JP2006345832A - 微生物検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 迅速かつ高精度に特定の微生物を検出するための微生物検出方法を提供する。
【解決手段】 以下の方法により、特定の微生物の検出を行う。すなわち、まず、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する（ステップＳ１）。そして、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する（ステップＳ２）。そして、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し（ステップＳ３）、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する（ステップＳ４）。
【選択図】 図１
【解決手段】 以下の方法により、特定の微生物の検出を行う。すなわち、まず、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する（ステップＳ１）。そして、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する（ステップＳ２）。そして、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し（ステップＳ３）、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する（ステップＳ４）。
【選択図】 図１
Description
本発明は、微生物検出方法に関する。
食中毒を防止するため、食品の安全面や衛生面の管理の高度化が望まれている。従来、食中毒原因菌すなわちサルモネラ等の特定微生物を検出する場合に行われている方法としては、培養法、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、免疫磁気ビーズ法、ＤＮＡ検出法等や、これらの改良技術がある（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１には、食品又は食品原料を目的微生物を増殖させる条件で培養し、得られた培養物を目的微生物を選択的に増殖させる条件で培養した後に、得られた培養物から目的微生物の持つ酵素活性を指標として目的微生物を検出する技術が公開されている。
特開２００３−３３９３９７号公報（第２−４頁）
しかし、上記の方法のうちどの方法を用いるにせよ、増菌培養が必要であり、微生物の検出結果を得るまでに長時間を要する。検出に要する時間は、方法や検出対象の微生物によって異なるが、それぞれ８時間以上を要している。このため賞味期限の短い食品の場合、検査結果を待って出荷することができない。
また、食品中には、検出対象の微生物のみならず、他の微生物が混在する場合がある。さらに、検出対象の微生物の死菌や溶出したＤＮＡが混入している場合もある。このため、微生物の検出をＤＮＡの検出により行う場合であっても、検出対象の微生物以外の微生物に由来するＤＮＡによる誤判定の可能性や、死菌や溶出されているＤＮＡの影響により生菌のみの検出、測定を行うことができない可能性がある。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、迅速かつ高精度に特定の微生物を検出するための微生物検出方法を提供することにある。
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する工程と、前記捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程と、前記抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程と、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程とを有することを要旨とする。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の微生物検出方法において、前記捕捉体は、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズ、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁性ナノ粒子、及び、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を内面に固定化した容器のいずれか１つであることを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の微生物検出方法において、前記増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程は、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、酵素標識されたレポータプローブと、前記酵素と反応する基質とを用いて、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記レポータプローブに標識された前記酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出することを要旨とする
。
。
請求項４に記載の発明は、請求項１又は２に記載の微生物検出方法において、前記増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程は、電気泳動法、蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法のいずれか１つにより行うことを要旨とする。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか１つに記載の微生物検出方法において、前記捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程は、熱抽出法により、前記捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出することを要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項１又は２に記載の微生物検出方法において、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、温度制御部と、前記電極に流れる電流値を測定する電流測定部とを備えたＤＮＡ検出装置を用い、前記捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程は、前記捕捉体に結合した状態の微生物を含むサンプル液の温度を前記温度制御部により制御して熱抽出法によりＤＮＡを抽出し、前記抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程は、前記抽出されたＤＮＡを含むサンプル液の温度を前記温度制御部により制御してＰＣＲ法によりターゲットＤＮＡを増幅し、前記増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程は、酵素標識されたレポータプローブと、前記酵素と反応する基質とを用い、前記増幅産物を含むサンプル液の温度を前記温度制御部により制御して、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記電流測定部により、前記レポータプローブに標識された前記酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出することを要旨とする。
（作用）
請求項１に記載の発明によれば、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲し、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することにより、微生物の検出を行う。このため、特定の微生物の検出を行う場合に、増菌培養を行わないため、短時間で微生物の検出を行うことができる。また、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲することによる選択と、ＤＮＡの検出という２段階の選定を行うため、判定の精度を向上させることができる。
請求項１に記載の発明によれば、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲し、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することにより、微生物の検出を行う。このため、特定の微生物の検出を行う場合に、増菌培養を行わないため、短時間で微生物の検出を行うことができる。また、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲することによる選択と、ＤＮＡの検出という２段階の選定を行うため、判定の精度を向上させることができる。
請求項２に記載の発明によれば、前記捕捉体は、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズ、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁性ナノ粒子、及び、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を内面に固定化した容器を捕捉体として用いることができる。
