KR102380264B1 - 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능의 평가에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 방법은 핵산 중합효소를 포함하는 구성요소의 성능을 평가하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 타겟 핵산 서열의 검출에서 내부 대조군으로 사용될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2017년 8월 31일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제2017-0111441호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소, 특히 증폭 반응과 관련된 구성요소의 성능의 평가에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 검출 방법이 널리 사용되고 있다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 이용하는 방법의 예로서, 헤어핀 구조를 갖는 이중 표지된 프로브를 이용한 Molecular beacon 방법(Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), HyBeacon 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여체 및 수용체로 각각 표지된 2개의 프로브를 이용한 혼성화 프로브 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Lux 방법(미국 특허 제7,537,886호)이 있다. 또한, 이중 표지된 프로브와 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
대안적인 방법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재시 형성되는 이합체를 이용한 실시간 검출 방법이 제안되어왔다: Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO cleavage AND extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법 (WO 2013/115442), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818).
타겟 핵산 서열의 증폭 및 검출에 관여하는 많은 구성요소(amplification reaction-related element)가 존재한다. 구성요소의 예는, 비제한적으로, 프라이머, 프로브, 표지, 핵산 중합효소, 완충액, dNTP, 염, 및 첨가제(예컨대, BSA, DMSO, 베타인, 및 비-이온성 계면활성제)와 같은 화학적 구성요소; 증폭 용기(예컨대, 튜브), 열순환기 및 검출기와 같은 물리적 구성요소; 및 관심 핵산 서열의 검출을 위해 준비된 샘플(특히 샘플에 포함된 구성요소)과 같은 다른 구성요소를 포함한다.
이러한 구성요소의 성능은 타겟 핵산 서열의 증폭 및 검출에 상당한 영향을 미친다.
일 예로서, 프라이머의 연장에 관여하는 핵산 중합효소의 성능은 검출하고자 하는 타겟 핵산 서열의 증폭에 직접적인 영향을 미친다. 성능이 우수한 핵산 중합효소는 짧은 PCR 사이클만으로도 검출가능한 수준의 증폭 산물을 생성시킬 수 있는 반면, 성능이 열악한 핵산 중합효소는 긴 사이클에도 불구하고 검출가능한 수준의 증폭 산물을 생성하지 못할 수 있다.
다른 예로서, 타겟 핵산 서열로부터의 시그널을 검출하는데 관여하는 증폭 장치(특히, 검출기)의 성능은 타겟 시그널의 분석에 영향을 미친다. 성능이 우수한 증폭 장치는 발생한 시그널 강도 모두를 검출할 수 있는 반면, 성능이 열악한 증폭 장치는 발생한 시그널 강도 중 일부만을 검출할 수 있다.
구성요소의 성능은 제조 중 성능의 편차 및 제품 보관 중 성능의 열화와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 부적절한 보관 조건 및 긴 보관 기간으로 인한 핵산 중합효소의 중합 활성의 감소는 타겟 핵산 서열의 충분치 않은 증폭을 유발하여, 샘플 내에 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우에도 위음성 결과를 초래할 수 있다. 또한, 핵산 중합효소의 활성의 편차는 동일한 샘플의 분석에서 상이한 결과를 야기할 수 있다. 이것은 증폭 장치와 같은 다른 구성요소에서 동일하게 문제될 수 있다.
따라서, 보다 정확하고 일관된 결과를 얻기 위해서는, 구성요소의 성능을 정확하게 평가하고 상기 평가에 기초하여 동일 또는 유사한 성능을 갖는 구성요소를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
일반적으로 구성요소의 성능 평가는 표준 균주로부터의 주형 DNA 및 상기 주형 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 표지된 프로브를 사용한 실시간 PCR 방법에 의해 수행되어 왔다. 하지만, 이러한 방법은 (i) 반응 조건 및 사용되는 프라이머 및 프로브의 서열의 최적화 어려움; (ii) 사용되는 구성요소들 간의 비특이적 간섭(interference)의 가능성; (iii) 반응의 낮은 민감성과 같은, 실제 구성요소의 성능을 정확하게 결정하는데 심각한 단점이 있다.
따라서, 이러한 단점을 해결하기 위한 구성요소의 성능을 평가하는 새로운 방법의 개발이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 증폭 반응에 사용되는 다양한 구성요소(예컨대, 증폭 조성물 내의 구성요소 또는 증폭 장치 내의 구성요소)의 성능을 평가하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 종래의 성능 평가에서 문제가 되는 구성요소들 간의 비특이적 간섭 및 낮은 민감도를 개선하고자 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 주형 없이 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 증폭 반응에 의해 구성요소의 성능을 보다 정확하고 민감하게 평가할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다이머-형성 프라이머(dimer-forming primer) 쌍을 이용한 증폭 반응에 의해 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소의 성능(performance)을 평가하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소의 성능을 평가하기 위한 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
I.
