KR20130065337A - 식중독균 검출용 키트 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식중독균 검출용 키트 및 이를 이용하여 여러 종류의 식중독균을 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하면, 여러 종류의 식중독균을 동시에 효율적으로 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 식중독균 검출용 키트 및 이를 이용하여 여러 종류의 식중독균을 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다.
식중독균은 주로 육류, 낙농제품, 식수 등 음식을 통하여 전파되므로, 음식과 같은 시료에서 식중독균의 존재 여부를 신속하고 경제적으로 확인할 수 있는 방법이 요구된다. 식중독균을 검출하기 위한 통상적 방법은 선택적 배지에서 시료를 배양하여, 식중독균로 추측되는 균을 분리한 후, 이를 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인하는 것이다. 그러나, 항체를 이용한 면역학적인 방법은 높은 정확도로 세균의 검출이 가능하지만, 많은 양의 시료가 필요하고, 각 진단에 필요한 항체를 생산하기 위해서는 해당 세균의 단백질 순화, 생산 또는 펩타이드 제작이 필수적이며, 높은 항체 생산 비용이 요구된다. 또한, 단백질의 특성상 보관과 이용상의 어려움이 많고, 한 번에 한 종류 또는 제한된 종류의 세균 검출만이 가능하며, 세균의 배양 및 실험 단계에 있어서 긴 시간이 소모된다. 이러한 단점을 개선하기 위하여, PCR 방법을 이용한 각종 세균 검출 키트들이 연구 개발되기 시작하였다. PCR 방법을 이용한 검출 키트들은 높은 정확성과 간편성, 신속성 때문에 각종 분야에서 날로 그 수요가 증가하고 있다.
특히, 최근 많이 사용되고 있는 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭 산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭 산물과 반응하는 형광 물질의 검출과 정량으로 해석하는 방법이다. 이 방법은 기존의 PCR 방법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기 영동 후 PCR 증폭 산물을 확인하는 것에 비해, 전기 영동의 추가 작업이 필요 없고, 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하며, 결과를 수치화할 수 있고, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 실시간 PCR 방법을 통해 PCR 또는 항원/항체와 같은 정성적인 결과가 아닌 높은 특이도를 갖는 정량적인 결과를 확인할 수 있다. 또한 형광 표지 인자로 표지된 프로브를 이용하기 때문에 DNA 칩이나 항원/항체 반응에 사용되는 시료의 양 보다 적은 양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다.
따라서, 음식물 내의 식중독균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하기 위해 실시간 PCR 방법을 이용한 식중독균의 검출 방법 및 검출 키트 개발의 필요성이 요구되고 있다.
일 구체예는 PCR 칩 내에 여러 종류의 식중독균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공하는 것이다.
다른 구체예는 식중독균 검출용 키트를 이용하여 여러 종류의 식중독균을 동시에 실시간으로 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 제1 플레이트; 상기 제1 플레이트의 윗 부분에 배치되고, 하나 이상의 관통 개구 채널을 구비하는 제2 플레이트; 및 상기 제2 플레이트의 윗 부분에 배치되고, 상기 하나 이상의 관통 개구 채널 상의 각각의 일 영역에 형성된 관통 개구 유입부 및 다른 일 영역에 형성된 관통 개구 유출부를 구비하는 제3 플레이트를 포함하는 PCR 칩의 상기 하나 이상의 관통 개구 채널 내에,
(a) 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 31의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 32의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Listeria monocytogenes를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(b) 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 33의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 34의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Staphylococcus aureus를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(c) 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 35의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 36의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Shigella boydii, Shigella flexneri 또는 Shigella sonnei를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(d) 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Clostridium perfringerns를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(e) 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Camphylobacter jejuni를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(f) 서열번호 11의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Bacillus cereus를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(g) 서열번호 13의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Yersinia enterocolitica를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(h) 서열번호 15의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 37의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 38의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Salmonella 속 박테리아를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(i) 서열번호 17의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 19의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio parahaemolyticus를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(j) 서열번호 21의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 23의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 39의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 40의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 또는 서열번호 41의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 42의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 장독성 대장균를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
(k) 서열번호 25의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 26의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 27의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 28의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 29의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 30의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 43의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 44의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 또는 서열번호 45의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 46의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 E. coli O157:H7을 검출하기 위한 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 각각 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공한다.
용어 “프라이머(primer)”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 디자인용 프로그램(예를 들어, PRIMER 3, VectorNTI 프로그램)을 이용하여 할 수 있다. 한편, 일 구체예에 따른 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 상기 서열 번호 1 내지 서열 번호 30 중 어느 하나의 염기 서열 내의 10개 이상 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머는 상기 서열 번호 1 내지 서열 번호 30 중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 하나 이상의 프라이머 세트는 각각 제1 플레이트; 상기 제1 플레이트의 윗 부분에 배치되고, 하나 이상의 관통 개구 채널을 구비하는 제2 플레이트; 및 상기 제2 플레이트의 윗 부분에 배치되고, 상기 하나 이상의 관통 개구 채널 상의 각각의 일 영역에 형성된 관통 개구 유입부 및 다른 일 영역에 형성된 관통 개구 유출부를 구비하는 제3 플레이트를 포함하는 PCR 칩의 상기 하나 이상의 관통 개구 채널 내에 포함되어 있다. 예를 들어, 상기 15종류의 프라이머를 동시에 검출하기 위한 PCR 칩을 제작한다면, 상기 PCR 칩 내에 관통 개구 채널이 양성 대조군 및 음성 대조군을 포함하여 총 17개가 되도록 PCR 칩을 제작할 수 있다. 한편, 일 구체예에 따르면, 상기 PCR 칩은 광투과성 재질로 구현될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 플레이트 및 제3 플레이트는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate), 폴리에테르설폰(polyether sulfone), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재질로 이루어지고, 상기 제2 플레이트는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 사이클로올레핀 코폴리머, 폴리아미드(polyamide), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 열가소성 수지 또는 열경화성 수지 또는 열 경화성 수지 재질로 이루어질 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제3 플레이트의 관통 개구 유입부는 직경 1.0 mm 내지 3.0 mm이고, 상기 관통 개구 유출부는 직경 1.0 mm 내지 1.5 mm이며, 상기 제3 플레이트의 두께는 0.1 mm 내지 2 mm이고, 상기 제2 플레이트의 두께는 100 ㎛ 내지 200 ㎛이며, 상기 관통 개구 채널의 폭은 0.5 mm 내지 3 mm이고, 상기 관통 개구 채널의 길이는 20 mm 내지 60 mm일 수 있다. 이는 상기 관통 개구 채널에 포함되는 PCR 반응액의 양에 따라 조절될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트로부터 검출할 수 있는 Enterotoxigenic 박테리아는 예를 들어, 장독성 대장균일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트로부터 검출할 수 있는 상기 Salmonella 속 박테리아는 Salmonella enteritidis, Salmonella bongori 및 Salmonella enterica로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트는 상기 관통 개구 채널 내부에 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물, DNA 중합 효소 및 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다.
용어 "검출 가능한 표지(detectable label)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자로, 상기 검출 가능한 표지는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기 키트는 상기 관통 개구 채널 내부에 완충 용액을 포함할 수 있다. 완충 용액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 PCR 칩은 2개 이상의 관통 개구 채널, 구체적으로 2개 이상 17개 이하의 관통 개구 채널을 가질 수 있으나, 이는 검출하고자 하는 식중독균의 종류에 따라 임의로 조절할 수 있음은 상기 설명한 바와 같다.
다른 양상은 식중독균 감염이 의심되는 대상 시료를 상기 키트의 하나 이상의 관통 개구 유입부에 주입하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과로부터 상기 대상 시료 중에 식중독균의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 2 이상의 식중독균을 동시에 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.
상기 2 이상의 식중독균을 동시에 실시간으로 검출하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 상기 방법은, 식중독균 감염이 의심되는 대상 시료를 상기 키트의 하나 이상의 관통 개구 유입부에 주입하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 수행할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 실시간 PCR은 열블록, 광투과성 열블록, 또는 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에서 각각 수행되는 것일 수 있다. 상기 광투과성 열블록 또는 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 본 발명자에 의해 제작된 것으로, 실시간 PCR을 수행할 수 있으며, 상기 장치에 대한 상세한 설명은 후술하도록 한다.
일 구체예에 따른 검출 방법은 식중독균이 감염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 상기 시료는 예를 들어, 배양된 세포, 혈액, 타액 등의 체액 및 육류, 낙농 제품, 음료수 등과 같은 음식물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 시료로부터 식중독균의 DNA를 별도로 추출하는 방법을 수행할 수 있으나, PCR 과정 중 발생하는 높은 온도에 의해 식중독균의 세포막이 파괴되고 그로 인해 식중독균의 DNA가 외부로 노출될 수 있으므로, 상기 시료 자체를 실시간 PCR 반응에 바로 사용할 수도 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 실시간 PCR 반응은 본 발명자에 의해 개발된 실시간 PCR 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 열 순환기(thermal cycler) 및 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, DNA 중합 효소와 FRET의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 나타나는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭 산물을 비 특이적인 증폭 산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다. 일 구체예에 따른 식중독균의 검출 방법에 있어서, 실시간 PCR 반응은 당업계에 알려진 통상적인 조건으로 실시할 수 있으며, 예를 들어, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분 동안 수행한 후, 변성(denaturation)을 95℃에서 5초 동안, 프라이머의 어닐링(annealing) 및 신장(elongation)을 72℃에서 20초 동안 총 30회 실시하는 조건으로 수행할 수 있다.