請求項３に記載の発明によれば、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極のキャプチャープローブと、酵素標識されたレポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させる。そして、レポータプローブに標識された酵素と基質による反応により電極に流れる電流値を測定することにより、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することができる。
請求項４に記載の発明によれば、電気泳動法、蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法により、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することができる。
請求項５に記載の発明によれば、熱抽出法により、捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出することができる。
請求項５に記載の発明によれば、熱抽出法により、捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出することができる。
請求項６に記載の発明によれば、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、温度制御部と、前記電極に流れる電流値を測定する電流測定部とを備えたＤＮＡ検出装置を用いて微生物の検出を行うことができる。すなわち、捕捉体に結合した状態の微生物を含むサンプル液の温度を制御して熱抽出法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを含むサンプル液の温度を制御してＰＣＲ法によりターゲットＤＮＡを増幅する。そして、酵素標識されたレポータプローブと、前記酵素と反応する基質とを用い、増幅産物を含むサンプル液の温度を制御して、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させる。そして、前記レポータプローブに標識された前記酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することによりターゲットＤＮＡを検出する。これにより、捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出、ＰＣＲ法による増幅、及びターゲットＤＮＡの検出を、前記電極、前記温度制御部及び前記電流測定部を備えたＤＮＡ検出装置を用いて行うことができる。
本発明によれば、迅速かつ高精度に特定の微生物を検出できる。
以下、本発明を具体化した実施形態を、図１を用いて説明する。本実施形態では、迅速かつ高精度に特定の微生物を検出するための微生物検出方法として説明する。
図１に示すように、本発明における微生物検出方法では、まず、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する（ステップＳ１）。
図１に示すように、本発明における微生物検出方法では、まず、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する（ステップＳ１）。
この工程では、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズや磁性ナノ粒子、又は、このようなリガンドもしくは抗体を内面に固定化した容器を、捕捉体として用いる。そして、この捕捉体に固定化されているリガンドもしくは抗体に微生物の構成成分が結合することにより、微生物がこの捕捉体に結合する。そして、微生物と結合した捕捉体を収集することにより、微生物を収集する（すなわち、微生物を捕獲する）。
微生物の構成成分と結合するリガンド又は抗体としては、例えば、検出対象の微生物がサルモネラの場合、例えば、ポリミキシンＢを用いる。ポリミキシンＢは、サルモネラ等のグラム陰性菌の外膜の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に結合することが知られている。この場合、リガンドであるポリミキシンＢが、サルモネラの外膜の構成成分であるリポポリサッカライドと結合することにより、サルモネラが捕捉体に結合する。なお、微生物の構成成分と結合する抗体を固定化した捕捉体を用いてもよい。この場合、微生物の構成成分に含まれる抗原と、捕捉体に固定化された抗体とが結合することにより、微生物が捕捉体に結合する。
リガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズを捕捉体として用いる場合、磁石により磁気ビーズを収集することにより、微生物を収集できる。磁性ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ微粒子の表層に熱応答性高分子を固定化した熱応答性磁性ナノ粒子を用いる。このような熱応答性磁性ナノ粒子は、水溶液の温度を変化させることにより急速に凝集し、磁石による分離が可能となる。このような磁性ナノ粒子にリガンドもしくは抗体を固定化させて捕捉体として用い、微生物と結合した状態で磁性ナノ粒子を収集することにより、微生物を収集する。
また、リガンドもしくは抗体を内面に固定化した容器としては、例えば、ＰＣＲ処理に用いるチューブ等の内面にリガンドもしくは抗体を固定化したものが挙げられる。容器の内面にリガンドもしくは抗体を固定化して捕捉体として用いる場合、容器から反応液を除
去する際に、容器内面に固定化されたリガンドもしくは抗体に微生物の構成成分が結合していることにより、容器内面に微生物が付着して残留し、微生物を収集することができる。
去する際に、容器内面に固定化されたリガンドもしくは抗体に微生物の構成成分が結合していることにより、容器内面に微生物が付着して残留し、微生物を収集することができる。
次に、捕獲された微生物からＤＮＡを抽出する（ステップＳ２）。この工程におけるＤＮＡの抽出方法は、特に限定されるものではなく、例えば、熱抽出法等の公知の方法を用いることができる。
そして、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法（ポリメラーゼチェイン反応：Polymerase Chain
Reaction）により増幅する（ステップＳ３）。すなわち、ＰＣＲ法、又は、ＰＣＲ法の
改良技術により、検出対象の微生物の２本鎖のＤＮＡの特定領域を挟むようにして設計された２種類のプライマーを用いて、この特定領域を含むＤＮＡ断片を増幅する。なお、この特定領域を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅についての具体例は、後述する。
Reaction）により増幅する（ステップＳ３）。すなわち、ＰＣＲ法、又は、ＰＣＲ法の
改良技術により、検出対象の微生物の２本鎖のＤＮＡの特定領域を挟むようにして設計された２種類のプライマーを用いて、この特定領域を含むＤＮＡ断片を増幅する。なお、この特定領域を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅についての具体例は、後述する。
そして、増幅産物である、検出対象の微生物の特定のＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を検出する（ステップＳ４）。すなわち、検出対象の微生物が捕獲された場合、この微生物から抽出されたＤＮＡの特定領域を含むＤＮＡ断片が増幅されており、このＤＮＡ断片が検出される。この工程におけるＤＮＡの検出方法は、特に限定されないが、電気泳動法、蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法、ＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法等を用いることができる。
電気泳動法によるＤＮＡの検出は、公知の技術により行うことができる。
蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。このリアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタし解析する方法である。すなわち、このリアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、上記抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程（ステップＳ３）と、増幅産物である特定のＤＮＡを検出する工程（ステップＳ４）とを、このリアルタイムＰＣＲ法により行うこととなる。通常、リアルタイムＰＣＲのモニタは蛍光発光により行う。この蛍光発光のモニタ方法としては、例えば、公知の方法として、インカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法等がある。
蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。このリアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタし解析する方法である。すなわち、このリアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、上記抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程（ステップＳ３）と、増幅産物である特定のＤＮＡを検出する工程（ステップＳ４）とを、このリアルタイムＰＣＲ法により行うこととなる。通常、リアルタイムＰＣＲのモニタは蛍光発光により行う。この蛍光発光のモニタ方法としては、例えば、公知の方法として、インカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法等がある。
ＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法では、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極のキャプチャープローブと、酵素標識されたレポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、レポータプローブに標識された酵素と基質による反応により電極に流れる電流値を測定することにより、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する。このようなＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法で用いる電極について以下に詳述する。
このＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法で用いる電極は、導電体上にメディエータが積層されて構成されていてもよい。
導電体としては、通常、電極として用いられるものであればどのような材料でも使用することができる。例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等；アルミニウム、銅、金、白金、銀等の金属又は合金、ＳｎＯ2、Ｉｎ2Ｏ3、ＷＯ3、ＴｉＯ2等、導
電性酸化物等種々の材料の単層又は２種以上の積層構造が挙げられる。電極の膜厚、大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用するメディエータ、酵素等の種類、得ようとするバイオセンサの性能等によって適宜調整することができる。例えば、厚み０．１〜５ｍｍ程度、１〜１００００ｍｍ2程度の面積の矩形形状であることが適当である。
導電体としては、通常、電極として用いられるものであればどのような材料でも使用することができる。例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等；アルミニウム、銅、金、白金、銀等の金属又は合金、ＳｎＯ2、Ｉｎ2Ｏ3、ＷＯ3、ＴｉＯ2等、導
電性酸化物等種々の材料の単層又は２種以上の積層構造が挙げられる。電極の膜厚、大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用するメディエータ、酵素等の種類、得ようとするバイオセンサの性能等によって適宜調整することができる。例えば、厚み０．１〜５ｍｍ程度、１〜１００００ｍｍ2程度の面積の矩形形状であることが適当である。
メディエータとしては、電極と酵素との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能するもので、酵素反応に悪影響を与えないものであれば、どのようなものでも使用するこ
とができる。例えば、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル置換体、エチル置換体、プロピル置換体等）、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン等の酸化還元性の有機又は無機化合物の１種あるいは２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、水や水溶性有機溶媒（低級アルコール等）に溶解し、取り扱いが容易であるもの、電子移動媒体としての機能が安定しているものが好ましく、例えば、フェロセン、フェリシアン化カリウム等が好適に用いられる。
とができる。例えば、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル置換体、エチル置換体、プロピル置換体等）、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン等の酸化還元性の有機又は無機化合物の１種あるいは２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、水や水溶性有機溶媒（低級アルコール等）に溶解し、取り扱いが容易であるもの、電子移動媒体としての機能が安定しているものが好ましく、例えば、フェロセン、フェリシアン化カリウム等が好適に用いられる。
導電体上に積層されるメディエータの膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、レポータプローブに標識された酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、メディエータを導電体上に積層する方法は、メディエータの種類によって、適当なものを適宜選択することができる。例えば、メディエータをその機能を阻害しない溶媒、例えば、水又は水溶性有機溶媒等に溶解させ、塗布、乾燥する方法、メディエータを適当な担体、例えば、樹脂、タンパク等の高分子化合物等に混合及び分散させ、担体を薄膜状に形成する方法、交互積層法（現代化学、１９９７年１月、ｐ２０〜２５参照）等、当該分野で公知の薄膜形成法のすべてを利用することができる。なかでも、後述する交互積層法が好ましい。
このＤＮＡ測定装置の電極では、上述したメディエータが、高分子担体とともに層状で積層されているものもある。ここで用いることができる高分子担体としては、電荷を有すること、ポリマーであること及び水溶性であることのいずれか１種、好ましくは全ての性質を満足するものが適当である。電荷は正及び負のいずれでもよい。高分子担体は、例えば、各種タンパク質（例えば、酵素、抗体、レセプタータンパク等）、ポリペプチド（例えば、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等）、水溶性合成高分子化合物（例えば、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレンスルホン酸、ポリジメチルジアリルアンモニウムクロライド等）、天然高分子（アルギン酸及びその塩類、トラガントガム等）が挙げられる。
メディエータ等を高分子担体とともに積層する方法としては、特に限定されるものではなく、メディエータ等を高分子担体に分散、あるいは高分子担体とともに適当溶媒（水、緩衝液、水溶性有機溶媒等）に溶解又は分散し、塗布、乾燥する方法でもよいし、交互積層法を利用してもよい。
メディエータを積層する交互積層法（ここでは、各層を順次積層する方法）は、例えば、以下のように行うことができる。
まず、導電体表面を活性化することにより、正又は負に帯電させる。次いで、メディエータを構成する分子、あるいはメディエータを分散／メディエータと結合した高分子担体を負又は正に帯電させ、これを導電体表面に接触させることにより、正と負との電荷の間の相互作用を通してメディエータを導電体表面に積層する。なお、このような１回の正負の相互作用によって、必要なメディエータ量を確保することができれば、上述のような積層は１層のみでよいが、さらに多量のメディエータを導電体表面に積層したい場合は、上述の相互作用を複数回行うことによって、メディエータ層を複数層、例えば、２〜２０層程度積層してもよい。この場合、積層されたメディエータ上に、これと反対の電荷を有する担体（例えば、上述した高分子担体）又はメディエータ等を積層し、再度、メディエータを構成する分子等を、この高分子担体等の上に積層するという一連の操作を繰り返すことによって、多数層のメディエータの積層を実現することができる。
まず、導電体表面を活性化することにより、正又は負に帯電させる。次いで、メディエータを構成する分子、あるいはメディエータを分散／メディエータと結合した高分子担体を負又は正に帯電させ、これを導電体表面に接触させることにより、正と負との電荷の間の相互作用を通してメディエータを導電体表面に積層する。なお、このような１回の正負の相互作用によって、必要なメディエータ量を確保することができれば、上述のような積層は１層のみでよいが、さらに多量のメディエータを導電体表面に積層したい場合は、上述の相互作用を複数回行うことによって、メディエータ層を複数層、例えば、２〜２０層程度積層してもよい。この場合、積層されたメディエータ上に、これと反対の電荷を有する担体（例えば、上述した高分子担体）又はメディエータ等を積層し、再度、メディエータを構成する分子等を、この高分子担体等の上に積層するという一連の操作を繰り返すことによって、多数層のメディエータの積層を実現することができる。
この電極には、ＤＮＡ断片を固定させておく。このＤＮＡ断片は、ＤＮＡの相補性を利用して、検出及び／又は定量目的のＤＮＡ（以下「ターゲットＤＮＡ」と記す）と対合させるためのキャプチャープローブである。
そして、別のＤＮＡ断片（ターゲットＤＮＡ及びレポータプローブ）を加えて、キャプチャープローブ、ターゲットＤＮＡ、レポータプローブがこの順にメディエータを介して電極に結合させられ、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量を行う。つまり、電極上で、いわゆるターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを行わせる。そして、ターゲットＤＮＡ及びレポータプローブが結合された電極を用いて、メディエータを介する間接的な電子授受を、例えば、電流値として測定することによって、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。
