguished based on the positions between these probes 240. The need for different fluorescent dyes can be eliminated.
  • the present invention by using one light source and a filter, detection of a multiplex PCR product is possible, which not only reduces the size of the optical equipment and reduces the equipment cost, but also reduces the time required for detection.
  • the efficiency of operation of the multiplex PCR device can be improved.
  • a flat plate-shaped first plate 210 may be provided as a base of the multiplex PCR chip 200.
  • the second plate 220 and the third plate 230 may be sequentially disposed on the first plate 210.
  • the first plate 210 may be made of various materials, but preferably, polymethylmethacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cycloolefin copolymer (COC), polyamide (polyamide, PA), polyethylene, PE, polypropylene, PP, polyphenylene ether (PPE), polystyrene (PS), polyoxymethylene (POM), polyether Polyetheretherketone (PEEK), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylchloride (PVC), polyvinylidene fluoride (PVDF), polybutylene terephthalate (PBT) , Fluorinated ethylenepropylene (FEP), perfluoroalkoxyalkane (PFA), and combinations thereof It may be a thermoplastic resin or a thermosetting resin material.
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • PC polycarbonate
  • COC cycloolefin copolymer
  • PA polyamide
  • PE polypropylene
  • PP poly
  • the second plate 220 may be disposed on the first plate 210.
  • the second plate 220 may include an inlet 222 through which a fluid (for example, a sample solution containing a nucleic acid to be amplified) is introduced, a reaction region through which the introduced fluid moves, and a PCR reaction and a hybridization reaction are performed ( 224 and an outlet portion 226 through which the reaction is completed is discharged.
  • the reaction zone 224 of the second plate 220 is formed by recessing from the surface (eg, top and / or bottom) of the second plate 220 or through the second plate 220. Can be.
  • the inlet 222 and the outlet 226 of the second plate 220 penetrate the second plate 220 and, at the same time, from the surface of the second plate 220, as described in more detail below. It may be formed to protrude.
  • the second plate 220 may be formed of various materials, but preferably, polydimethylsiloxane (PDMS), cyclo olefin copolymer (COC), polymethyl methacrylate (PMMA) , Polycarbonate (PC), polypropylene carbonate (PPC), polyether sulfone (PES), and polyethylene terephthalate (PET), and combinations thereof It may be a material.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • COC cyclo olefin copolymer
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC Polycarbonate
  • PPC polypropylene carbonate
  • PES polyether sulfone
  • PET polyethylene terephthalate
  • the thickness of the second plate 220 may vary, but may be selected from 0.1 mm to 2.0 mm.
  • the width and length of the reaction zone 224 may vary, but preferably the width of the reaction zone 224 is selected from 0.5 mm to 3 mm, and the length of the reaction zone 224 is 20 mm to 60 mm. Can be selected from.
  • the inner wall of the second plate 220 may be coated with a material such as silane-based and Bovine Serum Albumin (BSA) to prevent DNA and protein adsorption. The treatment can be performed according to methods known in the art.
  • the inlet 222 may have various sizes, but preferably may be selected from a diameter of 1.0 mm to 3.0 mm.
  • the outlet portion 226 may have various sizes, but preferably may be selected from 1.0 mm to 3.0 mm in diameter.
  • the third plate 230 may be disposed on the second plate 220. Specifically, the third plate 230 is disposed on the second plate 220, so that a portion of the reaction zone 224 of the second plate 220 (that is, the reaction zone 224 of the second plate 220) is provided. At the same time, the PCR reaction product may be measured through at least one probe 240 spaced apart from each other on a portion of the lower surface of the third plate 230.
  • the third plate 230 may be formed of various materials, but preferably, polydimethylsiloxane (PDMS), cyclo olefin copolymer (COC), polymethyl methacrylate (PMMA) , Polycarbonate (PC), polypropylene carbonate (PPC), polyether sulfone (PES), and polyethylene terephthalate (PET), and combinations thereof It may be a material.
  • the thickness of the third plate 230 may vary, but preferably may be selected from 0.1 mm to 2.0 mm.
  • the shape of at least one of the first plate 210, the second plate 220 and the third plate 230 may be injection molded, hot-embossing, casting, laser ablation. It can be formed by various mechanical and chemical processing processes. The machining process is exemplary, and various machining processes may be applied according to the embodiment to which the present invention is applied.
  • the bonding between the first plate 210 and the second plate 220 and / or the bonding between the second plate 220 and the third plate 230 may be, for example, thermal bonding, ultrasonic bonding, ultraviolet bonding, solvent, or the like. It can be carried out by various bonding methods applicable in the art, such as bonding, tape bonding.
  • surface treatment may be performed on at least a portion (eg, an inner wall of the second plate 220) of the inner surface of the multiplex PCR chip 200.
  • a material such as silane series, Bovine Serum Albumin (BSA) to prevent DNA and protein adsorption on the surface, such surface treatment is It can be performed according to various techniques known in the art.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the multiplex PCR chip 200 is provided with separate cover means (not shown) for the inlet 222 and / or outlet 226, the inlet 222 and the outlet Contamination inside the multiplex PCR chip 200 through the unit 226 may be prevented, or leakage of fluid injected into the microfluidic chip 200 may be prevented.
  • cover means may be embodied in various shapes, sizes or materials.
  • the shape or structure of the multiplex PCR chip 200 shown in FIG. 2 is exemplary, and microfluidic chips of various shapes or structures may be used according to the embodiment to which the present invention is applied.
  • Figure 3 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • At least one region (ie, one region of the lower surface of the third plate 230) of the inner surface of the multiplex PCR chip 300 is treated with a hydrophilic material 310 to perform multiplex PCR.
  • a hydrophilic material 310 may be a variety of materials, but may be preferably selected from the group consisting of carboxyl group (-COOH), amine group (-NH2), hydroxy group (-OH), and sulfone group (-SH). .
  • the treatment of the hydrophilic material 310 may be treated by a method selected from the group consisting of oxygen and argon plasma treatment, corona discharge treatment, and surfactant application, which is exemplary, the embodiment to which the present invention is applied Depending on the various treatment methods known in the art can be applied.
  • FIG. 4 illustrates a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • the third plate 230 may include a portion of the reaction region 224 of the second plate 220 (that is, the reaction region of the second plate 220). 224) can be inserted into the through region. For this purpose, some regions 410 of the lower surface of the third plate 230 may protrude downward. The protruding region 410 covers the through region of the reaction region 224 of the second plate 220, and the third plate 230 and the second plate 220 through insertion into the through region. Easy joint alignment of the can be achieved.
  • the shape of the multiplex PCR chip 400 illustrated in FIG. 4 is exemplary and various shapes may be applied according to an embodiment to which the present invention is applied.
  • FIG. 5 illustrates a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 (a) shows a plan view of the multiplex PCR chip 500
  • Figure 5 (b) shows a cross-sectional view in the AA 'direction of the multiplex PCR chip 500
  • Figure 5 (c) shows a bottom perspective view of the inner surface of the multiplex PCR chip 500 shown in Figs. 5A and 5B.
  • the multiplex PCR chip 500 may further include a probe fixing part 510.
  • Probe fixing portion 510 is for receiving and fixing the probe 240 for the detection of the target sequence, for example, formed in one region of the lower surface of the third plate 230 of the multiplex PCR chip 500 It may be composed of a central portion 512 and a peripheral portion 514 protruding to surround the central portion 512.
  • the center portion 512 may provide an accommodation space of the probe 240, and the peripheral portion 514 may prevent the probe 240 from being separated from the center portion 512.
  • the shape of the probe fixing part 510 shown in FIG. 5 is exemplary, and various shapes of the probe fixing part may be used according to an embodiment to which the present invention is applied.
  • FIG. 6 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 (a) shows a plan view of the multiplex PCR chip 600
  • Figure 6 (b) shows a cross-sectional view in the AA 'direction of the multiplex PCR chip 600
  • Figure 6 (c) shows a bottom perspective view of a part of the multiplex PCR chip 600 shown in Figs. 6A and 6B.
  • the reaction zone 224 may include a light measurement zone for measuring a product of various reactions (eg, PCR reaction, hybridization reaction, etc.) performed in the reaction zone 224.
  • the light measuring region may be at least a portion of the reaction region 224 in which the optical signal emitted from the reaction product is detected, and may correspond to the region in which the probe 240 in which the result of the hybridization reaction appears is disposed.
  • the multiplex PCR chip 600 may further include a bubble removing unit 610.
  • the bubble removing unit 610 is for preventing bubbles contained in the fluid from being located in a predetermined region (eg, the probe 240 or the probe fixing unit 510) of the reaction region, as shown. It may be formed to protrude downward from the inner surface of the third plate 230. Specifically, since the bubble removing unit 610 is formed to protrude into the reaction region from the lower inner surface of the third plate 230, bubbles contained in the fluid are pushed out of the bubble removing unit 610 due to buoyancy. It will be placed in the surrounding space. In other words, the bubbles deviate from the light measurement region to the outside, thereby not affecting the optical signal sensitivity emitted from the reaction product present in the light measurement region.
  • the bubble removing unit 610 as at least part of the third plate 230 may be made of a light transmissive material, so that an optical signal generated from the reaction product in the light measuring region passes through the bubble removing unit 610.
  • the light may be emitted to the outside of the multiplex PCR chip 600 without degrading the sensitivity.
  • the reaction product in the reaction region 224 ie, the probe 240
  • the optical signal sensitivity is significantly increased, so that a small number of small reaction products can be measured quickly and accurately at the same time.
  • the bubble removing unit 610 is an example, and according to the embodiment to which the present invention is applied, the bubble removing unit 610 may be utilized for various purposes.
  • the bubble removing unit 610 may be used to remove bubbles contained in the fluid from the flow of the fluid during the movement of the fluid through the reaction region.
  • the shape of the bubble removing unit 610 shown in Figure 6 is an example, not limited to this, in accordance with an embodiment of the present invention, may be variously modified and applied.
  • FIG. 7 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7A illustrates a plan view of the multiplex PCR chip 700
  • FIG. 7B illustrates a cross-sectional view along the AA ′ direction of the multiplex PCR chip 700
  • FIG. (c) shows a bottom perspective view of a part of the multiplex PCR chip 700 shown in Figs. 7A and 7B.
  • the bubble removing unit 710 may be formed as an inclined surface extending from the lower inner surface of the third plate 230 to have an inclined surface and connected to the probe fixing unit 510. As described above, when the side surface of the bubble removing unit 710 is formed as an inclined surface, since the bubble is movable above the reaction region along the inclined surface, bubbles are more easily moved to the surrounding space of the bubble removing unit 710. can do.
  • the probe fixing part may include a flat surface provided on the bottom surface of the periphery of the probe fixing part and an inclined surface extending from the circumference of the flat surface to be connected to the bubble removing unit.