다이머
-형성
프라이머
쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가 방법
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 다이머-형성 프라이머(dimer-forming primer) 쌍을 이용한 증폭 반응에 의해 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소의 성능(performance)을 평가하는 방법을 제공한다:
(a) 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하는 증폭 조성물을 제공하는 단계; 상기 다이머-형성 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하며; 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 3'-다이머 형성 부위를 포함하고, 상기 제1 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이며;
(b) 증폭 장치에서 상기 증폭 조성물을 사용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 증폭 조건 하에 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 각각 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성하며; 상기 연장 이합체에 의존적인 방식으로 검출가능한 시그널이 제공되고;
(c) 증폭 반응 동안 또는 후에 상기 검출가능한 시그널을 검출하는 단계;
(d) 상기 검출된 시그널로부터 증폭을 나타내는 지표(indicator)를 수득하는 단계; 및
(e) 상기 수득된 지표에 기초하여 구성요소의 성능을 평가하는 단계.
본 발명자들은 증폭 반응에 사용되는 다양한 구성요소(예컨대, 증폭 조성물 내의 구성요소 또는 증폭 장치 내의 구성요소)의 성능을 평가하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 종래의 성능 평가에서 문제가 되는 구성요소들 간의 비특이적 간섭 및 낮은 민감도를 개선하고자 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 주형 없이 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 증폭 반응에 의해 구성요소의 성능을 보다 정확하고 민감하게 평가할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 구성요소의 성능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 구성요소는 증폭 반응에 사용되는 것이다. 상기 구성요소는 핵산 서열의 증폭 반응에 사용되는 것이다. 상기 구성요소는 핵산 서열의 실시간 증폭 반응에 사용되는 것이다.
상기 평가될 구성요소는 증폭 조성물 내의 구성요소 및 증폭 장치 내의 구성요소로부터 선택될 수 있다. 상기 평가될 구성요소는 본 발명의 사용자에 의해 선택될 수 있다. 상기 평가될 구성요소는 본 발명의 방법을 실시하기 전에 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 평가될 구성요소는 핵산 중합효소이다.
또 다른 구현예에서, 상기 평가될 구성요소는 표지이다.
또 다른 구현예에서, 상기 평가될 구성요소는 샘플이다.
또 다른 구현예에서, 상기 평가될 구성요소는 증폭 용기이다.
또 다른 구현예에서, 상기 평가될 구성요소는 열순환기 및/또는 검출기이다.
본 발명의 방법에서 평가되는 구성요소는 하기 명세서에서 상세히 설명된다.
본 발명의 일 구현예(100)가 도 1에 예시되어 있다. 본 발명은 하기와 같이 도 1을 참조하여 보다 상세히 설명될 것이다:
단계 (a): 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하는 증폭 조성물의 제공( 110 )
먼저, 단계 (b)의 증폭 반응을 수행하기 위한 증폭 조성물을 준비한다(110). 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 증폭 조성물은 다이머-형성 프라이머 쌍(dimer-forming primer pair)을 포함한다.
본 발명의 방법의 핵심적인 특징은 독특한 구조를 갖는 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "프라이머"는 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 특히, 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에 사용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 통상적인 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본원에서 사용되는 용어 "다이머-형성 프라이머"는 특정 조건 하에서 주형이 아닌 또 다른 다이머-형성 프라이머와 부분적으로 혼성화되어 핵산 중합효소의 존재 하에 연장될 수 있는 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "다이머-형성 프라이머 쌍"은 서로 부분적으로 혼성화되어 각각 핵산 중합효소의 중합 활성에 의해 연장될 수 있는 2개의 프라이머의 쌍, 예컨대 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 지칭한다.
다이머-형성 프라이머의 문맥에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위에 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위가 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 5'-템플레이팅 부위 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
통상적인 프라이머는 핵산 가닥(주형)을 증폭하기 위하여 핵산 가닥에 혼성화되는데 반해, 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머는 상응하는 또 다른 다이머-형성 프라이머를 증폭하기 위하여 이에 혼성화된다.
프라이머 다이머(primer dimer)는 당업자에게 널리 알려져 있다. 프라이머 다이머는 PCR과 같은 핵산 증폭 반응에서의 잠재적인 부산물(by-product)이다. 프라이머 다이머는 증폭 반응에서 타겟 핵산 서열의 증폭을 억제하여 정확한 분석을 방해할 수 있다. 종래의 기술들은 이러한 프라이머 다이머의 형성을 억제하는데 집중해왔다. 그러나, 우리가 아는 한, 인위적인 다이머 형성 프라이머의 유용성을 개시하는 종래 기술은 전혀 알려진 바 없다.
