JP5423006B2 - プライマー評価方法、プライマー評価プログラム及びリアルタイムｐｃｒ装置 - Google Patents

Description

本発明はプライマー評価方法、プライマー評価プログラム及びリアルタイムＰＣＲ装置に関し、核酸を増幅する技術分野などにおいて好適なものである。

ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction：ＰＣＲ）法では、増幅対象のＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)、ＤＮＡ合成酵素及び大量のプライマーが混合される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにＤＮＡ合成反応の開始点を供給する役割を担う短い核酸の断片であり、いかなるＤＮＡ合成反応においても必須となる。したがってプライマーの設計は重要である。

プライマーの設計には、候補とすべき複数の配列を合成し、それら配列から所定の条件を満たす最適な配列をスクリーニングするといった手法が提案されている（例えば特許文献１，特許文献２参照）。

特開２００３−２１０１７５公報 特開２００１−２５８５７６公報

ところがかかる設計手法では、所定の条件として塩基長、ＧＣ含量又はＴｍ値が考慮されているが、反応温度の変動による増幅効率の変化については考慮されていない。この要因は、プライマーが機能すべきアニーリングステージでの温度条件が６０[℃]程度とされていることを前提としているからと考えられる。

しかしながら、実際にリアルタイムＰＣＲ装置又はＰＣＲ装置を用いてＤＮＡを増幅させる場合、当該ＰＣＲ装置における経年劣化やＰＣＲ装置外部の温度変化などを要因とする温度条件の相違は存在してしまうものである。また近年では、小型化の要請により持ち運び可能なＰＣＲ装置が本出願人により提案されており、より一段と温度条件の相違が生じる環境下での使用が想定される。

したがって、たとえ上記の設計手法で設計されたプライマーであっても、当該ＰＣＲ装置を実際に用いたときの温度に応じて、ＰＣＲ産物（核酸）の増幅効率が変化してしまう。この温度に起因する核酸の増幅効率の変化は、現在市販されているプライマーであっても同様の結果となる。

温度変化によって核酸の増幅効率が変わるということは、増幅対象の核酸の定量値が変わるということである。したがって、例えば、ある生物における核酸量を所定期間おきにモニタする場合、各定量時期での温度の相違によって核酸の増幅効率が変わるため、定量された核酸量を比較することの価値が低減してしまう。このことは、臨床では特に重要な問題となる。したがって、温度変化にかかわらずある一定値以上の増幅効率を呈するプライマーが求められている。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、一定の温度耐性をもつプライマーを設計させ得るプライマー評価方法、プライマー評価プログラム及びリアルタイムＰＣＲ装置を提案しようとするものである。

課題を解決するために本発明は、プライマー評価方法であって、標的核酸の増幅反応の場とされる複数の容器に与えるべき熱量を、対応する容器に対して設定される温度に応じて個別に制御する制御部に対して、段階ごとに希釈された標的核酸を単位として、アニーリングステージで相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配される容器に設定すべきアニーリングステージでの温度を決定する決定ステップと、段階ごとに希釈された標的核酸の初期量を示す信号を取得する初期量取得ステップと、容器に割り当てられる受光素子から、アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定としてサンプルセットが増幅されたときの増幅量の時間変化を示す信号を取得する増幅量取得ステップと、増幅量の時間変化と初期量とに基づいて、温度条件ごとに増幅効率を求め、タイプ別のプライマーごとに温度条件に対する該増幅効率のばらつき度を算出する算出ステップと、ばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とを提示する提示ステップとを有する。

また本発明は、プライマー評価プログラムであって、コンピュータに対して、標的核酸の増幅反応の場とされる複数の容器に与えるべき熱量を、対応する容器に対して設定される温度に応じて個別に制御する制御部に対して、段階ごとに希釈された標的核酸を単位として、アニーリングステージで相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配される容器に設定すべきアニーリングステージでの温度を決定すること、段階ごとに希釈された標的核酸の初期量を示す信号を取得すること、容器に割り当てられる受光素子から、アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定としてサンプルセットが増幅されたときの増幅量の時間変化を示す信号を取得すること、増幅量の時間変化と初期量とに基づいて、温度条件ごとに増幅効率を求め、タイプ別のプライマーごとに温度条件に対する該増幅効率のばらつき度を算出すること、ばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とを提示することを実行させる。