  • the side surface of the periphery of the probe fixing portion is formed of an inclined surface, similar to the bubble removing portion having the inclined surface on the side, bubbles around the probe are easily moved out of the optical measuring region (or above the reaction region) along the inclined surface. Therefore, the optical measurement efficiency can be further improved.
  • the bubble removing unit may further include a bubble collecting unit formed by recessing the lower surface of the third plate upward along the circumference of the bubble removing unit. Since the bubble collecting portion is located above the reaction region relatively compared to regions other than the bubble collecting portion, bubbles pushed out of the bubble removing portion can be collected in the bubble collecting portion.
  • FIG. 8 illustrates an example of using a multiplex PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • heaters 810 and 810 ′ are applied to the inlet 222 and the outlet 226 of the multiplex PCR chip 200, so that the inside of the multiplex PCR chip (that is, the reaction region ( 224)).
  • each of the inlet portion 222 and the outlet portion 226 of the multiplex PCR chip 200 has openings 820 and 830 and openings 820 and 830 formed through the second plate 220.
  • Adjacent portions may include protrusions 840 and 850 formed by protruding the surface of the second plate 220. That is, the heaters 810 and 810 ′ are applied to the inlet 222 and the outlet 226 of the multiplex PCR chip 200 to transfer heat, and thus the protrusions of the inlet 222 and the outlet 226. 840 and 850 may melt to seal the openings 820 and 830. Through this, after the fluid is introduced into the reaction region 224 through the inlet 222, it is possible to prevent at least some of the fluid from being lost to the outside during the PCR reaction.
  • FIGS. 9A-9D illustrate a thermal block in accordance with one embodiment of the present invention.
  • the multiplex PCR chip 200 to 700 contacts at least one column block 900 to amplify a denaturation step, annealing step, and extension (or amplification) to amplify a nucleic acid molecule.
  • the temperature for performing the step can be maintained.
  • the thermal block 900 is connected to the substrate 910, the heating layer 920 disposed on the substrate 910, the insulation protection layer 930 disposed on the heating layer 920, and the heating layer 920.
  • the electrode 940 may be provided.
  • the substrate 910 is a plate material such as a plastic material, a metal material having high heat resistance, and is illustrated as a flat plate, but may have various shapes such as a semi-cylindrical shape and a hemispherical shape. In addition, the substrate 910 may serve to support the heating layer 920.
  • the heating layer 920 may serve as a heat source of the thermal block 900 for performing the denaturation step, annealing step, and extension (or amplification) step of the multiplex PCR.
  • the heating layer 920 may include a heating wire as a heat source.
  • the heating wire may generate heat using power applied from the electrode 940, and may be operably connected to various temperature sensors (not shown) for monitoring the temperature of the heating wire.
  • the hot wire may be arranged to be symmetrical in the vertical direction and / or the horizontal direction with respect to the center point of the surface of the thermal block 900 in order to maintain a constant internal temperature of the thermal block 900.
  • the arrangement of the hot wires symmetrically in the vertical direction and / or the horizontal direction may vary.
  • an adhesion reinforcing layer (not shown) may be formed between the substrate 910 and the heating layer 920 to strongly fix the heating layer 920 to the substrate 910.
  • the adhesion reinforcing layer may be formed of silica or a polymer.
  • the insulating protective layer 930 is for physically and / or electrically protecting the heating layer 920 and may include an insulating material.
  • the insulating material may be selected from the group consisting of dielectric oxides, perylenes, nanoparticles, and polymer films. Meanwhile, the insulating protective layer 930 may be transparent.
  • the electrode 940 is connected to the heat generating layer 920 directly or indirectly to supply power to the heat generating layer 920.
  • the electrode 940 may be used with various materials capable of supplying power, and may be selected from the group consisting of metal materials, conductive epoxy, conductive pastes, solders, and conductive films, for example. According to FIG. 9, the electrodes 940 are connected to both sides of the heat generating layer 920, but may be connected to the heat generating layer 920 at various operable positions if power can be supplied to the heat generating layer 920. In addition, the electrode 940 may be included in the multiplex PCR apparatus or electrically connected to an externally arranged power source.
  • the electrode 940 directly contacts the heat generating layer 920, connects the heat generating layer 920 to an external circuit (not shown) through a wire (not shown), and the wire is connected to the electrode 940.
  • the terminal may be arranged to be stably fixed to the.
  • the multiplex PCR chips 200 to 700 are in contact with at least a portion of the upper surface of the thermal block 900, and thus are heated or cooled according to the heat supply or recovery of the thermal block 900 to perform each reaction step of the multiplex PCR. Can be done. According to an embodiment, the multiplex PCR chips 200 to 700 may perform heat supply by directly or indirectly contacting the thermal block 900.
  • the light reflection prevention layer 950 may be disposed in contact with the upper surface of the insulating protective layer 930 to further increase the sensing efficiency.
  • the light reflection prevention layer 950 may perform an insulation protection function and a light reflection prevention function in combination with the insulation protection layer 930 and may include a light reflection prevention material.
  • the anti-reflective material may be, for example, a fluoride such as MgF 2 , an oxide such as SiO 2 , or Al 2 O 3 , but is not limited as long as the material has a property of preventing light reflection.
  • the light absorbing layer 960 may be disposed in contact with an upper surface of the insulating protective layer 930, and the light absorbing layer 960 may include a light absorbing material.
  • the light absorbing material may be, for example, mica, but is not limited as long as the material has a property of absorbing light. Therefore, the light absorbing layer 960 absorbs a part of the light derived from the light source, and the generation of reflected light acting as noise of the optical signal can be suppressed as much as possible.
  • the light absorbing material is formed on the lower surface of the thermal block 900 to form the light absorbing layer 960, and at the same time, the light reflecting preventing material is processed on the upper surface of the thermal block 900 to prevent the light reflection preventing layer 950 )
  • the ratio of the optical signal to the noise should have the maximum possible value, and the ratio of the optical signal to the noise may be improved as the reflectance of the excitation light from the multiplex PCR chips 200 to 700 is lower. have.
  • the structure and shape of the thermal block 900 shown in FIGS. 9A to 9D are exemplary and may be variously modified and applied according to an embodiment of the present invention. For example, depending on the embodiment, the stacking order between the components 910 to 960 forming the thermal block 900 may be changed.
  • FIG. 10 shows a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • the multiplex PCR device 1000 may be configured to drive light to provide light to a thermal block 900, multiplex PCR chips 200 to 700, and multiplex PCR chips 200 to 700.
  • the display unit 1010 and the multiplex PCR chip (200 to 700) may further include a light detector 1020 is disposed to be driven to receive light.
  • the light providing unit 1010 may be a module for providing light to the multiplex PCR chips 200 to 700.
  • the light providing unit 1010 may include a light source for emitting light, such as a light emitting diode (LED) light source, a laser light source, a first light filter for selecting light having a predetermined wavelength from light emitted from the light source, and It may include a first optical lens for collecting the light emitted from the first optical filter to increase the intensity of the emitted light.
  • the light provider 1010 may further include a first aspherical lens disposed to spread light between the light source and the first light filter. That is, by adjusting the arrangement direction of the first aspherical lens, it is possible to extend the light range emitted from the light source to reach the measurable area.
  • the configuration of the light providing unit 1010 is not limited thereto.
  • the light detector 1020 is a module for receiving the light emitted from the multiplex PCR chips 200 to 700 and measuring a PCR reaction product performed by the multiplex PCR chips 200 to 700. Light emitted from the light passes through or reflects through the multiplex PCR chip 200 to 700, specifically, the reaction region 224 or the probe 240 of the multiplex PCR chip 200 to 700, in this case generated by nucleic acid amplification.
  • the optical detector 1020 may detect the optical signal.
  • the light detector 1020 is a predetermined wavelength from the light emitted from the second optical lens, the second optical lens to collect the light emitted from the multiplex PCR chip (200 to 700) to increase the intensity of the emitted light It may include a second optical filter for selecting the light having a light analyzer for detecting an optical signal from the light emitted from the second optical filter.
  • a second aspherical lens and / or a second aspherical lens disposed between the second optical filter and the optical analyzer and / or between the second aspherical lens and the optical analyzer are arranged to integrate light emitted from the second optical filter.
  • a photodiode integrated circuit arranged to remove noise of the emitted light and to amplify the light emitted from the second aspherical lens.
  • the light providing unit 1010 can detect the multiplex PCR product by using only one light source and the filter, without having to provide a plurality of light sources and filters.
  • the light detection unit 1020 can also detect a multiplex PCR product even if only one filter is provided. This configuration of the light providing unit 1010 and the light detecting unit 1020 can reduce the size of the optical equipment and reduce the equipment cost, as well as reduce the time required for detection, compared to the conventional multiplex PCR device. Can be.
  • the targets are monitored in real time by monitoring the reaction result by the amplification of the nucleic acid in the reaction region 224, particularly in the probe 240. Whether to amplify the nucleic acid sequence and the degree of amplification can be measured and analyzed in real time.
  • the multiplex PCR apparatus 1000 adjusts a traveling direction of light so that the light emitted from the light providing unit 1010 may reach the light detecting unit 1020, and may be determined in advance. It may further comprise at least one dichroic filter for separating light having a wavelength.
  • the dichroic filter is a module that reflects light at an angle selectively transmitted or selectively adjusted according to the wavelength.
  • the first dichroic filter is inclined at an angle of about 45 degrees with respect to the optical axis of the light emitted from the light providing unit 1010, so that the light is selectively transmitted according to its wavelength and the long wavelength component is at right angles. It can be reflected to reach multiplex PCR chips 200-700.
  • the second dichroic filter is disposed at an angle of about 45 degrees with respect to the optical axis of the light reflected from the multiplex PCR chip 200 to 700 and the thermal block, and the light is selectively short-wavelength component depending on its wavelength. And the long wavelength component may be reflected at right angles to reach the photodetector 1020.
  • the light providing unit 1010 and the light detecting unit 1020 are shown to be disposed on the multiplex PCR chips 200 to 700 and the thermal block 900 (reflective type), but this is regarded as an example. It may be arranged in various locations according to the embodiment to which the invention is applied. For example, the light providing unit 1010 and the light detecting unit 1020 may be disposed (transmitted) above and below the multiplex PCR chip 200 to 700 and the thermal block 900.
  • 11A and 11B show a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • the multiplex PCR device 1100 includes a substrate 1110; A first row block 900A disposed on the substrate 1110 and a second row block 900B spaced apart from the first row block 900A; It may include a chip holder 1120 on which the multiplex PCR chips 200 to 700 are mounted and a driving unit 1130 to move the chip holder 1120.
  • the substrate 1110 has no change in its physical and / or chemical properties due to the heating and temperature maintenance of the first thermal block 900A and the second thermal block 900B, and the first thermal block 900A and the second thermal block And any material having a material such that mutual heat exchange does not occur between 900B.