마지막으로, 상기 실시간 PCR 결과로부터 상기 대상 시료 중에 식중독균의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 식중독균의 존재 유무는 상기 실시간 PCR 과정에서 증폭된 PCR 산물에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 Ct 값을 계산함으로써 확인할 수 있다. 상기 Ct 값의 계산은 상기 실시간 PCR 기기 내에 포함된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 식중독균은 Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus , Shigella boydii, Shigella flexneri , Shigella sonnei , Clostridium perfringerns , Camphylobacter jejuni , Bacillus cereus , Yersinia enterocolitica, Salmonella enteritidis, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Vibrio parahaemolyticus , Enterotoxigenic 박테리아 및 E. coli O157:H7로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하면, 여러 종류의 식중독균을 동시에 효율적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시한다.
도 2a는 종래 PCR 장치에 포함된 열 블록의 열 분포를 도시한다.
도 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록의 열 분포를 도시한다.
도 2c는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록의 시간에 따른 온도 변화를 도시한다.
도 3a는 기판 하부 면에 흡광층이 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시하고, 도 3b는 절연 보호층 상부 면에 광반사방지층이 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시하고, 도 3c는 기판 하부면에 흡광층이 접촉 배치되고, 외부 공기층과 절연보호층의 접촉에 의한 광 반사를 방지하기 위한 광반사방지층이 상기 절연보호층의 상부에 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시한다.
도 4는 광 제공부 및 광 검출부를 포함하는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광투과성 열블록 상에 PCR 칩이 배치된 것을 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광 제공부를 보다 상세하게 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광 검출부를 보다 상세하게 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 이색성 필터에 의해 광 경로를 도시한다.
도 8은 본 발명의 다른 일 구체예에 따른 광투과성 PCR 칩의 단면을 도시한다.
도 9는 양면 접착제 또는 열가소성 수지 또는 열경화성 수지가 처리된 본 발명의 다른 일 구체예에 따른 광투과성 PCR 칩의 단면을 도시한다.
도 10은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치를 도시한다.
도 11은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치의 칩 홀더의 이동에 의한 핵산 증폭 반응의 각 단계를 도시한다.
도 12는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치를 이용하여 실시간으로 핵산 증폭 반응을 관찰하는 단계를 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Staphylococcus aureus , Clostridium perfringerns 및 E. coli O157 : H7을 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Vibrio paraheamolyticus , E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2, Yesinia enterocolitica 및 Listeria monocytogenes를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Camphylobacter jejuni , Salmonella spp, Bacillus cereus 및 Shigella spp를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli O157의 stx1 유전자 및 uidA 유전자를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Vibrio parahaemolyticus를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2의 Sth 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Salmonella spp 및 Shigella spp를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli O157을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 종래 PCR 장치에 포함된 열 블록의 열 분포를 도시한다.
도 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록의 열 분포를 도시한다.
도 2c는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록의 시간에 따른 온도 변화를 도시한다.
도 3a는 기판 하부 면에 흡광층이 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시하고, 도 3b는 절연 보호층 상부 면에 광반사방지층이 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시하고, 도 3c는 기판 하부면에 흡광층이 접촉 배치되고, 외부 공기층과 절연보호층의 접촉에 의한 광 반사를 방지하기 위한 광반사방지층이 상기 절연보호층의 상부에 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록을 도시한다.
도 4는 광 제공부 및 광 검출부를 포함하는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광투과성 열블록 상에 PCR 칩이 배치된 것을 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광 제공부를 보다 상세하게 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광 검출부를 보다 상세하게 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 이색성 필터에 의해 광 경로를 도시한다.
도 8은 본 발명의 다른 일 구체예에 따른 광투과성 PCR 칩의 단면을 도시한다.
도 9는 양면 접착제 또는 열가소성 수지 또는 열경화성 수지가 처리된 본 발명의 다른 일 구체예에 따른 광투과성 PCR 칩의 단면을 도시한다.
도 10은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치를 도시한다.
도 11은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치의 칩 홀더의 이동에 의한 핵산 증폭 반응의 각 단계를 도시한다.
도 12는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치를 이용하여 실시간으로 핵산 증폭 반응을 관찰하는 단계를 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Staphylococcus aureus , Clostridium perfringerns 및 E. coli O157 : H7을 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Vibrio paraheamolyticus , E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2, Yesinia enterocolitica 및 Listeria monocytogenes를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Camphylobacter jejuni , Salmonella spp, Bacillus cereus 및 Shigella spp를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli O157의 stx1 유전자 및 uidA 유전자를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Vibrio parahaemolyticus를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2의 Sth 유전자를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 Salmonella spp 및 Shigella spp를 동시에 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 구체예에 따른 식중독균 검출용 키트를 사용하여 E. coli O157을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록(100)을 도시한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치는 기판(10), 상기 기판(10) 상에 배치된 도전성 나노 입자를 포함하는 발열층(20), 상기 발열층 상에 배치된 절연 보호층(30) 및 상기 발열층과 연결 배치된 전극(40)을 구비하는 광투과성 열블록(100)을 포함하고, 상기 광투과성 열블록의 상부 면은 적어도 일부 영역에 PCR 칩의 접촉부(50)를 포함한다.
상기 기판(10)은 광투과성 재질의 판재로서, 광투과성 유리 또는 광투과성 플라스틱 재질일 수 있다. 또한, 상기 기판(10)은 도 1에 따르면, 평판형으로 도시되어 있지만, 반원통형, 반구면형 등의 다양한 형상을 가질 수 있다. 또한, 상기 기판(10)은 상기 발열층(20)을 지지하는 역할을 수행한다.
상기 발열층(20)은 PCR의 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장(또는 증폭) 단계를 수행하기 위한 상기 광투과성 열블록(100)의 열원 역할을 수행한다. 상기 발열층(20)은 상기 기판(10) 상에 배치되고, 도전성 나노 입자(도시되지 않음)를 포함한다. 상기 도전성 나노 입자는 산화물 반도체 물질 또는 상기 산화물 반도체 물질에 In, Sb, Al, Ga, C 및 Sn로 구성된 군으로부터 선택된 불순물이 첨가된 물질일 수 있다. 또한, 상기 발열층(20)은 상기 도전성 나노 입자가 물리적으로 연계(necking)된 성긴 조직(loose texture) 구조를 가질 수 있고, 제조 공정의 열 처리 조건에 따라 치밀한 조직(close-packed texture)을 가질 수 있으며, 또한 완전한 막 상태로 구현될 수도 있다. 또한, 상기 도전성 나노 입자는 용매에 분산된 상태로 존재하므로, 상기 기판(10) 상에 용이하게 적층할 수 있기 때문에, 그 적층 수를 조절하여 상기 발열층(20)의 두께 조절을 용이하게 할 수 있다. 또한, 상기 도전성 나노 입자를 포함하는 분산액의 농도를 조절함으로써 상기 발열층(20)의 도전성을 용이하게 조절할 수도 있다. 또한, 상기 발열층(20)을 상기 기판(10)에 강하게 고정하기 위하여 상기 기판(10)과 발열층(20) 사이에 접착력 강화층(도시되지 않음)이 형성될 수 있다. 상기 접착력 강화층은 실리카 또는 폴리머로 형성될 수 있고, 도전성 나노 입자를 포함할 수 있어 발열층과 동일한 역할을 또한 수행할 수도 있다. 또한, 상기 발열층(20)은 투명할 수 있다. 예를 들어, 가시광선의 파장은 400 내지 700 nm이고, 도전성 나노 입자를 포함하는 발열층을 이러한 파장의 1/4 이하의 두께, 예를 들어 약 100 nm 이하가 되도록 형성하는 경우 광투과성을 획득할 수 있다.
상기 절연 보호층(30)은 상기 발열층(20)을 물리적 및/또는 전기적으로 보호하기 위한 것으로서, 절연성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 절연성 물질은 유전체 산화물, 페릴린, 나노 입자 및 고분자 필름으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한편, 상기 절연 보호층(30)은 투명할 수 있다.
상기 전극(40)은 상기 발열층(20)과 직접 또는 간접적으로 연결 배치되어 상기 발열층(20)에 전력을 공급하는 것이다. 상기 전극(40)은 전력을 공급할 수 있는 다양한 물질이 사용될 수 있고, 예를 들어 금속 물질, 전도성 에폭시, 전도성 페이스트, 솔더 및 전도성 필름으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 도 1에 따르면, 상기 전극(40)은 상기 발열층(20)의 양 측면에 연결 배치되지만, 상기 발열층(20)에 전력을 공급할 수 있다면 다양하게 작동가능한 위치에서 연결 배치될 수 있다. 또한, 상기 전극(40)은 상기 PCR 장치에 포함되거나 또는 외부 배치된 전원과 전기적으로 연결될 수도 있다. 예를 들어, 상기 전극(40)은 상기 발열층(20)에 직접 접촉하고, 배선(도시되지 않음)을 통해 외부 회로(도시되지 않음)에 상기 발열층(20)을 연결하며, 상기 배선이 전극(40)에 안정적으로 고정되도록 단자가 배치될 수 있다.
상기 광투과성 열블록(100)은 그 상부 면의 적어도 일부 영역에 PCR 칩(도시되지 않음)이 접촉하는 칩 접촉부(50)를 포함한다. 상기 PCR 칩은 상기 칩 접촉부(50)에 접촉함으로써, 상기 광투과성 열블록(100)의 열 공급 또는 회수에 따라 가열 또는 냉각되어 PCR의 각 반응 단계를 수행할 수 있다. 또한, 상기 PCR 칩은 상기 칩 접촉부(50)에 직접 또는 간접적으로 접촉할 수 있다. 한편, 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치는 상기 광투과성 열블록을 포함하는 기타 PCR을 수행하기 위한 모듈들을 추가적으로 포함할 수 있고, 본 명세서에 기재되지 아니한 세부적인 모듈들은 종래 기술 중 자명한 범위 안에서 모두 구비하고 있는 것을 전제로 한다.