また本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置であって、核酸の増幅反応の場とされる複数の容器に割り当てられる熱源素子と、熱源素子での熱量を、対応する容器に対して設定される温度に応じて個別に制御する制御手段と、段階ごとに希釈された標的核酸を単位として、相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配される容器に設定すべきアニーリングステージでの温度を決定する決定手段と、段階ごとに希釈された標的核酸の初期量を示す信号を取得する初期量取得手段と、容器に割り当てられる複数の受光素子から、アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定としてサンプルセットが増幅されたときの増幅量を示す信号を取得する増幅量取得手段と、増幅量の時間変化と初期量とに基づいて温度条件ごとに増幅効率を求め、タイプ別のプライマーごとに温度条件に対する該増幅効率のばらつき度を算出する算出手段と、ばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とを提示する提示手段とを有する。

本発明は、アニーリングステージで相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットを、該アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として増幅されたときの増幅効率のばらつき度を求めるため、プライマーに対する温度依存性を検出することができる。また、このばらつき度を、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とともに提示するため、一定の温度耐性をもつプライマーを設計させることが可能となる。

リアルタイムＰＣＲ装置の構成を概略的に示す図である。 キャリブレーション期間を示す図である。 増幅曲線を得るための標準サンプルの配置例を概略的に示す図である。 プライマー評価指標提示部の構成を概略的に示す図である。 実験結果（１）を示すグラフである。 実験結果（２）を示すグラフである。 実験結果（３）を示すグラフである。 実験結果（４）を示すグラフである。 実験結果（５）を示すグラフである。 増幅効率のばらつき度を示すグラフである。 プライマー評価指標提示処理手順を示すフローチャートである。 他の実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置の構成を概略的に示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下に示す順序とする。
＜１．実施の形態＞
［１−１．リアルタイムＰＣＲ装置の構成］
［１−２．プライマー評価指標提示部の構成］
［１−３．プライマー評価指標提示処理手順］
［１−４．効果等］
＜２．他の実施の形態＞

＜１．実施の形態＞
［１−１．リアルタイムＰＣＲ装置の構成］
図１において、リアルタイムＰＣＲ装置１の概略的な構成を示す。このリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室ＲＭに対して、複数の基板１１〜１６を所定間隔で層状に配置した構造を有する。

反応基板１１は、基準層となる基板であり、該基板には、核酸の増幅反応の場とされる容器（以下、これをウェルとも呼ぶ）ＵＬが高密度に形成される。これらウェルＵＬには、増幅対象の標的核酸及びその標的核酸の増幅に要する各種物質（プライマー、緩衝液、酵素、ｄＮＴＰ、蛍光色素等）が与えられる。

例えば６［ｃｍ］四方の反応基板１１を用いた場合、１［μＬ］以下の容量でなる４万個程度のウェルＵＬを形成することが可能となる。したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室ＲＭを小型化した場合であっても、同種又は異種でなる多くの標的核酸を取り扱うことが可能となる。

発熱基板１２は、反応基板１１に対して下側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１１と対向する面には、ウェルＵＬごとに熱源素子ＨＤが割り当てられ、これら熱源素子ＨＤの周囲には複数の感温素子ＴＤが配される。この熱源素子ＨＤには例えばＴＦＴ(Thin Film Transistor)等が用いられ、感温素子ＴＤには例えばピンダイオード等が用いられる。

発熱基板１２の熱源素子ＨＤ及び感温素子ＴＤには温度制御部２０が接続される。温度制御部２０は、各熱源素子ＨＤでの熱量を、当該熱源素子ＨＤを囲む感温素子ＴＤを用いて所定間隔ごとにセンシングした温度に応じて個別に制御する。