  • the substrate 1110 may include or consist of a material such as plastic.
  • the first row block 900A and the second row block 900B are for maintaining a temperature for performing a denaturation step, an annealing step and an extension (or amplification) step for amplifying a nucleic acid, which will be described with reference to FIG. 9.
  • the description is the same as the column block 900 described above, and thus redundant descriptions are omitted.
  • Each of the thermal blocks 900A, 900B may be implemented to maintain an appropriate temperature for performing the denaturation step, or the annealing and extension (or amplification) steps.
  • the thermal blocks 900A, 900B may maintain 50 ° C. to 100 ° C., and preferably, 90 ° C. to 100 ° C.
  • the denaturation step when the denaturation step is performed in the thermal blocks 900A, 900B, preferably Preferably, it may be maintained at 95 ° C., and may be maintained at 55 ° C. to 75 ° C., preferably at 72 ° C., when performing annealing and extension (or amplification) steps in thermal blocks 900A and 900B.
  • the temperature is not limited so long as the denaturation step or the annealing and extension (or amplification) step can be performed.
  • the first row block 900A and the second row block 900B may be spaced apart at a predetermined distance such that mutual heat exchange does not occur.
  • the denaturation step and annealing and extension are performed. Accurate temperature control of (or amplification) steps is possible.
  • the multiplex PCR chips 200 to 700 are in contact with one surface of each of the row blocks 900A and 900B, the first row block 900A and the second row block 900B are the multiplex PCR chips 200 to 700.
  • the contact surface with 700 may be heated and temperature maintained as a whole, so that the fluid in the multiplex PCR chips 200 to 700 may be uniformly heated and temperature maintained.
  • the chip holder 1120 may be equipped with multiplex PCR chips 200 to 700.
  • the inner wall of the chip holder 1120 may have a shape and structure to be fixedly mounted to the outer walls of the multiplex PCR chips 200 to 700 so that the multiplex PCR chips 200 to 700 do not separate from the chip holder 1120.
  • the multiplex PCR chip 200 to 700 may be detachable to the chip holder 1120.
  • the chip holder 1120 may be operably connected to the driving unit 1130.
  • the driver 1130 may move the chip holder 1120 left and right and / or up and down on the thermal blocks 900A and 900B.
  • the driver 1130 may include all means for allowing the chip holder 1120 to move left and right and / or up and down over the first row block 900A and the second row block 900B.
  • the chip holder 1120 is capable of reciprocating between the first row block 900A and the second row block 900B, and by the vertical movement of the drive unit 1130, The holder 1120 may be in contact with and separated from the first row block 900A and the second row block 900B.
  • the driving unit 1130 includes a rail 1132 extending in the left and right directions, and a connecting member 1134 slidably moved in the left and right directions through the rail 1132 and slidable in the vertical direction.
  • the chip holder 1120 may be disposed at one end of the connection member 1134.
  • the driver 1130 reciprocates the multiplex PCR chips 200 to 700 mounted on the chip holder 1120 while reciprocating between the first row block 900A and the second row block 900B.
  • the reaction can be carried out.
  • the first heat block 900A may be heated and maintained at a temperature for the denaturation step, eg, 90 ° C. to 100 ° C., preferably at 95 ° C.
  • the second row block 900B may be heated and maintained at a temperature for an annealing and extension (or amplification) step, eg, 55 ° C. to 75 ° C., preferably at 72 ° C.
  • the chip holder 1120 equipped with the flex PCR chips 200 to 700 may be contacted with the first row block 900A to perform the first denaturation step of the multiplex PCR (step x).
  • the coupling member 1134 of the driving unit 1130 is controlled to move the multiplex PCR chips 200 to 700 upward, thereby to move the chip holder 1120 on which the multiplex PCR chips 200 to 700 are mounted.
  • the first denaturation step of the multiplex PCR is terminated by separating from the thermal block 900A, and the multiplex PCR chips 200 to 700 are moved onto the second thermal block 900B through the rail 1132 of the driving unit 1130. (Y step).
  • the coupling member 1134 of the driving unit 1130 is controlled to move the multiplex PCR chips 200 to 700 downward to move the chip holder 1120 on which the multiplex PCR chips 200 to 700 are mounted.
  • the thermal block 900B may be contacted to perform the first annealing and extension (or amplification) step of the multiplex PCR (step z).
  • the multiplex PCR chip 200 to 700 is moved upward by controlling the connection member 1134 of the driving unit 1130, so that the chip holder 1120 on which the multiplex PCR chip 200 to 700 is mounted is second. Separating from the row block 900B terminates the first annealing and extension (or amplification) step of the multiplex PCR, and passes the multiplex PCR chips 200 to 700 through the rail 1132 of the driver 1130 in a first row.
  • the nucleic acid amplification reaction can be performed by repeating steps x, y, and z (circulation step).
  • FIG. 12 illustrates a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • the light providing unit 1010 and the light detecting unit 1020 may be disposed with the first column block 900A and the second column block 900B interposed therebetween. have.
  • a through part 1136 may be formed in the driver 1130 to pass light emitted from the light providing part 1010 to measure light.
  • the multiplex PCR chip 200 to 700 may be formed of a light transmissive material. It may be a light transmissive plastic material.
  • the nucleic acid is amplified in the multiplex PCR chips 200 to 700 during the nucleic acid amplification reaction by the multiplex PCR device 1200.
  • the degree can be detected in real time.
  • the multiplex PCR chip reciprocates between the first row block 900A and the second row block 900B to perform each step of the PCR reaction.
  • the driving unit 1130 may stop the multiplex PCR chip 200 to 700 on the spaced space between the first row block 900A and the second row block 900B.
  • the light is emitted from the light providing unit 1010, and the emitted light is the multiplex PCR chip 200 to 700, specifically, the reaction region 224 or the probe 240 of the multiplex PCR chip 200 to 700. Since it passes through, the light detector 1020 can detect the optical signal generated by the amplification of the nucleic acid.
  • the reaction result of the amplification of the nucleic acid in the reaction region 224, in particular the probe 240, in real time during each cyclic step of the multiplex PCR reaction is monitored in real time.
  • the amount of target nucleic acid sequence can thereby be measured and analyzed in real time.
  • the light providing unit 1010 is shown at the bottom and the light detecting unit 1020 is located at the top. However, the light providing unit 1010 is at the top and the light detecting unit 1020 is at the bottom. Can be located.
  • FIGS. 11A, 11B, and 12 a multiplex PCR apparatus for performing a PCR reaction using two column blocks 900A and 900B is illustrated, but this is merely an example, and the heat used to perform the PCR reaction is illustrated.
  • the number of blocks can vary. For example, only one column block may be used for one multiplex PCR chip 200 to 700.
  • Figure 13 shows an experimental example of a multiplex PCR device according to an embodiment of the present invention.
  • a probe was prepared, spaced apart on a multiplex PCR chip, and a PCR reagent capable of being probed by the probe was injected, followed by PCR and fluorescence measurement.
  • a prepolymer (or hydrogel solution) is prepared by mixing predetermined reagents, and a probe solution is prepared by mixing the prepolymer solution with an Ersinia enterocolitica forward primer. .
  • the reagent composition of the prepolymer solution is as follows.
  • composition of the probe solution is as follows.
  • the probe solution may be placed in a multiplex PCR chip, and then irradiated with ultraviolet light to cure. The cured solution is then washed with the wash solution.
  • a PCR reagent including a reverse primer capable of complementarily binding to a probe was injected with 20 uL into a multiplex PCR chip, followed by fluorescence measurement after PCR.
  • composition of the PCR reagent is as follows.
  • PCR driving conditions are as follows.
  • the experimental results of the multiplex PCR chip of the present invention according to the above conditions are shown.
  • a plurality of probes that are specifically hybridized with sequences of different nucleic acid molecules are spaced apart from each other to thereby sequence the nucleic acid molecules hybridized by the probes based on the positions between the probes.

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 장치가 개시된다. 상기 멀티플렉스 PCR 장치는 서로 상이한 다수의 핵산 분자를 동시에 탐지하는 멀티플렉스 PCR 칩을 포함하고, 상기 멀티플렉스 PCR 칩에는 상기 핵산 분자의 서로 상이한 증폭된 서열과 특이적으로 혼성화되는 다수의 혼성화 반응용 프로브가 서로 이격하여 고착되는 것을 특징으로 할 수 있다.

Description

멀티플렉스 ＰＣＲ 칩 및 이를 포함하는 멀티플렉스 ＰＣＲ 장치
본 발명은 멀티플렉스 PCR 칩 및 이를 포함하는 멀티플렉스 PCR 장치에 관한 것으로서, 더 구체적으로는 다수의 프로브 간의 위치에 기초하여 서로 상이한 복수의 핵산 분자를 동시에 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 칩 및 이를 포함하는 멀티플렉스 PCR 장치에 관한 것이다.
본 발명은 보건복지부 한국보건산업진흥원의 보건의료연구개발사업의 지원을 받아 수행한 연구로부터 도출된 것이다[과제고유번호: HI13C2262, 연구과제명: "말라리아 현장검사용 유전자 초고속 진단을 위한 랩칩 기반 다채널 동시다중검출 전과정 자동화 Real-time PCR 시스템 개발"].
중합효소 연쇄 반응, 즉 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 핵산을 포함하는 샘플 용액을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열을 갖는 부위를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로써, 구체적으로 열변성(Denaturation), 어닐링(Annealing), 및 신장(Extension) 등의 일련의 온도 효소 반응 단계로 진행될 수 있다. PCR은 생명과학, 유전공학 및 의료 분야 등에서 분석 및 진단 목적으로 널리 사용되고 있다.
한편, 위와 같은 핵산 증폭을 통한 진단이나 특정 유전자의 검색 기법은 한번에 하나의 주형을 검색한다는 점에서 한계를 가진다. 여러 개의 주형을 증폭해야 하는 상황에서 각각의 주형을 한번에 하나씩 증폭하는 것은 번거롭고 시간을 많이 소비하는 작업이다. 예를 들면 같은 환자에게 같은 증상이 발생할지라도 발병의 원인이 여러 종류의 감염성 병원체에 의한 경우가 많아서 다양한 병원체의 진단이 개별적으로 필요하게 된다. 또한, 암이나 유전적인 결함 등은 여러 유전자의 복합적인 변이에 기인한다고 알려져 있다. 유전자 다형성(polymorphim)이나 돌연변이(mutation)는 다양한 유전자의 좌위(loci) 변화에 기인하여 추가적인 접합체(zygote)의 검사가 필요하다. 일반적인 환경에서 제한된 시료에서 추출할 수 있는 핵산의 양은 유한하므로, 제한된 양의 핵산을 이용하여 핵산 증폭을 통한 반복적인 진단이 불가능할 경우가 자주 발생할 수 있다.