상기 광투과성 열블록(100)을 포함하는 PCR 장치는 종래 기존 석열 히터, 세라믹 히터 또는 금속 히터를 열 블록으로 이용하는 PCR 장치에 비해 많은 장점을 갖는다. 먼저, 열원으로서 도전성 나노 입자를 이용하기 때문에 발열층의 단선의 우려가 없고, 상기 도전성 나노 입자를 직접적으로 가열하기 때문에 높은 열 효율 및 낮은 소비 전력을 획득할 수 있으며(예를 들어, 상기 광투과성 열블록이 약 2X2 ㎝의 규격일 경우 약 12V의 전압으로 발열이 가능함), 금속 재질이 아니므로 산화, 부식이 거의 일어나지 않아 내구성이 뛰어나다. 또한, 상기 기판(10), 발열층(20) 및 절연 보호층(30)의 제조시 광투과성을 획득할 수 있기 때문에, 이하 설명될 광 제공부 및 광 검출부와 함께 구현될 경우 샘플 용액에 포함된 형광 물질에 의한 PCR의 실시간 모니터링이 가능하다. 또한, 상기 기판(10), 발열층(20) 및 절연 보호층(30)의 제조시 그 두께 조절이 용이하기 때문에 상기 광투과성 열블록(100)의 슬림화가 가능하여 상기 광투과성 열블록(100)을 포함하는 PCR 장치의 소형화가 가능하다. 또한, 상기 도전성 나노 입자가 상기 발열층(20)에 균일하게 분포되어 상기 광투과성 열블록(100)의 균일한 열 분포 및 신속한 온도 제어가 가능하기 때문에 PCR 결과의 검출 효율이 높고, PCR 결과를 신속하게 얻을 수 있다. 상기 광투과성 열블록(100)의 열 분포의 균일성 및 온도 제어의 신속성은 도 2에 따른 실험 결과로서 확인할 수 있다. 도 2a는 종래 PCR 장치에 포함된 열 블록의 열 분포를 도시하고, 도 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록(100)의 열 분포를 도시하며, 도 2c는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록(100)의 시간에 따른 온도 변화를 도시한다. 기존 PCR 장치에서 열 블록으로 사용된 석열 히터, 세라믹 히터 또는 금속 히터에 전력을 인가하여 온도 분포를 관찰하고, 본 발명의 일 구체예에 따른 광투과성 열블록(100)에 상기 전극(40)을 통해 전력을 인가하여 온도 분포를 관찰하였다. 그 결과, 도 2a에 따르면, 기존 히터 상의 온도 분포는 히터 표면 전체에 걸쳐서 균일하지 않지만, 도 2b에 따르면, 상기 광투과성 열블록(100) 상의 온도 분포는 상기 도 2a에 비해 전체적으로 균일한 것으로 관찰되었다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 광투과성 열블록(100)에 상기 전극(40)을 통해 전력을 인가하여 시간에 따른 상기 광투과성 열블록(100)의 온도 변화를 관찰하였다. 그 결과, 온도 상승 폭은 최대 17 ℃/sec으로 나타났고, 이는 대표적인 기존 히터들(예를 들어, Bio-Rad사의 CFX96)의 온도 상승 폭이 최대 5 ℃/sec인 것에 비해 상당히 높은 수치임을 확인할 수 있다.
도 3a는 기판(10) 하부 면에 흡광층(60)이 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록(100)을 도시하고, 도 3b는 절연 보호층(30) 상부 면에 광반사방지층(70)이 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록(100)을 도시하고, 도 3c는 기판(10) 하부면에 흡광층(60)이 접촉 배치되고, 외부 공기층과 절연보호층(30)의 접촉에 의한 광 반사를 방지하기 위한 광반사방지층(70)이 상기 절연보호층(30)의 상부에 접촉 배치된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 광투과성 열블록(100)을 도시한다.
일반적으로, PCR을 수행함과 동시에 형광물질을 이용하여 PCR 산물의 발생 유무 및 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다. 이와 같은 PCR을 소위 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)이라고 한다. 상기 반응은 PCR 칩에 PCR 반응에 필요한 시약뿐만 아니라 형광물질이 첨가되고, PCR 산물의 생성에 따라 상기 형광물질이 특정 파장의 광에 의해 발광함으로써 측정 및 분석 가능한 광 신호를 유발하게 된다. 따라서, 실시간으로 PCR 산물을 정확하게 모니터링하기 위해서는 상기 광 신호의 센싱 효율을 가능한 높힐 필요가 있다. 상기 광투과성 열블록(100)은 전체적으로 광투과성을 갖기 때문에 광원으로부터 유래된 여기 광을 대부분 그대로 투과시켜 상기 광 신호의 센싱 효율을 높힐 수 있다. 그러나, 상기 여기 광의 일부는 상기 광투과성 열블록(100) 상에서 반사되거나 또는 상기 광투과성 열블록(100)을 통과한 후 반사되어 광 신호의 노이즈(noise)로서 작용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 상기 광투과성 열블록(100)의 하부 면에 흡광 물질을 처리하여 센싱 효율을 더욱 높힐 수 있다. 도 3a에 따르면, 흡광층(60)이 상기 기판(10)의 하부 면에 접촉 배치되고, 상기 흡광층(60)은 흡광 물질을 포함한다. 상기 흡광 물질은 예를 들어, 운모(mica)일 수 있으나, 광을 흡수하는 성질을 갖는 물질이라면 제한되지 않는다. 따라서, 광원으로부터 유래된 광의 일부를 상기 흡광층(60)이 흡수하여, 광 신호의 노이즈로 작용하는 반사 광의 발생을 최대한 억제할 수 있다. 또한, 대안적으로, 상기 광투과성 열블록(100)의 상부 면에 광반사방지 물질을 처리하여 센싱 효율을 더욱 높힐 수 있다. 도 3b에 따르면, 광반사방지층(70)이 상기 절연 보호층(30)의 상부 면에 접촉 배치되고, 상기 광반사방지층(70)은 절연보호층 (30)과 조합하여 절연보호 기능 및 광반사방지 기능을 수행하며, 광반사방지 물질을 포함한다. 상기 광반사방지 물질은 예를 들어, MgF2와 같은 불화물, SiO2, Al2O3와 같은 산화물일 수 있으나, 광반사를 방지할 수 있는 성질을 갖는 물질이라면 제한되지 않는다. 또한, 더 바람직하게는, 상기 광투과성 열블록(100)의 하부 면에 흡광 물질을 처리하고, 동시에 상기 광투과성 열블록(100)의 상부 면에 광반사방지 물질을 처리하여 센싱 효율을 더욱 높힐 수 있다. 즉, 효과적인 실시간 PCR의 모니터링을 위하여 상기 노이즈 대비 광 신호 비율은 가능한 최대값을 가져야 하고, 상기 노이즈 대비 광 신호 비율은 상기 PCR 칩으로부터 여기 광의 반사율이 낮을수록 향상될 수 있다. 예를 들어, 일반적인 금속성 재질의 기존 히터들의 여기 광의 반사율은 약 20 내지 80 %이지만, 상기 도 3a 또는 도 3b에 따른 흡광층(60) 또는 광반사방지층(70)을 포함하는 본 발명에 따른 광투과성 열블록(100)을 사용하는 경우 광 반사율을 0.2% 내지 4% 이내로 줄일 수 있고, 상기 도 3c에 따른 흡광층(60) 및 광반사방지층(70)을 포함하는 본 발명에 따른 광투과성 열블록(100)을 사용하는 경우 광 반사율을 0.2% 이하로 줄일 수 있다.
도 4는 광 제공부 및 광 검출부를 포함하는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광투과성 열블록 상에 PCR 칩이 배치된 것을 도시한다.
도 4에 따르면, 상기 PCR 장치는 상기 칩 접촉부(50)에 배치되는 PCR 칩(900)에 광을 제공하도록 구동가능하게 배치된 광 제공부(200) 및 상기 칩 접촉부(50)에 배치되는 PCR 칩(900)으로부터 방출되는 광을 수용하도록 구동가능하게 배치된 광 검출부(300)를 더 포함한다. 상기 광 제공부(200)는 상기 PCR 칩(900)에 광을 제공하기 위한 모듈이고, 상기 광 검출부(300)는 상기 PCR 칩(900)으로부터 방출되는 광을 수용하여 상기 PCR 칩(900)에서 수행되는 PCR 반응을 측정하기 위한 모듈이다. 상기 광 제공부(200)로부터 광이 방출되고, 상기 방출된 광은 상기 PCR 칩(900), 구체적으로 상기 PCR 칩(900)의 반응 챔버(또는 채널)(도시되지 않음)를 통과하거나 반사하고, 이 경우 상기 반응 챔버(또는 채널) 내의 핵산 증폭에 의해 발생하는 광 신호를 상기 광 검출부(300)가 검출한다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 따르면, 상기 PCR 칩(900)에서 상기 PCR의 각 순환 단계가 진행되는 동안 상기 반응 챔버(또는 채널) 내에서 (형광 물질이 결합된) 핵산의 증폭에 의한 반응 결과를 실시간으로 모니터링함으로써 초기 샘플 용액에 포함되어 있는 표적 핵산의 증폭 여부 및 증폭 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다. 또한, 상기 광 제공부(200) 및 광 검출부(300)는 상기 광투과성 열블록(900)을 중심으로 위 또는 아래에 모두 배치되거나 각각 배치될 수 있다. 다만, 상기 광 제공부(200) 및 광 검출부(300)의 배치는 본 발명에 따른 PCR 장치의 최적의 구현을 위하여 다른 모듈과의 배치 관계를 고려하여 다양할 수 있으며, 바람직하게는 도 4에 따라, 상기 광 제공부(200) 및 광 검출부(300)은 상기 광투과성 열블록의 상부에 배치될 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광 제공부(200)를 보다 상세하게 도시한다.