ターゲットＤＮＡは、ＤＮＡの相補性を利用して、このキャプチャープローブと対合させられる検出及び／又は定量目的のＤＮＡ断片である。なお、このターゲットＤＮＡは、本発明の微生物検出方法においては、捕獲された微生物から抽出されたＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されて用いられる。レポータプローブは、ＤＮＡの相補性を利用してターゲットＤＮＡと対合して、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量するために酵素が標識されている。
電極上にキャプチャープローブを固定する方法としては、当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。例えば、電極上にストレプトアビジンを積層し、キャプチャープローブの５’末端をビオチン修飾し、アビジン−ビオチンの相互作用により固定する方法又はこれに準じた方法が挙げられる。
なお、ＤＮＡ断片を用いる方法、つまりＤＮＡプローブ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション自体は当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。この際に利用するＤＮＡ断片は、市販されているいずれを用いてもよい。例えば、サルモネラのプローブ（Rahn K., S. A. De Grandis, R. C. Clarke, S. A. McEwen, J. E. Galan, C. Ginocchio, R. Curtiss and C.L. Gyles, Mol. Cell. Probes, 6, 271-279 (1992)参照）、タカラバイオケミカルス、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）invE遺伝
子検出用Primer Set INV-1& 2、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）ipaH遺伝子検出
用Primer Set IPA-1& 2、コレラ毒素遺伝子検出用Primer Set VCT-1 & 2（いずれも（株
）島津製作所製）等が挙げられる。
子検出用Primer Set INV-1& 2、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）ipaH遺伝子検出
用Primer Set IPA-1& 2、コレラ毒素遺伝子検出用Primer Set VCT-1 & 2（いずれも（株
）島津製作所製）等が挙げられる。
上記のようにして作成された電極は、通常、対電極と、これらの電極及び対電極とを収容し、基質を含有する溶液を収容することができる反応器内に配置され、さらにこの反応器内に、両電極がほぼ完全に浸漬する程度に溶液で充填されたバイオセンサにおいて、利用されることが適当である。このようなバイオセンサにおいては、サイクリックボルタンメトリを利用することによって、例えば、両電極に所定の電位差を有する定電位を与え、酵素の反応に起因して発生する電流値を、例えば、限界酸化電流値として測定して、判定を行うことができる。電流値の検出は、例えば、ポテンショスタット、電流計等の電流検出部によって行うことができる。このＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法においては、このようなバイオセンサを用いて電流値を測定することによりＤＮＡの検出を行う。
以上のように、上記ステップＳ１〜ステップＳ４の各工程を、順次、実行することにより、特定の微生物の検出を行うことができる。
例えば、サルモネラの検出を行う場合であって、サルモネラを捕獲する際に、ポリミキシンＢを固定化した捕捉体を用いた場合、ポリミキシンＢと結合するリポポリサッカライドを外膜の構成成分に有するグラム陰性菌が捕獲される。そして、捕獲された微生物のＤ
ＮＡを抽出してＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を経てターゲットＤＮＡを検出するため、捕獲された微生物（この場合は、グラム陰性菌）に由来するＤＮＡから増幅された増幅産物のみを対象として、サルモネラのＤＮＡの検出が行われる。
例えば、サルモネラの検出を行う場合であって、サルモネラを捕獲する際に、ポリミキシンＢを固定化した捕捉体を用いた場合、ポリミキシンＢと結合するリポポリサッカライドを外膜の構成成分に有するグラム陰性菌が捕獲される。そして、捕獲された微生物のＤ
ＮＡを抽出してＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を経てターゲットＤＮＡを検出するため、捕獲された微生物（この場合は、グラム陰性菌）に由来するＤＮＡから増幅された増幅産物のみを対象として、サルモネラのＤＮＡの検出が行われる。
また、検出対象の微生物の構成成分である抗原と結合する抗体を固定化した捕捉体を用いる場合、この抗原を有する微生物のみが捕獲される。そして、捕獲された微生物のＤＮＡを抽出してＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を経てターゲットＤＮＡを検出するため、捕獲された微生物（この場合は、捕捉体に固定化された抗体に結合する抗原を有する微生物）に由来するＤＮＡから増幅された増幅産物のみを対象として、検出対象の微生物のＤＮＡの検出が行われる。
このように、本実施形態の微生物検出方法では、微生物を捕獲することによる第１段階の選択と、捕獲された微生物から抽出されたＤＮＡを増幅し、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する第２段階の選択との、２段階の選択が行われる。
以上、本実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
（１） 上記実施形態では、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲し、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することにより、微生物の検出を行う。このため、特定の微生物の検出を行う場合に、増菌培養を行わないため、短時間で微生物の検出を行うことができる。また、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲することによる選択と、ＤＮＡの検出という２段階の選定を行うため、判定の精度を向上させることができる。また、まず微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲することにより微生物の選択を行った後に、ＤＮＡの検出を行うため、捕捉体に固定化されたリガンドもしくは抗体と結合する構成成分を有さない微生物のＤＮＡや、死菌や微生物の死滅により溶出されているＤＮＡによる影響を受けることなく、検出対象の微生物を検出できる。
（１） 上記実施形態では、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲し、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することにより、微生物の検出を行う。このため、特定の微生物の検出を行う場合に、増菌培養を行わないため、短時間で微生物の検出を行うことができる。また、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲することによる選択と、ＤＮＡの検出という２段階の選定を行うため、判定の精度を向上させることができる。また、まず微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲することにより微生物の選択を行った後に、ＤＮＡの検出を行うため、捕捉体に固定化されたリガンドもしくは抗体と結合する構成成分を有さない微生物のＤＮＡや、死菌や微生物の死滅により溶出されているＤＮＡによる影響を受けることなく、検出対象の微生物を検出できる。
（２） 上記実施形態では、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した、磁気ビーズ、磁性ナノ粒子、容器内面を捕捉体として用いることができる。このため、容易に微生物を捕獲できる。
（３） 上記実施形態では、電気泳動法により、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することができる。このため、増幅産物であるターゲットＤＮＡの検出を、より少ないコストで簡易に行うことができる。
（４） 上記実施形態では、蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法により、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することができる。このため、より短時間かつ高感度で増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することができる。
（５） 上記実施形態では、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極のキャプチャープローブと、酵素標識されたレポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、レポータプローブに標識された酵素と基質による反応により電極に流れる電流値を測定することにより、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出することができる。これにより、増幅産物であるターゲットＤＮＡの検出を、より簡易、簡便かつ高感度に行うことができる。