따라서 같은 시료로부터 동시에 많은 주형의 핵산을 분석하는 기법이 필요하고, 이런 분석 기법은 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)로 지칭될 수 있다. 이와 관련하여 도 1은 종래의 멀티플렉스 PCR의 예시적인 프로세스를 도시한다.
도 1을 참조하면, 종래의 멀티플렉스 PCR은 하나의 반응 용기(또는 튜브(tube))에 다종의 프라이머 세트를 주입하여 PCR 수행할 수 있다. 다종의 프라이머 세트는 핵산 분자의 다양한 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 따라서 동시에 다수의 표적 핵산 서열이 증폭될 수 있다. 즉, 멀티플렉스 PCR은 한 번의 실험으로 복수의 유전자 및 질병 확인/진단 가능하고, 이를 통해 실험 횟수 및 노동력 감소시키고, 비용 절감의 효과를 제공할 수 있다.
그러나 멀티플렉스 PCR의 증폭 산물을 실시간으로 모니터링하기 위해서는 특수한 검출 장비가 요구되는데, 이는 PCR 장치의 전체적인 크기 및 복잡도를 증가시키고, 결과적으로 비용-비경제적일 수 있다. 구체적으로, 멀티플렉스 PCR의 증폭 산물의 모니터링은 증폭 반응이 진행되는 동안 여기 광선(excitation light)을 조사하고 이로부터 발생하는 형광(emission light)을 검출함으로써 수행될 수 있으며, 여기서 형광 발생을 위해서는 증폭반응 동안 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생할 수 있는 형광 염료에 의해 표지된 올리고뉴클레오타이드(즉, 프라이머 또는 프로브)를 사용하는데, 특히 멀티플렉스 PCR에서는 증폭될 수 있는 다수의 다양한 핵산 서열을 구분하기 위해, 각 핵산 서열에 특이적인 다양한 올리고뉴클레오타이드가 이용될 수 있다. 즉, 종래의 멀티플렉스 PCR에서는 다종의 표적 핵산 서열의 검출을 위해, 다종의 형광 염료가 표지되어야 하며, 또한, 다종의 형광 염료로부터의 다종의 형광 검출을 위해, 별개의 파장 대역에서의 각각의 형광 염료의 검출을 위해 최적화되는 다중 파장의 광원 및 필터가 요구된다. 이는 다중 파장별 측정 시간을 필요로 하여 핵산 서열의 검출에 소요되는 시간을 증가시키고, PCR 장치의 전체적인 크기 및 복잡도를 증가시키고, 결과적으로 비용-비경제적일 수 있다.
따라서, 전체 구조가 단순하고, 전체 PCR 반응 시간을 최소화할 뿐만 아니라, 신뢰할 수 있는 PCR 반응 수율을 얻을 수 있는 멀티플렉스 PCR 장치가 요구된다.
본 발명은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 다수의 프로브 간의 위치에 기초하여 서로 상이한 복수의 핵산 분자를 동시에 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 칩이 개시된다. 상기 멀티플렉스 PCR 칩은 서로 상이한 다수의 핵산 분자를 동시에 탐지하기 위해 상기 핵산 분자의 서로 상이한 증폭된 서열과 특이적으로 혼성화되는 다수의 혼성화 반응용 프로브(probe)를 포함하고, 상기 다수의 프로브는 서로 이격하여 고착되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 장치가 개시된다. 상기 멀티플렉스 PCR 장치는 상기 멀티플렉스 PCR 칩; 상기 멀티플렉스 PCR 칩 내의 상기 프로브를 향해 여기 광선(excitation light)을 조사하는 광 제공부; 및 상기 여기 광선에 의하여 다수의 프로브에서 발생하는 형광(emission light)을 검출하는 광 검출부를 포함하고, 상기 광 제공부 및 상기 광 검출부에 의한 검출은 단일 파장의 광을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 장치가 개시된다. 상기 멀티플렉스 PCR 장치는 상기 멀티플렉스 PCR 칩; 및 상기 멀티플렉스 PCR 칩에 접촉하여, 상기 멀티플렉스 PCR 칩에 멀티플렉스 PCR을 위한 열을 전달하는 적어도 하나의 열 블록을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 서로 상이한 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 다종의 프로브를 이격하여 배치함으로써, 이러한 프로브 간의 위치에 기초하여 프로브에 의해 혼성화되는 핵산 분자의 서열을 구분할 수 있기에, 상기 프로브에 표지하기 위한 상이한 형광 염료의 필요성을 제거할 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로브 간의 위치에 기초하여 프로브와 혼성화되는 핵산 분자의 서열이 구분가능하기 때문에, 1종의 광원 및 필터만을 사용하여 멀티플렉스 PCR 산물의 검출이 가능하다. 이는 광학 장비의 크기를 소형화하고 장비 가격을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 검출에 소요되는 시간을 감소시키는 등 멀티플렉스 PCR 장치의 동작의 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 다종의 프로브가 멀티플렉스 PCR 칩의 표면 상에서 소정의 접착 물질을 통해 결합함으로써, 더 견고한 결합력을 제공할 수 있으며, 이는 결합의 분리 및 혼성화와 세척 동안 발생하는 왜곡된 결과를 예방할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 접착 물질은 다공 구조(pore structure)를 형성할 수 있으며 다공 구조 표면에 프로브가 결합함으로써, 프로브와 멀티플렉스 PCR 산물간의 접촉 면적을 증가시켜, 반응성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 상세한 설명에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 종래의 멀티플렉스 PCR의 예시적인 프로세스를 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 사용 예를 도시한다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 열 블록을 도시한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치의 실험예를 도시한다.
이하, 본 발명에 따른 실시예들은 첨부된 도면들을 참조하여 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 실시예들을 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정되거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 장치는 특정 염기 서열을 갖는 다양한 핵산을 증폭하는 멀티플렉스 PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction)을 수행하기 위한 장치이다. 구체적으로, 멀티플렉스 PCR 장치는 특정 염기 서열을 갖는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 증폭하기 위해, 이중 가닥의 DNA를 포함하는 샘플 용액을 특정 온도, 예를 들어 약 95℃로 가열하여 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리하는 변성 단계(denaturing step), 샘플 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 분리된 단일 가닥의 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 55℃로 냉각하여 단일 가닥의 DNA의 특정 염기 서열에 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링 단계(annealing step), 및 어닐링 단계 이후 샘플 용액을 적정 온도, 예를 들어 72℃로 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중 가닥의 DNA를 형성하는 연장 (혹은 증폭) 단계(extension step)를 수행하고, 3 단계를 예를 들어, 20회 내지 40회로 반복함으로써 특정 염기 서열을 갖는 DNA를 기하급수적으로 증폭할 수 있다. 또한, 경우에 따라, PCR 장치는 어닐링 단계와 연장 (혹은 증폭) 단계를 동시에 수행할 수 있고, 이 경우 PCR 장치는 연장 단계와 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계로 구성된 2 단계를 수행함으로써, 제 1 순환을 완성할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치는 단계들을 수행하기 위한 모듈들을 포함하는 장치를 말하며, 본 명세서에 기재되지 아니한 세부적인 모듈들은 PCR을 수행하기 위한 종래 기술 중 개시되고 자명한 범위에서 모두 구비하고 있는 것을 전제로 한다.
또한, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 장치는 멀티플렉스 PCR을 수행함과 동시에 멀티플렉스 PCR 산물의 발생 유무 및 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다. 멀티플렉스 PCR 칩에 PCR 반응에 필요한 시약뿐만 아니라 형광물질이 첨가되고, PCR 산물의 생성에 따라 형광물질이 특정 파장의 광에 의해 발광함으로써 측정 및 분석 가능한 광신호를 유발하게 된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 도시한다.
도 2를 참조하면, 멀티플렉스 PCR 칩(200)은 핵산 분자의 증폭(증폭 반응), 표적 서열의 탐지(혼성화 반응) 등을 수행하기 위한 것으로서, 유체가 수용되는 하나 이상의 반응 영역(224)을 포함할 수 있다. 여기서 유체는 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 반응 완충액(PCR reaction buffer) 등을 포함하는 샘플 용액일 수 있다.
멀티플렉스 PCR 칩(200)의 적어도 일부는 광 투과성 재질로 구현될 수 있고, 바람직하게는 광 투과성 플라스틱 재질을 포함할 수 있다. 멀티플렉스 PCR 칩(200)은 플라스틱 재질을 사용하여, 플라스틱 두께 조절만으로 열 전달 효율을 증대시킬 수 있고, 제작 공정이 단순하여 제조 비용을 절감할 수 있다. 또한, 멀티플렉스 PCR 칩(200)은 전체적으로 광 투과적인 성질을 구비할 수 있기 때문에 열 블록의 일 면에 배치된 상태에서 직접적으로 광 조사가 가능하여 실시간으로 핵산 증폭 여부 및 증폭 정도를 측정 및 분석할 수 있다. 증폭 반응을 위해, 멀티플렉스 PCR 칩(200)이 열 블록에 접촉하는 경우 열 블록의 열은 멀티플렉스 PCR 칩(200)에 전달되고, 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 반응 영역(224)에 포함된 유체가 가열되거나 냉각되어 일정 온도가 유지될 수 있다. 멀티플렉스 PCR 칩(200)은 전체적으로 평면 형상을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 2에서 도시되는 바와 같이, 멀티플렉스 PCR 칩(200)은 혼성화 반응을 위해 내부에 고착된 프로브(probe, 240)를 포함할 수 있다. 프로브(240)는 PCR을 통해 증폭되는 핵산을 탐지하기 위해 증폭 반응 동안 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오타이드로서, 핵산 분자의 증폭된 서열과 특이적으로 혼성화될 수 있다. 각각의 프로브(240)는 핵산 분자의 서로 상이한 증폭된 서열에 혼성화될 수 있다.
각각의 프로브(240)는 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 표면 상에 서로 이격하여 결합될 수 있다. 이러한 결합은 예를 들어, 스포터(spotter), 어레이어(arrayer), 잉크-제트(ink-jet) 등을 이용하여 프로브(240)를 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 표면 상에 도포함으로써 수행될 수 있다. 실시예에 따라, 각각의 프로브(240)는 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 표면 상에 공유 결합되거나, 접착 물질을 통해 결합할 수 있다. 여기서 접착 물질은 하이드로겔(hydrogel), 아가로스(agarose) 및 파라핀(paraffin) 중 적어도 하나일 수 있다. 상기 접착 물질들은 종래의 프로브(240)와 멀티플렉스 PCR 칩(200) 간의 공유 결합에 비해 더 견고한 결합력을 제공할 수 있으며, 이는 결합의 분리 및 혼성화와 세척 동안 발생하는 왜곡된 결과를 예방할 수 있다. 또한, 상기 접착 물질들은 다공 구조(pore structure)를 형성할 수 있는데, 다공 구조 표면에 프로브(240)가 결합함으로써, 프로브(240)와 멀티플렉스 PCR 산물(즉, 증폭된 핵산 분자) 간의 접촉 면적을 증가시켜, 반응성을 향상시킬 수 있다. 또한, 프로브(240)는 반응 영역(224)의 상면(또는 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 상부 내면 또는 제 3 판(230)의 하부 표면)에 배치될 수 있다. PCR 반응 중에는 기포가 발생할 수 있으며, 이러한 기포는 PCR 반응 산물을 측정하는 데 있어 간섭을 일으킬 수 있으나, 도 2에서 도시되는 바와 같이, 프로브(240)가 반응 영역(224)의 상면에 배치됨으로써, 기포는 프로브(240) 주변으로 이동하게 됨으로써, 이러한 간섭을 제거하여 측정 효율을 향상시킬 수 있다.