도 5에 따르면, 상기 광 제공부(200)는 LED(Light Emitting Diode) 광원 또는 레이저 광원(210), 상기 광원으로부터 방출되는 광에서 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 제1 광 여과기(230), 및 상기 제1 광 여과기로부터 방출되는 광을 포집하는 제1 광 렌즈(240)를 포함하고, 상기 광원(210)과 상기 제1 광 여과기(230) 사이에 빛을 퍼지게 하도록 배치된 제1 비구면 렌즈(220)를 더 포함한다. 상기 광원(210)은 광을 방출할 수 있는 모든 광원을 포함하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, LED(Light Emitting Diode) 광원 또는 레이저 광원을 포함한다. 상기 제1 광 여과기(230)는 다양한 파장대를 갖는 입사광 중 특정 파장의 광을 선택하여 방출하는 것으로, 미리 결정된 상기 광원(210)에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 광 여과기(230)는 상기 광원(210)으로부터 방출되는 광 중 500 nm 이하 파장대의 광만을 통과시킬 수 있다. 상기 제1 광 렌즈(240)는 그 입사광을 포집하여 그 방출광의 강도를 증가시키는 역할을 수행하는 것으로, 상기 광투과성 열블록(100)을 통해 PCR 칩에 조사되는 광의 강도를 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 광 제공부(200)은 상기 광원(210)과 상기 제1 광 여과기(230) 사이에 빛을 퍼지게 하도록 배치된 제1 비구면 렌즈(220)를 더 포함한다. 상기 제1 비구면 렌즈(220)의 배치 방향을 조정함으로써, 상기 광원(210)으로부터 방출되는 광 범위를 확장하여 측정 가능한 영역에 도달하게 한다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광 검출부(300)를 보다 상세하게 도시한다.
도 6에 따르면, 상기 광 검출부(300)는 상기 칩 접촉부에 배치되는 PCR 칩으로부터 방출되는 광을 포집하는 제2 광 렌즈(310), 상기 제2 광 렌즈로부터 방출되는 광에서 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 제2 광 여과기(320), 및 상기 제2 광 여과기로부터 방출되는 광으로부터 광 신호를 검출하는 광 분석기(350)를 포함하고, 상기 제2 광 여과기(320)와 상기 광 분석기(350) 사이에 상기 제2 광 여과기(320)로부터 방출되는 광을 집적하도록 배치된 제2 비구면 렌즈(330)를 더 포함하며, 상기 제2 비구면 렌즈(330)와 상기 광 분석기(350) 사이에 상기 제2 비구면 렌즈(330)로부터 방출되는 광의 노이즈(noise)를 제거하고 상기 제2 비구면 렌즈로(330)부터 방출되는 광을 증폭하도록 배치된 광다이오드 집적소자(photodiode integrated circuit)(340)를 더 포함한다. 상기 제2 광 렌즈(310)는 그 입사광을 포집하여 그 방출광의 강도를 증가시키는 역할을 수행하는 것으로, 상기 광투과성 열블록(100)을 통해 PCR 칩으로부터 방출되는 광의 강도를 증가시켜 광 신호 검출을 용이하게 한다. 상기 제2 광 여과기(320)는 다양한 파장대를 갖는 입사광 중 특정 파장의 광을 선택하여 방출하는 것으로, 상기 광투과성 열블록(100)을 통해 PCR 칩으로부터 방출되는 미리 결정된 광의 파장에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 광 여과기(320)는 상기 광투과성 열블록(100)을 통해 PCR 칩으로부터 방출되는 미리 결정된 광 중 500 nm 이하 파장대의 광만을 통과시킬 수 있다. 상기 광 분석기(350)는 상기 제2 광 여과기(320)로부터 방출되는 광으로부터 광 신호를 검출하는 모듈로서, 샘플 용액으로부터 발현 형광된 광을 전기 신호로 전환하여 정성 및 정략적인 측정이 가능하도록 한다. 또한, 상기 광 검출부(300)는 상기 제2 광 여과기(320)와 상기 광 분석기(350) 사이에 상기 제2 광 여과기(320)로부터 방출되는 광을 집적하도록 배치된 제2 비구면 렌즈(330)를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 비구면 렌즈(330)의 배치 방향을 조정함으로써, 상기 제2 광 여과기(320)로부터 방출되는 광 범위를 확장하여 측정 가능한 영역에 도달하게 한다. 또한, 상기 광 검출부(300)는 상기 제2 비구면 렌즈(330)와 상기 광 분석기(350) 사이에 상기 제2 비구면 렌즈(330)로부터 방출되는 광의 노이즈(noise)를 제거하고, 상기 제2 비구면 렌즈(330)로부터 방출되는 광을 증폭하도록 배치된 광다이오드 집적소자(photodiode integrated circuit, PDIC)(340)를 더 포함할 수 있다. 상기 광다이오드 집적소자(340)를 사용함으로써, 상기 PCR 장치의 소형화가 더욱 가능하고, 노이즈를 최소화하여 신뢰 가능한 광 신호를 측정할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치에 포함된 이색성 필터(400)에 의해 광 경로를 도시한다.
도 7에 따르면, 상기 PCR 장치는 상기 광 제공부(200)로부터 방출된 광이 광 검출부(300)까지 도달할 수 있도록 광의 진행 방향을 조절하고, 미리 결정된 파장을 갖는 광을 분리하기 위한 하나 이상의 이색성 필터(400)를 더 포함한다. 상기 이색성 필터(dichroic filter)(400)는 광을 파장에 따라 선택적으로 투과 또는 선택적으로 조절된 각도로 반사시키는 모듈이다. 도 7에 따르면, 이색성 필터(400a)는 광 제공부(200)으로부터 방출되는 광의 광축에 대하여 약 45도 각도로 경사지게 배치되고, 상기 광을 그 파장에 따라 선택적으로 단파장 성분을 투과시키고 장파장 성분을 직각으로 반사시켜 상기 광투과성 열블록(100) 상에 배치된 PCR 칩(900)에 도달하게 한다. 또한, 이색성 필터(400b)는 상기 PCR 칩(900) 및 광투과성 열블록(100)으로부터 반사된 광의 광축에 대하여 약 45도 각도로 경사지게 배치되고, 상기 광을 그 파장에 따라 선택적으로 단파장 성분을 투과시키고 장파장 성분을 직각으로 반사시켜 상기 광 검출부(300)에 도달하게 한다. 상기 광 검출부(300)에 도달한 광은 광 분석기에서 전기 신호로 전환되어 핵산 증폭 여부 및 증폭 정도를 나타내게 된다.
도 8은 본 발명의 다른 일 구체예에 따른 광투과성 PCR 칩(900)의 단면을 도시한다.
도 8에 따르면, 광투과성 PCR 칩(900)은 상기 설명된 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 광투과성 열블록(100)에 포함된 칩 접촉부(50)에 배치되고, 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액을 수용할 수 있다. 또한, 상기 광투과성 PCR 칩(900)은 광투과성 플라스틱 재질일 수 있다. 또한, 상기 광투과성 PCR 칩은 제1 플레이트(910); 상기 제1 플레이트(910) 상에 배치되고, 관통 개구 채널(921)을 구비하는 제2 플레이트(920); 및 상기 제2 플레이트(920) 상에 배치되고, 상기 관통 개구 채널(921) 상의 일 영역에 형성된 관통 개구 유입부(931) 및 다른 일 영역에 형성된 관통 개구 유출부(932)를 구비하는 제3 플레이트(930)을 포함한다.
상기 PCR 칩(900)은 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 반응 완충액 (PCR reaction buffer)를 포함하는 샘플 용액을 포함할 수 있다. 상기 PCR 칩(900)은 상기 샘플 용액을 도입하기 위한 유입부(931), 핵산 증폭 반응을 완료한 샘플 용액을 배출하기 위한 유출부(932) 및 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액이 수용된 하나 이상의 PCR 반응 챔버(또는 채널)(921)를 포함할 수 있다. 상기 PCR 칩(900)이 상기 광투과성 열블록(100)에 접촉하는 경우 상기 광투과성 열블록(100)의 열은 상기 PCR 칩(900)에 전달되고, 상기 PCR 칩(900)의 PCR 반응 챔버(또는 채널)(921)에 포함된 샘플 용액은 가열되거나 냉각되어 일정 온도가 유지될 수 있다. 또한, 상기 PCR 칩(900)은 전체적으로 평면 형상을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 PCR 칩(900)은 별도의 칩 홀더(도시되지 않음)에 장착된 상태로 상기 광투과성 열블록(100)에 간접적으로 접촉 배치될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 PCR 칩(900)이 상기 광투과성 열블록(100)의 칩 접촉부(50)에 배치된다는 것은 상기 PCR 칩(900)이 별도의 칩 홀더에 장착된 상태로 상기 광투과성 열블록(100)에 접촉 배치되는 것을 포함한다. 또한, 상기 PCR 칩(900)은 광투과성 재질로 구현될 수 있고, 바람직하게는 광투과성 플라스틱 재질을 포함한다. 상기 PCR 칩(900)은 플라스틱 재질을 사용하여, 플라스틱 두께 조절만으로 열 전달 효율을 증대시킬 수 있고, 제작 공정이 단순하여 제조 비용을 절감할 수 있다. 또한 상기 PCR 칩(900)은 전체적으로 광 투과적인 성질을 갖기 때문에 상기 광투과성 열블록(100)의 칩 접촉부(50)에 배치된 상태에서 PCR 칩에 직접적으로 광 조사가 가능하여 실시간으로 핵산 증폭 여부 및 증폭 정도를 측정 및 분석할 수 있다.
