KR20180023544A - 정형성 폐렴균 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 pcr 장치 및 정형성 폐렴균 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 정형성 폐렴균 검출용 프라이머-프로브 세트, 이를 포함하는 PCR용 키트 및 PCR 칩, 이를 이용한 PCR 장치, 및 이를 이용한 정형성 폐렴균 검출 방법에 관한 것으로서, 이에 따르면 정형성 폐렴균 감염 여부를 저렴한 비용으로 정확하고 신속하게 확인할 수 있어서 정형성 폐렴 확산을 예방하고 이에 신속한 대응 조치를 취하는 데에 크게 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 정형성 폐렴균 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 PCR용 키트, 이를 포함하는 PCR 칩 및 PCR 장치, 및 이를 이용하여 정형성 폐렴균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
폐렴(pneumonia)은 임상 증상에 따라 정형(typical)과 비정형(atypical) 폐렴으로 구분이 된다. 정형 폐렴은 발열, 가래, 기침, 흉통을 주 증상으로 하고, 폐렴 쌍구균(Streptococcus pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 헤모필루스 인플루엔자균( Haemophilus influenzae ) 등이 주된 원인균으로 알려져 있다. 비정형 폐렴은 마이코플라스마 폐렴균(Mycoplasma pneumoniae), 클라미도필라 폐렴균(Chlamidophilla pneumonia), 레지오넬라 폐렴균(Legionella pneumophila) 등의 감염에 의해 발생되는 폐렴으로 기침, 두통, 인후통, 근육통, 구토 등의 임상 증상과 흉부 엑스선에서 침윤 소견을 나타낸다. 그런데, 임상 증상만으로는 정형과 비정형 폐렴을 구분하기는 매우 어렵고, 이를 구분하기 위해서는 호흡기 검체로부터 원인균의 신속한 확인이 가장 중요하다.
폐렴쌍구균, 황색포도상구균, 헤모필루스 인플루엔자균 등의 감염에 의한 정형 폐렴과 마이코플라스마 폐렴균, 클라미도필라 폐렴균, 레지오넬라 폐렴균 등의 감염에 의한 비정형 폐렴은 초기 항생제 처방이 서로 다르기 때문에, 모든 환자의 경우 비정형 폐렴의 감염 가능성을 두고 경험적 항생제 치료 등을 받도록 되어 있다. 그러나 폐렴 원인균의 규명은 전체 폐렴의 35~50% 정도만이 확인되는 것으로 알려져 있으며, 경험적 항생제 치료는 내성 균주를 양산하는 결과를 초래하여 초기진단과정에서 폐렴 원인균의 확인은 이후 치료과정에서 원인균에 맞는 효과적인 치료제 선택에서 매우 중요하다.
특히, 최근 많이 사용되고 있는 실시간(real-time) PCR 방법은 PCR 증폭 산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭 산물과 반응하는 형광 물질의 검출과 정량으로 해석하는 방법이다. 이 방법은 기존의 PCR 방법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기 영동 후 PCR 증폭 산물을 확인하는 것에 비해, 전기 영동의 추가 작업이 필요 없고, 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하며, 결과를 수치화할 수 있고, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해 문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 실시간 PCR 방법을 통해 PCR 또는 항원/항체와 같은 정성적인 결과가 아닌 높은 특이도를 갖는 정량적인 결과를 확인할 수 있다. 또한 형광 표지 인자로 표지된 프로브를 이용하는 경우 DNA 칩이나 항원/항체 반응에 사용되는 시료의 양 보다 적은 양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다.
따라서, 정형성 폐렴균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하기 위해 실시간 PCR 방법을 이용한 정형성 폐렴균의 검출 방법 및 검출 키트 개발의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 3종의 정형성 폐렴균 중 하나 이상을 검출할 수 있는 정형성 폐렴균 검출용 프라이머-프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정형성 폐렴균을 검출할 수 있는 프라이머-프로브 세트를 포함하는 정형성 폐렴균 검출용 PCR 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 정형성 폐렴균을 검출할 수 있는 프라이머-프로브 세트를 포함하는 정형성 폐렴균 검출용 PCR 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 정형성 폐렴균을 검출할 수 있는 프라이머-프로브 세트를 포함하는 정형성 폐렴균 검출용 PCR 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 정형성 폐렴균 검출용 PCR 키트 및 이를 포함하는 PCR 장치를 이용하여 정형성 폐렴균을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명의 제1 실시 양태는, 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균( Haemophilus influenzae )을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는, 정형성 폐렴균(typical pneumonia) 검출용 프라이머-프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 제2 실시 양태는, 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3 의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균(Haemophilus influenzae )을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 정형성 폐렴균(typical pneumonia) 검출을 위한 PCR(polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다.
본 발명의 제3 실시 양태는, 제1 판; 상기 제1 판 상에 배치되고, 하나 이상의 반응 채널을 구비하는 제2 판; 및 상기 제2 판 상에 배치되고, 상기 하나 이상의 반응 채널의 양 말단과 연결되되 개폐 가능하도록 구현된 유입부 및 유출부를 구비하는 제3 판을 포함하는 PCR 칩으로서, 제1 실시 양태의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 칩을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 판 및 제3 판은 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질을 포함하고, 상기 제2 판은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 PCR 칩은 플라스틱 재질로 구현되되, 광 투과성을 갖도록 구현된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 하나 이상의 반응 채널 내에 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP를 포함하는 혼합물, DNA 중합효소 및 검출 가능한 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 칩을 제공한다. 본 발명에서, 상기 검출 가능한 표지는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제4 실시 양태는, 기판 상에 배치된 제1 열 블록; 상기 기판 상에 상기 제1 열 블록과 이격 배치된 제2 열 블록; 및 상기 제1 열 블록 및 제2 열 블록 위로 구동 수단에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 제3 실시양태의 PCR 칩이 장착된 칩 홀더;를 포함하는 PCR 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 광원이 더 배치되고, 상기 칩 홀더 위에 상기 광원으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부가 더 배치되거나, 또는 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 광원으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부가 더 배치되고, 상기 칩 홀더 위에 광원이 더 배치되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치를 제공한다.
본 발명의 제5 실시 양태는, 정형성 폐렴균 감염이 의심되는 대상 시료를 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩의 상기 하나 이상의 반응 채널에 도입하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 결과로부터 상기 대상 시료 중에 정형성 폐렴균의 존재 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 정형성 폐렴균 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 PCR 수행 단계는 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 정형성 폐렴균에 관한 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머-프로브 세트, 이를 포함하는 PCR 키트 및 PCR 칩, 이를 포함하는 PCR 장치, 및 이를 이용하는 정형성 폐렴균 검출 방법에 따르면, 정형성 폐렴균 감염 여부를 저렴한 비용으로 정확하고 신속하게 확인할 수 있어서 정형성 폐렴균 확산을 예방하고 이에 신속한 대응 조치를 취하는 데에 크게 기여할 수 있다.