具体的に温度制御部２０は、増幅ステージ（変性ステージ、アニーリングステージ、伸長ステージ）ごとにウェルＵＬ単位で目標温度を設定する。そして温度制御部２０は、目標温度に応じた値の電流又は電圧を、対応するウェルＵＬの熱源素子ＨＤに与えて、各ウェルＵＬを加熱させるようになされている。

また温度制御部２０は、感温素子ＴＤを用いて所定間隔ごとにセンシングするたびに、該感温素子ＴＤにおいてセンシングされる温度と、目標温度との差を求め、該差に応じて、熱源素子ＨＤに与えるべき電流又は電圧をウェルＵＬ単位で可変するようになされている。

これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、増幅に要する温度条件が異なる場合であっても、高密度に配される各ウェルＵＬの温度を、各増幅ステージ単位で高精度に調整することができる。したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、温度に起因する増幅反応結果の誤り率を低減して検出精度を向上し得るようになされている。

発熱補助基板１３は、発熱基板１２に対して下側の層として配される基板である。この発熱補助基板１３は、反応室ＲＭ全体における熱を吸収又は発散することで、該反応室ＲＭを、規定された温度に維持する。

したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、現ステージで設定される温度から次ステージで設定すべき温度にウェルＵＬの温度を移行させるまでの時間（温度勾配の時間）を高速化できるようになされている。ちなみに、発熱補助基板１３には例えばペルチェ素子等が用いられる。

発光基板１４は、反応基板１１に対して上側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１１と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、インターカレータ等の蛍光物に対する励起光を照射する光源素子ＬＳが配される。この光源素子ＬＳには例えばＬＥＤ(Light Emitting Diode)が用いられる。

励起光透過基板１５は、反応基板１１と発光基板１４との中間層として配される基板であり、光源素子ＬＳから照射される励起光を透過し、該励起光以外の光を反射する。この励起光透過基板１５には例えばダイクロイックミラーが用いられる。

この励起光透過基板１５のうち発光基板１４と対向する面には、該発光基板１４の各光源素子ＬＳの光軸に対応する位置を基準とする周囲に対して、当該光源素子ＬＳから照射される励起光の散乱光を受光する受光素子ＬＤＢが配される。

発光基板１４の光源素子ＬＳ及び励起光透過基板１５の受光素子ＬＤＢには光量制御部３０が接続される。このリアルタイムＰＣＲ装置１では、１回の増幅サイクルが終了した時点で直ちに次の増幅サイクルを開始するのではなく、図２に示すように、各回の増幅サイクルの終了時点から、光源素子ＬＳの光量を調整するキャリブレーション期間ＣＦが設けられている。光量制御部３０は、このキャリブレーション期間ＣＦごとに、各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量が一定となるよう、各ウェルＵＬに対応する光源素子ＬＳの光量を個別に制御するようになされている。

これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、各光源素子ＬＳにおける製造上のばらつきのみならず、当該光源素子ＬＳの経時的変動があっても、各ウェルＵＬに到達される励起光量を一定とすることができる。したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、励起光によって励起される蛍光量を、各ウェルＵＬでの核酸量自体を反映したものとして検出精度を向上し得るようになされている。

蛍光透過基板１６は、発熱基板１２と発熱補助基板１３との中間層として配される基板であり、励起光によって励起される蛍光物の蛍光を透過し、該蛍光以外の光を反射する。また発熱補助基板１３と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、当該ウェルで励起される蛍光を受光する受光素子ＬＤＡが配される。

この受光素子ＬＤＡには核酸量演算部４０が接続される。核酸量演算部４０は、各受光素子ＬＤＡで受光される蛍光量に応じた標的核酸の核酸量を、ステージ単位で算出するようになされている。また核酸量演算部４０は、現在と前回のキャリブレーション期間で得られた散乱光量を取得し、これら散乱光量に差がある場合、その差を有する散乱光量を照射する光源素子ＬＳに対応付けられるウェルＵＬでの核酸量を、該差に応じて調整する。これにより核酸量演算部４０は、光源素子ＬＳに経時的変動があったとしても標的核酸量を、励起光量を基準として均一化できるようになされている。