상기 제1 플레이트(910)은 상기 제2 플레이트(920) 상에 배치된다. 상기 제1 플레이트(910)이 상기 제2 플레이트(920)의 하부면에 접착 배치됨으로써 상기 관통 개구 채널(921)은 일종의 PCR 반응 챔버를 형성한다. 또한, 상기 제1 플레이트(910)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate), 폴리에테르설폰(polyether sulfone), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재질일 수 있다. 또한, 상기 제1 플레이트(910)의 상단 면은 친수성 물질(922)이 처리되어 PCR을 원활하게 수행할 수 있다. 상기 친수성 물질(922)의 처리에 의해 상기 제1 플레이트(910) 상에 친수성 물질(922)을 포함하는 단일층이 형성될 수 있다. 상기 친수성 물질은 다양한 물질일 수 있으나, 바람직하게는 카르복시기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 및 술폰기(-SH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 친수성 물질의 처리는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 제2 플레이트(920)은 상기 제1 플레이트(910) 상에 배치된다. 상기 제2 플레이트(920)은 관통 개구 채널(921)을 포함한다. 상기 관통 개구 채널(921)은 상기 제3 플레이트(910)에 형성된 관통 개구 유입부(931)과 관통 개구 유출부(932)에 대응되는 부분과 연결되어 일종의 PCR 반응 챔버를 형성한다. 따라서, 상기 관통 개구 채널(921)에 증폭하고자 하는 샘플 용액이 도입된 후 PCR 반응이 진행된다. 또한, 상기 관통 개구 채널(921)은 본 발명의 일 구체예에 따른 PCR 장치의 사용 목적 및 범위에 따라 2 이상 존재할 수 있고, 도 8에 따르면, 6개의 관통 개구 채널(921)이 예시되고 있다. 또한, 상기 제2 플레이트(920)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 사이클로올레핀 코폴리머, 폴리아미드(polyamide), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane), 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 열가소성 수지 또는 열경화성 수지 또는 열 경화성 수지 재질일수 있다. 또한, 상기 제2 플레이트(920)의 두께는 다양할 수 있으나, 100 ㎛ 내지 200 ㎛에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 관통 개구 채널(921)의 폭과 길이는 다양할 수 있으나, 바람직하게는 상기 관통 개구 채널(921)의 폭은 0.5 mm 내지 3 mm에서 선택되고, 상기 관통 개구 채널(921)의 길이는 20 mm 내지 60 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 제2 플레이트(920) 내벽은 DNA, 단백질 흡착을 방지하기 위해 실란(silane) 계열, 우혈청 알부민(bovine serum albumin) 등의 물질로 코팅할 수 있고, 상기 물질의 처리는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행 할 수 있다.
상기 제3 플레이트(930)은 상기 제2 플레이트(920) 상에 배치된다. 상기 제3 플레이트(930)은 상기 제2 플레이트(920)에 형성된 관통 개구 채널(921) 상의 일 영역에 형성된 관통 개구 유입부(931) 및 다른 일 영역에 형성된 관통 개구 유출부(932)를 구비한다. 상기 관통 개구 유입부(931)는 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액이 유입되는 부분이다. 상기 관통 개구 유출부(932)는 PCR 반응이 종료된 후 상기 샘플 용액(932)이 유출되는 부분이다. 따라서, 상기 제3 플레이트(930)은 이하 언급할 제2 플레이트(920)에 형성된 관통 개구 채널(921)을 커버하되, 상기 관통 개구 유입부(931) 및 관통 개구 유출부(932)는 상기 관통 개구 채널(921)의 유입부 및 유출부 역할을 수행하게 된다. 또한, 상기 제3 플레이트(930)은 다양한 재질로 구현될 수 있지만, 바람직하게는 폴리디메틸실옥산, 사이클로올레핀코폴리머, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌카보네이트, 폴리에테르설폰, 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재질일 수 있다. 또한, 상기 관통 개구 유입부(931)은 다양한 크기를 구비할 수 있으나, 바람직하게는 지름 1.0 mm 내지 3.0 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 관통 개구 유출부(932)는 다양한 크기를 구비할 수 있으나, 바람직하게는 지름 1.0 mm 내지 1.5 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 관통 개구 유입부(931) 및 관통 개구 유출부(932)는 별도의 커버 수단(도시되지 않음)을 구비하여, 상기 관통 개구 채널(921) 내에서 샘플 용액에 대한 PCR 반응이 진행될 때 샘플 용액이 누출되는 것을 방지할 수 있다. 상기 커버 수단은 다양한 형상, 크기 또는 재질로서 구현될 수 있다. 또한, 상기 제3 플레이트의 두께는 다양할 수 있으나, 바람직하게는 0.1 mm 내지 2.0 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 관통 개구 유입부(931) 및 관통 개구 유출부(932)는 2 이상 존재할 수 있다.
도 9는 양면 접착제 또는 열가소성 수지 또는 열경화성 수지(500)가 처리된 본 발명의 다른 일 구체예에 따른 광투과성 PCR 칩을 도시한다. 구체적으로, 도 9에 따른 PCR 칩은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 광투과성 PCR 칩(100)은 기계적 가공을 통해 관통 개구 유입부(931) 및 관통 개구 유출부(932)를 형성하여 제3 플레이트(930)을 제공하는 단계; 상기 제3 플레이트(930)의 하부면과 대응되는 크기를 갖는 판재에 상기 제3 플레이트(930)의 관통 개구 유입부(931)와 대응되는 부분으로부터 상기 제3 플레이트(930)의 관통 개구 유출부(932)에 대응되는 부분까지 기계적 가공을 통해 관통 개구 채널(921)을 형성하여 제2 플레이트(920)을 제공하는 단계; 상기 제2 플레이트(920)의 하부면과 대응되는 크기를 갖는 판재의 상부면에 표면 처리 가공을 통해 친수성 물질(922)로 구현된 표면을 형성하여 제1 플레이트(910)을 제공하는 단계; 및 상기 제3 플레이트(930)의 하부면을 상기 제2 플레이트(920)의 상부면에 접합 공정을 통해 접합하고, 상기 제2 플레이트(920)의 하부면을 상기 제1 플레이트(910)의 상부면에 접합 공정을 통해 접합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
상기 제3 플레이트(930)의 관통 개구 유입부(931) 및 관통 개구 유출부(932), 및 상기 제2 플레이트(920)의 관통 개구 채널(921)은 사출성형, 핫-엠보싱(hot-embossing), 캐스팅(casting), 및 레이저 어블레이션(laser ablation)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가공 방법에 의해 형성될 수 있다. 또한, 상기 제1 플레이트(910) 표면의 친수성 물질(922)은 산소 및 아르곤 플라즈마 처리, 코로나 방전 처리, 및 계면 활성제 도포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 처리될 수 있고 당업계에 공지된 방법에 따라 수행 할 수 있다. 또한, 상기 제3 플레이트(930)의 하부면과 상기 제2 플레이트(920)의 상부면, 및 상기 제2 플레이트(920)의 하부면과 상기 제1 플레이트(910)의 상부면은 열 접합, 초음파 융착, 용매 접합 공정에 의해 접착될 수 있고 당업계에 공지된 방법에 따라 수행 할 수 있다. 상기 제3 플레이트(930)과 제2 플레이트(920) 사이 및 상기 제2 플레이트(920)과 제3 플레이트(910) 사이에는 양면 접착제 또는 열가소성 수지(500)가 처리될 수 있다.
도 10은 도 1은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치를 도시한다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 기판(1400) 상에 배치된 제1 열블록(1100); 상기 기판(1400) 상에 상기 제1 열블록(1100)과 이격 배치된 제2 열블록(1200); 및 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200) 위로 구동 수단(1500)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, PCR용 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 포함한다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 상기 연장 단계와 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계로 구성된 2 단계를 수행함으로써, 제1 순환을 완성할 수도 있다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 기판(1400) 상에 배치된 제1 열블록(1100) 및 상기 기판(1400) 상에 상기 제1 열블록(1100)과 이격 배치된 제2 열블록(1200)을 포함한다.
상기 기판(1400)은 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)의 가열 및 온도 유지로 인해 그 물리적 및/또는 화학적 성질이 변하지 않고, 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200) 사이에서 상호 열 교환이 일어나지 않도록 하는 재질을 갖는 모든 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 기판(1400)은 플라스틱 등의 재질을 포함하거나 그러한 재질로 구성될 수 있다.
상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)은 핵산을 증폭하기 위한 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하기 위한 것이다. 따라서 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)은 상기 각 단계들에 요구되는 필요한 온도를 제공하고, 이를 유지하기 위한 다양한 모듈을 포함하거나 또는 그러한 모듈과 구동가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)가 상기 각 열블록(1100, 1200)의 일 면에 접촉되는 경우 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)은 상기 PCR 칩(900)과의 접촉면을 전체적으로 가열 및 온도 유지할 수 있어서, PCR 칩(900) 내의 샘플 용액을 균일하게 가열 및 온도 유지할 수 있다. 종래 단일 열 블록을 사용하는 PCR 장치는 상기 단일 열 블록에서의 온도 변화율이 초당 3 내지 7℃ 범위 내에서 이루어지는데 반해, 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 각각의 열블록(1100, 1200)에서의 온도 변화율이 초당 20 내지 40℃ 범위 내에서 이루어져 PCR 반응 시간을 크게 단축시킬 수 있다.
