JP2006003222A - Ｄｎａ検出装置及びｄｎａ検出用電極 - Google Patents

Abstract

【課題】 より簡易、簡便かつ高感度にＤＮＡの検出を行うことができるＤＮＡ検出装置及びＤＮＡ検出用電極を提供する。
【解決手段】 ＤＮＡ検出装置は、カーボン電極の表面に、メディエータを介して、キャプチャープローブが結合した電極３２ａを有する電極部３２を備える。ＤＮＡ検出装置は、ＤＮＡサンプル液に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うための温度サイクルを制御する。そして、電極部３２をＤＮＡサンプル液に浸漬し、電極３２ａのキャプチャープローブに増幅されたターゲットＤＮＡを結合させ、さらに、このターゲットＤＮＡに酵素が標識されたレポータプローブを結合させるように温度制御する。そして、判定液中で、レポータプローブに標識された酵素と基質との反応に基づいて電極３２ａに流れる限界酸化電流の電流値を測定することにより、ＤＮＡの検出を行う。
【選択図】 図４

Description

本発明は、ＤＮＡ検出装置に関し、より詳細には、ＤＮＡを増幅させた後、そのＤＮＡを電極型のバイオセンサを用いて検出し得るＤＮＡ検出装置及びＤＮＡ検出用電極に関する。

従来、ＤＮＡの配列により個体を特定する場合には、ターゲットとなるＤＮＡ配列に対するプライマーと酵素によりターゲットＤＮＡの複製物を大量に作り、電気泳動法により所定の分子量の複製物ができたかどうかを確認することにより行っている。また、自動的に核酸の検査を行う自動核酸検査装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この特許文献１では、ＰＣＲ増幅容器として加熱体一体型核酸増幅容器を用い、検出手段としてＤＮＡチップと楕円偏光解析を用いることが開示されている。

一方、基質（例えば、生体内物質等）を定量する方法や酵素活性を測定する方法に関しては、従来から、バッチ式のシステムにおいて、二種類の酸化還元酵素と補酵素とを組み合わせて行う方法が確立されている（例えば、非特許文献１参照）。
特開２００１−１４９０９７号公報 生化学実験講座、第５巻、酵素研究法（東京化学同人）p121-129

従来のＰＣＲ後に電気泳動を行って確認する方法によると、ＤＮＡを複製するための温度サイクルをサンプルに印加するための装置と、ＤＮＡを電気泳動で分離する装置とを用い、さらに、電気泳動した後のＤＮＡを染色し視覚的に検知できるようにする作業を行う。これら一連の作業を自動的に実施する装置は可能ではある。しかし、自動分注装置や送液機構などが必要となり、携帯してサンプリングした場所でＤＮＡの検出を行うことは不可能である。また、特許文献１に記載の自動核酸検査装置では、検出手段として電極型バイオセンサを用いることは開示されていない。

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、より簡易、簡便かつ高感度にＤＮＡの検出を行うことができるＤＮＡ検出装置及びＤＮＡ検出用電極を提供することを目的とする。

本発明のＤＮＡ検出装置は、導電体表面に、電子を授受し得るメディエータを介して、１種又は２種以上のＤＮＡ断片が結合してなる電極と、ＤＮＡサンプル液に対して、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための温度サイクルを制御する第１温度制御部と、前記電極に結合したＤＮＡ断片にターゲットＤＮＡを結合させ、さらに、前記ターゲットＤＮＡに酵素が標識されたＤＮＡ断片を結合させるための温度を制御する第２温度制御部と、前記ＤＮＡ断片に標識された酵素と基質との反応に基づいて前記電極に流れる限界酸化電流の電流値を測定する電流測定部とを備えたことを特徴とする。これによれば、ポリメラーゼ連鎖反応によりターゲットＤＮＡを増幅させ、増幅されたターゲットＤＮＡを、前記電極に結合したＤＮＡ断片に結合させ、さらに、前記ターゲットＤＮＡに前記酵素が標識されたＤＮＡ断片を結合させて、前記ＤＮＡ断片に標識された酵素と基質との反応に基づいて前記電極に流れる限界酸化電流の電流値を測定することにより、ＤＮＡを検出できる。

このＤＮＡ検出装置において、前記第１温度制御部と前記第２温度制御部とを、一つの
制御ユニットで構成することができる。これによれば、ターゲットＤＮＡの増幅のための温度制御と、前記電極に結合したＤＮＡ断片にターゲットＤＮＡを結合させ、さらに、前記ターゲットＤＮＡに前記酵素が標識されたＤＮＡ断片を結合させるための温度制御とを、同じ制御ユニットにより行うことができる。

このＤＮＡ検出装置において、前記ポリメラーゼ連鎖反応を行うための第１容器を備え、前記酵素と前記基質との反応のために、前記第１容器とは異なる第２容器を備えるように構成することができる。これによれば、ポリメラーゼ連鎖反応を行った第１容器に含まれる、前記電極上で前記ターゲットＤＮＡと結合しているＤＮＡ断片以外の、酵素が標識されたＤＮＡ断片等を除去することができる。従って、未反応のＤＮＡ断片に標識された酵素等による影響を排除できる。

このＤＮＡ検出装置において、前記ＤＮＡサンプル液中に入れる酵素が標識されたＤＮＡ断片の供給手段を備え、前記供給手段は、前記ポリメラーゼ連鎖反応を実行後のＤＮＡサンプル液に、酵素が標識されたＤＮＡ断片を供給するようにすることができる。これによれば、供給手段により、自動的に、ＤＮＡサンプル液に、酵素が標識されたＤＮＡ断片を供給することができる。

