JP2008278810A

JP2008278810A - リアルタイムｐｃｒ装置

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Publication number: JP2008278810A
Application number: JP2007126344A
Authority: JP
Inventors: Toshiki Moriwaki; 俊貴森脇; Tasuku Setoriyama; 翼世取山; Yuji Segawa; 雄司瀬川
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2008-11-20
Anticipated expiration: 2027-05-11
Also published as: US8017380B2; EP1994980A1; CN101302473A; JP5205802B2; CN101302473B; US20080280350A1

Abstract

【課題】網羅的解析が可能であり、各反応領域の温度制御を高精度で行なうことができるリアルタイムＰＣＲ装置を提供すること。
【解決手段】遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置１であって、複数の反応領域Ａ１と、前記反応領域Ａ１ごとに設けられた複数の加熱部１６と、前記複数の反応領域Ａ１全てに特定波長の励起光Ｌ１を照射可能な光学手段と、前記反応領域Ａ１ごとに設けられた複数の蛍光検出部１５と、を少なくとも備え、前記加熱部１６は、熱源近傍の温度を検出して電気的信号に変換する温度検出手段と、予め得られた前記電気的信号と発熱温度との相関関係情報に基づいて、前記熱源の加熱量を制御する手段と、を備えるリアルタイムＰＣＲ装置１とすること。
【選択図】図１

Description

本発明は、リアルタイムＰＣＲに関する。より詳細には遺伝子発現等を解析するリアルタイムＰＣＲ装置に関する。

近年、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多様のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡチップを用いて、ＤＮＡチップ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子発現等を網羅的に解析することができる。

そして、このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。

リアルタイムＰＣＲ法は、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行うことで、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させることができる。このようにして得られるＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングして前記微量核酸の定量分析を行う方法である。

そして、リアルタイムＰＣＲ法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置等を用いて前記ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることができる。このような装置として、リアルタイムＰＣＲ装置がある。

リアルタイムＰＣＲ装置は、試料にて増幅進行反応する際に励起光を照射することで蛍光信号をリアルタイムにて検出することができる反応処理装置であり、化学反応を含め、医療現場や遺伝子解析の研究に用いられるゲノムＤＮＡの観測を行なう検出器等として使用することができる。

例えば、ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法において、二本鎖ＤＮＡを特性する際に用いられる蛍光色素を標識した場合、その二本鎖ＤＮＡを加熱することで蛍光色素の変化を観察することができるが、リアルタイムＰＣＲには幾つかの検出方法がある。

例えば、特異性の高いプライマーにより目的のターゲットのみを増幅可能の場合には、ＳＹＢＲＲＧＲＥＥＮＩを用いるインターカレーター法が用いられる。

二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発するインターカレーターは、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、簡便にさまざまなターゲットの測定に利用できる。

また、よく似た配列を区別して検出する必要や、ＳＮＰｓのタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合には、プローブ法を用いる。その一つに５´末端を蛍光物質で、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法がある。

ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光発光は抑制される。伸長反応ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発光される。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の生成量をモニターすることができる。

このような方法によって、遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する原理を以下に述べる。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型として使用してＰＣＲを行なう。そして、一定の増幅産物量に達するサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸に、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットして、検量線を作成する。

未知濃度のサンプルについても、同じ条件下でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。この値と前述した検量線とから、サンプル中の目的のＤＮＡ量が測定できることになる。

そして、これらに関する技術として、特許文献１や特許文献２には温度制御等に関する技術が開示されている。

特開２００３−２９８０６８号公報。特開２００４−０２５４２６号公報。

このようなＰＣＲ装置は、遺伝子発現量の検出において定量性に優れているといった特徴を有する。しかし、一度に解析できるサンプル数が少なく、網羅的な解析ができないという問題がある。また、現在商品化されているサーマルサイクラー等の温度制御は、グラディエント機構であるため、各サンプルの温度制御が個別にできない。さらに、増幅時の時間制御も個別にできない。その結果、各サンプルの増幅量を一定にすることができず、副産物が生じることがあるという問題がある。