특히, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 이용하는 경우, 정형성 폐렴균에 대한 특이성이 매우 높아 우수한 효율로 검출이 가능하기 때문에, 매우 적은 양의 시료에서 나오는 미량의 DNA에서도 정형성 폐렴균을 검출할 수 있는 우수한 효과를 발휘한다.
도 1은 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩의 단면도 및 평면도를 나타낸다.
도 2는 양면 접착제 또는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지가 처리된 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩에 관한 도면이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치에 관한 도면이다.
도 4는 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 PCR 결과를 나타낸다.
도 5는 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 PCR 결과를 나타낸다.
도 6은 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 PCR 결과를 나타낸다.
도 7은 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Staphylococcus aureus 검출 재현성 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Streptococcus pneumoniae 검출 재현성 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Haemophilus influenzae 검출 재현성 실험 결과를 나타낸다.
도 10은 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Staphylococcus aureus 검출 특이성 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Streptococcus pneumoniae 검출 특이성 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Haemophilus influenzae 검출 특이성 실험 결과를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 본 발명과 종래 기술의 Staphylococcus aureus 검출 성능을 비교한 것이다.
도 14a 및 14b는 본 발명과 종래 기술의 Streptococcus pneumoniae 검출 성능을 비교한 것이다.
도 15a 및 15b는 본 발명과 종래 기술의 Haemophilus influenzae 검출 성능을 비교한 것이다.
도 2는 양면 접착제 또는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지가 처리된 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩에 관한 도면이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치에 관한 도면이다.
도 4는 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 PCR 결과를 나타낸다.
도 5는 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 PCR 결과를 나타낸다.
도 6은 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 PCR 결과를 나타낸다.
도 7은 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Staphylococcus aureus 검출 재현성 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Streptococcus pneumoniae 검출 재현성 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Haemophilus influenzae 검출 재현성 실험 결과를 나타낸다.
도 10은 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Staphylococcus aureus 검출 특이성 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Streptococcus pneumoniae 검출 특이성 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 PCR 칩의 Haemophilus influenzae 검출 특이성 실험 결과를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 본 발명과 종래 기술의 Staphylococcus aureus 검출 성능을 비교한 것이다.
도 14a 및 14b는 본 발명과 종래 기술의 Streptococcus pneumoniae 검출 성능을 비교한 것이다.
도 15a 및 15b는 본 발명과 종래 기술의 Haemophilus influenzae 검출 성능을 비교한 것이다.
이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시 양태에 대하여 상세하게 설명한다. 이하 설명은 본 발명에 실시 양태들을 용이하게 이해하기 위한 것일 뿐이며, 보호범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
본 발명의 제1 실시 양태는, 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균(Haemophilus influenzae )을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는, 정형성 폐렴균(typical pneumonia) 검출용 프라이머-프로브 세트에 관한 것이다.
본 발명에서, "프라이머(primer)"란 적합한 온도와 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다.
본 발명에서, "정방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"란 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
본 발명에서, "프로브(probe)"란 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수개 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 이후 증폭, 분리 및 검출에 의하여 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질을 포함하고, 3'-말단에 퀸처(quencher)를 포함하는 프로브를 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 프로브의 5' 말단은 FAM, 3' 말단은 BHQ1의 형광 물질을 부착할 수 있으며, 본 발명의 다른 구현예에서, 프로브의 5' 말단은 Cy5, 3' 말단은 BHQ2의 형광 물질을 부착할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프라이머 및 프로브의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머/프로브 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 족하다. 따라서, 본 발명의 제1 실시 양태에 따른 프라이머-프로브 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 또는 프로브 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 족하다.
따라서, 본 발명의 실시 양태에 따른 프라이머는 서열번호 1, 3, 4, 6, 7 및 9 중 어느 하나의 염기 서열 내의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 프라미어는 서열번호 1, 3, 4, 6, 7 및 9 중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 실시 양태에 따른 프로브는 서열번호 2, 5 및 8 중 어느 하나의 염기 서열 내의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 2, 5 및 8 중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
이러한 프라이머/프로브의 설계는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 설계용 프로그램(예를 들어, PRIMER 3, VectorNTI 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시 양태에 따른 프라이머 및 프로브는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다.
본 발명의 제2 실시 양태는, 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균(Haemophilus influenzae )을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 정형성 폐렴균(typical pneumonia) 검출을 위한 PCR(polymerase chain reaction)용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 프라이머 및 프로브 세트 외에 분리 시약, 증폭 시약 또는 검출 시약으로 사용가능한 물질들을 하나 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머-프로브 세트를 이용하여 정형성 폐렴균을 검출하는 방법은, 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 상기 프라이머-프로브 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 PCR 수행 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "대상 시료"란 정형성 폐렴균에 감염되었을 것으로 예상되는 개체의 시료(샘플 또는 샘플 용액)를 의미하고, 예를 들어 배양된 세포, 혈액, 타액 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 PCR 수행 단계는 이하 상세하게 설명될 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 실시간 PCR 장치에서 수행될 수 있으나, 이는 예시적인 것으로서 이에 한정되지 않는다. 실시간 PCR 장치를 이용할 경우 PCR 과정에서 증폭 산물에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 Ct 값을 계산함으로써 확인할 수 있다. 상기 Ct 값의 계산은 실시간 PCR 장치에 설치된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 정형성 폐렴균 검출을 위한 3종의 프라이머-프로브 세트는 다수개의 채널을 갖는 PCR 칩의 각 채널에 각각 도입됨으로써, 한번의 PCR 수행으로 정형성 폐렴균 3종 모두의 검출을 확인하는 것이 가능하다. 또한, 사용 목적이나 샘플 수에 따른 실험의 용이성을 위하여, PCR 칩 1개에 1종의 프라이머-프로브 세트를 도입할 수 있음은 물론이며, 필요에 따라 다르게 변형하여 사용할 수 있다.
예를 들어, 16개의 채널을 갖는 PCR 칩을 사용하여 3종의 검체에 대하여 정형성 폐렴 검출을 시행하려는 경우, 아래의 표 1에 나타낸 바와 같이 PCR 칩의 채널을 구성할 수 있다.
도 1에 따르면, 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩은 제1 판(11); 상기 제1 판(11) 상에 배치되고, 하나 이상의 반응 채널(14)을 구비하는 제2 판(12); 및 상기 제2 판(12) 상에 배치되고, 상기 하나 이상의 반응 채널(14)의 양 말단과 연결되되 개폐 가능하도록 구현된 유입부(15) 및 유출부(16)를 구비하는 제3 판(13)을 포함하는 것으로서, 상기 하나 이상의 반응 채널(14) 내에 본 발명의 제1 실시 양태에 따른 프라이머-프로브 세트를 포함한다.