このＤＮＡ検出装置において、前記電極に、前記酵素が標識されたＤＮＡ断片を、表面に付着させておくことができる。これによれば、電極をＤＮＡサンプル液に浸漬すると、酵素が標識されたＤＮＡ断片もＤＮＡサンプル液に入ることになり、自動的に酵素が標識されたＤＮＡ断片をＤＮＡサンプル液に供給できる。

本発明のＤＮＡ検出用電極は、電子を授受し得るメディエータを介して１種又は２種以上のＤＮＡ断片が結合してなる電極であって、前記電極でのＤＮＡ検出に必要な試薬を、前電極の表面に付着させていることを特徴とする。これによれば、前記ＤＮＡ検出用電極を用いてＤＮＡ検出を行う場合に、前記ＤＮＡ検出用電極を反応液中に浸漬することにより、自動的に、ＤＮＡ検出用電極でのＤＮＡ検出に必要な試薬を反応液に添加することができる。従って、より容易に、ＤＮＡの検出を行うことができる。

本発明によれば、ＤＮＡを増幅させた後、同じ装置を用いて、電流値の測定によりＤＮＡの検出を行うことができるため、より簡易、簡便かつ高感度に、ＤＮＡの検出を行うことができる。

本実施形態では、電極を用いた酵素活性の測定方法を利用したＤＮＡ検出装置について、図１〜図７を用いて説明する。このＤＮＡ検出装置は、ＤＮＡサンプル液のＤＮＡ断片をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により増幅させ、増幅されたＤＮＡ断片を電極
に固定されたＤＮＡ断片及び酵素が標識されたＤＮＡ断片と反応させ、これを用いてＤＮＡの検出を行う。つまり、本実施形態におけるＤＮＡ検出装置は、ＤＮＡ増幅工程とＤＮＡ検出工程とを自動化し、これらを行う装置を一体化したものである。

（ＤＮＡ検出装置で用いる電極）
まず、本発明のＤＮＡ検出装置で用いる電極について説明する。
このＤＮＡ検出装置で用いる電極は、測定対象となる酵素の活性を測定するために用いることができるものであり、少なくとも、導電体上に、メディエータが積層されて構成される。

導電体としては、通常、電極として用いられるものであればどのような材料でも使用す
ることができる。例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等；アルミニウム、銅、金、白金、銀等の金属又は合金、ＳｎＯ₂、Ｉｎ₂Ｏ₃、ＷＯ₃、ＴｉＯ₂等、導
電性酸化物等種々の材料の単層又は２種以上の積層構造が挙げられる。電極の膜厚、大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用するメディエータ、酵素等の種類、得ようとするバイオセンサの性能等によって適宜調整することができる。例えば、厚み０．１〜５ｍｍ程度、１〜１００００ｍｍ²程度の面積の矩形形状であることが適当である。

メディエータとしては、電極と酵素との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能するもので、酵素反応に悪影響を与えないものであれば、どのようなものでも使用することができる。例えば、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル置換体、エチル置換体、プロピル置換体等）、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン等の酸化還元性の有機又は無機化合物の１種あるいは２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、水や水溶性有機溶媒（低級アルコール等）に溶解し、取り扱いが容易であるもの、電子移動媒体としての機能が安定しているものが好ましく、例えば、フェロセン、フェリシアン化カリウム等が好適に用いられる。

導電体上に積層されるメディエータの膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、後述する酵素層の酵素の種類及び量、測定対象である酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、メディエータを導電体上に積層する方法は、メディエータの種類によって、適当なものを適宜選択することができる。例えば、メディエータをその機能を阻害しない溶媒、例えば、水又は水溶性有機溶媒等に溶解させ、塗布、乾燥する方法、メディエータを適当な担体、例えば、樹脂、タンパク等の高分子化合物等に混合及び分散させ、担体を薄膜状に形成する方法、交互積層法（現代化学、１９９７年１月、ｐ２０〜２５参照）等、当該分野で公知の薄膜形成法のすべてを利用することができる。なかでも、後述する交互積層法が好ましい。

さらに、酵素層が、導電体上に積層されたメディエータの上に積層されてもよいし、メディエータ及び酵素の種類等によっては、酵素層をメディエータとともに導電体上に配置してもよい。酵素層の膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、測定対象である酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、酵素層を積層する方法としては、メディエータとともに、あるいはメディエータの上に、メディエータを積層するのと同様の方法が挙げられる。

このＤＮＡ測定装置の電極では、上述したメディエータ、酵素層の少なくとも１種、好ましくは全てが、高分子担体とともに層状で積層されている。ここで用いることができる高分子担体としては、電荷を有すること、ポリマーであること及び水溶性であることのいずれか１種、好ましくは全ての性質を満足するものが適当である。電荷は正及び負のいずれでもよい。高分子担体は、例えば、各種タンパク質（例えば、酵素、抗体、レセプタータンパク等）、ポリペプチド（例えば、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等）、水溶性合成高分子化合物（例えば、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレンスルホン酸、ポリジメチルジアリルアンモニウムクロライド等）、天然高分子（アルギン酸及びその塩類、トラガントガム等）が挙げられる。

メディエータ等を高分子担体とともに積層する方法としては、特に限定されるものでは
なく、メディエータ等を高分子担体に分散、あるいは高分子担体とともに適当溶媒（水、緩衝液、水溶性有機溶媒等）に溶解又は分散し、塗布、乾燥する方法でもよいし、交互積層法を利用してもよい。