かかる構成に加えて、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、アニーリングステージで与えるべき温度が異なる場合の蛍光量の推移（増幅曲線）に基づいて、プライマーを評価すべき指標を提示するプライマー評価指標提示部５０が設けられている。

プライマー評価指標提示部５０に対してプライマーの評価指標を取得させる場合、図３に便宜的に示すように、標準とすべき標的核酸を段階ごとに希釈した標準サンプルの組（以下、これをサンプルセットとも呼ぶ）Ｓｔが、相違させるべき温度条件の数だけ、各ウェルＵＬに用意される。ちなみに、これらウェルＵＬには、評価対象のプライマーなど、増幅に要する各種物質が与えられる。

このリアルタイムＰＣＲ装置１は各ウェルＵＬの温度を個別に調整できるため、アニーリングステージで与えるべき温度をサンプルセットＳｔごとに相違させることができる。したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、プライマー評価指標提示部５０に対して、アニーリングステージで与えるべき温度が異なる場合の蛍光量の推移（増幅曲線）を、１つの反応基板１１で同時に取得させることができるようになされている。

［１−２．プライマー評価指標提示部の構成］
次に、プライマー評価指標提示部５０について説明する。図４において、プライマー評価指標提示部５０の概略的な構成を示す。このプライマー評価指標提示部５０は、該プライマー評価指標提示部５０全体の制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)５１に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。

具体的には、ＲＯＭ(Read Only Memory)５２、ＣＰＵ５１のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)５３、操作部５４、記憶部５５及び表示部５６が接続される。このＲＯＭ５２には、プライマーの評価指標データを生成するためのプログラム（以下、これをプライマー評価指標提示プログラムとも呼ぶ）が格納される。

ＣＰＵ５１は、ＲＯＭ５２に格納されたプライマー評価指標提示プログラムをＲＡＭ５３に展開した場合、該プライマー評価指標提示プログラムにしたがって増幅制御部５１Ａ、増幅効率算出部５１Ｂ及び評価値演算部５１Ｃとして機能する。

増幅制御部５１Ａは、変性ステージ，伸長ステージでの目標温度として各サンプルセットＳｔそれぞれに同一の温度を決定するとともに、アニーリングステージでの目標温度としてサンプルセットＳｔごとに異なる温度を決定する。

目標温度の決定手法としては、例えば、プライマー評価指標提示プログラムに規定されたなかから選択させて決定する手法、あるいは、操作部５４から入力させて決定する手法などが採用される。

また増幅制御部５１Ａは、例えばサンプルセットＳｔにおける各標準サンプルの初期の核酸量（濃度）の入力画面を表示部５６に表示し、当該初期の核酸量を操作部５４から取得する。

増幅制御部５１Ａは、サンプルセットＳｔに対する各増幅ステージでの目標温度を決定した場合、当該決定した目標温度を設定するよう温度制御部２０に通知する。そして増幅制御部５１Ａは、温度制御部２０及び光量制御部３０を駆動させて増幅サイクルにしたがって増幅処理を開始させるようになされている。

増幅効率算出部５１Ｂには、増幅制御部５１Ａの増幅処理の開始により、サンプルセットＳｔにおける各標準サンプルが配されるウェルＵＬに対応する受光素子ＬＤＡ（図１）から、増幅量（蛍光量）を示す信号が与えられる。

増幅効率算出部５１Ｂは、受光素子ＬＤＡから与えられる増幅量（蛍光量）と、増幅制御部５１Ａでカウントされる増幅サイクル数とに基づいて、一定の蛍光強度に達する増幅サイクル数を検出する。