そこで、本発明は、網羅的解析が可能であり、各反応領域の温度制御を高精度で行なうことができるリアルタイムＰＣＲ装置を提供することを主目的とする。

本発明は、遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、複数の反応領域と、前記反応領域ごとに設けられた複数の加熱部と、前記複数の反応領域全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、前記反応領域ごとに設けられた複数の蛍光検出部と、を少なくとも備え、前記加熱部は、熱源近傍の温度を検出して電気的信号に変換する温度検出手段と、予め記憶された前記電気的信号と熱源の発熱量との相関関係に基づいて、前記熱源の加熱量を制御する手段と、を備えるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。加熱部を反応領域ごとに個別に設けることや、各加熱部の熱源近傍の温度を検出して電気的信号に変換し、この電気的信号と熱源の発熱量の相関関係を予め記憶させておき、その関係を加熱処理にフィードバックさせること等によって加熱を高精度に制御することができる。
そして、本発明は、前記加熱部の温度検出手段に用いられる検出媒体として、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ：Thin Film Transistor）やＥＬ（Electro Luminescence）素子を用いることができる。
続いて、本発明は、前記熱源近傍の温度検出手段に用いる検出媒体は、前記加熱部において前記熱源の加熱量を制御する回路内に配置されているリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。これにより、デバイスとしてより小型化できるともに、温度検出と熱源制御について一括制御することができる。
そして、本発明は、前記熱源近傍の温度検出手段に用いる検出媒体としてＥＬ素子を用い、前記加熱部の熱制御手段の制御媒体として薄膜トランジスタを使用し、前記ＥＬ素子と前記薄膜トランジスタとを同一画素内に配置するリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。このように、温度検出と熱制御の各媒体を同一画素内に設けることで、デバイスとしてより小型化すること等ができる。
さらに、本発明は、前記加熱部は定温制御可能なペルチェ素子を備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。これにより、各反応領域を定温制御すること等ができるため、各反応領域内の反応をより高精度で制御できる。

本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置によれば、遺伝子発現量を高精度で解析することができる。

以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照しながら説明する。なお、図面に示された実施形態等は、本発明の好適な実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。

図１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。以下に使用する図面では、説明の便宜上、装置の構成等については簡素化して示している。

図１中の符号１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置を示している。このリアルタイムＰＣＲ装置１のサイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、リアルタイムＰＣＲ装置１の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変更可能である。

リアルタイムＰＣＲ装置１は、複数の反応領域Ａ１を有するウェル基板１１と、光源１２と、該光源１２より発せられた励起光Ｌ１，Ｌ２を導く励起光走査板１３とを備えている。そして、フィルター１４と、蛍光Ｌ３を検出する蛍光検出部１５と、前記反応領域Ａ１を加熱する加熱部１６と、が測定基板１７に設けられている。

リアルタイムＰＣＲ装置１では、光源１２より発せられた励起光Ｌ１が、励起光走査板１３を経て、励起光Ｌ２として各反応領域Ａ１に照射される。そして、反応領域Ａ１内から発せられた蛍光Ｌ３を蛍光検出部１５により検出・測定される。

本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、特に、加熱部１６を反応領域Ａ１ごとに設け、かつ前記加熱部１６の熱源近傍の温度を検出して電気的信号に変換する温度検出手段を備え、予め得られた前記電気的信号と熱源の発熱量との相関関係に基づいて加熱量を決定する手段を備えることで、各々の反応領域Ａ１を個別に、かつ高精度に温度制御することができる。その結果、遺伝子発現量を高精度に解析することができる。なお、前記熱源の発熱量は、例えば、発熱温度を測定することによって評価することができる。以下、リアルタイムＰＣＲ装置１の各構成について詳細に説明する。