メディエータ及び酵素層の少なくとも１種、好ましくはすべてを積層する交互積層法（ここでは、各層を順次積層する方法）は、例えば、以下のように行うことができる。
まず、導電体表面を活性化することにより、正又は負に帯電させる。次いで、メディエータを構成する分子、あるいはメディエータを分散／メディエータと結合した高分子担体を負又は正に帯電させ、これを導電体表面に接触させることにより、正と負との電荷の間の相互作用を通してメディエータを導電体表面に積層する。なお、このような１回の正負の相互作用によって、必要なメディエータ量を確保することができれば、上述のような積層は１層のみでよいが、さらに多量のメディエータを導電体表面に積層したい場合は、上述の相互作用を複数回行うことによって、メディエータ層を複数層、例えば、２〜２０層程度積層してもよい。この場合、積層されたメディエータ上に、これと反対の電荷を有する担体（例えば、上述した高分子担体）又はメディエータ等を積層し、再度、メディエータを構成する分子等を、この高分子担体等の上に積層するという一連の操作を繰り返すことによって、多数層のメディエータの積層を実現することができる。

また、このＤＮＡ測定装置の電極では、測定対象となる酵素の活性を測定するために、（１）活性の測定対象となる酵素が積層されていてもよいし、（２）電極に接触するように、この電極とは別個に測定対象となる酵素が配置されていてもよい。（１）の場合には、メディエータ等と同様の積層法を利用して積層することができ、同様に、交互積層法によって形成することが好ましい。なお、（１）の場合には、測定対象となる酵素が導電体上に積層されていることにより、例えば、酵素が基質とともに溶液によって供給されるのに比較して、測定対象の酵素の反応に起因して発生する電流値が十分に高い出力として得ることができ、より測定感度が良好となり、測定誤差を低減することが可能になるという利点がある。（２）の場合には、例えば、測定対象となる酵素を、好ましくは基質の存在下において、溶液状、懸濁又は分散された液状で、電極に接触させてもよい。なお、（２）の場合には、測定対象となる酵素が含有された液状であってもよい。

本発明のＤＮＡ検出装置で用いる電極には、さらに、ＤＮＡ断片を固定させておく。このＤＮＡ断片は、ＤＮＡの相補性を利用して、検出及び／又は定量目的のＤＮＡ（以下「ターゲットＤＮＡ」と記す）と対合させるためのキャプチャープローブである。

そして、さらに、別のＤＮＡ断片（ターゲットＤＮＡ及びレポータプローブ）を加えて、キャプチャープローブ、ターゲットＤＮＡ、レポータプローブがこの順にメディエータを介して電極に結合させられ、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量を行う。つまり、電極上で、いわゆるターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを行わせる。そして、ターゲットＤＮＡ及びレポータプローブが結合された電極を用いて、メディエータを介する間接的な電子授受を、例えば、電流値として測定することによって、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。

ターゲットＤＮＡは、ＤＮＡの相補性を利用して、このキャプチャープローブと対合させられる検出及び／又は定量目的のＤＮＡ断片である。なお、このターゲットＤＮＡは、本発明のＤＮＡ検出装置においては、サンプルされたＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されて用いられる。レポータプローブは、ＤＮＡの相補性を利用してターゲットＤＮＡと対合して、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量するために酵素が標識されている。

電極上にキャプチャープローブを固定する方法としては、当該分野で公知の方法の全て
及びそれらに準じた方法を利用することができる。例えば、電極上にストレプトアビジンを積層し、キャプチャープローブの５’末端をビオチン修飾し、アビジン−ビオチンの相互作用により固定する方法又はこれに準じた方法が挙げられる。

なお、ＤＮＡ断片を用いる方法、つまりＤＮＡプローブ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション自体は当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。この際に利用するＤＮＡ断片は、市販されているいずれを用いてもよい。例えば、サルモネラのプローブ（Rahn K., S. A. De Grandis, R. C. Clarke, S. A. McEwen, J. E. Galan, C. Ginocchio, R. Curtiss and C.L. Gyles, Mol. Cell. Probes, 6, 271-279 (1992)参照）、タカラバイオケミカルス、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）invE遺伝
子検出用Primer Set INV-1& 2、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）ipaH遺伝子検出
用Primer Set IPA-1& 2、コレラ毒素遺伝子検出用Primer Set VCT-1 & 2（いずれも（株
）島津製作所製）等が挙げられる。

上記のようにして作成された電極は、通常、対電極と、これらの電極及び対電極とを収容し、液体、好ましくは測定対象の酵素の基質を含有する溶液を収容することができる反応器内に配置され、さらにこの反応器内に、両電極がほぼ完全に浸漬する程度に溶液で充填されたバイオセンサにおいて、利用されることが適当である。このようなバイオセンサにおいては、サイクリックボルタンメトリを利用することによって、例えば、両電極に所定の電位差を有する定電位を与え、測定対象の酵素の反応に起因して発生する電流値を、例えば、限界酸化電流値として測定して、測定対象の酵素の活性を判定することができる。電流値の検出は、例えば、ポテンショスタット、電流計等の電流検出部によって行うことができる。本発明のＤＮＡ検出装置においては、このようなバイオセンサを用いて電流値を測定することによりＤＮＡの検出を行う。

（ＤＮＡ検出装置）
次に、上記電極を利用したＤＮＡ検出装置について、説明する。
図１に示すように、本実施例におけるＤＮＡ検出装置３０の上面には、測定部３１が備えられている。この測定部３１には、本発明の電極部（バイオセンサ）３２（図２参照）が備えられており、この電極部３２を移動させるための電極移動用ツマミ３３が、この測定部３１の上面に備えられている。この測定部３１は、蓋状になっており、上下方向に開閉可能となっている。