상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)은 그 내부에 열선(도시되지 않음)이 배치될 수 있다. 상기 열선은 상기 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하도록 다양한 열원과 구동가능하게 연결될 수 있고, 상기 열선의 온도를 모니터링하기 위한 다양한 온도 센서와 구동가능하게 연결될 수 있다. 상기 열선은 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열블록(1100, 1200) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭되도록 배치될 수 있다. 상기 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭된 열선의 배치는 다양할 수 있다. 또한, 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)은 그 내부에 박막 히터(thin film heater, 도시되지 않음)가 배치될 수도 있다. 상기 박막 히터는 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열블록(1100, 1200) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 간격으로 이격 배치될 수 있다. 상기 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 박막 히터의 배치는 다양할 수 있다.
상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)은 동일한 면적에 대한 고른 열 분포 및 신속한 열 전달을 위해 금속 재질, 예를 들어 알루미늄 재질을 포함하거나 또는 알루미늄 재질로 구성될 수 있다.
상기 제1 열블록(1100)은 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치의 제1 열블록(1100)은 50℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 열블록에서 상기 변성 단계를 수행하는 경우 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95℃를 유지할 수 있으며, 상기 제1 열블록에서 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55℃ 내지 75℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72℃를 유지할 수 있다. 다만, 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 열블록(1200)은 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치의 제2 열블록(1200)은 상기 제2 열블록에서 상기 변성 단계를 수행하는 경우 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95℃를 유지할 수 있으며, 상기 제2 열블록(1200)에서 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55℃ 내지 75℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72℃를 유지할 수 있다. 다만, 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기 제1 열 블록(1100)은 PCR 반응의 변성 단계 온도 (denaturing temperature)를 유지할 수 있으며, 변성 단계 온도가 90℃보다 낮으면 PCR 반응의 주형이 되는 핵산의 변성이 일어나 효율이 떨어져 PCR 반응 효율이 떨어지거나 반응이 일어나지 않을 수 있고, 변성 단계 온도가 100℃보다 높아지면 PCR 반응에 이용되는 효소가 활성을 잃게 되므로, 상기 변성 단계 온도는 90℃ 내지 100℃일 수 있고, 바람직하게는 95℃일 수 있다. 또한, 상기 제2 열 블록(1200)은 PCR 반응의 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도(annealing/extension temperature)를 유지할 수 있다. 연장 (혹은 증폭) 단계 온도가 55℃보다 낮으면 PCR 반응 산물의 특이성(specificity)이 떨어질 수 있고, 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도가 75℃보다 높으면 프라이머에 의한 연장이 일어나지 않을 수 있기 때문에 PCR 반응 효율이 떨어지게 되므로 상기 어니링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도는 55℃ 내지 75℃일 수 있고, 바람직하게는 72℃일 수 있다.
상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200)은 상호 열 교환이 일어나지 않도록 미리 결정된 거리로 이격 배치될 수 있다. 이에 따라, 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(200) 사이에서 열 교환이 일어나지 않기 때문에, 미세한 온도 변화에 의해서도 중대한 영향을 받을 수 있는 핵산 증폭 반응에 있어서, 상기 변성 단계와 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 정확한 온도 제어가 가능하다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 상기 제1 열 블록(1100) 및 제2 열 블록(1200) 위로 구동 수단(1500)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, PCR용 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 포함한다. 또한, 상기 PCR 칩(900)은 상기 제1 열블록(1100) 또는 제2 열블록(1200)의 일 면에 접촉되고, 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액을 수용할 수 있도록 구현될 수 있다.
상기 PCR 칩(900)은 도 8 내지 도 9에서 설명한 바와 같다. 상기 PCR 칩(900)이 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)에 접촉하는 경우 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200)의 열은 상기 PCR 칩(900)에 전달되고, 상기 PCR 칩(900)의 반응 챔버(또는 채널)에 포함된 샘플 용액은 가열 및 온도 유지될 수 있다. 또한, 상기 PCR 칩(900)은 전체적으로 평면 형상을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 PCR 칩(900)의 외벽은 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 의해 핵산 증폭 반응이 수행되는 경우 상기 PCR 칩(900)이 상기 칩 홀더(1300)로부터 이탈하지 않도록 상기 칩 홀더(1300)의 내부 공간에 고정 장착되기 위한 형상 및 구조를 가질 수 있다.
상기 칩 홀더(1300)는 상기 PCR 칩(900)이 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 장착되는 모듈이다. 상기 칩 홀더(1300)의 내벽은 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 의해 핵산 증폭 반응이 수행되는 경우 상기 PCR 칩(900)이 상기 칩 홀더(1300)로부터 이탈하지 않도록 상기 PCR 칩(900)의 외벽과 고정 장착되기 위한 형상 및 구조를 가질 수 있다. 상기 칩 홀더(1300)는 상기 구동 수단(1500)에 구동가능하게 연결된다. 또한, 상기 PCR 칩(900)은 상기 칩 홀더(1300)에 착탈 가능할 수 있다.
상기 구동 수단(1500)은 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200) 위로 좌우 및/또는 상하 이동 가능하게 하는 모든 수단을 포함한다. 상기 구동 수단(1500)의 좌우 이동에 의해, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)는 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200) 사이에서 왕복 운동이 가능하고, 상기 구동 수단(1500)의 상하 이동에 의해, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)는 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200)에 접촉 및 분리될 수 있다. 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치의 구동 수단(1500)은 좌우 방향으로 연장된 레일(1510), 및 상기 레일(1510)을 통해 좌우 방향으로 슬라이딩 이동가능하게 배치되고, 상하 방향으로 슬라이딩 이동 가능한 연결 부재(1520)를 포함하고, 상기 연결 부재(1520)의 일 말단은 상기 칩 홀더(1300)가 배치된다. 상기 구동 수단(1500)의 좌우 및/또는 상하 이동은 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치의 내부 또는 외부에 구동가능하게 배치된 제어 수단(도시되지 않음)에 의해 제어될 수 있고, 상기 제어 수단은 PCR의 변성 단계와 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)와 상기 제1 열블록(1100) 및 제2 열블록(1200) 사이의 접촉 및 분리를 제어할 수 있다.
도 11은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치의 칩 홀더의 이동에 의한 핵산 증폭 반응의 각 단계를 도시한다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 의한 핵산 증폭 반응은 하기 단계에 의한다. 먼저, 상기 PCR 칩(900)에 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 반응 완충액(PCR reaction buffer)를 포함하는 샘플 용액을 도입하고, 상기 PCR 칩(900)을 상기 칩 홀더(1300)에 장착하는 단계를 수행한다. 그 후 또는 이와 동시에 상기 제1 열블록(1100)을 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90℃ 내지 100℃로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 95℃로 가열 및 유지하는 단계를 수행한다. 상기 제2 열블록(1200)을 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 55℃ 내지 75℃로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 72℃로 가열 및 유지하는 단계를 수행한다.
그 후, 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 하향 이동시켜, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 상기 제1 열블록(1100)에 접촉시켜 PCR의 제1 변성 단계를 수행한다(x 단계).
그 후, 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 상향 이동시켜, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 상기 제1 열블록(1100)으로부터 분리시켜 PCR의 제1 변성 단계를 종료하고, 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 제2 열블록(1200)의 위로 이동시키는 단계를 수행한다(y 단계).
그 후, 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 하향 이동시켜, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 상기 제2 열블록(1100)에 접촉시켜 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행한다(z 단계).
마지막으로, 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 상향 이동시켜, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 상기 제2 열블록(1200)으로부터 분리시켜 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 종료하고, 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 제1 열블록(1100)의 위로 이동시킨 후 상기 x, y, z 단계를 반복함으로써, 핵산 증폭 반응을 수행한다(순환 단계).
도 12는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치를 이용하여 실시간으로 핵산 증폭 반응을 관찰하는 단계를 도시한다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치는 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200) 사이에 광원(1700)이 더 배치되고, 상기 칩 홀더(1300) 위에 상기 광원(1700)으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부(1800)가 더 배치되거나, 또는 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200) 사이에 광원(1700)으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부(1800)가 더 배치되고, 상기 칩 홀더(1300) 위에 광원(1700)이 더 배치될 수 있다. 또한, 상기 광 검출부(1800)는 상기 구동 수단(1500) 위에 배치되고, 상기 구동 수단(1500)은 상기 광원(1700)으로부터 방출되는 광을 통과시키기 위한 관통부(1530)가 배치될 수 있다.
상기 광원(1700) 및 광 검출부(1800)의 배치에 의해, 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 의한 핵산 증폭 반응시 상기 PCR 칩(900) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출할 수 있도록 한다. 상기 PCR 칩(900) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 검출하기 위해서는 상기 PCR 칩(900)에 도입되는 샘플 용액에 별도의 형광 물질을 더 첨가할 수 있다. 상기 광원(1700)은 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200) 사이의 이격된 공간에 가능한 넓게 분포하도록 배치되고, 가능한 동일한 광을 방출하도록 배치된다. 상기 광원(1700)은 상기 광원(1700)으로부터 방출되는 광을 포집하는 렌즈(도시되지 않음) 및 특정 파장대의 광을 여과하는 광 필터(도시되지 않음)와 구동가능하게 연결 배치될 수 있다.