상기 PCR 칩(10)의 반응 채널(14) 내에는 상기 본 발명의 제1 실시 양태에 따른 프라이머-프로브 세트 이외에 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), 구체적으로 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP를 포함하는 혼합물, DNA 중합효소, 검출 가능한 표지, 및 PCR 완충액(PCR buffer)를 더 포함할 수 있다.
상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다.
상기 검출 가능한 표지는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 PCR 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충액들은 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PCR 칩(10)은 상기 샘플 용액을 도입하기 위한 유입부(15), 핵산 증폭 반응을 완료한 샘플 용액을 배출하기 위한 유출부(16) 및 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액이 수용된 하나 이상의 반응 채널(14)를 포함할 수 있다. 상기 PCR 칩(10)이 PCR 장치의 열 블록에 접촉하는 경우 상기 열 블록에서 발생하는 열은 상기 PCR 칩(10)에 전달되고, 상기 PCR 칩(10)의 반응 채널(14)에 포함된 샘플 용액은 가열되거나 냉각되어 일정 온도가 유지될 수 있다.
또한, 상기 PCR 칩(10)은 전체적으로 평면 형상을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 PCR 칩(10)은 PCR 장치의 칩 홀더에 장착된 상태로 상기 열 블록에 접촉 배치될 수도 있다. 따라서, 상기 PCR 칩(10)이 상기 열 블록의 일 면에 배치된다는 것은 상기 PCR 칩(10)이 상기 칩 홀더에 장착된 상태로 상기 열 블록에 접촉 배치되는 것을 포함한다.
또한, 상기 PCR 칩(10)은 플라스틱 재질로 구현되되, 광 투과성을 갖도록 구현될 수 있다. 상기 PCR 칩(10)은 플라스틱 재질을 사용하여, 플라스틱 두께 조절만으로 열 전달 효율을 증대시킬 수 있고, 제작 공정이 단순하여 제조 비용을 절감할 수 있다. 또한 상기 PCR 칩(10)은 전체적으로 광 투과성을 구비할 수 있기 때문에 상기 열 블록의 일 면에 배치된 상태에서 직접적으로 광 조사가 가능하여 실시간으로 핵산 증폭 여부 및 증폭 정도를 측정 및 분석할 수 있다.
상기 제1 판(11)은 상기 제2 판(12) 하부 면에 배치된다. 상기 제1 판(11)이 상기 제2 판(920)의 하부 면에 접착 배치됨으로써 상기 하나 이상의 반응 채널(14)은 일종의 PCR 반응 챔버를 형성한다. 또한, 상기 제1 판(11)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질일 수 있다. 또한, 상기 제1 판(11)의 상단 면은 친수성 물질(17)이 처리되어 PCR을 원활하게 수행할 수 있다. 상기 친수성 물질(17)의 처리에 의해 상기 제1 판(11) 상에 친수성 물질(17)을 포함하는 단일 층이 형성될 수 있다. 상기 친수성 물질은 다양한 물질일 수 있으나, 바람직하게는 카르복시기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 및 술폰기(-SH)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 친수성 물질의 처리는 당 업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 제2 판(12)은 상기 제1 판(11) 상부 면에 배치된다. 상기 제2 판(920)은 하나 이상의 반응 채널(14)을 포함한다. 상기 반응 채널(14)은 상기 제3 판(13)에 형성된 유입부(15)과 유출부(16)에 대응되는 부분과 연결되어 일종의 PCR 반응 챔버를 형성한다. 따라서, 상기 반응 채널(921)에 증폭하고자 하는 샘플 용액이 도입된 후 PCR이 진행된다. 또한, 상기 반응 채널(14)은 PCR 장치의 사용 목적 및 범위에 따라 2 이상 존재할 수 있고, 도 1에 따르면, 6개의 반응 채널(14)이 예시되고 있다. 또한, 상기 제2 판(12)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질일 수 있다. 또한, 상기 제2 판(12)의 두께는 다양할 수 있으나, 100 ㎛ 내지 200 ㎛에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 반응 채널(14)의 폭과 길이는 다양할 수 있으나, 바람직하게는 상기 반응 채널(14)의 폭은 0.5 mm 내지 3 mm에서 선택되고, 상기 관통 개구 채널(14)의 길이는 20 mm 내지 40 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 제2 판(12) 내벽은 DNA, 단백질(protein) 흡착을 방지하기 위해 실란(silane) 계열, 보바인 시럼 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 등의 물질로 코팅할 수 있고, 상기 물질의 처리는 당 업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
상기 제3 판(13)은 상기 제2 판(12) 상에 배치된다. 상기 제3 판(13)은 상기 제2 판(12)에 형성된 하나 이상의 반응 채널(921) 상의 일 영역에 형성된 유입부(15) 및 다른 일 영역에 형성된 유출부(16)를 구비한다. 상기 유입부(15)는 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액 등이 유입되는 부분이다. 상기 유출부(16)는 PCR이 종료된 후 샘플 용액 등이 유출되는 부분이다. 따라서, 상기 제3 판(13)은 이하 언급할 제2 판(12)에 형성된 하나 이상의 반응 채널(14)을 커버하되, 상기 유입부(15) 및 유출부(16)는 상기 반응 채널(14)의 유입부 및 유출부 역할을 수행하게 된다. 또한, 상기 제3 판(13)은 다양한 재질로 구현될 수 있지만, 바람직하게는 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질일 수 있다. 또한, 상기 유입부(15)은 다양한 크기를 구비할 수 있으나, 바람직하게는 지름 1.0 mm 내지 3.0 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 유출부(16)는 다양한 크기를 구비할 수 있으나, 바람직하게는 지름 1.0 mm 내지 1.5 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 유입부(15) 및 유출부(16)는 별도의 커버 수단(도시되지 않음)을 구비하여, 상기 반응 채널(14) 내에서 샘플 용액에 대한 PCR이 진행될 때 샘플 용액이 누출되는 것을 방지할 수 있다. 상기 커버 수단은 다양한 형상, 크기 또는 재질로서 구현될 수 있다. 또한, 상기 제3 판의 두께는 다양할 수 있으나, 바람직하게는 0.1 mm 내지 2.0 mm에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 유입부(15) 및 유출부(16)는 2 이상 존재할 수 있다.