（６） 上記実施形態では、熱抽出法により、捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出することができる。これにより、捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出を簡易な
操作により行うことができる。
操作により行うことができる。
（ＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法によるＤＮＡ検出装置を用いた具体例）
次に、上記のような微生物検出方法において、ＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法によるＤＮＡ検出装置を用いた具体例について、図２〜図７を用いて説明する。このＤＮＡ検出装置は、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、温度制御部と、前記電極に流れる電流値を測定する電流測定部とを備えている。そして、このＤＮＡ検出装置を用いて、上記ステップＳ２〜ステップＳ４の各工程を実行する。
次に、上記のような微生物検出方法において、ＤＮＡプローブを用いた電気化学的検出方法によるＤＮＡ検出装置を用いた具体例について、図２〜図７を用いて説明する。このＤＮＡ検出装置は、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、温度制御部と、前記電極に流れる電流値を測定する電流測定部とを備えている。そして、このＤＮＡ検出装置を用いて、上記ステップＳ２〜ステップＳ４の各工程を実行する。
なお、上記ステップＳ１については、例えば、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズや磁性ナノ粒子、又は、このようなリガンドもしくは抗体を内面に固定化した容器（例えば、チューブ）を用いて、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する。
そして、次の工程、すなわち、捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程（ステップＳ２）では、このようにして捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出を、このＤＮＡ検出装置を用いて行い、さらに、このＤＮＡ検出装置を用いて、抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程（ステップＳ３）と、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程（ステップＳ４）を実行する。
次に、ＤＮＡ検出装置について説明する。
図２に示すように、ＤＮＡ検出装置３０の上面には、測定部３１が備えられている。この測定部３１には、電極部（バイオセンサ）３２（図３参照）が備えられており、この電極部３２を移動させるための電極移動用ツマミ３３が、この測定部３１の上面に備えられている。この測定部３１は、蓋状になっており、上下方向に開閉可能となっている。
図２に示すように、ＤＮＡ検出装置３０の上面には、測定部３１が備えられている。この測定部３１には、電極部（バイオセンサ）３２（図３参照）が備えられており、この電極部３２を移動させるための電極移動用ツマミ３３が、この測定部３１の上面に備えられている。この測定部３１は、蓋状になっており、上下方向に開閉可能となっている。
この測定部３１を持ち上げた状態において、それぞれ２つのスタンバイステーション３４、ハイブリッドステーション３５及び測定ステーション３６が露出する。スタンバイステーション３４は、ＰＣＲの実行時に電極部３２を退避させておくために用いられる。ハイブリッドステーション３５は、捕獲した微生物を入れたサンプルチューブ１０１をセットして、ＤＮＡの熱抽出及び抽出されたＤＮＡを用いたＰＣＲを実行し、ＰＣＲ処理後に電極部３２を挿入して、ハイブリダイゼーションを行わせるために用いられる。測定ステーション３６は、判定液を注入した判定液チューブ１０２をセットし、ハイブリッドステーション３５から取り出した電極部３２を挿入して、電流を測定するために用いられる。
ＤＮＡ検出装置３０の上面には、さらに、電源スイッチ（電源ＳＷ）４１、スタートスイッチ（スタートＳＷ）４２、ストップスイッチ（ストップＳＷ）４３が備えられている。
ＤＮＡ検出装置３０の正面下部には、設定用ロータリースイッチ（設定用ロータリーＳＷ）４４及びＵＳＢコネクタ４５が備えられている。この設定用ロータリーＳＷ４４の上側には、制御される温度の推移を示す温度制御パターンが示されており、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、測定の各処理の各段階について、それぞれ、温度及び時間を設定するスイッチを対応付けて表示している。この設定用ロータリーＳＷ４４では、これらの各段階での温度及び時間、ＰＣＲサイクルの回数、及び測定電圧の設定入力が行われる。ＵＳＢコネクタ４５は、測定データの転送のためにパソコンと接続する場合に用いられる。
ＤＮＡ検出装置３０の正面上部には、ＬＣＤ表示部５１が設けられている。また、ＤＮＡ検出装置３０の両側の側面には、冷却用ファンモータ５２及び排熱口５３が、それぞれ備えられている。また、このＤＮＡ検出装置３０の背面には、図示しないが、冷却用ファ
ンモータ、ヒューズホルダ及び電源入力部が設けられている。
ンモータ、ヒューズホルダ及び電源入力部が設けられている。
次に、図３を用いて、ＤＮＡ検出装置３０のブロック構成を説明する。
図３に示すように、ＤＮＡ検出装置３０は、ＣＰＵ６１を備えている。ＣＰＵ６１は、スイッチ制御機能（ＳＷ制御機能）６２、設定数値変換機能６３、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５を備えている。さらに、ＣＰＵ６１は、温度制御機能６６、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７、温度制御機能６８、温度検出・ＰＩＤ演算機能６９を備えている。
図３に示すように、ＤＮＡ検出装置３０は、ＣＰＵ６１を備えている。ＣＰＵ６１は、スイッチ制御機能（ＳＷ制御機能）６２、設定数値変換機能６３、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５を備えている。さらに、ＣＰＵ６１は、温度制御機能６６、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７、温度制御機能６８、温度検出・ＰＩＤ演算機能６９を備えている。
ＳＷ制御機能６２は、スタートＳＷ４２、ストップＳＷ４３がそれぞれ押下されると、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５をそれぞれ制御することにより、処理を開始又は中断する機能である。設定数値変換機能６３は、設定用ロータリーＳＷ４４により設定入力された温度、時間、ＰＣＲサイクルの回数、及び測定電圧の数値に関するデータ変換を行い、各設定値を、時間制御機能６４、ＰＣＲステップ制御機能６５、温度制御機能６６，６８、測定電圧発生回路９１に対してそれぞれ指示する機能である。
時間制御機能６４は、各処理の処理時間を制御するとともに、時間制御に関する情報をＬＣＤ表示部５１に表示させる機能である。ＰＣＲステップ制御機能６５は、ＰＣＲステップの回数を制御するとともに、ＰＣＲステップ制御に関する情報をＬＣＤ表示部５１に表示させる機能である。
温度制御機能６６及び温度検出・ＰＩＤ演算機能６７は、ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションに関する温度の設定値に基づいて、ＰＣＲブロック７０における温度制御を行う機能である。
ＰＣＲブロック７０の各側面及び底面には、ペルチェ素子７１が設けられている。また、ＰＣＲブロック７０の両側側面及び背面には、冷却用ファン７２が設けられている。さらに、温度センサ７３がＰＣＲブロック７０に備えられている。そして、このＰＣＲブロック７０には、前述のハイブリッドステーション３５が設けられている。
ペルチェ素子７１は、ペルチェ効果を利用した素子であって、ＰＣＲブロック７０の温度サイクルを調整する。冷却用ファン７２は、放熱を行うために用いられる。温度センサ７３は、ＰＣＲブロック７０の温度の測定を行う。
温度制御機能６６は、ＰＣＲブロック７０の温度制御を行うための制御信号を、加熱／冷却切替回路７５に出力する機能である。温度検出・ＰＩＤ演算機能６７は、温度センサ７３によって測定されたＰＣＲブロック７０における温度を検出し、検出された温度と、温度制御機能６６から指示された設定温度とに基づいて、ＰＩＤ演算を行う機能である。そして、算出された値に関する信号を電流制御回路７４に出力する。
電流制御回路７４は、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７により出力された信号に従って、熱制御電源６０からの熱制御電源電圧に基づく制御電流を加熱／冷却切替回路７５に出力する。
加熱／冷却切替回路７５は、加熱／冷却の切替を指示する信号をペルチェ素子７１に出力する。そして、ペルチェ素子７１により、ＰＣＲブロック７０の温度サイクルの調整を行う。
温度制御機能６８及び温度検出・ＰＩＤ演算機能６９は、測定部ブロック８０における温度制御を行う機能である。
測定部ブロック８０は、加熱ヒータ８１により加熱される。また、温度センサ８２が測定部ブロック８０に備えられている。そして、この測定部ブロック８０には、前述の測定ステーション３６が設けられている。
測定部ブロック８０は、加熱ヒータ８１により加熱される。また、温度センサ８２が測定部ブロック８０に備えられている。そして、この測定部ブロック８０には、前述の測定ステーション３６が設けられている。