다수의 프로브(240)에는 동일한 형광 염료가 이용될 수 있다. 종래의 멀티플렉스 PCR에서 다수의 프로브(240)에 의해 혼성화되는 핵산 분자의 서열을 구분하기 위해 서로 상이한 색을 갖는 형광 염료(dye)에 의해 표지된 프로브(240)가 이용되어야 했으나, 본 발명에서는 동일한 형광 염료가 이용되더라도, 다수의 프로브(240)가 소정의 간격으로 이격하여 배치되며, 따라서 이러한 프로브(240) 간의 위치에 기초하여 프로브(240)에 의해 혼성화되는 핵산 분자의 서열을 구분할 수 있기에, 상이한 형광 염료의 필요성을 제거할 수 있다.
이와 같은 동일한 형광 염료의 사용은 형광 염료에 의한 형광을 검출하기 위한 광학 장치를 단순화시킬 수 있다. 종래의 멀티플렉스 PCR에서는, 하나의 반응 용기 내에 핵산 분자의 증폭된 서열과 특이적으로 혼성화될 수 있는 다수의 상이한 프로브(240)가 상이한 형광 염료에 의해 표지되고, 이러한 형광 염료에 의한 형광(emission light)을 구분하기 위해 각 형광 염료에 특이적인 다수의 파장을 갖는 광학 장치가 이용되었다. 그러나, 본 발명에서는, 다종의 프로브(240)를 향해 하나의 파장을 갖는 여기 광선(excitation light)을 조사하여 동일한 염색 시료에 의한 형광, 즉 동일한 색의 형광이 발생하더라도, 프로브(240) 간의 위치에 기초하여 증폭되는 핵산 분자의 서열을 구분할 수 있다. 즉, 본 발명에서는, 1종의 광원 및 필터를 사용함으로써, 멀티플렉스 PCR 산물의 검출이 가능하며, 이는 광학 장비의 크기를 소형화하고 장비 가격을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 검출에 소요되는 시간을 감소시키는 등 멀티플렉스 PCR 장치의 동작의 효율을 향상시킬 수 있다.
도 2에서 도시되는 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 구조를 보다 상세히 살펴보면, 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 베이스로서 평판 형상의 제 1 판(210)이 제공될 수 있다. 제 1 판(210) 상에 제 2 판(220) 및 제 3 판(230)이 순차적으로 배치될 수 있다. 제 1 판(210)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질일 수 있다.
제 1 판(210) 상에 제 2 판(220)이 배치될 수 있다. 제 2 판(220)은 유체(예를 들어, 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액 등)가 유입되는 유입부(222), 유입된 유체가 이동하고 PCR 반응 및 혼성화 반응이 수행되는 반응 영역(224) 및 반응이 종료된 유체가 배출되는 유출부(226)를 포함할 수 있다. 도시되는 바와 같이, 제 2 판(220)의 반응 영역(224)은 제 2 판(220)의 표면(예를 들어, 상면 및/또는 하면)으로부터 함몰되거나 제 2 판(220)을 관통되어 형성될 수 있다. 또한, 제 2 판(220)의 유입부(222) 및 유출부(226)는 하기 더 상세히 설명할 바와 같이, 제 2 판(220)을 관통함과 동시에, 제 2 판(220)의 표면으로부터 돌출되어 형성될 수 있다.
제 2 판(220)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질일 수 있다.
또한, 제 2 판(220)의 두께는 다양할 수 있으나, 0.1 mm 내지 2.0 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 반응 영역(224)의 폭과 길이는 다양할 수 있으나, 바람직하게는 반응 영역(224)의 폭은 0.5 mm 내지 3 mm에서 선택되고, 반응 영역(224)의 길이는 20 mm 내지 60 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 제 2 판(220)의 내벽은 DNA, 단백질(protein) 흡착을 방지하기 위해 실란(silane) 계열, 보바인 시럼 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 등의 물질로 코팅할 수 있고, 물질의 처리는 당 업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 유입부(222)는 다양한 크기를 구비할 수 있으나, 바람직하게는 지름 1.0 mm 내지 3.0 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 유출부(226)는 다양한 크기를 구비할 수 있으나, 바람직하게는 지름 1.0 mm 내지 3.0 mm에서 선택될 수 있다.
제 2 판(220) 상에 제 3 판(230)은 배치될 수 있다. 구체적으로, 제 3 판(230)은 제 2 판(220) 상에 배치되어, 제 2 판(220)의 반응 영역(224) 중 일부 영역(즉, 제 2 판(220)의 반응 영역(224) 중 관통 영역)을 커버함과 동시에, 제 3 판(230)의 하면 중 일부 영역 상에 서로 이격 배치된 적어도 하나의 프로브(240)를 통해, PCR 반응 산물을 측정할 수 있다.
제 3 판(230)은 다양한 재질로 구현될 수 있지만, 바람직하게는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질일 수 있다. 또한, 제 3 판(230)의 두께는 다양할 수 있으나, 바람직하게는 0.1 mm 내지 2.0 mm에서 선택될 수 있다.
제 1 판(210), 제 2 판(220) 및 제 3 판(230) 중 적어도 하나의 형상은 사출성형, 핫-엠보싱(hot-embossing), 캐스팅(casting), 레이저 어블레이션(laser ablation) 등 다양한 기계적, 화학적 가공 공정에 의해 형성될 수 있다. 상기 가공 공정은 예시적인 것으로서, 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 다양한 가공 공정이 적용될 수 있다. 또한, 제 1 판(210)과 제 2 판(220) 간의 접합 및/또는 제 2 판(220)과 제 3 판(230) 간의 접합은 예를 들어, 열 접합, 초음파 접합, 자외선 접합, 용매 접합, 테이프 접합 등의 당해 분야에서 적용 가능한 다양한 접합 방법에 의해 수행될 수 있다.
실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 내부 표면 중 적어도 일부(예를 들어, 제 2 판(220)의 내벽 등)에는 표면 처리가 수행될 수 있다. 예를 들어, 표면 상에 DNA, 단백질(protein) 흡착을 방지하기 위해 실란(silane) 계열, 보바인 시럼 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 등의 물질로 코팅될 수 있으며, 이러한 표면 처리는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기술에 따라 수행될 수 있다.
또한, 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 칩(200)은 유입부(222) 및/또는 유출부(226)를 위한 별도의 커버 수단(도시되지 않음)이 구비되어, 유입부(222) 및 유출부(226)를 통한 멀티플렉스 PCR 칩(200) 내부의 오염을 방지하거나, 미세유체 칩(200)에 주입된 유체의 누출 등을 방지할 수 있다. 이러한 커버 수단은 다양한 형상, 크기 또는 재질로서 구현될 수 있다.
도 2에서 도시되는 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 형상이나 구조는 예시적인 것으로서, 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 다양한 형상이나 구조의 미세유체 칩이 이용될 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 3을 참조하면, 멀티플렉스 PCR 칩(300)의 내부 표면 중 적어도 일 영역(즉, 제 3 판(230)의 하면 중 일 영역)에는 친수성 물질(310)이 처리되어 멀티플렉스 PCR의 수행을 원활하게 할 수 있다. 있다. 친수성 물질(310)은 다양한 물질일 수 있으나, 바람직하게는 카르복시기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 및 술폰기(-SH)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 친수성 물질(310)의 처리는 산소 및 아르곤 플라즈마 처리, 코로나 방전 처리, 및 계면 활성제 도포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 처리될 수 있으나, 이는 예시적인 것으로서, 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 당해 기술분야에 공지된 다양한 처리 방법이 적용될 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 도시한다.
도 4를 참조하면, 멀티플렉스 PCR 칩(400)에서, 제 3 판(230)은 제 2 판(220)의 반응 영역(224) 중 일부 영역(즉, 제 2 판(220)의 반응 영역(224) 중 관통 영역)에 삽입 배치될 수 있다. 이를 위해 제 3 판(230)의 하면 중 일부 영역(410)은 하부 방향으로 돌출 형성될 수 있다. 이와 같이 돌출 형성되는 영역(410)이 제 2 판(220)의 반응 영역(224) 중 관통 영역을 커버함과 동시에, 관통 영역으로의 삽입을 통한 제 3 판(230)과 제 2 판(220)의 용이한 접합 정렬을 달성할 수 있다.
도 4에서 도시되는 멀티플렉스 PCR 칩(400)의 형상은 예시적인 것으로서 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 다양한 형상이 적용될 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩을 도시한다.
구체적으로, 도 5의 (a)는 멀티플렉스 PCR 칩(500)의 평면도를 도시하고, 도 5의 (b)는 멀티플렉스 PCR 칩(500)의 A-A' 방향의 단면도를 도시하며, 도 5의 (c)는 도 5의 (a) 및 (b)에서 도시되는 멀티플렉스 PCR 칩(500)의 내부 표면의 저면 사시도를 도시한다.
도 5를 참조하면, 멀티플렉스 PCR 칩(500)은 프로브 고정부(510)를 더 포함할 수 있다. 프로브 고정부(510)는 표적 서열의 탐지를 위한 프로브(240)를 수용 및 고정하기 위한 것으로서, 예를 들어, 멀티플렉스 PCR 칩(500)의 제 3 판(230)의 하면 중 일 영역에 형성되는 중심부(512) 및 중심부(512)를 둘러싸도록 돌출되는 주변부(514)로 구성될 수 있다. 여기서 중심부(512)는 프로브(240)의 수용 공간을 제공할 수 있으며, 주변부(514)는 중심부(512)에 수용된 프로브(240)의 이탈을 방지할 수 있다.
도 5에서 도시되는 프로브 고정부(510)의 형상은 예시적인 것으로서 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 다양한 형상의 프로브 고정부가 이용될 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
구체적으로, 도 6의 (a)는 멀티플렉스 PCR 칩(600)의 평면도를 도시하고, 도 6의 (b)는 멀티플렉스 PCR 칩(600)의 A-A' 방향의 단면도를 도시하며, 도 6의 (c)는 도 6의 (a) 및 (b)에서 도시되는 멀티플렉스 PCR 칩(600) 중 일부의 저면 사시도를 도시한다.