この測定部３１を持ち上げた状態において、それぞれ２つのスタンバイステーション３４、ハイブリッドステーション３５及び測定ステーション３６が露出する。スタンバイステーション３４は、ＰＣＲの実行時に電極部３２を退避させておくために用いられる。ハイブリッドステーション３５は、ＤＮＡサンプルを入れたサンプルチューブ１０１（第１容器）をセットしてＰＣＲ処理を行い、ＰＣＲ処理後に電極部３２を挿入して、ハイブリダイゼーションを行わせるために用いられる。測定ステーション３６は、判定液を注入した判定液チューブ１０２（第２容器）をセットし、ハイブリッドステーション３５から取り出した電極部３２を挿入して、電流を測定するために用いられる。

ＤＮＡ検出装置３０の上面には、さらに、電源スイッチ（電源ＳＷ）４１、スタートスイッチ（スタートＳＷ）４２、ストップスイッチ（ストップＳＷ）４３が備えられている。

ＤＮＡ検出装置３０の正面下部には、設定用ロータリースイッチ（設定用ロータリーＳＷ）４４及びＵＳＢコネクタ４５が備えられている。この設定用ロータリーＳＷ４４の上側には、制御される温度の推移を示す温度制御パターンが示されており、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、測定の各処理の各段階について、それぞれ、温度及び時間を設定する
スイッチを対応付けて表示している。この設定用ロータリーＳＷ４４では、これらの各段階での温度及び時間、ＰＣＲサイクルの回数、及び測定電圧の設定入力が行われる。ＵＳＢコネクタ４５は、測定データの転送のためにパソコンと接続する場合に用いられる。

ＤＮＡ検出装置３０の正面上部には、ＬＣＤ表示部５１が設けられている。また、ＤＮＡ検出装置３０の両側の側面には、冷却用ファンモータ５２及び排熱口５３が、それぞれ備えられている。また、このＤＮＡ検出装置３０の背面には、図示しないが、冷却用ファンモータ、ヒューズホルダ及び電源入力部が設けられている。

次に、図２を用いて、ＤＮＡ検出装置３０のブロック構成を説明する。
図２に示すように、ＤＮＡ検出装置３０は、ＣＰＵ６１を備えている。ＣＰＵ６１は、スイッチ制御機能（ＳＷ制御機能）６２、設定数値変換機能６３、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５を備えている。さらに、ＣＰＵ６１は、温度制御機能６６、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７、温度制御機能６８、温度検出・ＰＩＤ演算機能６９を備えている。

ＳＷ制御機能６２は、スタートＳＷ４２、ストップＳＷ４３がそれぞれ押下されると、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５をそれぞれ制御することにより、処理を開始又は中断する機能である。設定数値変換機能６３は、設定用ロータリーＳＷ４４により設定入力された温度、時間、ＰＣＲサイクルの回数、及び測定電圧の数値に関するデータ変換を行い、各設定値を、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５、温度制御機能６６，６８、測定電圧発生回路９１に対してそれぞれ指示する機能である。

時間制御機能６４は、各処理の処理時間を制御するとともに、時間制御に関する情報をＬＣＤ表示部５１に表示させる機能である。ＰＣＲステップ制御機能６５は、ＰＣＲステップの回数を制御するとともに、ＰＣＲステップ制御に関する情報をＬＣＤ表示部５１に表示させる機能である。

温度制御機能６６及び温度検出・ＰＩＤ演算機能６７は、ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションに関する温度の設定値に基づいて、ＰＣＲブロック７０における温度制御を行う機能である。

ＰＣＲブロック７０の各側面及び底面には、ペルチェ素子７１が設けられている。また、ＰＣＲブロック７０の両側側面及び背面には、冷却用ファン７２が設けられている。さらに、温度センサ７３がＰＣＲブロック７０に備えられている。そして、このＰＣＲブロック７０には、前述のハイブリッドステーション３５が設けられている。

ペルチェ素子７１は、ペルチェ効果を利用した素子であって、ＰＣＲブロック７０の温度サイクルを調整する。冷却用ファン７２は、放熱を行うために用いられる。温度センサ７３は、ＰＣＲブロック７０の温度の測定を行う。

温度制御機能６６は、ＰＣＲブロック７０の温度制御を行うための制御信号を、加熱／冷却切替回路７５に出力する機能である。温度検出・ＰＩＤ演算機能６７は、温度センサ７３によって測定されたＰＣＲブロック７０における温度を検出し、検出された温度と、温度制御機能６６から指示された設定温度とに基づいて、ＰＩＤ演算を行う機能である。そして、算出された値に関する信号を電流制御回路７４に出力する。

電流制御回路７４は、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７により出力された信号に従って、熱制御電源６０からの熱制御電源電圧に基づく制御電流を加熱／冷却切替回路７５に出力する。

加熱／冷却切替回路７５は、加熱／冷却の切替を指示する信号をペルチェ素子７１に出力する。そして、ペルチェ素子７１により、ＰＣＲブロック７０の温度サイクルの調整を行う。

温度制御機能６８及び温度検出・ＰＩＤ演算機能６９は、測定部ブロック８０における温度制御を行う機能である。
測定部ブロック８０は、加熱ヒータ８１により加熱される。また、温度センサ８２が測定部ブロック８０に備えられている。そして、この測定部ブロック８０には、前述の測定ステーション３６が設けられている。

温度制御機能６８は、測定部ブロック８０の設定温度に関するデータを温度検出・ＰＩＤ演算機能６９に指示する機能である。
温度検出・ＰＩＤ演算機能６９は、温度センサ８２によって測定された測定部ブロック８０における温度を検出し、検出された温度と、温度制御機能６８から指示された設定温度とに基づいて、ＰＩＤ演算を行う機能である。そして、算出された値に関する信号を電流制御回路８３に出力する。