본 발명의 방법에 사용되는 다이머-형성 프라이머 쌍은 하기와 같은 특징을 갖는다:
(a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함함;
(b) 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 3'-다이머 형성 부위(3'-dimer-forming portion)를 포함함; 및
(c) 상기 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적임.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 2개의 프라이머, 즉 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 다이머-형성 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이 "제1 프라이머" 및 "제2 프라이머"는 2개의 구별되는 프라이머를 특정하고자 하는 것이다. 상기 용어는 특정 프라이머를 가리키지 않으며 프라이머 간에 특별한 순서, 의미, 선호도 등을 부여하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 달리 나타내지 않는 한, 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 제1 다이머-형성 프라이머 및 제2 다이머-형성 프라이머와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 3'-다이머 형성 부위(3'-dimer-forming portion)를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "3'-다이머 형성 부위"는 다이머-형성 프라이머의 3' 말단에 위치하는 부위로서, 특정 혼성화 조건하에서 또 다른 다이머-형성 프라이머의 3'-다이머 형성 부위와 혼성화되어 다이머를 형성할 수 있는 부위를 가리킨다. 즉, 3'-다이머 형성 부위는 다른 다이머-형성 프라이머의 3'-다이머 형성 부위와 혼성화될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 하나의 다이머-형성 프라이머의 3'-말단의 부위를 가리킨다.
본 명세서에서 용어 "혼성화(hybridizing)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중 가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치되거나 일부 미스매치를 가지는 실질적으로 일치된 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
다이머-형성 프라이머 간의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 구성요소의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온 세기와 같은 조건은 다이머-형성 프라이머의 길이 및 GC 함량을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 다이머-형성 부위를 갖는 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)]에서 확인할 수 있다.
용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다.
본 발명에 따르면, 제1 프라이머는 3' 말단에 3'-다이머 형성 부위를 갖고, 제2 프라이머는 3' 말단에 3'-다이머 형성 부위를 가지며, 상기 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위의 맥락에서 용어 "상보적(complementary)" 또는 "상보성(complementarity)"은 특정 어닐링 조건 또는 엄격 조건 하에 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위가 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 용어 "실질적으로 상보적(substantially complementary)" 및 "완전히 상보적(perfectly complementary)"을 포괄하고, 바람직하게는 완전히 상보적이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위는 서로 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은, 비상보적인 뉴클레오타이드가 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화 및 프라이머의 3'-말단에서의 연장에 유의한 영향을 미치지 않는 한, 1개 이상의 비상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 예를 들어, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머-형성 부위 각각은 그의 길이에 따라 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 비상보적인 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 3'-다이머-형성 부위 내의 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-5 미스매치 뉴클레오타이드)의 존재 하에서도 반응 조건에 따라 성공적으로 혼성화되어 연장될 수 있다.
비상보적인 뉴클레오타이드는 3'-다이머-형성 부위에서 연속적이거나 비연속적일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3' 말단의 뉴클레오타이드를 포함하여 최소 2개, 최소 3개, 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개, 또는 최소 8개의 비연속적인 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위는 서로 완전히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3 내지 50 뉴클레오타이드 길이이다. 본 발명의 일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40 또는 50 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3-50, 3-40, 3-35, 3-30, 3-25, 3-20, 3-17, 3-15, 3-12, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-50, 4-40, 4-35, 4-30, 4-25, 4-20, 4-17, 4-15, 4-12, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-50, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-17, 5-15, 5-12, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-50, 6-40, 6-35, 6-30, 6-25, 6-20, 6-17, 6- 15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-50, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8-17, 8-15, 8- 12, 8-10, 8-9, 9-50, 9-40, 9-35, 9-30, 9-25, 9-20, 9-17, 9-15, 9-12, 9-10, 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-17, 10-15, 10-12, 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-25, 12-20, 12-17, 12-15, 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-25, 15-20, 15-17 또는 17-20 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정한 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 5 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 8 뉴클레오타이드, 9 뉴클레오타이드 또는 10 뉴클레오타이드 길이이다.