본 발명에서 반응 영역(224)은 반응 영역(224) 내에 수행되는 각종 반응(예를 들어, PCR 반응, 혼성화 반응 등)의 산물을 측정하기 위한 광 측정 영역을 포함할 수 있다. 여기서 광 측정 영역은 반응 산물로부터 방출되는 광신호가 검출되는 반응 영역(224)의 적어도 일부 영역으로서, 혼성화 반응의 결과물이 나타나는 프로브(240)가 배치되는 영역에 대응할 수 있다.
도 6을 참조하면, 멀티플렉스 PCR 칩(600)은 기포 제거부(610)를 더 포함할 수 있다. 기포 제거부(610)는 유체에 포함된 기포가 반응 영역 중 소정의 영역(예를 들어, 프로브(240) 또는 프로브 고정부(510))에 위치하는 것을 방지하기 위한 것으로서, 도시되는 바와 같이, 제 3 판(230)의 내면으로부터 하부 방향으로 돌출되어 형성될 수 있다. 구체적으로, 기포 제거부(610)는 제 3 판(230)의 하부 내면으로부터 반응 영역 내측으로 돌출되어 형성되기 때문에, 유체 내에 포함된 기포는 부력으로 인해, 기포 제거부(610)에서 주변으로 밀려서 주변 공간에 배치되게 된다. 즉, 기포는 광 측정 영역으로부터 외부로 이탈하게 됨으로써, 광 측정 영역에 존재하는 반응 산물로부터 방출되는 광신호 감도에 영향을 미치지 않게 된다.
특히, 제 3 판(230)의 적어도 일부로서 기포 제거부(610)는 광 투과성 재질로 구성될 수 있으며, 따라서, 광 측정 영역 내의 반응 산물로부터 발생하는 광신호는 기포 제거부(610)를 통과하여, 감도 저하 없이 멀티플렉스 PCR 칩(600)의 외부로 방출될 수 있다. 이와 같이, 멀티플렉스 PCR 칩(600)을 이용하여 반응 영역(224) 내(즉, 프로브(240))의 반응 산물을 측정하는 경우, 멀티플렉스 PCR 칩(600)의 극-소형화에도 불구하고, 반응 영역(224) 내에 발생한 기포의 영향을 받지 않게 되어 광신호 감도가 상당하게 증가됨으로써, 다수의 소량의 반응 산물을 동시에 신속하며 정확하게 측정할 수 있게 된다.
이러한 기포 제거부(610)의 이용은 예시적인 것으로서, 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 기포 제거부(610)는 다양한 용도로 활용될 수 있다. 예를 들어, 기포 제거부(610)는 반응 영역을 경유하는 유체의 이동 중 유체에 포함된 기포를 유체의 흐름으로부터 제거하기 위해 이용될 수 있다.
또한, 도 6에 도시되는 기포 제거부(610)의 형상은 예시적인 것으로서, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 실시예에 따라, 다양하게 변형되어 적용될 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
구체적으로, 도 7의 (a)는 멀티플렉스 PCR 칩(700)의 평면도를 도시하고, 도 7의 (b)는 멀티플렉스 PCR 칩(700)의 A-A' 방향의 단면도를 도시하며, 도 7의 (c)는 도 7의 (a) 및 (b)에서 도시되는 멀티플렉스 PCR 칩(700) 중 일부의 저면 사시도를 도시한다.
도 7을 참조하면, 기포 제거부(710)는 제 3 판(230)의 하부 내면으로부터 경사면 가지도록 연장되어 프로브 고정부(510)에 연결되는 경사면으로 이루어질 수 있다. 이와 같이, 기포 제거부(710)의 측면이 경사면으로 이루어지는 경우, 기포가 경사면을 따라 반응 영역의 상측으로 이동 가능하기 때문에, 기포가 기포 제거부(710)의 주변 공간으로 보다 용이하게 이동 배치되게 할 수 있다.
도 6 및 도 7에서 도시되지는 않으나, 실시예에 따라, 프로브 고정부는 프로브 고정부의 주변부의 저면에 형성되는 구비되는 평탄면과 평탄면의 둘레로부터 연장되어 기포 제거부에 연결되는 경사면으로 이루어질 수 있다. 이와 같이 프로브 고정부의 주변의 측면이 경사면으로 이루어지는 경우, 측면에 경사면을 갖는 기포 제거부와 마찬가지로, 프로브 주위의 기포가 경사면을 따라 광 측정 영역 외부로(또는 반응 영역의 상측으로) 용이하게 이동하기 때문에, 광 측정 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
또한, 도 6 및 도 7에서 도시되지는 않으나, 실시예에 따라, 기포 제거부는 기포 제거부의 둘레를 따라 제 3 판의 하면이 상측으로 함몰되어 형성되는 기포 포집부를 더 포함할 수 있다. 기포 포집부는, 기포 포집부 이외의 영역에 비해, 상대적으로 반응 영역의 상측에 위치하기 때문에, 기포 제거부에서 밀려난 기포는 기포 포집부에 포집될 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 사용 예를 도시한다.
도 8을 참조하면, 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 유입부(222) 및 유출부(226)에 히터(heater, 810, 810')가 인가되어, 멀티플렉스 PCR 칩 내부(즉, 반응 영역(224))을 밀봉할 수 있다.
보다 구체적으로, 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 유입부(222) 및 유출부(226) 각각은 제 2 판(220)을 관통하여 형성되는 개구부(820, 830) 및 개구부(820, 830)에 인접하여 제 2 판(220)의 표면이 돌출되어 형성되는 돌출부(840, 850)를 포함할 수 있다. 즉, 히터(810, 810')가 멀티플렉스 PCR 칩(200)의 유입부(222) 및 유출부(226)에 인가되어 열을 전달함으로써, 유입부(222) 및 유출부(226)의 돌출부(840, 850)가 융해되어, 개구부(820, 830)를 밀봉할 수 있다. 이를 통해, 유체가 유입부(222)를 통해 반응 영역(224)에 유입된 이후에, PCR 반응 등을 수행하는 과정에서 유체 중 적어도 일부가 외부로 소실되는 것을 방지할 수 있다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 열 블록을 도시한다.
도 9a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에는 적어도 하나의 열 블록(900)이 접하여 핵산 분자를 증폭하기 위한 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지할 수 있다. 여기서 열 블록(900)은 기판(910), 기판(910) 상에 배치된 발열층(920), 발열층(920) 상에 배치된 절연 보호층(930) 및 발열층(920)과 연결 배치된 전극(940)을 구비할 수 있다.
기판(910)은 내열도가 높은 플라스틱 재질, 금속 재질 등의 판재로서, 평판형으로 도시되어 있지만, 반원통형, 반구면형 등의 다양한 형상을 가질 수 있다. 또한, 기판(910)은 발열층(920)을 지지하는 역할을 수행할 수 있다.
발열층(920)은 멀티플렉스 PCR의 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장(또는 증폭) 단계를 수행하기 위한 열 블록(900)의 열원 역할을 수행할 수 있다.
일 실시예에서, 발열층(920)은 열원으로서 열선을 포함할 수 있다. 열선은 전극(940)으로부터 인가된 전력을 이용하여 발열할 수 있으며, 이러한 열선의 온도를 모니터링하기 위한 다양한 온도 센서(도시되지 않음)와 구동 가능하게 연결될 수 있다. 열선은 열 블록(900) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 열 블록(900) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭되도록 배치될 수 있다. 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭된 열선의 배치는 다양할 수 있다.
일 실시예에서, 발열층(920)을 기판(910)에 강하게 고정하기 위하여 기판(910)과 발열층(920) 사이에 접착력 강화층(도시되지 않음)이 형성될 수 있다. 접착력 강화층은 실리카 또는 폴리머로 형성될 수 있다.
절연 보호층(930)은 발열층(920)을 물리적 및/또는 전기적으로 보호하기 위한 것으로서, 절연성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 절연성 물질은 유전체 산화물, 페릴린, 나노 입자 및 고분자 필름으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한편, 절연 보호층(930)은 투명할 수 있다.
전극(940)은 발열층(920)과 직접 또는 간접적으로 연결 배치되어 발열층(920)에 전력을 공급하는 것이다. 전극(940)은 전력을 공급할 수 있는 다양한 물질이 사용될 수 있고, 예를 들어 금속 물질, 전도성 에폭시, 전도성 페이스트, 솔더 및 전도성 필름으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 도 9에 따르면, 전극(940)은 발열층(920)의 양 측면에 연결 배치되지만, 발열층(920)에 전력을 공급할 수 있다면 다양하게 작동 가능한 위치에서 연결 배치될 수 있다. 또한, 전극(940)은 멀티플렉스 PCR 장치에 포함되거나 또는 외부 배치된 전원과 전기적으로 연결될 수도 있다. 예를 들어, 전극(940)은 발열층(920)에 직접 접촉하고, 배선(도시되지 않음)을 통해 외부 회로(도시되지 않음)에 발열층(920)을 연결하며, 배선이 전극(940)에 안정적으로 고정되도록 단자가 배치될 수 있다.
멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)은 열 블록(900)의 상부 면의 적어도 일부 영역에 접촉함으로써, 열 블록(900)의 열 공급 또는 회수에 따라 가열 또는 냉각되어 멀티플렉스 PCR의 각 반응 단계를 수행할 수 있다. 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)은 열 블록(900)에 직접 또는 간접적으로 접촉하여 열 공급을 수행할 수 있다.
도 9b에 따르면, 광반사방지층(950)이 절연 보호층(930)의 상부 면에 접촉 배치되어 센싱 효율을 더욱 높일 수 있다. 구체적으로, 광반사방지층(950)은 절연보호층(930)과 조합하여 절연보호 기능 및 광반사방지 기능을 수행하며, 광반사방지 물질을 포함할 수 있다. 여기서 광반사방지 물질은 예를 들어, MgF2와 같은 불화물, SiO2, Al2O3와 같은 산화물일 수 있으나, 광반사를 방지할 수 있는 성질을 갖는 물질이라면 제한되지 않는다.
도 9c에 따르면, 흡광층(960)이 절연 보호층(930)의 상부 면에 접촉 배치되고, 흡광층(960)은 흡광 물질을 포함할 수 있다. 여기서 흡광 물질은 예를 들어, 운모(mica)일 수 있으나, 광을 흡수하는 성질을 갖는 물질이라면 제한되지 않는다. 따라서, 광원으로부터 유래된 광의 일부를 흡광층(960)이 흡수하여, 광신호의 노이즈로 작용하는 반사광의 발생을 최대한 억제할 수 있다.