도 2에 따르면, 상기 PCR 칩(10)은 기계적 가공을 통해 유입부(15) 및 유출부(16)를 형성하여 제3 판(13)을 제공하는 단계; 상기 제3 판(13)의 하부면과 대응되는 크기를 갖는 판재에 상기 제3 판(13)의 유입부(15)와 대응되는 부분으로부터 상기 제3 판(13)의 유출부(16)에 대응되는 부분까지 기계적 가공을 통해 하나 이상의 반응 채널(14)을 형성하여 제2 판(12)을 제공하는 단계; 상기 제2 판(12)의 하부면과 대응되는 크기를 갖는 판재의 상부면에 표면 처리 가공을 통해 친수성 물질(17)로 구현된 표면을 형성하여 제1 판(11)을 제공하는 단계; 및 상기 제3 판(13)의 하부면을 상기 제2 판(12)의 상부면에 접합 공정을 통해 접합하고, 상기 제2 판(12)의 하부면을 상기 제1 판(11)의 상부면에 접합 공정을 통해 접합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 상기 제3 판(13)의 유입부(15) 및 유출부(16), 및 상기 제2 판(12)의 반응 채널(14)은 사출성형, 핫-엠보싱(hot-embossing), 캐스팅(casting), 및 레이저 어블레이션(laser ablation)으로 구성된 군으로부터 선택되는 가공 방법에 의해 형성될 수 있다. 또한, 상기 제1 판(11) 표면의 친수성 물질(17)은 산소 및 아르곤 플라즈마 처리, 코로나 방전 처리, 및 계면 활성제 도포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 처리될 수 있고 당 업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3 판(13)의 하부 면과 상기 제2 판(12)의 상부면, 및 상기 제2 판(12)의 하부 면과 상기 제1 판(11)의 상부면은 열 접합, 초음파 융착, 용매 접합 공정에 의해 접착될 수 있고 당 업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 제3 판(13)과 제2 판(12) 사이 및 상기 제2 판(12)과 제3 판(13) 사이에는 양면 접착제 또는 열가소성 수지 또는 열 경화성 수지(18)가 처리될 수 있다.
이하, 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩이 구동되는 PCR 장치에 관하여 설명한다. PCR 장치라 함은 특정 염기 서열을 갖는 핵산을 증폭하는 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 사용하기 위한 장치이다. 예를 들어, 특정 염기 서열을 갖는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 증폭하기 위한 PCR 장치는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 샘플 용액을 특정 온도, 예를 들어 약 95로 가열하여 상기 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리하는 변성 단계(denaturing step), 상기 샘플 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 상기 분리된 단일 가닥의 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 55로 냉각하여 상기 단일 가닥의 DNA의 특정 염기 서열에 상기 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링 단계(annealing step), 및 상기 어닐링 단계 이후 상기 샘플 용액을 적정 온도, 예를 들어 72로 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 상기 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중 가닥의 DNA를 형성하는 연장 (혹은 증폭) 단계(extension step)를 수행하고, 상기 3 단계를 예를 들어, 20회 내지 40회로 반복함으로써 상기 특정 염기 서열을 갖는 DNA를 기하급수적으로 증폭할 수 있다. 또한, 경우에 따라, PCR 장치는 상기 어닐링 단계와 상기 연장 (혹은 증폭) 단계를 동시에 수행할 수 있고, 이 경우 PCR 장치는 상기 연장 단계와 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계로 구성된 2 단계를 수행함으로써, 제1 순환을 완성할 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서, PCR 장치는 상기 단계들을 수행하기 위한 모듈들을 포함하는 장치를 말하며, 본 명세서에 기재되지 아니한 세부적인 모듈들은 PCR을 수행하기 위한 종래 기술 중 개시되고 자명한 범위에서 모두 구비하고 있는 것을 전제로 한다.
도 3a 내지 도 3c에 따르면, 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치가 상세하게 설명된다.
도 3a에 따르면, 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치는 기판(400a) 상에 배치된 제1 열 블록(100a); 상기 기판(400a) 상에 상기 제1 열 블록(100a)과 이격 배치된 제2 열 블록(200a); 및 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 구동 수단(500a)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 상기 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 포함한다.
상기 기판(400a)은 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)의 가열 및 온도 유지로 인해 그 물리적 및/또는 화학적 성질이 변하지 않고, 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 사이에서 상호 열 교환이 일어나지 않도록 하는 재질을 갖는 모든 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 기판(400a)은 플라스틱 등의 재질을 포함하거나 그러한 재질로 구성될 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 핵산을 증폭하기 위한 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하기 위한 것이다. 따라서 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 상기 각 단계들에 요구되는 필요한 온도를 제공하고, 이를 유지하기 위한 다양한 모듈을 포함하거나 또는 그러한 모듈과 구동가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)가 상기 각 열 블록(100a, 200a)의 일 면에 접촉되는 경우 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 상기 PCR 칩(10)과의 접촉면을 전체적으로 가열 및 온도 유지할 수 있어서, 상기 PCR 칩(10) 내의 샘플 용액을 균일하게 가열 및 온도 유지할 수 있다. 종래 단일 열 블록을 사용하는 PCR 장치는 상기 단일 열 블록에서의 온도 변화율이 초당 3 내지 7 범위 내에서 이루어지는데 반해, 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치는 각각의 열 블록(100a, 200a)에서의 온도 변화율이 초당 20 내지 40 범위 내에서 이루어져 PCR 진행 시간을 크게 단축시킬 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 그 내부에 열선(도시되지 않음)이 배치될 수 있다. 상기 열선은 상기 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하도록 다양한 열원과 구동가능하게 연결될 수 있고, 상기 열선의 온도를 모니터링하기 위한 다양한 온도 센서와 구동가능하게 연결될 수 있다. 상기 열선은 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열 블록(100a, 200a) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭되도록 배치될 수 있다. 상기 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭된 열선의 배치는 다양할 수 있다. 또한, 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 그 내부에 박막 히터(thin film heater, 도시되지 않음)가 배치될 수도 있다. 상기 박막 히터는 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열 블록(100a, 200a) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 간격으로 이격 배치될 수 있다. 상기 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 박막 히터의 배치는 다양할 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 동일한 면적에 대한 고른 열 분포 및 신속한 열 전달을 위해 금속 재질, 예를 들어 알루미늄 재질을 포함하거나 또는 알루미늄 재질로 구성될 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a)은 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치의 제1 열 블록(100a)은 50 내지 100를 유지할 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 열 블록(100a)에서 상기 변성 단계를 수행하는 경우 90 내지 100를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95를 유지할 수 있으며, 상기 제1 열 블록(100a)에서 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55 내지 75를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72를 유지할 수 있다. 다만, 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 열 블록(200a)은 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치의 제2 열 블록(200a)은 상기 제2 열 블록(200a)에서 상기 변성 단계를 수행하는 경우 90 내지 100를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95를 유지할 수 있으며, 상기 제2 열 블록에서 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55 내지 75를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72를 유지할 수 있다. 다만, 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 제4 실시 양태에 따르면, 상기 제1 열 블록(100a)은 PCR의 변성 단계 온도 (denaturing temperature)를 유지할 수 있으며, 변성 단계 온도가 90보다 낮으면 PCR의 주형이 되는 핵산의 변성이 일어나 효율이 떨어져 PCR 효율이 떨어지거나 반응이 일어나지 않을 수 있고, 변성 단계 온도가 100보다 높아지면 PCR에 이용되는 효소가 활성을 잃게 되므로, 상기 변성 단계 온도는 90 내지 100일 수 있고, 바람직하게는 95일 수 있다. 또한, 본 발명의 제4 실시 양태에 따르면, 상기 제2 열 블록(200a)은 PCR의 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도(annealing/extension temperature)를 유지할 수 있다. 연장 (혹은 증폭) 단계 온도가 55보다 낮으면 PCR 산물의 특이성(specificity)이 떨어질 수 있고, 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도가 74보다 높으면 프라이머에 의한 연장이 일어나지 않을 수 있기 때문에 PCR 효율이 떨어지게 되므로 상기 어니링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도는 55 내지 75일 수 있고, 바람직하게는 72일 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a)은 상호 열 교환이 일어나지 않도록 미리 결정된 거리로 이격 배치될 수 있다. 이에 따라, 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에서 열 교환이 일어나지 않기 때문에, 미세한 온도 변화에 의해서도 중대한 영향을 받을 수 있는 핵산 증폭 반응에 있어서, 상기 변성 단계와 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 정확한 온도 제어가 가능하다.