상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 의한 핵산 증폭 반응시 상기 PCR 칩(900) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출하는 단계는 하기 단계에 의한다. 상기 PCR의 제1 변성 단계의 종료 후 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 제1 열블록(1100)의 위로부터 제2 열블록(1200)의 위로 이동시키거나, 또는 상기 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 종료 후 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 PCR 칩(900)을 제2 열블록(1200)의 위로부터 제1 열블록(1100)의 위로 이동시키는 경우, 상기 PCR 칩(900)이 장착된 칩 홀더(1300)를 상기 구동 수단(1500)의 연결 부재(1520)를 제어하여 상기 제1 열블록(1100)과 제2 열블록(1200) 사이의 이격된 공간 상에 정지시키는 단계를 수행한다. 그 후, 상기 광원(1700)으로부터 광을 방출시키고, 상기 방출된 광은 상기 광투명한 PCR 칩(900), 구체적으로 상기 PCR 칩(900)의 반응 챔버(또는 채널)를 통과하고, 이 경우 상기 반응 챔버(또는 채널) 내의 핵산의 증폭에 의해 발생하는 광 신호를 상기 광 검출부(1800)가 검출한다. 이 경우 상기 광투명한 PCR 칩(900)을 통과한 광은 상기 구동 수단(1500), 구체적으로 상기 레일(1510)에 배치된 관통부(1530)를 통과하여 상기 광출부(1800)에 도달할 수 있다.
따라서, 상기 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치에 따르면, 상기 PCR 반응의 각 순환 단계가 진행되는 동안 상기 반응 챔버(또는 채널) 내에서 (형광 물질이 결합된) 핵산의 증폭에 의한 반응 결과를 실시간으로 모니터링함으로써 초기 반응 샘플에 포함되어 있는 표적 핵산의 양을 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다.
실시예
1: 식중독균 배양 및 게놈
DNA
의 추출
11종의 식중독을 유발하는 병원성 미생물을 한국 미생물 보존센터, 한국 생물 자원 센터, The global bioresource 센터로부터 구입하였다. 상기 병원성 미생물을 하기 표 1의 배양 조건에 따라 배양한 다음, QiaAmp DNA 정제 키트(QIAGEN)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다.
| 배지 | 균주 |
| BHI (Brain Heart infusion) : 37 |
바실러스속 (Bacillus) |
| 클러스트리듐속(Clostridium)(43 혐기성) | |
| 리스테리아속 (Listeria) | |
| 예르시니아속 (Yersinia) | |
| 쉬겔라속(Shigella) | |
| LB (Luria Bertani): 37 | 살모넬라속(Salmonella) |
| 독소형 박테리아속(ETEC) | |
| 비브리오속(Vibrio) | |
| 스타필로코코스속(Staphylococcus) | |
| 대장균(E.coli) | |
| CB(Campy BAP), NB(Nutrient Broth) | 캄필로박터속(Camphylobacter)(42 미호기성) |
실시예
2: 식중독균 검출용
프라이머
제작 및 합성
식중독균 11종의 실시간 검출을 위해 사용한 프라이머는 GC%를 40~60%가 되도록 하고, Tm 값 65~75℃의 조건이 되도록 하여 Primer 3를 통해 제작하고, 제작한 프라이머를 ㈜제노텍에 의뢰하여 합성하였다. 상기 프라이머 및 각각의 식중독균에서 특이적으로 증폭되는 유전자 목록은 하기 표 2와 같다. 하기 표에서, 프라이머 이름은 표적이 되는 유전자의 이름을 인용하였다. 예를 들어, Staphylococcus aureus에서 표적이 되는 유전자는 nucA 유전자이다.
| Strain Name | Product size ( bp ) | Primer name | Sequnce |
| Listeria monocytogenes | 221 | NBS-IAP-F | GCGCCACTACGGACGTTTAACCAAG (서열 번호 1) |
| NBS-IAP-R | ACAATCGCATCCGCAAGCACTGTAG (서열 번호 2) | ||
| 246 | NBS(N)-IAP-F | CGGACGTTTAACCAAGTTGCGCTAAC(서열 번호 31) | |
| NBS(N)-IAP-R | AGCTGGGATTGCGGTAACAGCATTTG(서열 번호 32) | ||
| Staphylococcus aureus | 198 | NBS-NUCA-F | ATTGGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCC (서열 번호 3) |
| NBS-NUCA-R | AAAGCTTCGTTTACCATTTTTCCATCAGCA (서열 번호 4) | ||
| 169 | NBS(N)-NUCA-F | AGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTG(서열 번호 33) | |
| NBS(N)-NUCA-R | GCAGCAGTGACACTTTTACAATGAGC(서열 번호 34) | ||
| Shigella boydii | 153 | NBS-IPAH-F | ATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC (서열 번호 5) |
| Shigella flexneri | NBS-IPAH-R | AGTTTCTCTGCGAGCATGGTCTGGAA (서열 번호 6) | |
| Shigella sonnei | 240 | NBS(N)-IPAH-F | AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAA(서열 번호 35) |
| NBS(N)-IPAH-R | TTTATCCCGGGCAATGTCCTCCAGAA(서열 번호 36) | ||
| Clostridium perfringerns | 155 | NBS-CPE-F | ACAATTTAAATCCAATGGTGTTCGAAAATGC (서열 번호 7) |
| NBS-CPE-R | GGGTTCCCCTAATATCCAACCATCTCCTTTA (서열 번호 8) | ||
| Camphylobacter jejuni | 210 | NBS-HIPO-F | ACCAAAAGGCATATTGTGCCATCCAAA (서열 번호 9) |
| NBS-HIPO-R | GTAATGCATGCTTGTGGTCATGATGGA (서열 번호 10) | ||
| Bacillus cereus | 187 | NBS-entFM-F | GTACAAAATTAACCATAACGGCCGCACAG (서열 번호 11) |
| NBS-entFM-R | AGATCTAGCGAATCCAGCGATTGAAGATG (서열 번호 12) | ||
| Yersinia enterocolitica | 223 | NBS-AIL-F | GCCATCTTTCCGCATCAACGAATATG (서열 번호 13) |
| NBS-AIL-R | ACCAAGCATCCAGGTGCCAACTTTTA (서열 번호 14) | ||
| Salmonella typhimurium | 217 | NBS-INVA-F | GCGCCGCCAAACCTAAAACCA (서열 번호 15) |
| Salmonella choleraesuis | |||
| NBS-INVA-R | GCAGGCGCACGCCATAATCAA (서열 번호 16) | ||
| Salmonella enteritidis | |||
| 218 | NBS(N)-INVA-F | TATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGA(서열 번호 37) | |
| Salmonella bongori | |||
| NBS(N)-INVA-R | CGCACGGAAACACGTTCGCTTAACAA(서열 번호 38) | ||
| Salmonella enterica | |||
| Vibrio parahaemolyticus | 162 | NBS-GYRB-F | AAGCGTTCGTTCAGCACTTAAACACCAA (서열 번호 17) |
| NBS-GYRB-R | GCTGTGGAATGTTGTTGGTGAAACAGAA (서열 번호 18) | ||
| 224 | NBS-TOXR-F | ACATCGGCACCAAATTTCTACTTGCTCA (서열 번호 19) | |
| NBS-TOXR-R | AGTCAGGCTTGAGTCATCCACCTCAAAA (서열 번호 20) | ||
| E. coli (ETEC) Plasmid DNA 2 | 187 | NBS-LT-F | GCGTATACAGCCCTCACCCATATGAACA (서열 번호 21) |
| NBS-LT-R | AATCTGTAACCATCCTCTGCCGGAGCTA (서열 번호 22) | ||
| 277 | NBS(N)-LT-F | AAAACGTTCCGGAGGTCTTATGCCCAGA(서열 번호 39) | |
| NBS(N)-LT-R | TGGGTGAGGGCTGTATACGCCTAATACA(서열 번호 40) | ||
| 233 | NBS-STh-F | GATGCCATGTCCGGAGGTAATATGAAGAA (서열 번호 23) | |
| NBS-STh-R | AATAGCACCCGGTACAAGCAGGATTACAA (서열 번호 24) | ||
| 240 | NBS(N)-STh-F | TCCGTGAAACAACATGACGGGAGGTA(서열 번호 41) | |
| NBS(N)-STh-R | CATGGAGCACAGGCAGGATTACAACA(서열 번호 42) | ||
| E. coli O157:H7 | 159 | NBS-STX1-F | GCAATTCTGGGAAGCGTGGCATTA (서열 번호 25) |
| NBS-STX1-R | CCCCAGAGTGGATGAATCCCACAA (서열 번호 26) | ||
| 148 | NBS(N)-STX1-F | GCGACGCCTGATTGTGTAACTGGAAA(서열 번호 43) | |
| NBS(N)-STX1-R | TCATCCCCGTAATTTGCGCACTGAGA(서열 번호 44) | ||
| 136 | NBS-STX2-F | ATGTGGCCGGGTTCGTTAATACGG (서열 번호 27) | |
| NBS-STX2-R | GCTGCGACACGTTGCAGAGTGGTA (서열 번호 28) | ||
| 225 | NBS(N)-STX2-F | TTCGCGCCGTGAATGAAGAGAGTCAA(서열 번호 45) | |
| NBS(N)-STX2-R | CAATCCGCCGCCATTGCATTAACAGA(서열 번호 46) | ||
| 159 | NBS-UIDA-F | GAATTGAGCAGCGTTGGTGGGAAA (서열 번호 29) | |
| NBS-UIDA-R | GGCCTGCCCAACCTTTCGGTATAA (서열 번호 30) |
각각의 식중독균에 대한 프라이머의 특이적 검출의 확인을 위해, 상기 실시예 1에서 획득한 균주들의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 하기 표 3 및 표 4에 상기 PCR 반응에 사용한 PCR 반응액의 조성 및 수행한 PCR 조건을 나타내었다. 각각의 PCR 반응액은 하기 조성에 증류수를 첨가하여 총 부피 50 ul가 되도록 하였다.