ウェル基板１１は、複数の反応領域（ウェル）Ａ１を備えている。この反応領域Ａ１で所定の反応を行う。例えば、このウェル基板１１は、低蛍光発光プラスチック材料やガラスで形成し、人の遺伝子数に匹敵する数の反応領域Ａ１をマトリクス状に配置することができる。

本発明では、ＰＣＲ反応のための反応領域（ウェル）Ａ１はマイクロ空間であることが望ましい。例えば、ウエルを３００μｍ×３００μｍ×３００μｍ（約３０ｎＬ容量）とし、約４万個のウエルを並べるとすると、約６ｃｍ角の面積を有するデバイスとなる。

ここで、個々の反応領域Ａ１の形状は特に限定されず、反応溶液を保持できる形状であれば、どのような形状でもよい。励起光Ｌ１，Ｌ２を照射・導入する光路や、蛍光Ｌ３を検出する光路等を考慮して適宜好適な形状を選択することができる。リアルタイムＰＣＲ装置１では、反応領域Ａ１内で前記蛍光Ｌ３を反射させるため、反応領域Ａ１は曲面部分を有している。

光散乱や外光の影響による検出感度の低下を抑制するために、反応領域Ａ１は、遮光する材質（例えば、ダイヤモンドライクカーボン等）にてコーティングされていることが望ましい。

本発明では、前記複数の反応領域Ａ１全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段として、光源１２や、励起光Ｌ１を各反応領域Ａ１に導入するための励起光走査板１３を用いることができる。

光源１２は、特定波長の光を発光するものであればよく、その種類は特に限定されないが、好適には、白色もしくは単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが望ましい。発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線を含まない光を簡便に得ることができる。

本発明では、光源１２の設置場所や光源数については特に限定されない。図示はしないが、各反応領域Ａ１に対応するように光源１２を複数設け、各光源１２が対応する各反応領域Ａ１に向かって励起光を直接照射する構造としてもよい。これにより各反応領域Ａ１を光源１２で直接照射できるため、励起光量をより多くとることができ、かつ励起光Ｌ１，Ｌ２の光量を個別に制御することができ、各反応領域Ａ１に均一に励起光Ｌ１，Ｌ２を照射できる。

励起光走査板１３は、光源１２から発せられる励起光Ｌ１をウェル基板１１内の各反応領域Ａ１に導くものである。前記励起光走査板１３内部のスペーサ１３１に光源１２から発せられる励起光Ｌ１が導入される。そして、前記励起光走査板１３の底部には反射膜１３２が設けられており、ウェル基板１１へ励起光Ｌ２を導入することができる。これにより、各反応領域Ａ１内の反応液中の蛍光物質を均一な光量で励起させることができる。前記反射膜１３２の材料等については特に限定されないが、好適には、ダイクロックミラーを用いることが望ましい。

また、本発明では、励起光走査板１３の上部に、前記励起光Ｌ１，Ｌ２の波長光のみを透過するフィルター１３３を設けることが望ましい。これにより、光源１２から発せられる光から励起光Ｌ２を効率よく取り出し、反応領域Ａ１へ導くことができる。このフィルター１３３としては、例えば偏光フィルター等を用いることができる。

反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ２は、反応領域Ａ１内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３は反応領域Ａ１内の壁面で反射して、反応領域Ａ１下方に設けられた蛍光検出部１５で検出・測定される。

また、本発明では、特定波長の光を取り出すことができるように、反応領域Ａ１と蛍光検出部１５との間にもフィルター１４を配置できる。前記フィルター１４は特定波長の光（蛍光Ｌ３等）を取り出すことができればよく、その材料は限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーを用いることができる。

蛍光検出部１５は、反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ２に応答して、インターカレートしたプローブ中の蛍光色素が励起することで発せられる蛍光を検出・測定する。