본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치는 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 구동 수단(500a)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 포함한다. 상기 칩 홀더(300a)는 상기 PCR 칩(10)이 상기 PCR 장치에 장착되는 모듈이다. 상기 칩 홀더(300a)의 내벽은 상기 PCR 장치에 의해 핵산 증폭 반응이 수행되는 경우 상기 PCR 칩(10)이 상기 칩 홀더(300a)로부터 이탈하지 않도록 상기 PCR 칩(10)의 외벽과 고정 장착되기 위한 형상 및 구조를 가질 수 있다. 상기 칩 홀더(300a)는 상기 구동 수단(500a)에 구동가능하게 연결된다. 또한, 상기 PCR 칩(10)은 상기 칩 홀더(300a)에 착탈 가능할 수 있다.
상기 구동 수단(500a)은 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 좌우 및/또는 상하 이동 가능하게 하는 모든 수단을 포함한다. 상기 구동 수단(500a)의 좌우 이동에 의해, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에서 왕복 운동이 가능하고, 상기 구동 수단(500a)의 상하 이동에 의해, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a)에 접촉 및 분리될 수 있다. 도 3a에 도시된 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치의 구동 수단(500a)은 좌우 방향으로 연장된 레일(510a), 및 상기 레일(510a)을 통해 좌우 방향으로 슬라이딩 이동가능하게 배치되고, 상하 방향으로 슬라이딩 이동 가능한 연결 부재(520a)를 포함하고, 상기 연결 부재(520a)의 일 말단은 상기 칩 홀더가 배치된다. 상기 구동 수단(500a)의 좌우 및/또는 상하 이동은 상기 PCR 장치의 내부 또는 외부에 구동가능하게 배치된 제어 수단(도시되지 않음)에 의해 제어될 수 있고, 상기 제어 수단은 PCR의 변성 단계와 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)와 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 사이의 접촉 및 분리를 제어할 수 있다.
도 3b는 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치의 칩 홀더의 이동에 의한 핵산 증폭 반응의 각 단계를 도시한다. 상기 PCR 장치에 의한 핵산 증폭 반응은 하기 단계에 의한다. 먼저, 상기 PCR 칩(10)에 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 완충액(PCR buffer)를 포함하는 샘플 용액을 도입하고, 상기 PCR 칩(10)을 상기 칩 홀더(300a)에 장착하는 단계를 수행한다. 그 후 또는 이와 동시에 상기 제1 열 블록(100a)을 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90 내지 100로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 95로 가열 및 유지하는 단계를 수행한다. 상기 제2 열 블록(200)을 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 55 내지 75로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 72로 가열 및 유지하는 단계를 수행한다. 그 후, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 하향 이동시켜, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제1 열 블록(100a)에 접촉시켜 PCR의 제1 변성 단계를 수행한다(x 단계). 그 후, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 상향 이동시켜, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제1 열 블록(100a)으로부터 분리시켜 PCR의 제1 변성 단계를 종료하고, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 제2 열 블록(200a)의 위로 이동시키는 단계를 수행한다(y 단계). 그 후, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 하향 이동시켜, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제2 열 블록(100a)에 접촉시켜 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행한다(z 단계). 마지막으로, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 상향 이동시켜, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제2 열 블록(100a)으로부터 분리시켜 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 종료하고, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 제1 열 블록(100a)의 위로 이동시킨 후 상기 x, y, z 단계를 반복함으로써, 핵산 증폭 반응을 수행한다(순환 단계).
도 3c은 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치를 이용하여 실시간으로 핵산 증폭 반응을 관찰하는 단계를 도시한다. 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에 광원(700a)이 더 배치되고, 상기 칩 홀더(300a) 위에 상기 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부(800a)가 더 배치되거나, 또는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부(800a)가 더 배치되고, 상기 칩 홀더(300a) 위에 광원(700a)이 더 배치될 수 있다. 또한, 상기 광 검출부(800a)는 상기 구동 수단(500a) 위에 배치되고, 상기 구동 수단(900a)은 상기 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 통과시키기 위한 관통부(530a)가 배치될 수 있다. 또한, 상기 PCR 칩(10)은 광투과성 재질, 구체적으로 광투과성 플라스틱 재질일 수 있다.
상기 광원(700a) 및 광 검출부(800a)의 배치에 의해, 상기 PCR 장치(1)에 의한 핵산 증폭 반응시 상기 PCR 칩(10) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출할 수 있도록 한다. 상기 PCR 칩(10) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 검출하기 위해서는 상기 PCR 칩(10)에 도입되는 샘플 용액에 별도의 형광 물질을 더 첨가할 수 있다. 상기 광원(700a)은 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이의 이격된 공간에 가능한 넓게 분포하도록 배치되고, 가능한 동일한 광을 방출하도록 배치된다. 상기 광원(700a)은 상기 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 포집하는 렌즈(도시되지 않음) 및 특정 파장대의 광을 여과하는 광 필터(도시되지 않음)와 구동가능하게 연결 배치될 수 있다.
본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치에 의한 핵산 증폭 반응시 상기 PCR 칩(10) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출하는 단계는 하기 단계에 의한다. 상기 PCR의 제1 변성 단계의 종료 후 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 제1 열 블록(100a)의 위로부터 제2 열 블록(200a)의 위로 이동시키거나, 또는 상기 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 종료 후 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 PCR 칩(10)을 제2 열 블록(200a)의 위로부터 제1 열 블록(200a)의 위로 이동시키는 경우, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이의 이격된 공간 상에 정지시키는 단계를 수행한다. 그 후, 상기 광원(700a)으로부터 광을 방출시키고, 상기 방출된 광은 상기 광투과성 PCR 칩(10), 구체적으로 상기 PCR 칩(10)의 반응 채널)를 통과하고, 이 경우 상기 반응 채널) 내의 핵산의 증폭에 의해 발생하는 광 신호를 상기 광 검출부(800a)가 검출한다. 이 경우 상기 광투과성 PCR 칩(10)을 통과한 광은 상기 구동 수단(500a), 구체적으로 상기 레일(510a)에 배치된 관통부(530a)를 통과하여 상기 광출부(800a)에 도달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제4 실시 양태에 따른 PCR 장치에 따르면, 상기 PCR의 각 순환 단계가 진행되는 동안 상기 반응 채널 내에서 (형광 물질이 결합된) 핵산의 증폭에 의한 반응 결과를 실시간으로 모니터링함으로써 초기 반응 샘플에 포함되어 있는 표적 핵산의 양을 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 정형성 폐렴균 게놈 DNA 추출
정형성 폐렴을 유발하는 3종의 균, Staphylococcus aureus , Streptococcus pneumoniae 및 Haemophilus influenzae는 모두 ATCC에서 구입하였으며, 이 중 Staphylococcus aureus(ATCC6538) 및 Streptococcus pneumoniae(ATCC33400)의 균은 배양된 형태로 구입하여 배양을 실시한 후 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen)를 사용하여 주형 DNA를 추출하였고, Haemophilus influenzae(ATCC51909D)는 정제된 DNA 형태로 구입하였다.