전술한 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위의 길이는 3' 말단의 뉴클레오타이드부터(3' 말단의 뉴클레오타이드 포함) 5' 방향의 특정 뉴클레오타이드까지의 범위를 가리킨다. 예를 들어, 3'-다이머 형성 부위가 5 뉴클레오타이드 길이인 경우, 상기 3'-다이머 형성 부위는 3'-말단의 첫 번째 뉴클레오타이드부터 5번째 뉴클레오타이드(첫 번째 및 5번째 뉴클레오타이드 포함)까지의 범위이다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 2개의 부위: (i) 5'-템플레이팅 부위(5'-templating portion) 및 (ii) 3'-다이머 형성 부위로 구성된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 다이머-형성 프라이머의 "5'-템플레이팅 부위"는 3'-다이머 형성 부위를 제외한 프라이머의 5' 말단에 있는 나머지 부위(영역)를 가리킨다. 또한, 용어 다이머-형성 프라이머의 "5'-템플레이팅 부위"는 다이머-형성 프라이머에 혼성화된 또 다른 다이머-형성 프라이머의 연장을 위한 주형으로서의 기능을 하는 다이머-형성 프라이머의 부위를 가리킨다. 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는 또 다른 다이머-형성 프라이머의 3'-다이머 형성 부위와 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
용어 "비상보적"은 프라이머 또는 프로브가 소정의 어닐링 조건 또는 엄격 조건 하에서 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화되지 않을 정도로 충분히 비상보적인 것을 의미하며, "실질적으로 비상보적(substantially non-complementary)" 및 "완전히 비상보적(perfectly non-complementary)"인 것을 모두 포괄하고, 특히 완전히 비상보적인 것을 의미한다. 예를 들어, 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위와 관련하여 용어 "비상보적"은 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위가 소정의 어닐링 조건 또는 엄격 조건 하에서 다른 다이머-형성 프라이머의 전체 서열에 선택적으로 혼성화되지 않을 정도로 충분히 비상보적인 것을 의미하며, "실질적으로 비상보적(substantially non-complementary)" 및 "완전히 비상보적(perfectly non-complementary)"인 것을 모두 포괄하고, 특히 완전히 비상보적인 것을 의미한다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는 자가-상보적인(self-complementary) 서열을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위가 자가 상보적인 서열을 갖는 경우, 5'-템플레이팅 부위는 헤어핀-스템(hairpin-stem) 구조와 같은 이차 구조를 형성할 수 있고 검출가능한 시그널을 제공하는 표지를 가질 수 있다(Sunrise 프라이머의 경우, Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 출원 제6,117,635호; Scorpion 프라이머의 경우, Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 출원 제6,326,145호 참고).
제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는, 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위에 비상보적인 서열을 갖는 한, 임의의 서열일 수 있다. 마찬가지로, 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는, 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위에 비상보적인 서열을 갖는 한, 임의의 서열일 수 있다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 각각은 100 뉴클레오타이드 길이이다. 특정한 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위의 길이는 최소 4, 10, 20, 30, 40, 60 또는 80 뉴클레오타이드부터 100, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 15 또는 10 뉴클레오타이드 이하의 범위이다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머는 증폭을 위해 연장되기 위해 3' 말단은 블록킹(blocking)되지 않아야 한다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머는 통상적인 프라이머와 달리 프라이머, 프로브 및 주형으로서 3가지 역할을 할 수 있다.
첫째, 본 발명의 다이머-형성 프라이머는 다른 다이머-형성 프라이머에 혼성화되고 연장됨으로써 프라이머로서의 역할을 할 수 있다. 둘째, 본 발명의 다이머-형성 프라이머는 이합체의 형성시, 이합체의 멜팅시, 또는 이합체의 멜팅 후 혼성화시에 표지로부터 시그널을 제공함으로써 프로브로서의 역할을 할 수 있다. 셋째, 본 발명의 다이머-형성 프라이머는 다른 다이머-형성 프라이머와 혼성화된 후 연장되기 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머를 증폭 반응에 사용하는 경우, 추가적인 주형, 프라이머 및 프로브가 요구되지 않을 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 다이머-형성 프라이머에 특이적인 주형, 즉 다이머-형성 프라이머와 혼성화되는 주형의 부재 하에 수행된다.
한편, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 사이의 혼성화 및 이의 연장에 의해 형성된 연장 산물은 내부적으로 생성된 주형으로서의 역할을 할 수 있다. 이 경우, 프라이머로서의 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 연장 산물에 특이적으로 혼성화되어, 내부적으로 생성된 주형을 증폭시킨다.