リアルタイムＰＣＲ装置１では、加熱部１６を各反応領域Ａ１にそれぞれ設けている。前記加熱部１６は温度制御機構を備えており、これにより前記加熱部１６の反応領域Ａ１の温度制御を行う。これにより、例えば、ＰＣＲサイクルを行う場合、熱変性→アニーリング→伸長反応のステップについてより高精度の温度制御を行うことができる。

以下、加熱部１６の温度検出手段と、その熱源の加熱量の制御手段等について説明する。

本発明では、各加熱部１６のそれぞれの熱源の近傍に、温度検出手段を設けることができる。これによりそれぞれの熱源の近傍の温度を個別に検出することができるため、各反応領域Ａ１の微小な温度変化も検出できる。検出には、検出した温度を電気的信号に変換する手法を使用することができる。

そして、本発明では、前記電気的信号と熱源の発熱量との相関関係を予め記憶されておき、この相関関係を用いて熱源の加熱量を制御することができる。これにより、前記温度検出手段により検出された温度情報に基づいて、熱源の加熱量を制御することができる。

加熱部１６の熱源の加熱量を制御する手法として、例えば、熱源における熱制御発生電流による発熱量と、設定する指標温度との相関関係をリアルタイムにフィードバック制御する手法を用いることができる。これにより、所定の設定温度となるようにリアルタイムで高精度に制御できる。

図２は、加熱部１６について温度検出機構と熱源をそれぞれ設けた概念図の一例である。図２では、各反応領域Ａ１に対応して温度検出機構と熱源とが設置されており、検出された温度情報（熱源近傍の温度）はＡＤＣ（アナログ−デジタル−コンバーター）に出力される。そして、この情報に基づいて、各反応領域Ａ１に対応して設けられたＣＰＵによって演算処理されることで、各反応領域Ａ１の適切な加熱量が各熱源に伝達される。

本発明の加熱部１６の温度検出手段は、その熱源近傍の温度を検出して電気的信号（電流値または電圧値）に変換する温度検出手段を有するが、本発明において前記温度制御における温度検出手段の検出媒体として使用する素子は、ダイオード特性を有する素子等を使用することができる。このような素子（ＥＬ素子等）は、図３に示すような電気的信号（電流値や電圧値）と温度との相関関係を有する特性がある。図３は、電流値と電圧値と温度の相関関係の一例を示す図である

ダイオード特性を有する薄膜トランジスタやＥＬ素子等は、温度に応じて、一定電圧における通電電流値、または一定電流における駆動電圧が変動する特性がある。例えば、一定電圧Ｖ_１を印加した際に、実際の温度が３０℃の場合には通電電流値Ｉ_１を検出し、実際の温度が４５℃の場合には通電電流値Ｉ_２を検出し、実際の温度が６０℃の場合には通電電流値Ｉ_３を検出する（図３参照）。同様に、電流を一定にして駆動電圧を測定する場合には、実際の温度に応じて変動する電圧値を検出できる。

以上より、本発明では、前記熱源近傍の温度検出手段に用いられる検出媒体としては、ダイオード特性を有する素子を用いることができるが、好適には、薄膜トランジスタ素子やＥＬ素子等を用いることが望ましい。

前記薄膜トランジスタ素子の種類については特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等の薄膜トランジスタを適宜使用できる。

そして、ＥＬ素子は、温度に応じて、一定電流における駆動電圧、または一定電圧における通電電流値が変動するという特性を有するため、この特性を利用することで、前記温度情報を電気的信号として検出することができる。

図４は、制御電流値と温度との相関関係の一例を示す図である。ドレイン（Ｄ）とソース（Ｓ）間の電流値（Ｉｄｓ）と、加熱温度との間には、図４に示されるような一定の相関関係がある。この相関関係を対応表等として制御媒体に記憶させておくことで、前記制御電流等をコントロールすることができる。その結果、各熱源の加熱量を高精度に制御することもできる。また、前記加熱量を補正できるように設定することもできる。