そして増幅効率算出部５１Ｂは、サンプルセットＳｔごとに、標準サンプルの増幅効率を算出するようになされている。具体的には、増幅制御部５１Ａが取得したサンプルセットＳｔにおける各標準サンプルの初期の核酸量を横軸とし、一定の蛍光強度に達する増幅サイクル数を縦軸とする検量線の傾きから増幅効率が算出される。

この検量線の傾きと増幅効率との関係について簡単に説明する。一般に、ＰＣＲ法では鋳型ＤＮＡは１サイクルで２倍に増幅すると理論的に考えられており、初期の鋳型ＤＮＡ量を[ＤＮＡ]_０とし、増幅効率をｅとし、増幅サイクル数をＣとすると、次式

と表される。この（１）式において、増幅効率ｅ＝１のときに括弧のなかが「２」となるので、鋳型ＤＮＡは１サイクルで２倍に増幅することになる。

ところで、（１）式の両辺の対数をとると、次式

となり、一定の蛍光強度に達するサイクルをＣｔとすると、

と表される。サイクルＣｔはｌｏｇ[ＤＮＡ]_０の関数として表現され、検量線の傾きは−１／ｌｏｇ（１＋ｅ）である。仮に、増幅効率が１００[％]（ｅ＝１）である場合、検量線の傾きは−３．３２となり、増幅効率が８５[％]（ｅ＝０．８５）である場合、−３．７４となる。つまり、検量線の傾きと増幅効率とは、検量線の傾きが大きいほど増幅効率が悪いという関係にある。書き換えると、増幅効率ｅは、次式

と表すことができる。

ここで、実験結果として、アデノウイルスのタイプ別に、アニーリングステージで与えるべき温度が異なる場合の増幅効率を図５〜図９に示す。この実験では、プライマーはタイプ別にそれぞれ設計した。また、図５〜図９に示すとおり、サンプルセットＳｔに対するアニーリングステージでの目標温度は、５５．０[℃]，５５．９[℃]，５６．７[℃]，５７．８[℃]，５９．３[℃]，６１．０[℃]，６２．４[℃]，６３．５[℃]，６４．２[℃]，６５．０[℃]とした。なお、プライマー及びアニーリングステージでの目標温度以外の条件は同一である。

図５〜図９をみると、例えばタイプ３に対するプライマーは、温度変化にかかわらず同等の増幅効率を呈し、例えばタイプ７に対するプライマーは、温度変化に応じて変動する増幅効率を呈していることが分かる。

評価値演算部５１Ｃは、各サンプルセットＳｔに対する増幅効率のばらつき度を、プライマーを評価するための指標として算出する。このばらつき度は、具体的には例えば標準偏差、分散又は平均偏差などが用いられる。

ここで、図５〜図９においてタイプ別に示した各温度の増幅効率のばらつき度を、図１０に示す。この図１０から明らかなように、タイプ３に対するプライマーは、温度依存性が最も低く、良好なプライマーであると評価できる。一方、タイプ７に対するプライマーは、温度依存性が最も高く、不良なプライマーであると評価できる。

評価値演算部５１Ｃは、各サンプルセットＳｔに対する増幅効率のばらつき度を算出した場合、ばらつき度に対するプライマーの良悪評価の基準値（以下、これをばらつき閾値とも呼ぶ）と比較する。そして評価値演算部５１Ｃは、算出対象のばらつき度がばらつき閾値以下となる場合、良好なプライマーであることと、算出対象のばらつき度及びばらつき閾値とを、画像表示又は音声により通知する。

これに対して評価値演算部５１Ｃは、算出対象のばらつき度がばらつき閾値よりも大きい場合、不良なプライマーであることと、算出対象のばらつき度及びばらつき閾値とを、画像表示又は音声により通知するようになされている。

なお、画像表示の態様としては、例えば、ばらつき度を棒状に示すグラフを、該グラフに対してばらつき閾値を示すラインを付すといった態様が採用される。ちなみに、ばらつき度を棒状に示すグラフとともに、相違させた温度と増幅効率との関係を示すグラフを表示させることもできる。