실시예
2. 정형성 폐렴균 검출용
프라이머
-
프로브
세트 제작
정형성 폐렴균 3종의 실시간 검출을 위해 사용한 프라이머-프로브 세트를 제작하기 위하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank에서 해당 유전자의 염기서열을 수집한 후 ClustalW를 이용하여 얼라인먼트(Alignment)를 실시하였다. 계통적으로 밀접한 근연종과 차이를 보이며, 동일종에서 상동성이 확보된 특이적 염기서열 부위를 선정하여 정형성 폐렴균 3종 각각에 특이적인 부위에 결합하는 프라이머 및 프로브는 길이 20~30base, 증폭산물은 100-150 bp 전후가 되도록 Primer3 프로그램을 사용하여 디자인하였다.
정형성 폐렴균 3종을 특이적으로 검출하기 위한 정방향 프라이머/프로브/역방향 프라이머 세트의 염기서열(sequence) 및 그에 따른 산물 크기는 아래의 표 2에 나타낸 바와 같다.
선정된 프라이머 및 프로브는 BLAST 서치를 통하여 다른 호흡기 감염질환 유발 병원성 세균과 반응하지 않는 다는 것을 in- silico 상에서 분석하여 확인하였다.
실시예
3. 정형성 폐렴균 검출을 위한
PCR
수행
정형성 폐렴균에 대한 본 발명의 프라이머-프로브 세트의 특이적 검출의 확인을 위하여, 상기 실시예 1에서 획득한 정형성 폐렴균의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 실시예 2에서 제작된 3종의 프라이머-프로브 세트를 본 발명의 제3 실시 양태에 따른 PCR 칩에 도입하여 PCR을 수행하였다. 실시간 PCR을 위한 반응액의 조성 및 실시간 PCR의 반응 조건은 하기 표 3 및 표 4에 기재하였다.
| 단계 | 온도(℃) | 시간(초) | Cycle No. |
| 1 | 95 | 8 | 1 |
| 2 | 95 | 7 | 44 |
| 56 | 14 | ||
| Scan | FAM/Cy5 |
| Materials | 부피(㎕) |
| 2xBMW Real-time PCR Master Mix | 5 |
| 프라이머/프로브 믹스 | 1 |
| IPC | 1 |
| 주형 | 3 |
| Total | 10 |
3-1
. Staphylococcus
aureus
검출 범위 및 민감도 확인
Staphylococcus aureus 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 1 내지 3)의 검출 민감도를 확인하기 위하여 Staphylococcus aureus의 유전자가 삽입된 Plasmid DNA 주형을 10배씩 단계적 희석을 하여 한 반응당(/rxn) 5 x 106 내지 5 x 101이 되도록 하였다.
PCR 칩의 각 채널에 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트 및 각 농도에 따른 DNA 주형을 상기 표 4의 조성에 맞도록 도입하고 PCR을 수행하여 Ct 값을 도출하였다. Ct 값은 총 6번의 개별적인 PCR을 수행한 평균값으로 계산하였으며, PCR 수행 결과 그래프와 주형의 각 농도에 따른 Ct 값 도출 결과를 도 4 및 표 5에 각각 나타내었다.
상기 표 5에서 확인 가능한 바와 같이, 주형 복제 회수 5 x 101 내지 5 x 106 범위에서 모두 Staphylococcus aureus 검출이 가능하였으며, 특히 5x101copy/rxn까지 100% 검출이 확인되어 매우 높은 민감도로 Staphylococcus aureus 검출이 가능하다는 것을 알 수 있다.
3-2.
Streptococcus pneumoniae
검출 범위 및 민감도 확인
Streptococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 4 내지 6)의 검출 민감도 시험을 상기 3-1과 동일한 방식으로 수행하였다. PCR 수행 결과 그래프와 주형의 각 농도에 따른 Ct 값 도출 결과를 도 5 및 표 6에 각각 나타내었다.
상기 표 6에서 확인 가능한 바와 같이, 주형 복제 회수 5 x 101 내지 5 x 106 범위에서 모두 Streptococcus pneumoniae 검출이 가능하였으며, 특히 5x101copy/rxn까지 100% 검출이 확인되어 매우 높은 민감도로 Streptococcus pneumoniae 검출이 가능하다는 것을 알 수 있다.
3-3.
Haemophilus
influenzae
검출 범위 및 민감도 확인
Haemophilus influenzae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 7 내지 9)의 검출 민감도 시험을 상기 3-1과 동일한 방식으로 수행하였다. PCR 수행 결과 그래프와 주형의 각 농도에 따른 Ct 값 도출 결과를 도 6 및 표 7에 각각 나타내었다.
상기 표 7에서 확인 가능한 바와 같이, 주형 복제 회수 5 x 101 내지 5 x 106 범위에서 모두 Haemophilus influenzae 검출이 가능하였으며, 특히 5x101copy/rxn까지 100% 검출이 확인되어 매우 높은 민감도로 Haemophilus influenzae 검출이 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예
4. 정형성 폐렴균 검출 재현성 시험
4-1.
Staphylococcus
aureus
검출 재현성 시험
Staphylococcus aureus 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 1 내지 3)의 검출 재현성을 확인하기 위하여 세 명의 검사자(tester)가 양성대조군(positive control DNA) 및 음성 대조군(no template)을 대상으로 5회의 PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인 가능한 바와 같이, tester 1 내지 3에 의해 수행된 5번의 PCR 결과에서 모두 음성 대조군에서는 검출이 확인되지 않았고, 양성 대조군에서는 약 19의 Ct 값이 확인되었다. 이는 본 발명의 Staphylococcus aureus 검출용 프라이머-프로브 세트의 검출 재현성이 매우 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
4-2.
Streptococcus
pneumoniae
검출 재현성 시험
Streptococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 4 내지 6)의 검출 재현성 시험을 상기 재현성 시험 4-1에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인 가능한 바와 같이, tester 1 내지 3에서 수행된 5번의 PCR에서 모두 음성 대조군에서는 검출이 확인되지 않고, 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트는 약 19의 Ct 값이 확인되었다. 이는 본 발명에 따른 Streptococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트의 검출 재현성이 매우 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
4-3.