温度制御機能６８は、測定部ブロック８０の設定温度に関するデータを温度検出・ＰＩＤ演算機能６９に指示する機能である。
温度検出・ＰＩＤ演算機能６９は、温度センサ８２によって測定された測定部ブロック８０における温度を検出し、検出された温度と、温度制御機能６８から指示された設定温度とに基づいて、ＰＩＤ演算を行う機能である。そして、算出された値に関する信号を電流制御回路８３に出力する。
温度検出・ＰＩＤ演算機能６９は、温度センサ８２によって測定された測定部ブロック８０における温度を検出し、検出された温度と、温度制御機能６８から指示された設定温度とに基づいて、ＰＩＤ演算を行う機能である。そして、算出された値に関する信号を電流制御回路８３に出力する。
電流制御回路８３は、温度検出・ＰＩＤ演算機能６９により出力された信号に従って、熱制御電源６０からの熱制御電源電圧に基づく制御電流を加熱ヒータ８１に出力する。そして、加熱ヒータ８１により、測定部ブロック８０の温度が調整される。
測定電圧発生回路９１は、測定電圧を発生させ、この測定電圧をワーク電流測定ヘッドアンプ９２に出力する。ワーク電流測定ヘッドアンプ９２には、電極部３２が接続されている。電極部３２は、電極３２ａ、参照電極３２ｂ、及び対電極３２ｃを備えている（図５参照）。
ワーク電流測定ヘッドアンプ９２は、測定電流をＡ／Ｄ変換回路９３に出力する。Ａ／Ｄ変換回路９３は、測定電流についてＡ／Ｄ変換を行い、測定電流をＬＣＤ表示部５１に表示させる。
このＤＮＡ検出装置３０において、温度制御機能６６、温度検出・ＰＩＤ演算機能６７、電流制御回路７４、加熱／冷却切替回路７５、ペルチェ素子７１、冷却用ファン７２及び温度センサ７３が、特許請求の範囲に記載の温度制御部を構成する。また、ワーク電流測定ヘッドアンプ９２、Ａ／Ｄ変換回路９３及び測定電圧発生回路９１が、特許請求の範囲に記載の電流測定部を構成する。
次に、上述のステップＳ２〜ステップＳ４の各工程について説明する。ここで、ＰＣＲ処理及び測定処理における温度制御及び電極移動についての説明では、図４及び図５を用いる。図４は、ＰＣＲ処理及び測定処理における温度制御の説明図である。なお、ＰＣＲ繰り返し回数は設定変更可能であるが、図４においては、ＰＣＲ繰り返し回数を３回とした場合の温度遷移例を示す。図５は、電極移動の説明図である。
まず、捕獲された微生物からＤＮＡを抽出する工程（ステップＳ２）、及び、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅する工程（ステップＳ３）について説明する。
捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出においては、捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出する。具体的には、まず、捕捉体に結合した状態の微生物を含有する溶液をサンプルチューブ１０１に入れる。ここで、例えば、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズや磁性ナノ粒子を捕捉体として用い、微生物が結合した状態の磁気ビーズや磁性ナノ粒子をサンプルチューブ１０１に投入する。なお、このようなリガンドもしくは抗体をサンプルチューブ１０１の内面に固定化して捕捉体として用いてもよい。この場合、サンプルチューブ１０１の内面に微生物が付着した状態で、サンプルチューブ１０１内の溶液の入れ替えを行う。なお、サンプルチューブ１０１に入れる溶液は、ここでは、後述するサンプル液のように調製する。
捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出においては、捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出する。具体的には、まず、捕捉体に結合した状態の微生物を含有する溶液をサンプルチューブ１０１に入れる。ここで、例えば、微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズや磁性ナノ粒子を捕捉体として用い、微生物が結合した状態の磁気ビーズや磁性ナノ粒子をサンプルチューブ１０１に投入する。なお、このようなリガンドもしくは抗体をサンプルチューブ１０１の内面に固定化して捕捉体として用いてもよい。この場合、サンプルチューブ１０１の内面に微生物が付着した状態で、サンプルチューブ１０１内の溶液の入れ替えを行う。なお、サンプルチューブ１０１に入れる溶液は、ここでは、後述するサンプル液のように調製する。
この捕捉体に結合した状態の微生物を含む溶液（サンプル液）を入れたサンプルチューブ１０１を用いてＤＮＡの熱抽出が行われる。なお、ここでは、捕獲された微生物からの
ＤＮＡの抽出は、ＰＣＲ処理における高温時に、微生物からＤＮＡが抽出されることにより行う。これについては後述する。
ＤＮＡの抽出は、ＰＣＲ処理における高温時に、微生物からＤＮＡが抽出されることにより行う。これについては後述する。
図４に示すように、ＰＣＲにおいては、高温（ＴＨ）、中温（ＴＭ）、低温（ＴＬ）の温度サイクルを繰り返す。この温度サイクルにおける高温（ＴＨ）、中温（ＴＭ）、低温（ＴＬ）のそれぞれにおける温度及び時間は、設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。
具体的には、高温（ＴＨ）は８４〜９９℃、中温（ＴＭ）は６７〜８２℃、低温（ＴＬ）は４５〜６０℃の範囲でそれぞれ設定可能となっている。ＰＣＲ繰り返し時の各温度の維持時間は、高温維持時間（ｔＨ）は２３〜３８秒、中温維持時間（ｔＭ）は２３〜３８秒、低温維持時間（ｔＬ）は１〜１６秒の範囲でそれぞれ設定可能となっている。
また、ＰＣＲ繰り返し回数も設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。ここでは、中温−高温−低温を１回として、１〜４８回の範囲で設定可能であり、３回を１つの単位として繰り返し回数を設定することができる。
ＰＣＲ後において行うハイブリダイゼーションにおける温度及び時間についても、設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。
具体的には、ハイブリッド時について、高温（ＴＨＲ）は８４〜９９℃、中温（ＴＭＲ）は６７〜８２℃の範囲でそれぞれ設定可能となっている。なお、図４においては、ハイブリッド時の中温（ＴＭＲ）として、ＰＣＲサイクルにおける中温（ＴＭ）より高い温度を設定している。ハイブリッド時の各温度の維持時間は、高温維持時間（ｔＨＲ）は０．５〜８．０分、中温維持時間（ｔＭＲ）は０〜１５０秒の範囲でそれぞれ設定可能となっている。
具体的には、ハイブリッド時について、高温（ＴＨＲ）は８４〜９９℃、中温（ＴＭＲ）は６７〜８２℃の範囲でそれぞれ設定可能となっている。なお、図４においては、ハイブリッド時の中温（ＴＭＲ）として、ＰＣＲサイクルにおける中温（ＴＭ）より高い温度を設定している。ハイブリッド時の各温度の維持時間は、高温維持時間（ｔＨＲ）は０．５〜８．０分、中温維持時間（ｔＭＲ）は０〜１５０秒の範囲でそれぞれ設定可能となっている。
さらに測定ステーション３６における測定温度、測定時間、及び測定ワーク電圧についても、設定用ロータリーＳＷ４４を用いて設定される。測定温度は、３０〜４５℃の範囲で設定可能となっている。また、測定時間は、０．５分〜８．０分の範囲で設定可能となっている。また、測定ワーク電圧については、５０〜８００ｍＶの範囲で設定可能となっている。
図４に示すように、電源投入により、ＤＮＡ検出装置３０は、ハイブリッドステーション３５についてウォーミングアップ温度（３０℃）を維持するように作動する。また、ＤＮＡ検出装置３０は、測定ステーション３６について測定設定温度を維持するように作動する。なお、それぞれ、ウォーミングアップ温度及び測定設定温度になるまで（ウォーミングアップ中）は、スタートＳＷ４２のスタートランプを点滅させ、それぞれの温度で安定すると（ウォーミングアップが完了すると）、スタートランプを静止点灯させる。そして、ＤＮＡ検出装置３０は、ＬＣＤ表示部５１に、「サンプルをセットし、スタートＳＷを押して下さい」というメッセージを表示させる。
これにより、利用者は、図５に示すように、捕獲された微生物を含むサンプル液を入れたサンプルチューブ１０１をハイブリッドステーション３５にセットするとともに、判定液を注入した判定液チューブ１０２を測定ステーション３６にセットする。なお、捕獲された微生物は、上述のように、捕捉体に結合した状態となっている。
ここで、サンプル液には、一般的なＰＣＲ処理で用いられる構成成分を含有させる。具体的には、このサンプル液は、２種類のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｍｇ2+、及び、捕獲された微生物を構成成分として含有する。なお、各構成成分の濃度については、一般的な場合に準じるが、反応条件に応じて変更する必要がある。判定液は、例
えばトリス塩酸緩衝液中に、後述する基質を含有する溶液を用いる。
えばトリス塩酸緩衝液中に、後述する基質を含有する溶液を用いる。
そして、利用者は、電極部３２を測定部３１に装着し、測定部３１をステーション３４，３５，３６の上に下ろす。そして、図５のステップ１のように、電極移動用ツマミ３３をスタンバイステーション３４の位置にスライドさせて、スタンバイステーション３４にセットされたサンプルチューブ１０１内に電極部３２を挿入する。
ここで、スタートＳＷ４２を押下すると、ＤＮＡ検出装置３０は、上記の設定温度、設定時間及びＰＣＲ繰り返し回数に従って、温度サイクルの制御を行う。なお、図４に示すように、スタート時は、高温（ＴＨ）まで、温度を上昇させる。そして、設定されたＰＣＲ繰り返し回数に従って、温度サイクルを繰り返す。ここで、最初の高温（ＴＨ）時において、微生物からＤＮＡが抽出されるとともに、２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに解離させられる。