この実施の形態における評価値演算部５１Ｃは、ばらつき閾値を、評価対象のプライマーを用いた増殖反応結果の使用用途に応じて切り換えるようになされている。

具体的には、例えば、全般な用途に適用すべき第１のばらつき閾値と、該第１のばらつき閾値よりも小さい値として、薬理実験での比較用途に適用すべき第２のばらつき閾値と、臨床での診断用途に適用すべき第３のばらつき閾値とが設定され、これらをユーザに選択させる。

これにより評価値演算部５１Ｃは、ユーザに対して、与えられる設計時間を考慮しながらも、プライマー設計の重要度（つまり増殖反応結果に対する使用用途）に応じて、一定の温度耐性をもつプライマーを設計させることが可能となる。

［１−３．プライマー評価指標提示処理手順］
次に、プライマー評価指標提示処理手順について、図１１に示すフローチャートを用いて説明する。

すなわちＣＰＵ５１は、例えばプライマーの評価指標を提示すべき命令が操作部５４から与えられた場合、このプライマー評価指標提示処理手順を開始して第１ステップＳＰ１に移行する。ＣＰＵ５１は、この第１ステップＳＰ１では、サンプルセットＳｔごとに、当該サンプルセットに対するアニーリングステージでの目標温度を決定し、第２ステップＳＰ２に移行する。

ＣＰＵ５１は、この第２ステップＳＰ２では、サンプルセットＳｔにおける各標準サンプルの初期量（濃度）を取得し、第３ステップＳＰ３に移行する。ＣＰＵ５１は、この第３ステップＳＰ３では、第１ステップＳＰ１で決定した目標温度の条件で、各サンプルセットＳｔに対する増幅処理を開始させ、第４ステップＳＰ４に移行する。

ＣＰＵ５１は、この第４ステップＳＰ４では、サンプルセットＳｔごとに増幅効率を算出し、第５ステップＳＰ５に移行する。ＣＰＵ５１は、この第５ステップＳＰ５では、各サンプルセットＳｔに対する増幅効率のばらつき度を算出し、第６ステップＳＰ６に移行する。

ＣＰＵ５１は、この第６ステップＳＰ６では、ばらつき閾値を選択させ、選択されたばらつき閾値を設定し、第７ステップＳＰ７に移行する。ＣＰＵ５１は、この第７ステップＳＰ７では、ステップＳＰ５で算出したばらつき度と、ステップＳＰ６で設定したばらつき閾値とに基づいてプライマーを評価し、第８ステップＳＰ８に移行する。

ＣＰＵ５１は、この第８ステップＳＰ８では、プライマーの評価結果と、算出対象のばらつき度及びばらつき閾値とを、画像表示又は音声により通知し、当該通知後、このプライマー評価指標提示処理手順を終了する。

このようにしてＣＰＵ５１は、プライマー評価指標提示プログラムにしたがって、プライマー評価指標提示処理を実行するようになされている。

［１−４．効果等］
以上の構成において、リアルタイムＰＣＲ装置１は、相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットＳｔごとに（図３参照）、アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として増幅されたときの増幅量の時間変化を示す信号を取得する。

またリアルタイムＰＣＲ装置１は、サンプルセットＳｔを構成する、段階ごとに希釈された標準サンプルの初期量（濃度）を取得し、該初期量と増幅量の時間変化に基づいて、温度条件ごとに増幅効率を求める（図５乃至図９参照）。

そしてリアルタイムＰＣＲ装置１は、温度条件ごとに求めた増幅効率のばらつき度を算出し（図１０参照）、算出したばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値（ばらつき閾値）とを提示する。

このリアルタイムＰＣＲ装置１は、アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として増幅されたときの増幅効率のばらつき度を求めるため、プライマーに対する温度依存性を検出することができる。これに加えてリアルタイムＰＣＲ装置１は、このばらつき度を、ばらつき閾値とともに提示するため、一定の温度耐性をもつプライマーを設計させることが可能となる。

ところでこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、複数のウェルＵＬに与えるべき熱量を、当該ウェルＵＬに対して設定される温度に応じて個別に制御する温度制御部２０（図１）を有する。リアルタイムＰＣＲ装置１は、この温度制御部２０に対して、サンプルセットＳｔごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配されるウェルＵＬに設定すべきアニーリングステージでの温度を決定する。

そしてリアルタイムＰＣＲ装置１は、対応するウェルＵＬに割り当てられる受光素子ＬＤＡ（図１）から、アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として増幅されたときの増幅量の時間変化を示す信号を取得するようになされている。

したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、アニーリングステージで与えるべき温度条件が異なる場合の増幅量の時間変化（増幅曲線）を、１つの反応基板１１で同時に取得させることができる。この結果、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、増幅効率のばらつき度を算出する効率を格段に向上することができる。

さらにこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、ばらつき閾値を、評価対象のプライマーを用いた増殖反応結果の使用用途に応じて切り換える。

したがってリアルタイムＰＣＲ装置１は、例えば、全般な用途、薬理実験での比較用途、臨床での診断用途など、プライマー設計の重要度（つまり増殖反応結果に対する使用用途）に応じて、ばらつき閾値を厳しくあるいはゆるく設定することができる。この結果、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、ユーザに対して、与えられる設計時間を考慮しながらも、プライマー設計の重要度に応じて、一定の温度耐性をもつプライマーを設計させることが可能となる。

以上の構成によれば、増殖サイクルのうちアニーリングステージでの温度条件を異ならせた場合の増幅効率のばらつき度を、ばらつき閾値とともに提示するようにしたことにより、一定の温度耐性をもつプライマーを設計させ得るリアルタイムＰＣＲ装置１が実現できる。

＜２．他の実施の形態＞
上述の実施の形態では、変性ステージ，伸長ステージでの目標温度はプログラムに規定されたなかから選択させて決定する又は操作部５４から入力させて決定されたが、予め規定した固定値であってもよい。

また上述の実施の形態では、増殖サイクルのうちアニーリングステージでの温度条件を異ならせた場合の増幅量の時間変化を示す信号を取得する取得態様として、同一の反応基板１１を用いて取得する態様が適用された。しかしながら取得態様はこの実施の形態に限定されるものではない。

例えば、温度条件ごとに別々の反応基板１１を用いて取得する態様が適用されてもよい。また例えば、増殖サイクルのうちアニーリングステージでの温度条件を異ならせた場合の増幅量の時間変化を示す信号が格納されるデータ格納媒体から取得する態様が適用されてもよい。

なお、データ格納媒体としては、例えばフレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ（Compact Disk-Read Only Memory）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc）等のパッケージメディアや、データが一時的若しくは永続的に格納される半導体メモリや磁気ディスク等がある。これらデータ格納媒体からデータを取得する方法としては、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体を利用することも可能である。

また上述の実施の形態では、リアルタイムＰＣＲ装置１として、いわゆる透過型のものが適用された。しかしながら、これに代えて、例えば、図１との対応部分に同一符号を付した図１２に示すように、いわゆる反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用するようにしてもよい。

このリアルタイムＰＣＲ装置１００における反応基板１１１には、側壁の底面がＲ状に形成された複数のウェルＵＬが形成され、これらウェルＵＬに対応させて受光素子ＬＤＡが一面に配される。各光源ＬＳから照射される励起光は、励起光透過基板１５を介して反応基板１１１に形成される対応するウェルＵＬに導光される。各ウェルＵＬでは、励起光によって励起される蛍光物の蛍光はウェルＵＬの壁面で反射し、反応基板１１１の一面に形成された受光素子ＬＤＡに入射する。

このような反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用した場合であっても、上述の実施の形態と同様の効果を得ることができる。