Haemophilus
influenzae
검출 재현성 시험
Haemophilus influenzae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 7 내지 9)의 검출 재현성 시험을 상기 시험 4-1에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 확인 가능한 바와 같이, tester 1 내지 3에서 수행된 5번의 PCR에서 모두 음성 대조군에서는 검출이 확인되지 않고, 서열번호 7 내지 9의 프라이머-프로브 세트는 약 19의 Ct 값이 확인되었다. 이는 본 발명에 따른 Haemophilus influenzae 검출용 프라이머-프로브 세트의 검출 재현성이 매우 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
실시예
5. 정형성 폐렴균 검출 특이성 시험
5-1.
Staphylococcus
aureus
검출 특이성 시험
본 발명의 Staphylococcus aureus 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 1 내지 3)의 검출 특이성을 확인하기 위하여, 도 10에 나열한 바와 같은 다양한 병원성 세균으로부터 정제한 DNA를 대상으로 PCR을 수행하였다.
도 10에서 확인 가능한 바와 같이, PCR 수행결과에서 Staphylococcus aureus에 대한 검출만이 확인되었으며, 다른 모든 병원성 세균으로부터 어떠한 검출도 확인되지 않았다. 이로부터, 본 발명의Staphylococcus aureus 검출용 프라이머-프로브 세트의 검출 특이성이 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
5-2.
Streptococcus
pneumoniae
검출 특이성 시험
본 발명의 Streptococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 4 내지 6)의 검출 특이성을 확인하기 위하여, 도 11에 나열한 바와 같은 다양한 병원성 세균을 대상으로 PCR을 수행하였다.
도 11에서 확인 가능한 바와 같이, PCR 수행결과에서 Streptococcus pneumoniae 에 대한 검출만이 확인되었으며, 다른 모든 병원성 세균으로부터 어떠한 검출도 확인되지 않았다. 이로부터, 본 발명의 Streptococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트의 검출 특이성이 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
5-3.
Haemophilus
influenzae
검출 특이성 시험
본 발명의 Haemophilus influenzae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 7 내지 9)의 검출 특이성을 확인하기 위하여, 도 12에 나열한 바와 같은 다양한 병원성 세균을 대상으로 PCR을 수행하였다.
도 12에서 확인 가능한 바와 같이, PCR 수행결과에서 Haemophilus influenzae에 대한 검출만이 확인되었으며, 다른 모든 병원성 세균으로부터 어떠한 검출도 확인되지 않았다. 이로부터, 본 발명의 Streptococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트의 검출 특이성이 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
실시예
6. 종래 기술의 시약과 검출 성능 비교
6-1.
Staphylococcus
aureus
검출 성능 비교
본 발명의 Staphylococcus aureus 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 1 내지 3)를 포함하는 PCR 칩의 정형성 폐렴 검출 성능을 종래 기술의 시약과 비교하였다.
본 발명의 서열번호 1 내지 3의 프라이머-프로브 세트는 상기 표 3 및 표 4의 조건으로 PCR을 수행하되, 주형 DNA를 10-1 내지 10-6까지 단계적 희석으로 하여 사용하였다. Ct 값은 5회의 시험 결과에 대한 평균값으로 계산하였으며, 그 결과를 도 13a 및 표 10에 나타내었다.
종래기술의 검출 시약으로는, 코젠 바이오텍사에서 개발한 PowerChekTM Staphylococcus aureus Real-time PCR Kit(R0103)를 사용하였다. PCR 반응 시 2X Real-time PCR master mix와 Primer/Probe mix 및 control DNA를 얼음 상에서 녹여 준비한 후 S. aureus 유전체 DNA를 10-1 내지 10-6까지 단계적 희석으로 하여 주형으로 첨가하여, ABI 7500 PCR 장비로 표 8 및 표 9의 반응 조건에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 13b 및 표 10에 나타내었다.
| Materials | 부피(㎕) |
| 2 X Real-time PCR Master Mix | 10 |
| 프라이머/프로브 믹스 | 4 |
| DW | 3 |
| 주형 | 3 |
| Total | 20 |
| 단계 | 온도(℃) | 시간 | Cycle No. |
| 1 | 50 | 2 분 | 1 |
| 2 | 95 | 10분 | 1 |
| 3 | 95 | 15초 | 40 |
| 4 | 60 | 1 분 |
도 13 및 표 10에서 확인 가능한 바와 같이, 본 발명에 의한 프라이머-프로브 세트를 사용한 PCR 칩은 종래 기술에 의한 PCR 칩과 유사한 효율을 나타내었다. 그러나, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용한 경우 검출 및 분석이 약 21분만에 완료되었지만, 종래 기술의 경우 검출 및 분석이 약 1시간 36분만에 완료되었다.
즉, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용하는 경우 종래 기술에 비하여 분석시간을 현저히 단축시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
6-2.
Streptococcus
pneumoniae
검출 성능 비교
본 발명의 Staphylococcus pneumoniae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 4 내지 6)를 포함하는 PCR 칩의 정형성 폐렴 검출 성능을 종래 기술의 시약과 비교하였다.
본 발명의 서열번호 4 내지 6의 프라이머-프로브 세트는 상기 표 3 및 표 4의 조건으로 PCR을 수행하되, 주형 DNA를 10-1 내지 10-6까지 단계적 희석으로 하여 사용하였다. Ct 값은 5회의 시험 결과에 대한 평균값으로 계산하였으며, 그 결과를 도 14a 및 표 13에 나타내었다.
종래기술의 검출 시약으로는, Genesig 사의 Streptococcus pneumoniae kit (Path-S.pneumoniae)를 사용하였으며, PCR 반응 시 2X Real-time PCR master mix와 Primer/Probe mix 및 Control DNA를 얼음 상에서 녹여 준비한 후 S. pneumoniae 유전체 DNA를 10-1 내지 10-6까지 단계적 희석으로 하여 주형으로 첨가하여, ABI 7500 PCR 장비로 표 11 및 표 12의 반응 조건에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 14b 및 표 13에 나타내었다.
| Materials | 부피(㎕) |
| 2 X Real-time PCR Master Mix | 10 |
| S.P 프라이머/프로브 믹스 | 1 |
| I.C 프라이머/프로브 믹스 | 1 |
| I.C DNA | 1 |
| 주형 | 4 |
| DW | 3 |
| Total | 20 |
| 단계 | 온도(℃) | 시간 | Cycle No. |
| 1 | 37 | 15분 | 1 |
| 2 | 95 | 2 분 | 1 |
| 3 | 95 | 10초 | 50 |
| 4 | 60 | 1 분 |
도 14 및 표 13에서 확인 가능한 바와 같이, 본 발명에 의한 프라이머-프로브 세트를 사용한 PCR 칩은 종래 기술에 의한 PCR 칩과 유사한 효율을 나타내었다. 그러나, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용한 경우 검출 및 분석이 약 24분만에 완료되었지만, 종래 기술의 경우 검출 및 분석이 약 1시간 50분만에 완료되었다.