電流制御回路８３は、温度検出・ＰＩＤ演算機能６９により出力された信号に従って、熱制御電源６０からの熱制御電源電圧に基づく制御電流を加熱ヒータ８１に出力する。そして、加熱ヒータ８１により、測定部ブロック８０の温度が調整される。

測定電圧発生回路９１は、測定電圧を発生させ、この測定電圧をワーク電流測定ヘッドアンプ９２に出力する。ワーク電流測定ヘッドアンプ９２には、電極部３２が接続されている。電極部３２は、電極３２ａ、参照電極３２ｂ、及び対電極３２ｃを備えている（図４参照）。

ワーク電流測定ヘッドアンプ９２は、測定電流をＡ／Ｄ変換回路９３に出力する。Ａ／Ｄ変換回路９３は、測定電流についてＡ／Ｄ変換を行い、測定電流をＬＣＤ表示部５１に表示させる。

このＤＮＡ検出装置３０において、温度制御機能６６、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７、電流制御回路７４、加熱／冷却切替回路７５、ペルチェ素子７１、冷却用ファン７２及び温度センサ７３が、特許請求の範囲に記載の第１温度制御部及び第２温度制御部を構成する。また、ワーク電流測定ヘッドアンプ９２、Ａ／Ｄ変換回路９３及び測定電圧発生回路９１が、特許請求の範囲に記載の電流測定部を構成する。

次に、温度制御及び電極移動について、図３及び図４を用いて説明する。図３は、温度制御の説明図である。なお、ＰＣＲ繰り返し回数は設定変更可能であるが、図３においては、ＰＣＲ繰り返し回数を３回とした場合の温度遷移例を示す。図４は、電極移動の説明図である。

図３に示すように、ＰＣＲにおいては、高温（ＴＨ）、中温（ＴＭ）、低温（ＴＬ）の温度サイクルを繰り返す。この温度サイクルにおける高温（ＴＨ）、中温（ＴＭ）、低温（ＴＬ）のそれぞれにおける温度及び時間は、設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。

具体的には、高温（ＴＨ）は８４〜９９℃、中温（ＴＭ）は６７〜８２℃、低温（ＴＬ）は４５〜６０℃の範囲でそれぞれ設定可能となっている。ＰＣＲ繰り返し時の各温度の維持時間は、高温維持時間（ｔＨ）は２３〜３８秒、中温維持時間（ｔＭ）は２３〜３８
秒、低温維持時間（ｔＬ）は１〜１６秒の範囲でそれぞれ設定可能となっている。

また、ＰＣＲ繰り返し回数も設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。本実施例では、中温−高温−低温を１回として、１〜４８回の範囲で設定可能であり、３回を１つの単位として繰り返し回数を設定することができる。

ＰＣＲ後において行うハイブリダイゼーションにおける温度及び時間についても、設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。
具体的には、ハイブリッド時について、高温（ＴＨＲ）は８４〜９９℃、中温（ＴＭＲ）は６７〜８２℃の範囲でそれぞれ設定可能となっている。なお、図３においては、ハイブリッド時の中温（ＴＭＲ）として、ＰＣＲサイクルにおける中温（ＴＭ）より高い温度を設定している。ハイブリッド時の各温度の維持時間は、高温維持時間（ｔＨＲ）は０．５〜８．０分、中温維持時間（ｔＭＲ）は０〜１５０秒の範囲でそれぞれ設定可能となっている。

さらに測定ステーション３６における測定温度、測定時間、及び測定ワーク電圧についても、設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。測定温度は、３０〜４５℃の範囲で設定可能となっている。また、測定時間は、０．５分〜８．０分の範囲で設定可能となっている。また、測定ワーク電圧については、５０〜８００ｍＶの範囲で設定可能となっている。

図３に示すように、電源投入により、ＤＮＡ検出装置３０は、ハイブリッドステーション３５についてウォーミングアップ温度（３０℃）を維持するように作動する。また、ＤＮＡ検出装置３０は、測定ステーション３６について測定設定温度を維持するように作動する。なお、それぞれ、ウォーミングアップ温度及び測定設定温度になるまで（ウォーミングアップ中）は、スタートＳＷ４２のスタートランプを点滅させ、それぞれの温度で安定すると（ウォーミングアップが完了すると）、スタートランプを静止点灯させる。そして、ＤＮＡ検出装置３０は、ＬＣＤ表示部５１に、「サンプルをセットし、スタートＳＷを押して下さい」というメッセージを表示させる。

これにより、利用者は、図４に示すように、ＤＮＡサンプル液を注入したサンプルチューブ１０１をハイブリッドステーション３５にセットするとともに、判定液を注入した判定液チューブ１０２を測定ステーション３６にセットする。

ここで、ＤＮＡサンプル液は、一般的なＰＣＲ処理で用いられる構成成分を含有する。具体的には、ＤＮＡサンプル液は、２種類のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｍｇ^２＋、及びサンプルＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を構成成分として含有する。なお、各構成成分の濃度については、一般的な場合に準じるが、反応条件に応じて変更する必要がある。判定液は、例えばトリス塩酸緩衝液中に、後述する基質を含有する溶液を用いる。

そして、利用者は、電極部３２を測定部３１に装着し、測定部３１をステーション３４，３５，３６の上に下ろす。そして、図４のステップ１のように、電極移動用ツマミ３３をスタンバイステーション３４の位置にスライドさせて、スタンバイステーション３４にセットされたサンプルチューブ１０１内に電極部３２を挿入する。

ここで、スタートＳＷ４２を押下すると、ＤＮＡ検出装置３０は、上記の設定温度、設定時間及びＰＣＲ繰り返し回数に従って、温度サイクルの制御を行う。なお、図３に示すように、スタート時は、高温（ＴＨ）まで、温度を上昇させる。そして、設定されたＰＣＲ繰り返し回数に従って、温度サイクルを繰り返す。