| 항목 | 농도 |
| 10X PCR 완충액(코스모진텍) | 1X |
| 10mM dNTPs | 1 mM |
| 주형 (게놈 DNA) | 25 ng |
| 프라이머(정방향/역방향) | 1 uM |
| Taq 중합효소(코스모진텍) | 1 U |
| 반응 온도 | 반응 시간 |
| 95 (denaturation) | 10초 |
| 72 (annealing & extention) | 10초 |
(2 step, 30 cycle)
PCR이 끝난 후, 각각의 반응액 중 3 ul를 1% 아가로즈 젤에 전기 영동하여 PCR 반응 산물을 확인함으로서, 상기 표 2의 프라이머 세트들에 의해 각각의 식중독균에 존재하는 특이적 유전자가 검출됨을 확인하였으며, 나머지 47 ul를 1% 아가로즈 젤에 전기 영동한 후, gel extraction kit(Invitrogen)를 사용하여 상기 PCR 반응 산물의 DNA 절편을 추출하였다. 추출된 각각의 DNA 절편들은 StrataClone PCR cloning Kit(Stratagene)로 클로닝하였다. 상기 클로닝한 벡터를 각각 E. coli에 형질전환시킨 후 암피실린/X-gal/IPTG가 포함된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 이후, 상기 PCR 증폭 산물이 포함되도록 클로닝된 벡터를 포함하는 콜로니만을 선별하여 LB 배지에서 배양 한 후, plasmid DNA miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
실시예
3:
광투과성
열블록
또는 2개의
열블록을
각각 포함하는
PCR
장치 및
광투과성
PCR
칩을 이용한 식중독균의 동시 검출
상기 실시예 1에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 11종의 식중독균을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 본 발명자에 의해 제작된 Real-time PCR 기기(광투과성 열블록 또는 2개의 열블록을 포함하는 PCR 장치) 및 광투과성 PCR 칩을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 실시간 PCR을 위한 반응액의 조성 및 실시간 PCR의 반응 조건을 하기 표 5 및 표 6에 기재하였다. 각각의 PCR 반응액은 하기 조성에 증류수를 첨가하여 총 부피 12 ul가 되도록 하였으며, 서로 다른 종류의 식중독균 검출을 위한 반응액은 PCR 칩 내의 서로 다른 관통 개구 채널의 관통 개구 유입부에 주입하였다. 본 실시예에서, 상기 PCR 칩 상에는 6개의 관통 개구 채널을 배치하여 6 종류의 식중독균을 동시에 검출할 수 있도록 하였다. 양성 대조군으로는 게놈 DNA 대신 New Influenza A virus H1N1의 HA (Hemagglutinin)유전자를 포함하는 플라스미드 pSC-HA를 주형으로 사용하였다.
| 항목 | 농도 |
| 10X PCR 완충액 | 1X |
| 10mM dNTPs | 1 mM |
| 주형 (게놈 DNA) | 25 ng |
| 프라이머 (정방향/역방향) | 1 uM |
| Taq 중합효소 | 3 U |
| SYBR Green Dye | 1X |
| 반응 온도 | 반응 시간 |
| 95 (denaturation) | 5초 |
| 72 (annealing & extention) | 14초 |
(2step, 30 cycle)
도 13 내지 도 22에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 본 발명의 키트를 이용하여 각각의 식중독균을 실시간으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> NANOBIOSYS INC.
<120> Kit and method for detecting food-borne bacteria
<130> PN089984
<160> 46
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-IAP-F)
<400> 1
gcgccactac ggacgtttaa ccaag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-IAP-R)
<400> 2
acaatcgcat ccgcaagcac tgtag 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-NUCA-F)
<400> 3
attggttgat acacctgaaa caaagcatcc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-NUCA-R)
<400> 4
aaagcttcgt ttaccatttt tccatcagca 30
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-IPAH-F)
<400> 5
ataatgatac cggcgctctg ctctcc 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-IPAH-R)
<400> 6
agtttctctg cgagcatggt ctggaa 26
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-CPE-F)
<400> 7
acaatttaaa tccaatggtg ttcgaaaatg c 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-CPE-R)
<400> 8
gggttcccct aatatccaac catctccttt a 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-HIPO-F)
<400> 9
accaaaaggc atattgtgcc atccaaa 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-HIPO-R)
<400> 10
gtaatgcatg cttgtggtca tgatgga 27
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-entFM-F)
<400> 11
gtacaaaatt aaccataacg gccgcacag 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-entFM-R)
<400> 12
agatctagcg aatccagcga ttgaagatg 29
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-AIL-F)
<400> 13
gccatctttc cgcatcaacg aatatg 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-AIL-R)
<400> 14
accaagcatc caggtgccaa ctttta 26
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS-INVA-F)
<400> 15
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<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-INVA-R)
<400> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-TOXR-R)
<400> 20
agtcaggctt gagtcatcca cctcaaaa 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-LT-R)
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aatctgtaac catcctctgc cggagcta 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gatgccatgt ccggaggtaa tatgaagaa 29
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<211> 29
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer(NBS-STh-R)
<400> 24
aatagcaccc ggtacaagca ggattacaa 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> reverse primer(NBS-STX2-R)
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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agctgggatt gcggtaacag catttg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer(NBS(N)-NUCA-F)
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agttcgtcaa ggcttggcta aagttg 26
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<220>
<223> reverse primer(NBS(N)-NUCA-R)
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> forward primer(NBS(N)-LT-F)
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tccgtgaaac aacatgacgg gaggta 26
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catggagcac aggcaggatt acaaca 26
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caatccgccg ccattgcatt aacaga 26
Claims (11)
- 제1 플레이트; 상기 제1 플레이트의 윗 부분에 배치되고, 하나 이상의 관통 개구 채널을 구비하는 제2 플레이트; 및 상기 제2 플레이트의 윗 부분에 배치되고, 상기 하나 이상의 관통 개구 채널 상의 각각의 일 영역에 형성된 관통 개구 유입부 및 다른 일 영역에 형성된 관통 개구 유출부를 구비하는 제3 플레이트를 포함하는 PCR 칩의 상기 하나 이상의 관통 개구 채널 내에,
(a) 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 31의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 32의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Listeria monocytogenes를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(b) 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 33의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 34의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Staphylococcus aureus를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(c) 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 35의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 36의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Shigella boydii, Shigella flexneri 또는 Shigella sonnei를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(d) 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Clostridium perfringerns를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(e) 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Camphylobacter jejuni를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(f) 서열번호 11의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Bacillus cereus를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(g) 서열번호 13의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Yersinia enterocolitica를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(h) 서열번호 15의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 37의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 38의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Salmonella 속 박테리아를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(i) 서열번호 17의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 서열번호 19의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio parahaemolyticus를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(j) 서열번호 21의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 23의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 39의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 40의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 또는 서열번호 41의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 42의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 장독성 대장균를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
(k) 서열번호 25의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 26의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 27의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 28의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 29의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 30의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 서열번호 43의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 44의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머, 또는 서열번호 45의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 46의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 E. coli O157:H7을 검출하기 위한 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 각각 포함하는 식중독균 검출용 키트. - 제1항에 있어서, 상기 PCR 칩은 광투과성 재질로 구현된 것인 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 플레이트 및 제3 플레이트는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate), 폴리에테르설폰(polyether sulfone), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재질로 이루어지고, 상기 제2 플레이트는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 사이클로올레핀 코폴리머, 폴리아미드(polyamide), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 열가소성 수지 또는 열경화성 수지 또는 열 경화성 수지 재질로 이루어진 것인 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 제3 플레이트의 관통 개구 유입부는 직경 1.0 mm 내지 3.0 mm이고, 상기 관통 개구 유출부는 직경 1.0 mm 내지 1.5 mm이며, 상기 제3 플레이트의 두께는 0.1 mm 내지 2 mm이고, 상기 제2 플레이트의 두께는 100 ㎛ 내지 200 ㎛이며, 상기 관통 개구 채널의 폭은 0.5 mm 내지 3 mm이고, 상기 관통 개구 채널의 길이는 20 mm 내지 60 mm인 것인 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 Salmonella 속 박테리아는 Salmonella enteritidis, Salmonella bongori 및 Salmonella enterica로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 키트는 상기 관통 개구 채널 내부에 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물, DNA 중합 효소 및 검출 가능한 표지를 더 포함하는 것인 키트.
- 제6항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 PCR 칩은 2개 이상의 관통 개구 채널을 갖는 것인 키트.
- 식중독균 감염이 의심되는 대상 시료를 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 키트의 하나 이상의 관통 개구 유입부에 주입하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 실시간 PCR 결과로부터 상기 대상 시료 중에 식중독균의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 2 이상의 식중독균을 동시에 실시간으로 검출하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 단일 열블록, 광투과성 열블록, 및 2개의 열블록으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하는 PCR 장치에서 수행되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 식중독균은 Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus, Shigella boydii, Shigella flexneri , Shigella sonnei , Clostridium perfringerns, Camphylobacter jejuni , Bacillus cereus , Yersinia enterocolitica , Salmonella enteritidis, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Vibrio parahaemolyticus , 장독성 대장균 및 E. coli O157:H7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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