ＰＣＲ繰り返しにおいては、高温（ＴＨ）時の変成ステップ、低温（ＴＬ）時のアニーリングステップ、中温（ＴＭ）時の伸長ステップが繰り返される。変成ステップにおいては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる。アニーリングステップにおいては、解離したＤＮＡに相補的な配列をもつ２種類のプライマーが水素結合によって部分的に２本鎖を形成する。伸長ステップにおいては、ＤＮＡポリメラーゼにより、２種類のプライマーのそれぞれをＤＮＡ合成の開始点として、相補正をもつもう一本のＤＮＡが合成される。
ＰＣＲ繰り返しの最後のサイクルでは、高温維持時間（ｔＨ）を経ずに、ハイブリダイゼーションの処理に移行する。そして、ハイブリッド高温（ＴＨＲ）をハイブリッド高温維持時間（ｔＨＲ）だけ維持する。
そして、ハイブリッド高温維持時間（ｔＨＲ）の終了後、ハイブリッド中温（ＴＭＲ）に制御してハイブリッド中温維持時間（ｔＭＲ）維持するとともに、その間ブザーを鳴動し、電極部３２をハイブリッドステーション３５にスライドさせることを促す表示を行う。具体的には、ＬＣＤ表示部５１には、「電極をハイブリッドステーションに移動し、スタートＳＷを押して下さい」と表示する。また、このとき、スタートランプを点滅させ、この間、ｔＭＲ時間の進行を停止する。
以下、増幅産物であるＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を検出する工程（ステップＳ４）について説明する。
利用者は、指示に従って、図５のステップ２のように、電極部３２をハイブリッドステーション３５に移動し、サンプルチューブ１０１に挿入する。ここで、電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、ＤＮＡ検出装置３０に備えられた供給手段により、サンプルチューブ１０１内に添加されるようになっている。本実施形態では、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、電極３２ａの表面に付着している。このため、電極３２ａを含む電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、サンプルチューブ１０１内に供給される。
利用者は、指示に従って、図５のステップ２のように、電極部３２をハイブリッドステーション３５に移動し、サンプルチューブ１０１に挿入する。ここで、電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、ＤＮＡ検出装置３０に備えられた供給手段により、サンプルチューブ１０１内に添加されるようになっている。本実施形態では、凍結乾燥させた状態の、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、電極３２ａの表面に付着している。このため、電極３２ａを含む電極部３２がサンプルチューブ１０１に挿入されると、酵素２６が標識されたレポータプローブ２８ｃが、サンプルチューブ１０１内に供給される。
電極部３２の電極３２ａは、図７に示すように、導電体であるカーボン電極２１上にメディエータ２２の表面に、ターゲットＤＮＡ２８ｂと相補的にハイブリダイズするキャプチャープローブ２８ａが固定されている。
スタートＳＷ４２が押下されると、ＤＮＡ検出装置３０は、スタートＳＷ４２のスタートランプを静止点灯させ、ｔＭＲ時間の進行を開始する。
そして、このｔＭＲ時間中に、図７に示すように、キャプチャープローブ２８ａ、１本
鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられる。ここで、検出対象のＤＮＡが得られている場合には、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂに相当する。従って、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれている場合に、キャプチャープローブ２８ａ、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられることとなる。
そして、このｔＭＲ時間中に、図７に示すように、キャプチャープローブ２８ａ、１本
鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられる。ここで、検出対象のＤＮＡが得られている場合には、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂに相当する。従って、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれている場合に、キャプチャープローブ２８ａ、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられることとなる。
ｔＭＲ時間完了後、ＤＮＡ検出装置３０は、ハイブリッドステーション３５を測定温度に移行させ、この測定温度に達すると、再度ブザーを鳴動し、電極部３２を測定ステーション３６にスライドさせることを促す表示を行う。具体的には、ＬＣＤ表示部５１には、「電極を測定ステーションに移動し、スタートＳＷを押して下さい」と表示する。また、このとき、スタートＳＷ４２のスタートランプを点滅させ、この間、測定時間の進行を停止する。利用者は、この指示に従って、図５のステップ３のように、電極部３２を測定ステーション３６に移動する。
ここで、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれていた場合には、電極部３２の電極３２ａ上には、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ、レポータプローブ２８ｃが、この順で結合されている。なお、レポータプローブ２８ｃには、酵素２６が結合されている。
そして、スタートＳＷ４２が押下されると、ＤＮＡ検出装置３０は、スタートランプを静止点灯させ、測定時間の進行を開始する。
電流値の測定は、電極部３２の電極３２ａに、参照電極３２ｂを基準として＋５００ｍＶの電位を印加し、電極３２ａに流れる電流を測定することにより行う。
電流値の測定は、電極部３２の電極３２ａに、参照電極３２ｂを基準として＋５００ｍＶの電位を印加し、電極３２ａに流れる電流を測定することにより行う。
ここで、電極部３２の電極３２ａに電位を印加すると、判定液中の基質と酵素が反応し、メディエータを介して電子の授受が行われる。具体的には、図７に示すように、酵素２６が基質２５と反応して酸化体基質２７を生成する際に生じた電子の授受を、メディエータ２２を介してカーボン電極２１に伝達させる。そして、ＤＮＡ検出装置３０は、電極３２ａのカーボン電極２１に流れる電流（限界酸化電流）の電流値を測定する。
なお、電解質溶液のみを用い、酵素反応が起こらない場合であっても、ベースとなる電流が発生するが、酵素反応が起こった場合の酸化還元反応の電子の移動を、このベース電流に比較してより大きな値として測定することができる。
このように、酵素反応に基づく酵素−電極間の電子伝達をモニタする、つまり、一連の電子移動を電流として捕らえることにより、ターゲットＤＮＡの有無又は濃度を検知することができる。このため、ターゲットＤＮＡを捕捉するキャプチャープローブ及びキャプチャーしたターゲットＤＮＡにさらに結合し、信号を得るためのレポータプローブを用いるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイによりＤＮＡの検出を行うことが可能となる。
測定中は、ＤＮＡ検出装置３０は、所定の間隔（例えば、１秒毎）で、テキストファイル形式の測定データをパーソナルコンピュータに送信する。
また、測定中においては、ＬＣＤ表示部５１に、図６に示す測定状態に関する表示画面１２０が表示される。
また、測定中においては、ＬＣＤ表示部５１に、図６に示す測定状態に関する表示画面１２０が表示される。
図６に示すように、表示画面１２０には、測定数値表示欄１２１及び測定結果グラフ表示欄１２２が設けられている。測定数値表示欄１２１には、測定チューブ実温度、測定時間設定（分）、測定ワーク電圧（ｍＶ）、測定残り時間（ｓｅｃ）、測定実データ（ｎＡ）が表示される。測定結果グラフ表示欄１２２には、測定結果がグラフ描画される。この
グラフにおいて、Ｘ軸は測定時間であり、Ｙ軸は測定データ（電流値）である。
グラフにおいて、Ｘ軸は測定時間であり、Ｙ軸は測定データ（電流値）である。
以上、本実施形態によれば、上記（１），（２），（５），（６）の効果に加えて、以下に示す効果を得ることができる。
（７） 上記実施形態では、導電体（カーボン電極２１）の表面にキャプチャープローブ２８ａが結合してなる電極３２ａと、温度制御部と、電極３２ａに流れる電流値を測定する電流測定部とを備えたＤＮＡ検出装置３０を用いて微生物の検出を行うことができる。すなわち、捕捉体に結合した状態の微生物を含むサンプル液の温度を制御して熱抽出法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを含むサンプル液の温度を制御してＰＣＲ法によりターゲットＤＮＡ２８ｂを増幅する。そして、酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃと、酵素２６と反応する基質２５とを用い、増幅産物を含むサンプル液の温度を制御して、キャプチャープローブ２８ａと、レポータプローブ２８ｃとにターゲットＤＮＡ２８ｂを結合させる。そして、レポータプローブ２８ｂに標識された酵素２６と基質２５による反応により電極３２ａに流れる電流値を測定することによりターゲットＤＮＡ２８ｂを検出する。これにより、捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出、ＰＣＲ法による増幅、及びターゲットＤＮＡの検出を、ＤＮＡ検出装置３０を用いて行うことができる。このため、より簡易、簡便かつ高感度にターゲットＤＮＡを検出できる。従って、より簡易、簡便かつ高感度に微生物の検出を行うことができる。