ＰＣＲ繰り返しにおいては、高温（ＴＨ）時の変成ステップ、低温（ＴＬ）時のアニーリングステップ、中温（ＴＭ）時の伸長ステップが繰り返される。変成ステップにおいては、サンプルの２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる。アニーリングステップにおいては、解離したＤＮＡに相補的な配列をもつ２種類のプライマーが水素結合によって部分的に２本鎖を形成する。伸長ステップにおいては、ＤＮＡポリメラーゼにより、２種類のプライマーのそれぞれをＤＮＡ合成の開始点として、相補正をもつもう一本のＤＮＡが合成される。

ＰＣＲ繰り返しの最後のサイクルでは、高温維持時間（ｔＨ）を経ずに、ハイブリダイゼーションの処理に移行する。そして、ハイブリッド高温（ＴＨＲ）をハイブリッド高温維持時間（ｔＨＲ）だけ維持する。

そして、ハイブリッド高温維持時間（ｔＨＲ）の終了後、ハイブリッド中温（ＴＭＲ）に制御してハイブリッド中温維持時間（ｔＭＲ）維持するとともに、その間ブザーを鳴動し、電極部３２をハイブリッドステーション３５にスライドさせることを促す表示を行う。具体的には、ＬＣＤ表示部５１には、「電極をハイブリッドステーションに移動し、スタートＳＷを押して下さい」と表示する。また、このとき、スタートランプを点滅させ、この間、ｔＭＲ時間の進行を停止する。利用者は、指示に従って、図４のステップ２のように、電極部３２をハイブリッドステーション３５に移動し、サンプルチューブ１０１に挿入する。ここで、電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、ＤＮＡ検出装置３０に備えられた供給手段により、サンプルチューブ１０１内に添加されるようになっている。本実施形態では、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、電極３２ａの表面に付着している。このため、電極３２ａを含む電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、サンプルチューブ１０１内に供給される。

電極部３２の電極３２ａは、図７に示すように、導電体であるカーボン電極２１上にメディエータ２２の表面に、ターゲットＤＮＡ２８ｂと相補的にハイブリダイズするキャプチャープローブ２８ａが固定されている。

スタートＳＷ４２が押下されると、ＤＮＡ検出装置３０は、スタートＳＷ４２のスタートランプを静止点灯させ、ｔＭＲ時間の進行を開始する。
そして、このｔＭＲ時間中に、図７に示すように、キャプチャープローブ２８ａ、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられる。ここで、検出対象のＤＮＡが得られている場合には、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂに相当する。従って、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれている場合に、キャプチャープローブ２８ａ、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられることとなる。

電源投入からＰＣＲ制御中においては、ＬＣＤ表示部５１に、図５に示す設定条件及び実効状態に関する表示画面１１０が表示される。
図５に示すように、表示画面１１０には、ＰＣＲ設定条件表示欄１１１、ハイブリダイゼーション設定条件表示欄１１２、測定条件表示欄１１３及び実効状態表示欄１１４が設けられている。ＰＣＲ設定条件表示欄１１１には、ＰＣＲ制御時の高温、中温、低温の各ステップにおける設定温度及び設定時間が表示される。ハイブリダイゼーション設定条件表示欄１１２には、ハイブリダイゼーション制御時の高温、中温の各ステップにおける設定温度及び設定時間が表示される。測定条件表示欄１１３には、電流測定時の測定時間の設定値及び設定電圧が表示される。

実効状態表示欄１１４には、測定部温度１１５、ＰＣＲ繰り返し回数１１６、ハイブリッドチューブ現在温度１１７、実行残り時間１１８が表示される。測定部温度１１５には、測定部ブロックの温度（℃）を示す。ＰＣＲ繰り返し回数１１６は、設定されたＰＣＲ繰り返し回数（３回を１単位とした単位数）を示し、括弧内に残り回数（３回を１単位とした単位数）を示す。なお、本実施形態では、ＰＣＲ繰り返し回数は、上記のように３回を１単位として設定している。ここでは、１０単位を設定しており、ＰＣＲ繰り返し回数として３０回が設定されている。ハイブリッドチューブ現在温度１１７は、ハイブリッドステーション３５にセットされたサンプルチューブ１０１の現在温度（℃）を示す。実行残り時間１１８は、ＰＣＲ制御及びハイブリダイゼーション制御の全体が終了するまでの残り時間を示す。

なお、ＰＣＲ設定条件表示欄１１１、ハイブリダイゼーション設定条件表示欄１１２において、制御中のステップが反転文字で表示される。
ｔＭＲ時間完了後、ＤＮＡ検出装置３０は、ハイブリッドステーション３５を測定温度に移行させ、この測定温度に達すると、再度ブザーを鳴動し、電極部３２を測定ステーション３６にスライドさせることを促す表示を行う。具体的には、ＬＣＤ表示部５１には、「電極を測定ステーションに移動し、スタートＳＷを押して下さい」と表示する。また、このとき、スタートＳＷ４２のスタートランプを点滅させ、この間、測定時間の進行を停止する。利用者は、この指示に従って、図４のステップ３のように、電極部３２を測定ステーション３６に移動する。

ここで、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれていた場合には、電極部３２の電極３２ａ上には、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ、レポータプローブ２８ｃが、この順で結合されている。なお、レポータプローブ２８ｃには、酵素２６が結合されている。