本発明は、遺伝子実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用することができる。

１……リアルタイムＰＣＲ装置、１１……反応基板、１２……発熱基板、１３……発熱補助基板、１４……発光基板、１５……励起光透過基板、１６……蛍光透過基板、２０……温度制御部、３０……光量制御部、４０……核酸量演算部、５０……プライマー評価指標提示部、５１Ａ……増幅制御部、５１Ｂ……増幅効率算出部、５１Ｃ……評価値演算部、５２……ＲＯＭ、５３……ＲＡＭ、５４……操作部、５５……記憶部、５６……表示部、ＵＬ……ウェル、Ｓｔ……サンプルセット。

Claims (5)

1. 標的核酸の増幅反応の場とされる複数の容器に与えるべき熱量を、対応する容器に対して設定される温度に応じて個別に制御する制御部に対して、段階ごとに希釈された標的核酸を単位として、アニーリングステージで相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配される容器に設定すべきアニーリングステージでの温度を決定する決定ステップと、
   上記段階ごとに希釈された標的核酸の初期量を示す信号を取得する初期量取得ステップと、
   上記容器に割り当てられる受光素子から、上記アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として上記サンプルセットが増幅されたときの増幅量の時間変化を示す信号を取得する増幅量取得ステップと、
   上記増幅量の時間変化と上記初期量とに基づいて、上記温度条件ごとに増幅効率を求め、タイプ別のプライマーごとに温度条件に対する該増幅効率のばらつき度を算出する算出ステップと、
   上記ばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とを提示する提示ステップと
   を有するプライマー評価方法。
2. 上記基準値を、評価対象のプライマーを用いた増殖反応結果の使用用途に応じて切り換える切換ステップ
   をさらに有する、請求項１に記載のプライマー評価方法。
3. 上記提示ステップは、
   上記算出ステップで算出されたばらつき度と、上記基準値とを比較し、ばらつき度が基準値以下である場合には増殖に用いられたプライマーが良好であること、ばらつき度が基準値よりも大きい場合には当該増殖に用いられたプライマーが不良であることも提示する、請求項２に記載のプライマー評価方法。
4. コンピュータに対して、
   標的核酸の増幅反応の場とされる複数の容器に与えるべき熱量を、対応する容器に対して設定される温度に応じて個別に制御する制御部に対して、段階ごとに希釈された標的核酸を単位として、アニーリングステージで相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配される容器に設定すべきアニーリングステージでの温度を決定すること、
   上記段階ごとに希釈された標的核酸の初期量を示す信号を取得すること、
   上記容器に割り当てられる受光素子から、上記アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として上記サンプルセットが増幅されたときの増幅量の時間変化を示す信号を取得すること、
   上記増幅量の時間変化と上記初期量とに基づいて、上記温度条件ごとに増幅効率を求め、タイプ別のプライマーごとに温度条件に対する該増幅効率のばらつき度を算出すること、
   上記ばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とを提示すること
   を実行させるプライマー評価プログラム。
5. 基板に対して核酸の増幅反応の場として形成される複数の容器に割り当てられる熱源素子と、
   上記熱源素子での熱量を、対応する容器に対して設定される温度に応じて個別に制御する制御手段と、
   段階ごとに希釈された標的核酸を単位として、相違させるべき温度条件の数だけ用意されるサンプルセットごとに、当該サンプルセットにおける標的核酸が配される容器に設定すべきアニーリングステージでの温度を決定する決定手段と、
   上記段階ごとに希釈された標的核酸の初期量を示す信号を取得する初期量取得手段と、
   上記容器に割り当てられる複数の受光素子から、上記アニーリングステージ以外のステージでの温度条件を固定として上記サンプルセットが増幅されたときの増幅量を示す信号を取得する増幅量取得手段と、
   上記増幅量の時間変化と上記初期量とに基づいて、上記温度条件ごとに増幅効率を求め、タイプ別のプライマーごとに温度条件に対する該増幅効率のばらつき度を算出する算出手段と、
   上記ばらつき度と、該ばらつき度に対して設定される、プライマーの良悪評価の基準値とを提示する提示手段と
   を有するリアルタイムＰＣＲ装置。

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