本発明では、前記加熱部１６について、予め得た前記電気的信号と熱源により発生する発熱量との相関関係に基づいて、加熱量を補正する手段を備えることもできる。例えば、温度検出機構により検出した温度によって発生する物理量に基づいて補正する際には、予め記憶した電気的信号と温度との対応表（相関関係）をもとに、制御電流をコントロールする。これによって、より高精度な温度制御サイクルシステムとすることができる。

図５は、加熱部１６の温度検出機構の回路の一例である。温度検出機構は、熱源近傍の温度検出を行う領域Ｓと、レベル調整回路を構成する領域Ｔとから構成される。温度検出用の電流値−電圧値シフト検出（電気的信号の変動量検出）を行なうＥＬ素子に負荷抵抗が直列に接続されている。

そして、ゲート電圧に一定に電圧が印加された薄膜トランジスタ（ソース：Ｓ）を使用する。この構成によって、ＥＬ素子のカソードと、薄膜トランジスタのソースの間に十分に高い電圧が印加される。

このＥＬ素子と、負荷抵抗との接続接点に抵抗Ｒ１が接続されている。そして、検出した電圧を差動増幅器（ＡＭＰ）に対して非反転（＋）入力する。そして、反転（−）入力が抵抗Ｒ２を介して接続され、この差動増幅器と非反転入力と出力との間に接続された抵抗Ｒ３が設けられている。これにより、ＥＬ素子で検出された電圧（Ｖ−ＥＬ）は所定の倍率で増幅されて出力される。

図６は、加熱部１６の温度検出機構の回路の他の一例である。本発明では、図５等に示す前記温度検出機構について、例えば、図６に示す画素回路のように簡略化することもできる。即ち、図６は、領域Ｔ（レベル調整回路、図５参照）の代替として、アナログ−デジタルコンバータ（ＡＤＣ）を介して、ＲＯＭ内に格納されている線形データ（例えば、増幅率等）に基づいて温度差分を検出する構成である。そして、この温度差分検出データをデジタル−アナログコンバータ（ＤＡＣ）に出力させることができる。この手法では、予めＲＯＭ格納されている線形データを活用できるため、より明確な温度差分検出データを使用することができる。

さらに、本発明によれば、前記反応領域Ａ１の加熱時間についても、前記反応領域Ａ１に対応する加熱部１６により個別に制御できる。前記加熱部１６により、前記反応領域Ａ１ごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記反応領域Ａ１内の増幅反応等をより高精度で制御できる。

図７は、同実施形態の加熱部１６を反応領域Ａ１ごとにマトリクス状に配置した一例を示す概念図である。本発明では、各反応領域Ａ１ごとに加熱部１６をマトリクス状に配置することができる。

即ち、前記加熱部１６を反応領域Ａ１ごとに設け、ゲート線（Ｘ方向）とデータ線（Ｙ方向）に沿ってマトリクス状に複数配置させることができる。そして、本発明では、各加熱部１６の熱源近傍の温度検出と熱源の加熱量の制御（熱制御）とを一括制御することもできる。

従って、本発明では、好適には、前記温度検出手段に用いる検出媒体は、熱源の加熱量を制御する回路内に配置する構成であることが望ましい。このような構成とすることでデバイスの小型も可能となる。その結果、小さなデバイスでありながら網羅的な解析を効率よく行なうこともできる。また、これによって、デバイスとしての煩雑な製造工程を省略できる。

そして、本発明では、より好適には、前記熱源近傍の温度検出手段に用いる検出媒体をＥＬ素子であり、前記加熱部１６の発熱量の制御（熱制御）を薄膜トランジスタにより行ない、前記ＥＬ素子と前記薄膜トランジスタとを同一画素回路内に配置させることが望ましい。

前記ＥＬ素子と前記薄膜トランジスタとを同一画素回路内に組み込むことで、温度検出と熱制御とを一括制御することができ、かつ省スペース化も可能となる点でより好適である。