도 9d에 따르면, 열 블록(900)의 하부 면에 흡광 물질을 처리하여 흡광층(960)을 형성하고, 동시에 열 블록(900)의 상부 면에 광반사방지 물질을 처리하여 광반사방지층(950)을 형성하여 센싱 효율을 더욱 높일 수 있다. 즉, 효과적인 실시간 멀티플렉스 PCR의 모니터링을 위하여 노이즈 대비 광신호 비율은 가능한 최대값을 가져야 하고, 노이즈 대비 광신호 비율은 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)으로부터 여기 광선의 반사율이 낮을수록 향상될 수 있다.
도 9a 내지 도 9d에서 도시되는 열 블록(900)의 구조 및 형상은 예시적인 것으로서, 본 발명의 실시예에 따라, 다양하게 변형되어 적용될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 따라, 열 블록(900)을 이루는 각 구성 요소(910 내지 960) 간의 적층 순서가 변경될 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 10을 참조하면, 멀티플렉스 PCR 장치(1000)는 열 블록(900), 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700), 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에 광을 제공하도록 구동 가능하게 배치된 광 제공부(1010) 및 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)으로부터 방출되는 광을 수용하도록 구동 가능하게 배치된 광 검출부(1020)를 더 포함할 수 있다.
광 제공부(1010)는 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에 광을 제공하기 위한 모듈일 수 있다. 일 실시예에서 광 제공부(1010)는 LED(Light Emitting Diode) 광원, 레이저 광원 등과 같이 광을 발출하는 광원, 광원으로부터 방출되는 광 중에서 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 제 1 광 필터, 및 제 1 광 필터로부터 방출되는 광을 포집하여 방출광의 강도를 증가시키는 제 1 광 렌즈를 포함할 수 있다. 부가적인 실시예에 따라, 광 제공부(1010)는 광원과 제 1 광 필터 사이에 빛을 퍼지게 하도록 배치된 제 1 비구면 렌즈를 더 포함할 수 있다. 즉, 제 1 비구면 렌즈의 배치 방향을 조정함으로써, 광원으로부터 방출되는 광 범위를 확장하여 측정 가능한 영역에 도달하게 할 수 있다. 다만, 광 제공부(1010)의 구성은 이에 한정되지 않는다.
광 검출부(1020)는 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)으로부터 방출되는 광을 수용하여 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에서 수행되는 PCR 반응 산물을 측정하기 위한 모듈로서, 광 제공부(1010)로부터 방출된 광은 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700), 구체적으로 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)의 반응 영역(224) 또는 프로브(240)를 통과하거나 반사하고, 이 경우 핵산 증폭에 의해 발생하는 광신호를 광 검출부(1020)가 검출할 수 있다. 일 실시예에서, 광 검출부(1020)는 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)으로부터 방출되는 광을 포집하여 방출광의 강도를 증가시키는 제 2 광 렌즈, 제 2 광 렌즈로부터 방출되는 광에서 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 제 2 광 필터 및 제 2 광 필터로부터 방출되는 광으로부터 광신호를 검출하는 광 분석기를 포함할 수 있다. 부가적인 실시예에 따라, 제 2 광 필터와 광 분석기 사이에 제 2 광 필터로부터 방출되는 광을 집적하도록 배치된 제 2 비구면 렌즈 및/또는 제 2 비구면 렌즈와 광 분석기 사이에 제 2 비구면 렌즈로부터 방출되는 광의 노이즈(noise)를 제거하고 제 2 비구면 렌즈로부터 방출되는 광을 증폭하도록 배치된 광다이오드 집적소자(photodiode integrated circuit)를 더 포함할 수 있다.
광 제공부(1010)가 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700) 내의 다종의 프로브(240)를 향해 하나의 파장을 갖는 여기 광선을 조사하여 동일한 염색 시료에 의한 형광, 즉 동일한 색의 형광이 발생하더라도, 프로브(240) 간의 위치에 기초하여 증폭되는 핵산 분자의 서열을 구분할 수 있다. 따라서, 광 제공부(1010)는 다종의 광원 및 필터를 구비할 필요 없이, 1종의 광원 및 필터만을 사용함으로써, 멀티플렉스 PCR 산물의 검출이 가능하다. 마찬가지로 광 검출부(1020) 또한 1종의 필터만 구비하고도 멀티플렉스 PCR 산물의 검출이 가능하다. 광 제공부(1010) 및 광 검출부(1020)의 이러한 구성은 종래의 멀티플렉스 PCR 장치에 비해, 광학 장비의 크기를 소형화하고 장비 가격을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 검출에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다.
또한, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에서 멀티플렉스 PCR의 각 순환 단계가 진행되는 동안 반응 영역(224) 내에서, 특히 프로브(240)에서 핵산의 증폭에 의한 반응 결과를 실시간으로 모니터링함으로써 표적 핵산 서열의 증폭 여부 및 증폭 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다.
도 10에는 도시되지 않으나, 실시예에 따라, 멀티플렉스 PCR 장치(1000)는 광 제공부(1010)로부터 방출된 광이 광 검출부(1020)까지 도달할 수 있도록 광의 진행 방향을 조절하고, 미리 결정된 파장을 갖는 광을 분리하기 위한 적어도 하나의 이색성 필터를 더 포함할 수 있다. 여기서 이색성 필터(dichroic filter)는 광을 파장에 따라 선택적으로 투과 또는 선택적으로 조절된 각도로 반사시키는 모듈이다. 예를 들어, 제 1 이색성 필터가 광 제공부(1010)으로부터 방출되는 광의 광축에 대하여 약 45도 각도로 경사지게 배치되어, 광을 그 파장에 따라 선택적으로 단파장 성분을 투과시키고 장파장 성분을 직각으로 반사시켜 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에 도달하게 할 수 있다. 또한, 예를 들어, 제 2 이색성 필터가 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700) 및 열 블록으로부터 반사된 광의 광축에 대하여 약 45도 각도로 경사지게 배치되고, 광을 그 파장에 따라 선택적으로 단파장 성분을 투과시키고 장파장 성분을 직각으로 반사시켜 광 검출부(1020)에 도달하게 할 수 있다.
도 10에서는, 광 제공부(1010) 및 광 검출부(1020)가 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700) 및 열 블록(900) 상부에 배치되는 것으로 도시되어 있으나(반사형), 이는 예시적인 것으로서 본 발명이 적용되는 실시예에 따라 다양한 위치에 배치될 수 있다. 예를 들어, 광 제공부(1010) 및 광 검출부(1020)는 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700) 및 열 블록(900)을 중심으로 위 및 아래에 배치(투과형)될 수 있다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 11a를 참조하면, 멀티플렉스 PCR 장치(1100)는 기판(1110); 기판(1110) 상에 배치된 제 1 열 블록(900A)과 제 1 열 블록(900A)과 이격 배치된 제 2 열 블록(900B); 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)가 장착되는 칩 홀더(1120) 및 칩 홀더(1120)를 이동시키는 구동부(1130)를 포함할 수 있다.
기판(1110)은 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B)의 가열 및 온도 유지로 인해 그 물리적 및/또는 화학적 성질이 변하지 않고, 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B) 사이에서 상호 열 교환이 일어나지 않도록 하는 재질을 갖는 모든 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기판(1110)은 플라스틱 등의 재질을 포함하거나 그러한 재질로 구성될 수 있다.
제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B)은 핵산을 증폭하기 위한 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하기 위한 것으로서, 도 9를 참조하여 설명된 열 블록(900)과 마찬가지로 설명되며, 따라서 중복되는 설명은 생략된다. 열 블록(900A, 900B) 각각은 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 열 블록(900A, 900B)은 50℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 열 블록(900A, 900B)에서 변성 단계를 수행하는 경우 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95℃를 유지할 수 있으며, 열 블록(900A, 900B)에서 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55℃ 내지 75℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72℃를 유지할 수 있다. 다만, 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 제 1 열 블록(900A)과 제 2 열 블록(900B)은 상호 열 교환이 일어나지 않도록 미리 결정된 거리로 이격 배치될 수 있다. 이에 따라, 제 1 열 블록(900A)과 제 2 열 블록(900B) 사이에서 열 교환이 일어나지 않기 때문에, 미세한 온도 변화에 의해서도 중대한 영향을 받을 수 있는 핵산 증폭 반응에 있어서, 변성 단계와 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 정확한 온도 제어가 가능하다. 또한, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 각 열 블록(900A, 900B)의 일 면에 접촉되는 경우 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B)은 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)과의 접촉면을 전체적으로 가열 및 온도 유지할 수 있어서, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700) 내의 유체를 균일하게 가열 및 온도 유지할 수 있다. 종래 단일 열 블록을 사용하는 멀티플렉스 PCR 장치는 단일 열 블록에서의 온도 변화율이 초당 3 내지 7℃ 범위 내에서 이루어지는데 반해, 멀티플렉스 PCR 장치(1100)는 2개의 열 블록을 포함하며, 따라서 각각의 열 블록(900A, 900B)에서의 온도 변화율이 초당 20 내지 40℃ 범위 내에서 이루어져 멀티플렉스 PCR 반응 시간을 크게 단축시킬 수 있다.
칩 홀더(1120)에는 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 장착될 수 있다. 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 칩 홀더(1120)로부터 이탈하지 않도록 칩 홀더(1120)의 내벽은 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)의 외벽과 고정 장착되기 위한 형상 및 구조를 가질 수 있다. 또한, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)은 칩 홀더(1120)에 착탈 가능할 수 있다. 칩 홀더(1120)는 구동부(1130)에 구동 가능하게 연결될 수 있다.
구동부(1130)는 열 블록(900A, 900B) 상으로 칩 홀더(1120)를 좌우 및/또는 상하 이동시킬 수 있다. 구체적으로, 구동부(1130)는 칩 홀더(1120)를 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B) 위로 좌우 및/또는 상하 이동 가능하게 하는 모든 수단을 포함할 수 있다. 구동부(1130)의 좌우 이동에 의해, 칩 홀더(1120)는 제 1 열 블록(900A)과 제 2 열 블록(900B) 사이에서 왕복 운동이 가능하고, 구동부(1130)의 상하 이동에 의해, 칩 홀더(1120)는 제 1 열 블록(900A)과 제 2 열 블록(900B)에 접촉 및 분리될 수 있다. 이를 위해, 구동부(1130)는 좌우 방향으로 연장된 레일(1132), 및 레일(1132)을 통해 좌우 방향으로 슬라이딩 이동 가능하게 배치되고, 상하 방향으로 슬라이딩 이동 가능한 연결 부재(1134)를 포함하고, 연결 부재(1134)의 일 단부에 칩 홀더(1120)가 배치될 수 있다.
도 11b를 참조하면, 구동부(1130)는 칩 홀더(1120)에 장착된 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B) 사이에서 왕복 이동시키면서 PCR 반응을 수행할 수 있다.
먼저, 제 1 열 블록(900A)을 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90℃ 내지 100℃로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 95℃로 가열 및 유지할 수 있다. 또한, 제 2 열 블록(900B)을 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 55℃ 내지 75℃로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 72℃로 가열 및 유지할 수 있다.
멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 칩 홀더(1120)에 장착한 후 또는 이와 동시에 구동부(1130)의 연결 부재(1134)를 제어하여 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 하향 이동시켜, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 장착된 칩 홀더(1120)를 제 1 열 블록(900A)에 접촉시켜 멀티플렉스 PCR의 제 1 변성 단계를 수행할 수 있다(x 단계).
계속해서, 구동부(1130)의 연결 부재(1134)를 제어하여 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 상향 이동시켜, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 장착된 칩 홀더(1120)를 제 1 열 블록(900A)으로부터 분리시켜 멀티플렉스 PCR의 제 1 변성 단계를 종료하고, 구동부(1130)의 레일(1132) 통해 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 제 2 열 블록(900B) 상으로 이동시킬 수 있다(y 단계).
계속해서, 구동부(1130)의 연결 부재(1134)를 제어하여 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 하향 이동시켜, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 장착된 칩 홀더(1120)를 제 2 열 블록(900B)에 접촉시켜 멀티플렉스 PCR의 제 1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있다(z 단계).
마지막으로, 구동부(1130)의 연결 부재(1134)를 제어하여 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 상향 이동시켜, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)이 장착된 칩 홀더(1120)를 제 2 열 블록(900B)으로부터 분리시켜 멀티플렉스 PCR의 제 1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 종료하고, 구동부(1130)의 레일(1132)을 통하여 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 제 1 열 블록(900A)의 위로 이동시킨 후 x, y, z 단계를 반복함으로써, 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다(순환 단계).
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치를 도시한다.
도 12를 참조하면, 멀티플렉스 PCR 장치(1200)에서는, 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B)을 사이에 두고 광 제공부(1010)와 광 검출부(1020)가 배치될 수 있다. 광 측정을 위해 구동부(1130)에는 광 제공부(1010)으로부터 방출되는 광을 통과시키기 위한 관통부(1136)가 형성될 수 있으며, 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)은 광투과성 재질, 구체적으로 광투과성 플라스틱 재질일 수 있다.
도 12에서 도시되는 광 제공부(1010) 및 광 검출부(1020)의 배치에 의해, 멀티플렉스 PCR 장치(1200)에 의한 핵산 증폭 반응 중에 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출할 수 있다. 구체적으로, 멀티플렉스 PCR 칩은 PCR 반응의 각 단계를 수행하기 위해 제 1 열 블록(900A) 및 제 2 열 블록(900B) 사이를 왕복하게 된다. 이러한 과정에서, 구동부(1130)는 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)을 제 1 열 블록(900A)과 제 2 열 블록(900B) 사이의 이격된 공간 상에 정지시킬 수 있다. 이때, 광 제공부(1010)으로부터 광을 방출시키고, 방출된 광은 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700), 구체적으로 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)의 반응 영역(224) 또는 프로브(240)를 통과하게 되므로, 핵산의 증폭에 의해 발생하는 광신호를 광 검출부(1020)가 검출할 수 있다.
이와 같이, 멀티플렉스 PCR 장치(1100)에 따르면, 멀티플렉스 PCR 반응의 각 순환 단계가 진행되는 동안 반응 영역(224) 내에서, 특히 프로브(240)에서 핵산의 증폭에 의한 반응 결과를 실시간으로 모니터링함으로써 표적 핵산 서열의 양을 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다.
도 12에서는 광 제공부(1010)가 하단에, 광 검출부(1020)가 상단에 위치하는 것으로 도시되나, 이는 예시적인 것으로서, 광 제공부(1010)가 상단에, 광 검출부(1020)가 하단에 위치할 수 있다.
한편, 도 11a, 11b 및 도 12에서는 두 개의 열 블록(900A, 900B)을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 멀티플렉스 PCR 장치가 도시되고 있지만, 이는 예시적인 것으로서, PCR 반응을 수행하는 데 이용되는 열 블록의 개수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 하나의 멀티플렉스 PCR 칩(200 내지 700)에 대해 하나의 열 블록만이 이용될 수 있다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티플렉스 PCR 장치의 실험예를 도시한다.
본 실험예는 프로브를 제조하여 멀티플렉스 PCR 칩에 이격 배치하고, 상기 프로브에 의해 검침 가능한 PCR 시약을 주입한 후, PCR을 수행 및 형광 측정한 것이다.
먼저, 소정의 시약을 혼합하여 프리폴리머(prepolymer)(또는 하이드로겔(hydrogel) 용액을 제조하고, 프리폴리머 용액을 에르시니아 엔테로콜리티카 정방향 프라이머(Yersinia enterocolitica Forward Primer) 등과 혼합하여 프로브 용액을 제조하게 된다.
프리폴리머 용액의 시약 조성은 다음과 같다.
표 1
구성 부피(uL)
PEGDA 200
PEG 400
Darocur 1173 50
3x TE Buffer 350
또한, 프로브 용액의 조성은 다음과 같다.
표 2
구성 부피(uL)
프리폴리머 용액 90
Yersinia enterocolitica Reverse Primer 10
계속해서, 프로브 용액을 멀티플렉스 PCR 칩 내에 배치한 후, 자외선 조사하여 경화시킬 수 있다. 경화된 용액은 이후에 세척액을 이용하여 세척된다. 프로브에 상보적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 PCR 시약을 멀티플렉스 PCR 칩 내에 20uL 주입 후, PCR 수행 후 형광 측정하였다.
PCR 시약의 조성은 다음과 같다.
표 3
구성 부피(uL)
NBS SYBR green 2x master mix 10
Yersinia enterocolitia Reverse Primer 2
Yersinia enterocolitia Template 1
DW 7
또한, PCR 구동 조건은 다음과 같다.
표 4
PCR 단계 온도(도) 시간(초) 사이클
Pre-Denaturation 95 60 1
Denaturation 95 10 40
Annealing 68 10
도 13을 참조하면, 상기 조건에 따른 본 발명의 멀티플렉스 PCR 칩의 실험결과가 도시된다. 도시되는 바와 같이, 멀티플렉스 PCR 칩에 의하면, 서로 상이한 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 다종의 프로브를 이격하여 배치함으로써, 이러한 프로브 간의 위치에 기초하여 프로브에 의해 혼성화되는 핵산 분자의 서열을 구분할 수 있다. 이는 각각의 프로브에 표지하기 위한 상이한 형광 염료의 사용 및 복잡한 구성의 광원 및 필터를 이용한 PCR 산출의 검출의 필요성을 제거할 수 있다. 따라서, 광학 장비의 크기를 소형화하고 장비 가격을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 검출에 소요되는 시간을 감소시키는 등 멀티플렉스 PCR 장치의 동작의 효율을 향상시킬 수 있다.
이상에서와 같이 도면과 명세서에서 최적 실시 예가 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 서로 상이한 다수의 핵산 분자를 동시에 탐지하기 위해 상기 핵산 분자의 서로 상이한 증폭된 서열과 특이적으로 혼성화되는 다수의 혼성화 반응용 프로브(probe)를 포함하고,
    상기 다수의 프로브는 서로 이격하여 고착되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction) 칩.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 칩은 상기 멀티플렉스 PCR 칩의 내부 표면과 상기 프로브 사이에 배치되어, 상기 멀티플렉스 PCR 칩의 표면과 상기 프로브 사이의 결합력을 향상시키는 접착 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 접착 물질은 상기 프로브와 상기 핵산 분자 간의 접촉 면적을 증가시키도록 다공 구조(pore structure)를 형성하여 상기 다공 구조에 상기 프로브가 결합되도록 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 다공 구조는 하이드로겔(hydrogel), 아가로스(agarose) 및 파라핀(paraffin) 중 적어도 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브는, 상기 멀티플렉스 PCR 칩의 상부 내면에 배치되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 칩은, 평판 형상의 제 1 판; 상기 제 1 판 상에 배치되고, 유입부, 반응 영역 및 유출부를 포함하는 제 2 판; 및 상기 제 2 판 상에 배치되어 상기 반응 영역을 커버하고, 하부 표면에 상기 프로브가 이격 배치되는 제 3 판을 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 칩은, 상기 프로브가 배치되는 중심부 및 상기 중심부를 둘러싸도록 상기 중심부에 인접하여 돌출 형성되는 주변부로 구성되는 프로브 고정부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 칩은, 상기 반응 영역 내의 기포가 상기 프로브 상에 위치하는 것을 방지하기 위해 상기 제 3 판의 하부 내면으로부터 하부 방향으로 돌출되어 형성되는 광 투과성 재질의 기포 제거부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 칩.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 제 1 판은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질이고,
    상기 제 2 판 및 상기 제 3 판 각각은 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET) 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 제 2 판의 상기 반응 영역 중 관통된 영역에 대응하도록 상기 제 3 판의 하면 중 적어도 일 영역이 돌출 형성되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  11. 제 6 항에 있어서,
    상기 유입부 및 상기 유출부 각각은 유체가 유입되는 개구부 및 상기 개구부에 인접하여 돌출 형성되는 돌출부를 포함하고, 상기 돌출부는 열을 인가받아 융해됨으로써 상기 개구부를 밀봉하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩.
  12. 제 1 항에 따른 멀티플렉스 PCR 칩;
    상기 멀티플렉스 PCR 칩 내의 상기 프로브를 향해 여기 광선(excitation light)을 조사하는 광 제공부; 및
    상기 여기 광선에 의하여 다수의 프로브에서 발생하는 형광(emission light)을 검출하는 광 검출부를 포함하고,
    상기 광 제공부 및 상기 광 검출부에 의한 검출은 단일 파장의 광을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 장치.
  13. 제 1 항에 따른 멀티플렉스 PCR 칩; 및
    상기 멀티플렉스 PCR 칩에 접촉하여, 상기 멀티플렉스 PCR 칩에 멀티플렉스 PCR을 위한 열을 전달하는 적어도 하나의 열 블록을 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 장치.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 멀티플렉스 PCR 칩이 장착되는 칩 홀더; 및 상기 칩 홀더를 상기 열 블록 위로 좌우 및 상하 이동시키는 구동부를 더 포함하고, 상기 열 블록은 제 1 열 블록 및 제 2 열 블록을 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 장치.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 제 1 열 블록 및 상기 제 2 열 블록 중 하나의 열 블록은 PCR 반응의 변성 단계 온도를 유지하도록 구현되고, 다른 하나의 열 블록은 PCR 반응의 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도를 유지하도록 구현된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 장치.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 제 1 열 블록과 상기 제 2 열 블록은 상호 열 교환이 일어나지 않도록 이격 배치되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 장치.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 구동부는 좌우 방향으로 연장된 레일, 및 레일을 통해 좌우 방향으로 슬라이딩 이동 가능하게 배치되고, 상하 방향으로 슬라이딩 이동 가능한 연결 부재를 포함하고, 연결 부재의 일 말단은 칩 홀더가 배치되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 장치.
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