そして、スタートＳＷ４２が押下されると、ＤＮＡ検出装置３０は、スタートランプを静止点灯させ、測定時間の進行を開始する。
電流値の測定は、電極部３２の電極３２ａに、参照電極３２ｂを基準として＋５００ｍＶの電位を印加し、電極３２ａに流れる電流を測定することにより行う。

ここで、電極部３２の電極３２ａに電位を印加すると、判定液中の基質と酵素が反応し、メディエータを介して電子の授受が行われる。具体的には、図７に示すように、酵素２６が基質２５と反応して酸化体基質２７を生成する際に生じた電子の授受を、メディエータ２２を介してカーボン電極２１に伝達させる。そして、ＤＮＡ検出装置３０は、電極３２ａのカーボン電極２１に流れる電流（限界酸化電流）の電流値を測定する。

なお、電解質溶液のみを用い、酵素反応が起こらない場合であっても、ベースとなる電流が発生するが、酵素反応が起こった場合の酸化還元反応の電子の移動を、このベース電流に比較してより大きな値として測定することができる。

このように、酵素反応に基づく酵素−電極間の電子伝達をモニタする、つまり、一連の電子移動を電流として捕らえることにより、ターゲットＤＮＡの有無又は濃度を検知することができる。このため、ターゲットＤＮＡを捕捉するキャプチャープローブ及びキャプチャーしたターゲットＤＮＡにさらに結合し、信号を得るためのレポータプローブを用いるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイによりＤＮＡの検出を行うことが可能となる。

測定中は、ＤＮＡ検出装置３０は、所定の間隔（例えば、１秒毎）で、テキストファイル形式の測定データをパーソナルコンピュータに送信する。
また、測定中においては、ＬＣＤ表示部５１に、図６に示す測定状態に関する表示画面１２０が表示される。

図６に示すように、表示画面１２０には、測定数値表示欄１２１及び測定結果グラフ表示欄１２２が設けられている。測定数値表示欄１２１には、測定チューブ実温度、測定時間設定（分）、測定ワーク電圧（ｍＶ）、測定残り時間（ｓｅｃ）、測定実データ（ｎＡ）が表示される。測定結果グラフ表示欄１２２には、測定結果がグラフ描画される。このグラフにおいて、Ｘ軸は測定時間であり、Ｙ軸は測定データ（電流値）である。

そして、測定時間が完了すると、ＤＮＡ検出装置３０は、ブザーを１秒間鳴動し、スタートＳＷ４２を点滅させ、ハイブリッドステーション３５をウォーミングアップ温度に制御する。なお、ハイブリッドステーション３５がウォーミングアップ温度に到達すると、スタートＳＷ４２を静止点灯させ、ＬＣＤ表示部５１に「測定が終了しました」と表示する。

以上、本実施例によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・ 上記実施形態では、ＰＣＲにより増幅させたＤＮＡの検出を、電極３２ａ、参照電極３２ｂ及び対電極３２ｃを備えた電極部３２を用いて電流値を測定することにより行う。電極３２ａについては、メディエータ２２を設けることにより、電子伝達場を設けることができる。そして、ターゲットＤＮＡ２８ｂを、電極上に固定化したキャプチャープローブ２８ａ及び酵素２６を結合させたレポータプローブ２８ｃとハイブリダイゼーションさせ、この電極３２ａを用いて、酵素と基質との反応に基づく電流値を測定してＤＮＡの検出を行う。これにより、目的のＤＮＡの有無を、より容易に判断することができる。従って、より簡易、簡便かつ高感度に、ＤＮＡの検出を行うことができる。

・ 上記実施形態では、ＤＮＡ検出装置３０は、ＤＮＡサンプル液に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うための温度サイクルを制御する。そして、電極部３２をＤＮＡサンプル液に浸漬し、電極３２ａのキャプチャープローブ２８ａに増幅されたターゲットＤＮＡ２８ｂを結合させ、さらに、このターゲットＤＮＡ２８ｂに酵素が標識されたレポータプローブ２８ｃを結合させるように温度制御する。これにより、ターゲットＤＮＡ２８ｂの増幅と、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃのハイブリダイゼーションとを行わせるように温度を制御できる。従って、より簡易、簡便かつ高感度に、ＤＮＡの検出を行うことが可能なＤＮＡ検出装置を実現できる。

・ 上記実施形態では、ターゲットＤＮＡ２８ｂの増幅の温度制御と、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃのハイブリダイゼーションとの温度制御とを、いずれもＰＣＲブロック７０の温度を制御することにより行う。このため、これらの温度制御を、同じ制御ユニットを用いて行うことができる。

・ 上記実施形態では、ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションはハイブリッドステーション３５にセットしたサンプルチューブ１０１内で行い、酵素と基質との反応は測定ステーション３６にセットした判定液チューブ１０２内で行う。このため、電流の測定の際に、電極３２ａ上のターゲットＤＮＡ２８ｂと結合したレポータプローブ２８ｃ以外のレポータプローブ２８ｃに標識された酵素による影響を排除できる。

・ 上記実施形態では、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、電極３２ａの表面に固定されている。このため、電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、サンプルチューブ１０１内に供給される。従って、電極部３２をサンプルチューブ１０１内のＤＮ
Ａサンプル液に挿入することにより、自動的に、ＤＮＡサンプル液中に、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃを供給することができる。

・ 上記実施形態では、ＤＮＡを増幅するための温度サイクルをサンプルに印加する装置（ＰＣＲ装置）と、増幅されたＤＮＡを検出するための電極の電流出力を測定する装置とを一体化した。これにより、携帯が容易な装置を実現できる。従って、サンプリングしたその場でＤＮＡの検出を行うことが可能となる。また、ＤＮＡ増幅産物の移動やピペッティング操作が不要となるため、より容易にＤＮＡの検出を行うことができる。さらに、ＤＮＡの検出を、上記の電極を用いて電流値の測定により行うことにより、電気泳動及び染色の処理を行わないため、ＤＮＡの検出のための所要時間を短縮できる。