즉, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용하는 경우 종래 기술에 비하여 분석시간을 현저히 단축시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
6-3.
Haemophilus
influenzae
검출 성능 비교
본 발명의 Haemophilus influenzae 검출용 프라이머-프로브 세트(서열번호 7 내지 9)를 포함하는 PCR 칩의 정형성 폐렴 검출 성능을 종래 기술로서 Genesig 사의 Haemophilus influenzae kit(Path-H.influenzae)를 사용한 것을 제외하고는 상기 시험 6-2와 동일한 방식으로 종래 기술의 시약과 비교하였다. 그 결과를 도 15 및 표 14에 나타내었다.
도 15 및 표 14에서 확인 가능한 바와 같이, 본 발명에 의한 프라이머-프로브 세트를 사용한 PCR 칩은 종래 기술에 의한 PCR 칩과 유사한 효율을 나타내었다. 그러나, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용한 경우 검출 및 분석이 약 24분만에 완료되었지만, 종래 기술의 경우 검출 및 분석이 약 1시간 50분만에 완료되었다.
즉, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용하는 경우 종래 기술에 비하여 분석시간을 현저히 단축시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
이상 본 발명의 일부 구현 형태에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 바와 같은 구현 형태에 대해서만 한정되는 것이 아니라 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 수정 및 변형하여 실시할 수 있으며, 그러한 수정 및 변형이 가해진 형태 또한 본 발명의 기술적 사상에 속하는 것으로 이해되어야 한다.
<110> Nanobiosys
<120> Primer and Probe Set for Detecting Typical Pneumonia, PCR Device
Using Same, and Method for Detecting Typical Pneumonia
<130> P-001
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial forward primer1
<400> 1
agtggttctg aagatccaac agtata 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial probe1
<400> 2
aaccgtatca ccatcaatcg ctt 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial reverse primer1
<400> 3
gtctgaatgt cattggttga cctttg 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial forward primer2
<400> 4
ccatgaagac aggctgggtc aa 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial probe2
<400> 5
cctgttccgt cygckgactg ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial reverese primer2
<400> 6
twccgtctgg tttgaggtag ta 22
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial forward primer3
<400> 7
actccgttgg taaaagaact tgcacaata 29
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial probe3
<400> 8
aatgtggaas tgcatccyta caccgtg 27
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial reverse primer3
<400> 9
gcatcataca tttgatttac gtctgtga 28
Claims (14)
- 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;
서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및
서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균( Haemophilus influenzae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;
로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는, 정형성 폐렴균(typical pneumonia) 검출용 프라이머-프로브 세트.
- 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;
서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및
서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균( Haemophilus influenzae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;
로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 정형성 폐렴균(typical pneumonia) 검출을 위한 PCR(polymerase chain reaction)용 키트.
- 제1 판;
상기 제1 판 상에 배치되고, 하나 이상의 반응 채널을 구비하는 제2 판; 및
상기 제2 판 상에 배치되고, 상기 하나 이상의 반응 채널의 양 말단과 연결되되 개폐 가능하도록 구현된 유입부 및 유출부를 구비하는 제3 판
을 포함하는 PCR 칩으로서,
서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;
서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트; 및
서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 및 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머로 구성되는 헤모필루스 인플루엔자균( Haemophilus influenzae)을 검출하기 위한 프라이머-프로브 세트;
로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 칩.
- 제 3 항에 있어서,
상기 제1 판 및 제3 판은 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질을 포함하고,
상기 제2 판은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는, PCR 칩.
- 제 3 항에 있어서,
상기 PCR 칩은 플라스틱 재질로 구현되되, 광 투과성을 갖도록 구현된 것을 특징으로 하는 PCR 칩.
- 제 3 항에 있어서,
상기 하나 이상의 반응 채널 내에 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP를 포함하는 혼합물, DNA 중합효소 및 검출 가능한 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 칩.
- 제 6 항에 있어서,
상기 검출 가능한 표지는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PCR 칩.
- 기판 상에 배치된 제1 열 블록;
상기 기판 상에 상기 제1 열 블록과 이격 배치된 제2 열 블록; 및
상기 제1 열 블록 및 제2 열 블록 위로 구동 수단에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 PCR 칩이 장착된 칩 홀더;
를 포함하는 PCR 장치.
- 제 8 항에 있어서,
상기 제1 열 블록과 상기 제2 열 블록이 서로 상이한 온도를 유지하는 것을 특징으로 하는, PCR 장치.
- 제 8 항에 있어서,
상기 PCR용 칩이 상기 칩 홀더의 상기 이동에 의해, 상기 제1 열 블록과 상기 제2 열 블록 사이를 왕복하여 접촉함으로써, PCR이 수행되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
- 제 8 항에 있어서,
상기 제1 열 블록 및 제2 열 블록은 그 내부에 열선이 배치된 것을 특징으로 하는, PCR 장치.
- 제 8 항에 있어서,
상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 광원이 더 배치되고, 상기 칩 홀더 위에 상기 광원으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부가 더 배치되거나, 또는 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 광원으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부가 더 배치되고, 상기 칩 홀더 위에 광원이 더 배치되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
- 정형성 폐렴균 감염이 의심되는 대상 시료를 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 PCR 칩의 상기 하나 이상의 반응 채널에 도입하여 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 결과로부터 상기 대상 시료 중에 정형성 폐렴균의 존재 유무를 확인하는 단계;
를 포함하는 정형성 폐렴균 검출 방법.
- 제 13 항에 있어서,
상기 PCR 수행 단계가 제 8 항에 따른 PCR 장치에서 수행되는 것을 특징으로 하는 정형성 폐렴균 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160109078A KR20180023544A (ko) | 2016-08-26 | 2016-08-26 | 정형성 폐렴균 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 pcr 장치 및 정형성 폐렴균 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160109078A KR20180023544A (ko) | 2016-08-26 | 2016-08-26 | 정형성 폐렴균 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 pcr 장치 및 정형성 폐렴균 검출 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180023544A true KR20180023544A (ko) | 2018-03-07 |
Family
ID=61688631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160109078A KR20180023544A (ko) | 2016-08-26 | 2016-08-26 | 정형성 폐렴균 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 pcr 장치 및 정형성 폐렴균 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20180023544A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102076417B1 (ko) | 2018-08-01 | 2020-02-11 | 윤현규 | 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴균의 검출 방법 및 키트 |
-
2016
- 2016-08-26 KR KR1020160109078A patent/KR20180023544A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102076417B1 (ko) | 2018-08-01 | 2020-02-11 | 윤현규 | 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴균의 검출 방법 및 키트 |
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