さらに、本発明では、前記温度検出手段に用いる検出媒体と、熱源の加熱量を制御する制御媒体とを、保護層を介する積層構造としてもよい。かかる構造とすることで、より省スペース化が可能となるため、より小さなデバイスとすることができる。

また、図示はしないが、本発明では、蛍光検出部１５に用いる蛍光検出用素子の画素回路と、前記熱源の加熱量制御（熱制御）の制御媒体の画素回路を同一画素内に設けることもできる。この同一画素内の形状としては、温度制御用素子と蛍光検出用素子とを保護層を介した積層構造としてもよい。

これにより、同じ画素レイヤで熱制御と蛍光検出が可能になり、かつ、デバイスとしての小型化をさらに容易にすることができる。例えば、加熱部１６に用いる熱制御用の薄膜トランジスタ素子やＥＬ素子の画素回路内に、蛍光受光部１５に用いる蛍光受光用の薄膜トランジスタ素子やＥＬ素子の画素回路を設けること等ができる。

また、本発明では、反応領域Ａ１の温度制御を行なうためにペルチェ素子１８を備えることが望ましい。ＰＣＲサイクルは、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のステップに応じて温度制御を行なう必要があるが、ペルチェ素子１８を設けることで、定温制御がより容易であり、かつ高精度の温度制御を行なうことができる。例えば、予め、反応領域Ａ１内の温度をＰＣＲサイクルの最低温度（例えば、５５℃）に維持しておくことができる。

本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、通常用いられているＰＣＲ法を行なうことができる。具体的には、（１）増幅させたい目標ＤＮＡ、（２）目標ＤＮＡと特異的に結合する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ−、（３）緩衝液、（４）酵素、（５）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸等を用い、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のサイクルを繰り返すことで、前記目標ＤＮＡを所望する量まで増幅させること等ができる。

以下、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１を用いた測定手順の一例について説明する。

各反応領域Ａ１には、予め設計された異なる遺伝子配列を有するプライマーを投入する。投入方法については、特に限定されず、例えば、インクジェット等を用いる方法によることができる。このように各反応領域Ａ１に各プライマーを含む溶液を滴下して乾燥させる。

続いて、検体から抽出したTotal ＲＮＡを逆転写（reverse transcription）法によりｃＤＮＡに転写して、各反応領域Ａ１に投入する。これと併せて、増幅に必要となる各塩基の原材料となるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、インターカレータ（「ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮＩ」）、ＤＮＡ伸長増幅反応に必要な酵素ＤＮＡポリメラーゼ等を投入する。

熱変性ステップでは、反応領域Ａ１内が９５℃となるように加熱部１６等により設定し、二本鎖のＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにする。続くアニーリングステップでは、反応領域Ａ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが前記一本鎖ＤＮＡ相補的な塩基配列と結合させる。次のＤＮＡ伸長ステップでは、反応領域Ａ１内が７２℃となるように設定することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。

このような「９５℃（熱変性）→５５℃（プライマーのハイブリダイゼーション）→７２℃（ＤＮＡ伸長）」の温度サイクル毎に、各反応領域Ａ１内のｃＤＮＡは２倍量に増幅されていく。そして、各反応領域Ａ１にそれぞれ設置された加熱部１６によって、各反応領域Ａ１内の温度を設計したプライマー反応の最適値に制御できる。また、プライマーのハイブリダイゼーション時間やポリメラーゼ反応時間も制御できるため、不要な反応副産物の生成も制御できる。その結果、各反応領域Ａ１内の遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅率を一定に揃えることができるため、精度のよいＰＣＲ反応を行なうことができる。

ＤＮＡの複製反応時に生成されたｄｓ−ＤＮＡには、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩがインターカレートする。このＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩは、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートし、その後に励起光Ｌ２を照射することで励起して蛍光を発光する物質である（励起光波長：４９７ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）。