이것은 본 발명의 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용한 증폭 반응이 외부에서 제공된 주형 없이도 통상적인 증폭 반응을 모사할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 제1 다이머-형성 프라이머 및 제2 다이머-형성 프라이머를 사용한 증폭 반응은 반응에 관여한 구성요소의 성능 또는 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머 쌍을 구성하는 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 어떤 특정 길이를 요구하지 않는다. 일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 7 내지 100 뉴클레오타이드 길이이다. 특정한 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 길이는 최소 7, 10, 15, 20, 30, 50, 60 또는 80 뉴클레오타이드부터 100, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10 이하의 뉴클레오타이드 범위이다. 예를 들어, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 7-40, 7-60, 7-80, 7-100, 10-40, 10-60, 10-80, 10-100, 15-40, 15-60, 15-80, 15-100, 20-40, 20-60, 20-80, 20-100, 30-40, 30-60, 30-80 또는 30-100 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머는 자가-상보적인 서열을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 본 발명의 다이머-형성 프라이머가 자가-상보적인 서열을 갖는 경우, 다이머-형성 프라이머는 상기 자가-상보적인 서열의 혼성화에 의하여 이차 구조, 예컨대 헤어핀-스템 구조를 형성할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 스템 구조를 형성하는데 관여하는 서열은 모두 5'-템플레이팅 부위에 모두 존재하거나, 모두 3'-다이머 형성 부위에 모두 존재하거나; 하나는 5'-템플레이팅 부위에 존재하고 다른 하나는 3'-다이머 형성 부위에 존재하거나; 하나는 5'-템플레이팅 부위 및 3'-다이머 형성 부위 중 하나에 존재하고, 다른 하나는 5'-템플레이팅 부위의 일부부터 3'-다이머 형성 부위의 일부에 걸친 영역에 존재할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 스템 구조를 형성하는데 관여하는 각 가닥은, 특히 연속적으로 배열된, 최소 3 이상, 최소 4 이상 또는 최소 5 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 스템 구조를 형성하는데 관여하는 각 가닥은, 특히 연속적으로 배열된, 15 이하, 10 이하, 8 이하의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머가 자가-상보적인 서열을 갖지 않는 경우, 다이머-형성 프라이머는 랜덤 코일(random-coil)을 형성할 수 있다.
다이머-형성 프라이머 쌍을 구성하는 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2'-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 "유니버설 염기"는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상기 변형 뉴클레오타이드, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 유니버설 염기는 다이머-형성 프라이머 내에 연속적으로 또는 비연속적으로 존재할 수 있다. 상기 변형 뉴클레오타이드, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 유니버설 염기의 개수는 1-8개, 1-5개, 1-3개 또는 1-2개일 수 있다. 상기 변형 뉴클레오타이드, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 유니버설 염기는 다이머-형성 프라이머 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 변형 뉴클레오타이드, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 유니버설 염기는 5'-템플레이팅 부위, 3'-다이머 형성 부위, 또는 이 둘 모두에 위치할 수 있다. 상기 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드 또는 유니버설 염기의 좌측 및 우측에 위치한 서열은 서로 상보적이고 서로 혼성화하여 스템 구조를 형성할 수 있다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머는 5'-템플레이팅 부위 및 3'-다이머 형성 부위 외에 임의의 부가적인 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 부가적인 서열은 5'-템플레이팅 부위의 5' 방향에 위치하며, 템플레이트로서 역할을 하지 않으며 다른 다이머-형성 프라이머와의 혼성화 역할을 하지 않는다. 상기 부가적인 서열은 프라이머의 연장을 방지하기 위한 블록커(blocker)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍을 구성하는 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머는 선택된 시그널링 방식에 적합한 표지 시스템을 포함할 수 있다.
제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머를 위한 시그널링 방식 및 표지 시스템은 단계 (b)에서 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 단계 (a)에서, 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하는 증폭 조성물이 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "증폭 조성물" 또는 "증폭 반응용 조성물"은 증폭 반응에 사용되는 화학적 구성요소의 집합 또는 혼합물을 지칭한다. 특히, 상기 용어는 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하는, 다이머-형성 프라이머 쌍의 연장 또는 이로부터의 시그널 발생에 관여하는 화학적 구성요소의 집합 또는 혼합물을 지칭한다. 상기 용어는 증폭 반응에 사용되는 임의의 물리적 또는 기계적 구성요소, 예컨대 용기, 열순환기, 또는 검출기를 배제하는 것으로 의도된다.
전술한 바와 같이, 증폭 조성물은 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하여 하나 이상의 구성요소를 포함한다.
증폭 조성물에 포함될 수 있는 구성요소의 예는 핵산 중합효소, dNTPs, 완충액, 염, 첨가제, 표지 등이다.
증폭에 포함될 수 있는 구성요소를 하기에 설명한다:
(a) 핵산 중합효소
증폭 조성물은 프라이머를 연장시키기 위한 핵산 중합효소를 함유할 수 있다. 상기 핵산 중합효소는 주형-의존적 핵산 중합효소일 수 있다. 주형-의존적 핵산 중합효소는 임의의 핵산 중합효소, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
(b) dNTP
증폭 조성물은 합성되는 DNA 또는 RNA의 빌딩 블록인 dNTP를 함유할 수 있다. 상기 dNTP는 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드, 즉 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(또는 dUTP)의 혼합물을 포함한다.
(c) 완충액(buffer)
증폭 조성물은 핵산 중합효소의 최적의 활성을 위한 pH 환경을 제공하고 증폭 반응 동안의 온도 변화와 화학적인 작용으로 인한 pH의 급격한 변화를 방지하기 위해 완충액을 포함할 수 있다. 완충액의 예는 Tris-HCl을 포함한다.