（７） 上記実施形態では、導電体（カーボン電極２１）の表面にキャプチャープローブ２８ａが結合してなる電極３２ａと、温度制御部と、電極３２ａに流れる電流値を測定する電流測定部とを備えたＤＮＡ検出装置３０を用いて微生物の検出を行うことができる。すなわち、捕捉体に結合した状態の微生物を含むサンプル液の温度を制御して熱抽出法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを含むサンプル液の温度を制御してＰＣＲ法によりターゲットＤＮＡ２８ｂを増幅する。そして、酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃと、酵素２６と反応する基質２５とを用い、増幅産物を含むサンプル液の温度を制御して、キャプチャープローブ２８ａと、レポータプローブ２８ｃとにターゲットＤＮＡ２８ｂを結合させる。そして、レポータプローブ２８ｂに標識された酵素２６と基質２５による反応により電極３２ａに流れる電流値を測定することによりターゲットＤＮＡ２８ｂを検出する。これにより、捕獲された微生物からのＤＮＡの抽出、ＰＣＲ法による増幅、及びターゲットＤＮＡの検出を、ＤＮＡ検出装置３０を用いて行うことができる。このため、より簡易、簡便かつ高感度にターゲットＤＮＡを検出できる。従って、より簡易、簡便かつ高感度に微生物の検出を行うことができる。
本発明の微生物検出方法は、医療分野及び食品分野のほか、環境計測用などの幅広い分野で、微生物の検出に利用することができる。
２１…カーボン電極（導電体）、２２…メディエータ、２５…基質、２６…酵素、２７…酸化体基質、２８ａ…キャプチャープローブ、２８ｂ…ターゲットＤＮＡ、２８ｃ…レポータプローブ、３０…ＤＮＡ検出装置、３２…電極部（バイオセンサ）、３２ａ…電極、３２ｂ…参照電極、３２ｃ…対電極。
Claims (6)
- 微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した捕捉体を用いて微生物を捕獲する工程と、前記捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程と、前記抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程と、増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程とを有することを特徴とする微生物検出方法。
- 前記捕捉体は、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁気ビーズ、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を固定化した磁性ナノ粒子、及び、前記微生物の構成成分と結合するリガンドもしくは抗体を内面に固定化した容器のいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
- 前記増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程は、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、酵素標識されたレポータプローブと、前記酵素と反応する基質とを用いて、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記レポータプローブに標識された前記酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
- 前記増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程は、電気泳動法、蛍光発光を利用してターゲットＤＮＡの増幅を検出する方法のいずれか１つにより行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
- 前記捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程は、熱抽出法により、前記捕捉体に結合した状態の微生物からＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の微生物検出方法。
- 導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、温度制御部と、前記電極に流れる電流値を測定する電流測定部とを備えたＤＮＡ検出装置を用い、
前記捕獲した微生物からＤＮＡを抽出する工程は、前記捕捉体に結合した状態の微生物を含むサンプル液の温度を前記温度制御部により制御して熱抽出法によりＤＮＡを抽出し、
前記抽出されたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する工程は、前記抽出されたＤＮＡを含むサンプル液の温度を前記温度制御部により制御してＰＣＲ法によりターゲットＤＮＡを増幅し、
前記増幅産物であるターゲットＤＮＡを検出する工程は、酵素標識されたレポータプローブと、前記酵素と反応する基質とを用い、前記増幅産物を含むサンプル液の温度を前記温度制御部により制御して、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記電流測定部により、前記レポータプローブに標識された前記酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005179795A JP2006345832A (ja) | 2005-06-20 | 2005-06-20 | 微生物検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2005179795A JP2006345832A (ja) | 2005-06-20 | 2005-06-20 | 微生物検出方法 |
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|---|---|
| JP2006345832A true JP2006345832A (ja) | 2006-12-28 |
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ID=37642324
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| JP2005179795A Pending JP2006345832A (ja) | 2005-06-20 | 2005-06-20 | 微生物検出方法 |
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| JP (1) | JP2006345832A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015503729A (ja) * | 2011-12-22 | 2015-02-02 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | 感染性微生物の迅速な検出のための方法及び装置 |
| WO2016148089A1 (ja) * | 2015-03-13 | 2016-09-22 | 静岡県公立大学法人 | 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた検出対象を検出する方法 |
-
2005
- 2005-06-20 JP JP2005179795A patent/JP2006345832A/ja active Pending
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| US9671364B2 (en) | 2011-12-22 | 2017-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Methods and apparatus for rapid detection of infectious microorganisms |
| US9970896B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-05-15 | Becton, Dickinson And Company | Methods and apparatus for rapid detection of infectious microorganisms |
| WO2016148089A1 (ja) * | 2015-03-13 | 2016-09-22 | 静岡県公立大学法人 | 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた検出対象を検出する方法 |
| JP2016168019A (ja) * | 2015-03-13 | 2016-09-23 | 静岡県公立大学法人 | 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた検出対象を検出する方法 |
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