・ 上記実施形態では、酵素２６を結合したレポータプローブ２８ｃとして凍結乾燥した状態のものを用いる。このため、酵素２６を結合したレポータプローブ２８ｃを冷却保存する必要がない。このため、ＤＮＡ検出装置３０を携帯して、サンプリングを行った場所でＤＮＡ検出を行うことが、より容易となる。

なお、上記実施形態は、以下のように変更してもよい。
○ 上記実施形態では、酵素２６を結合したレポータプローブ２８ｃとして凍結乾燥した状態のものを用いたが、酵素２６を結合したレポータプローブ２８ｃは、液状試薬を用いてもよい。

○ 上記実施形態では、凍結乾燥させた状態の酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃを電極３２ａの表面に付着させておき、サンプル液中に酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃを供給したが、別の方法で供給を行ってもよい。例えば、凍結乾燥した状態の酵素２６を結合したレポータプローブ２８ｃは、電極部３２の電極３２ａ以外の部分に付着させていてもよい。

○ 上記実施形態では、スタンバイステーション３４、ハイブリッドステーション３５、測定ステーション３６を設けた。これに代えて、スタンバイステーション３４は設けずに、電極部３２をサンプルチューブ１０１に挿入するまで、電極部３２を別の場所に退避させておいてもよい。

○ 上記実施形態では、ハイブリッドステーション３５と測定ステーション３６とを別々に設けたが、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅及びハイブリダイゼーションによる電極の作成と、電流の測定とを同じステーションにセットされたチューブ内で行ってもよい。この場合、ハイブリダイゼーションの完了後、測定温度まで温度を下げた後に、サンプル液が入っているチューブに基質を添加する。なお、この場合、電極３２ａ上のターゲットＤＮＡｂと結合したレポータプローブ２８ｃ以外のレポータプローブ２８ｃに標識された酵素による影響を、実験データに基づく数値を用いて補償してもよい。これにより、ハイブリッドステーション３５から測定ステーション３６に電極を移動する必要がないため、利用者の操作をより簡略化できる。

○ 上記実施形態では、電極部３２をサンプルチューブ１０１に挿入する際と、サンプルチューブ１０１から判定液チューブ１０２に電極部３２を移動する際には、それぞれブザーを鳴らして利用者の操作を促した。これに代えて、サンプルチューブ１０１への電極部３２の挿入と、サンプルチューブ１０１から判定液チューブ１０２への電極部３２の移動とを自動的に行ってもよい。なお、この場合、サンプルチューブ１０１に電極部３２の挿入する際に、酵素が結合したレポータプローブ２８ｃを、自動的にサンプル液に添加する。

本発明のＤＮＡ検出装置は、医療分野及び食品分野のほか、環境計測用などの幅広い分野で、ＤＮＡ検出に利用することができる。

本発明のＤＮＡ検出装置の斜視図である。 本発明のＤＮＡ検出装置の回路構成を示すブロック図である。 本発明のＤＮＡ検出装置の温度制御の説明図である。 本発明のＤＮＡ検出装置における電極移動の説明図である。 本発明のＤＮＡ検出装置における表示画面の説明図である。 本発明のＤＮＡ検出装置における表示画面の説明図である。 本発明のＤＮＡ検出装置の電極における反応の説明図である。

符号の説明

２１ カーボン電極（導電体）
２２ メディエータ
２５ 基質
２６ 酵素
２７ 酸化体基質
２８ａ キャプチャープローブ
２８ｂ ターゲットＤＮＡ２８ｂ
２８ｃ レポータプローブ２８ｃ
３０ ＤＮＡ検出装置
３２ 電極部（バイオセンサ）
３２ａ 電極
３２ｂ 参照電極
３２ｃ 対電極

Claims (6)

1. 導電体表面に、電子を授受し得るメディエータを介して、１種又は２種以上のＤＮＡ断片が結合してなる電極と、
   ＤＮＡサンプル液に対して、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための温度サイクルを制御する第１温度制御部と、
   前記電極に結合したＤＮＡ断片にターゲットＤＮＡを結合させ、さらに、前記ターゲットＤＮＡに酵素が標識されたＤＮＡ断片を結合させるための温度を制御する第２温度制御部と、
   
   前記ＤＮＡ断片に標識された酵素と基質との反応に基づいて前記電極に流れる限界酸化電流の電流値を測定する電流測定部と
   を備えたことを特徴とするＤＮＡ検出装置。
2. 前記第１温度制御部と前記第２温度制御部とを、一つの制御ユニットで構成することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出装置。
3. 前記ポリメラーゼ連鎖反応を行うための第１容器を備え、
   前記酵素と前記基質との反応のために、前記第１容器とは異なる第２容器を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡ検出装置。
4. 前記ＤＮＡサンプル液中に入れる酵素が標識されたＤＮＡ断片の供給手段を備え、
   前記供給手段は、前記ポリメラーゼ連鎖反応を実行後のＤＮＡサンプル液に、酵素が標識されたＤＮＡ断片を供給することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡ検出装置。
5. 前記供給手段は、前記酵素が標識されたＤＮＡ断片を、表面に付着させた前記電極であることを特徴とする請求項４のいずれか１つに記載のＤＮＡ検出装置。
6. 導電体表面に、電子を授受し得るメディエータを介して１種又は２種以上のＤＮＡ断片が結合してなる電極であって、前記電極でのＤＮＡ検出に必要な試薬を、前記電極の表面に付着させているＤＮＡ検出用電極。

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