(d) 염(salt)
증폭 조성물은 핵산 중합효소의 활성을 안정화시키는데 도움을 주기 위해 염을 포함할 수 있다. 상기 염은 마그네슘 또는 칼륨의 염일 수 있고, 예를 들어 MgCl2, MgSO4 또는 KCl이다. 상기 염은 당업계에 공지된 다양한 농도로 첨가될 수 있다.
(e) 첨가물
증폭 조성물은 핵산 중합효소를 안정화시키기 위해 다양한 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물의 예는 BSA, DMSO, 베타인, KCl, 비-이온성 계면활성제(예컨대, Tween 20, Tritox X-100)을 포함한다.
(f) 표지
증폭 조성물은 시그널을 발생시키기 위해 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지의 상세한 내용은 본 명세서의 다른 곳을 참조한다.
본 발명의 증폭 조성물은 전술한 구성요소 외에도 당업계에 공지된 임의의 다른 구성요소를 추가로 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
일 구현예에서, 증폭 조성물은 타겟 핵산 서열을 포함하거나 포함할 것으로 의심되는 샘플을 추가로 포함한다. 일반적으로, 샘플은 증폭 반응의 효율을 저하시키는 임의의 물질(예컨대, 구성요소를 분해시키거나 그의 성능을 억제하는 임의의 물질)을 함유할 수 있다. 따라서, 샘플은 샘플이 이러한 억제제를 함유하는지 결정하기 위해, 즉 샘플의 성능을 평가하기 위해, 본 발명의 증폭 조성물에 포함될 수 있다. 샘플이 증폭 조성물에 포함되는 경우, 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 내부 대조군으로의 역할을 할 수 있다.
증폭 조성물에 포함되는 샘플은 샘플 내의 타겟 핵산 서열을 추출하기 전의 샘플이거나 샘플 내의 타겟 핵산 서열을 추출한 후의 샘플일 수 있다.
다이머-형성 프라이머 쌍은 핵산 추출 과정 또는 증폭 반응을 모니터링하기 위한 내부 대조군으로서 역할을 할 수 있다.
일 구현예에서, 다이머-형성 프라이머 쌍이 샘플에 첨가(spike)되고, 상기 첨가된 샘플은 핵산 증폭 과정에 적용되고, 추출 산물이 증폭 조성물에 분취된다. 일 구현예에서, 다이머-형성 프라이머 쌍은, 타겟 핵산용 프라이머를 포함하는 다른 올리고뉴클레오타이드와 함께 증폭 조성물에 직접 첨가된다.
증폭 조성물 내의 각 구성요소는 본 발명의 방법에 의해 그의 성능이 평가될 수 있으며, 따라서 본 발명의 방법에 의해 평가될 구성요소로서 간주될 수 있다. 하지만, 다이머-형성 프라이머 쌍은, 증폭 조성물에 포함된 구성요소이긴 하지만, 본 발명의 방법에 의해 평가될 구성요소로서 간주되지 않는다.
단계 (b): 증폭 장치에서 증폭 조성물을 사용한 증폭 반응의 실시( 120 )
다음으로, 증폭 장치에서 단계 (a)의 증폭 조성물을 사용하여 증폭 반응을 실시한다(120). 상기 증폭 반응에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 증폭 조건 하에 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성하며, 상기 연장 이합체에 의존적인 방식으로 검출가능한 시그널이 제공된다.
본원에 사용된 용어 "증폭 조건"은 증폭에 필요한 성분의 존재, 및 적합한 온도 및 pH의 조건을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "증폭 조건"은 올리고뉴클레오타이드의 어닐링/혼성화, 프라이머의 연장 및 이합체의 변성과 같은 증폭 반응에 포함되는 별도의 단계를 위한 조건을 지칭한다. 이러한 조건은 다이머-형성 프라이머의 길이 및 GC 함량 및 다이머-형성 부위의 길이 및 GC 함량을 포함한 다양한 인자에 의해 달라질 수 있다. 상세한 조건은 문헌[Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)]에서 확인할 수 있다.
본원에 사용된 표현 "상기 연장 이합체에 의존적인 방식으로 검출가능한 시그널이 제공된다"는 검출가능한 시그널이 연장 이합체의 존재로부터 직접 또는 간접적으로 제공된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 특히, 검출가능한 시그널은 연장 이합체 자체로부터 제공될 수 있거나, 연장 이합체와 결합된 다른 올리고뉴클레오타이드로부터 제공될 수 있다.