これにより、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製時に、光源１２からの光Ｌ１が励起光走査板１３を経由して励起光Ｌ２として、インターカレートしたＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩを励起させて蛍光Ｌ３を発光させる。この蛍光Ｌ３の発光量を前記温度サイクル毎に蛍光検出部１５で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する発光量との相関関係に基づいて、遺伝子発現量として初期ｃＤＮＡ量を求めることができる。

図８は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明し、共通する部分についてはその説明を割愛する。

このリアルタイムＰＣＲ装置２は、反応領域（ウェル）Ａ１ごとに蛍光検出部２５や加熱部２６や備えている点では、第１の実施形態と共通する。しかし、励起光Ｌ２をウェル基板１１の上方から照射して、反応領域Ａ１内を透過した蛍光Ｌ３を検出する点等で相違する。

リアルタイムＰＣＲ装置２では、光源２２から発せられる励起光Ｌ１が、励起光走査板２３によって反応領域Ａ１に導かれる。励起光走査板１３では、スペーサ２３１を励起光Ｌ１が通過し、反射膜２３２とフィルター２３３によりウェル基板２１に励起光Ｌ２が導入される。

そして、該励起光Ｌ２は、反応領域Ａ１内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３は、反応領域Ａ１の下方に設けられた蛍光検出部２６で検出・測定される。

また、温度制御は、反応領域Ａ１下方に設けられた加熱部２６により行われ、ペルチェ素子２８等によって定温制御することができる。

一般的なリアルタイムＰＣＲ装置では、「熱変性→アニーリング→伸長反応」からなるサイクルを３０サイクル程度行なうために２５〜３０分の反応時間を要する。その際、約２℃／秒の温度制御を行っている。これに対して、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置では、２０℃以上／秒の温度制御が可能であるため、１サイクルあたり４０秒程度の時間短縮が可能となり、３０サイクル全体ではおよそ２５分以下の反応時間が達成できる。

また、プライマーの設計に応じて、アニーリング時間、伸長反応時間をコントロールすることができるため、増幅率を一定倍率（例えば２倍等）に揃えることができるため、遺伝子発現量の検出精度を向上させることができる。

本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。同実施形態の加熱部について温度検出機構と熱源をそれぞれ設けた一例の概念図である。電流値と電圧値と温度の相関関係の一例を示す図である。制御電流値と温度との相関関係の一例を示す図である。加熱部の温度検出機構の回路の一例を示す図である。加熱部の温度検出機構の回路の他の一例を示す図である。加熱部を反応領域ごとにマトリクス状に配置した一例を示す概念図である。本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。

符号の説明

１，２リアルタイムＰＣＲ装置
１１，２１ウェル基板
１２，２２光源
１３，２３励起光走査板
１４，２４フィルター
１５，２５蛍光検出部
１６，２６加熱部
１７，２７測定基板
１８，２８ペルチェ素子

Claims

遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、
複数の反応領域と、
前記反応領域ごとに設けられた複数の加熱部と、
前記複数の反応領域全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、
前記反応領域ごとに設けられた複数の蛍光検出部と、
を少なくとも備え、
前記加熱部は、熱源近傍の温度を検出して電気的信号に変換する温度検出手段と、予め記憶された前記電気的信号と前記熱源の発熱量との相関関係に基づいて、前記熱源の加熱量を制御する手段と、を備えるリアルタイムＰＣＲ装置。
前記熱源近傍の温度検出手段に用いられる検出媒体は、薄膜トランジスタであることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
前記熱源近傍の温度検出手段に用いる検出媒体は、ＥＬ素子であることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
前記熱源近傍の温度検出手段に用いる検出媒体は、前記加熱部において熱源の加熱量を制御する回路内に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
前記熱源近傍の温度検出手段に用いる検出媒体はＥＬ素子であり、前記加熱部の熱制御を薄膜トランジスタにより行ない、
前記ＥＬ素子と前記薄膜トランジスタとが同一画素回路内に配置されることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
前記加熱部は、定温制御可能なペルチェ素子を備えたことを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。