단계 (b)의 증폭 반응은 (i) 다이머-형성 프라이머 쌍의 혼성화; 및 (ii) 각 다이머-형성 프라이머 쌍의 연장을 포함한다. 상기 증폭 반응은 도 2에 예시되어 있다.
(i) 다이머-형성 프라이머 쌍의 혼성화
다이머-형성 프라이머 쌍은 서로 혼성화된다. 구체적으로, 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 3'-다이머 형성 부위 간의 상보성에 의해 서로 혼성화되어 다이머를 형성한다.
일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 5' -> 3' 방향으로 (i) 5'-템플레이팅 부위 및 (ii) 3'-다이머 형성 부위를 포함한다. 상기 혼성화 과정에서, 3'-다이머 형성 부위는 혼성화에 관여하지만, 5'-템플레이팅 부위는 혼성화에 관여하지 않는다(도 2(i) 참고).
전형적으로, 2개의 프라이머 간의 혼성화는 다양한 유형의 다이머를 생성할 수 있다. 이러한 다이머는 각 프라이머의 연장 여부에 따라 3개의 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 모두 연장될 수 있는 이합체 형태;
(b) 제1 프라이머 및 제2 프라이머 중 하나만 연장될 수 있는 이합체 형태; 및
(c) 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 모두 연장될 수 없는 이합체 형태.
상기 3가지 형태 중에서, (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 모두 연장될 수 있는 이합체 형태가 본 발명의 혼성화에 의해 의도된다. 다만, 본 발명의 방법은 이합체 형태 (b) 및 (c)의 형성을 배제하는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 고려되는 다이머 형태는 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 2개의 프라이머의 3'-다이머 형성 부위를 통해 부분적으로 혼성화된(부분적으로 중첩된) 형태를 포함한다. 이러한 다이머 형태는 부분적 다이머로서 지칭될 수 있다. 부분적 다이머의 각 프라이머는 핵산 중합효소의 중합 활성에 의해 연장될 수 있다.
일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 간의 부분적 혼성화에 의해 형성된 "다이머"는 (i) 제1 프라이머로 구성된 단일 가닥 부위; (ii) 제1 프라이머 및 제2 프라이머로 구성된 이중 가닥 부위; 및 (iii) 제2 프라이머로 구성된 단일 가닥 부위로 구성된, 구별되는 3부분(tripartite) 구조를 갖는다.
전술한 다이머-형성 프라이머 쌍의 혼성화는 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 혼성화가 가능한 조건 하에서 수행될 수 있다.
특히, 상기 혼성화 조건은 혼성화 단계에서 고려되는 다이머 형태에 따라 디자인 및 합성된 각 프라이머를 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
(ii) 다이머-형성 프라이머 쌍의 연장
상기 다이머의 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체(extended duplex)를 형성한다.
본원에서 사용된 용어 "연장 이합체" 또는 "연장 다이머"는 제1 프라이머가 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위를 따라 연장되고, 제2 프라이머가 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위를 따라 연장되는 연장 반응에 의해 형성된 이합체를 의미한다.
프라이머의 각 연장 산물은 연장 가닥으로 표현될 수 있다. 새롭게 연장된 서열인 프라이머를 제외한 연장 가닥의 부위는 연장 서열로 표현될 수 있다.
단계 (b)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 임의의 핵산 중합효소, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 특히, 중합효소는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다.
다이머의 연장은 핵산 중합효소의 활성을 위한 최적 온도 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 증폭 반응은 종래에 당업계에 공지된 증폭 반응 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 증폭 반응은 종래에 당업계에 공지된 PCR 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 증폭 반응은 변성 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이 경우 변성, 혼성화 및 연장 단계가 반복될 수 있다.
상기 변성 단계는 제1 프라이머 및 제2 프라이머, 또는 이의 연장 이합체를 해리시키기 위한 적절한 온도 및 시간을 고려하여 수행된다. 상기 혼성화 단계는 제1 프라이머를 제2 프라이머에 혼성화시키기 위한 적절한 온도 및 시간 또는 제1 프라이머를 연장 이합체의 가닥에 혼성화시키기 위한 적절한 온도 및 시간을 고려하여 수행된다. 상기 연장 단계는 제1 프라이머와 제2 프라이머를 연장시키기 위한 적절한 온도 및 시간을 고려하여 수행된다.
상기 변성, 혼성화 및 연장의 세부 조건은 문헌[Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)]을 참조한다.
본 발명의 방법에 따르면, 증폭 반응은 연장 이합체를 변성시키는 단계, 변성된 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머와 혼성화시키는 단계, 및 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 연장시켜 연장 이합체를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머 간의 혼성화 및 이의 연장에 의해 형성된 연장 산물은 내부적으로 생성된 주형으로서의 역할을 할 수 있다. 이 경우, 프라이머로서 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 연장 산물에 특이적으로 혼성화되어, 내부적으로 생성된 주형을 연장시킨다.
본 발명의 방법에서, 단계 (b)의 증폭 반응은 증폭 장치에서 실시된다.
본원에서 사용된 용어 "증폭 장치"는 증폭 반응에 사용되는 모든 물리적 또는 기계적 구성요소를 포괄하는 것으로 의도된다. 구체적으로, 증폭 장치는 열순환기 및 검출기뿐만 아니라 증폭 용기를 포괄한다. 본원에서 "증폭 반응이 증폭 장치에서 실시된다"는 것은 증폭 조성물이 증폭 용기, 열순환기 및 검출기를 사용한 증폭 반응에 적용된다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 증폭 장치 내의 구성요소는 열순환기이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 증폭 장치 내의 구성요소는 검출기이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 증폭 장치 내의 구성요소는 용기이다. 구성요소는 서로 결합되거나 결합되지 않을 수 있다.
열순환기 및/또는 검출기는 당업계에 널리 알려져 있으며, 비제한적으로 CFX(Bio-Rad), iCycler(Bio-Rad), LightCycler(Roche), StepOne(ABI), 7500(ABI), ViiA7(ABI), QuantStudio(ABI), AriaMx(Agilent)를 포함한다.
용기는 당업계에 널리 알려져 있으며, 튜브, 스트립, 플레이트 등을 포함한다.
증폭 장치 내의 각 구성요소는 본 발명의 방법에 의해 성능이 평가될 수 있고, 따라서 본 발명의 방법에 의해 평가되는 구성요소로서 간주될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 (b)에서, 검출가능한 시그널은 연장 이합체의 존재에 의존적으로 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "시그널"은 연장 이합체의 존재 또는 부존재를 나타낼 수 있는 임의의 시그널을 의미한다. 예를 들어, 시그널은 표지로부터의 시그널(시그널 발생 또는 소멸), 표지로부터의 시그널의 변화(시그널 증가 또는 감소), 멜팅 곡선, 멜팅 패턴 및 멜팅 온도(또는 Tm 값)를 포함한다.
검출가능한 시그널은 표지(들) 또는 표지 시스템에 의해 발생할 수 있다.
검출가능한 시그널은 당업계에 널리 알려진 다양한 시그널-발생 수단(즉, 표지 시스템)을 사용하여 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 검출가능한 시그널은 추가의 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고 연장 이합체의 존재에 의존적으로 발생한다.
또 다른 구현예에서, 검출가능한 시그널은 추가의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 연장 이합체의 존재에 의존적으로 발생한다.
특히, 검출가능한 시그널은 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 적어도 하나의 표지, (ii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지, (iii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지, (iv) 인터컬레이팅 표지, 또는 (v) 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공된다. 또한, 상기 기재된 검출 올리고뉴클레오타이드는 매개 올리고뉴클레오타이드와 같은 다른 추가의 올리고뉴클레오타이드의 도움으로 또는 도움 없이 검출 올리고뉴클레오타이드의 표지로부터 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
본 발명에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 상세하게 설명될 수 있다.
(ⅰ) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 적어도 하나의 표지
일 구현예에 따르면, 시그널은 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 적어도 하나의 표지에 의하여 제공된다. 제1 프라이머 또는 제2 프라이머의 표지는 연장 이합체의 형성시 실시간으로 검출가능한 시그널을 제공할 수 있거나, 연장 이합체의 멜팅시 또는 멜팅 후 혼성화시 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널은 표지의 위치에 따라 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 혼성화 단계에서 제공될 수 있다. 이 경우, 연장 이합체는 다이머와 상이한 Tm 값을 가지므로 연장 이합체 및 다이머의 Tm 값 차이를 이용하여 연장 이합체의 시그널을 다이머의 시그널과 구별할 수 있다. 예를 들어, 실시간 검출과 같이 미리 결정된 온도에서 시그널을 검출하는 경우, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 다이머는 실질적으로 해리되지만 연장 이합체는 실질적으로 해리되지 않는 온도에서 시그널을 검출한다. 택일적으로, 연장 이합체의 존재는 결과물의 Tm 값을 측정하여 결정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 표지는 프라이머의 연장을 방해하지 않기 위해 다이머-형성 프라이머의 3'-말단에 연결되지 않는다.
상기 표지는 상호작용적 이중 표지 및 단일 표지를 포함한다.
(i-1) 상호작용적 이중 표지
(a) 가닥내 상호작용적 이중 표지
상호작용적 표지 시스템의 대타겟 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 발명에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 설명될 수 있다. 상호작용적 이중 표지는 접촉-매개 퀀칭(contact-mediated quenching)에 기반하여 검출가능한 시그널을 제공하는 표지 쌍을 포함한다(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 본 발명에서, 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자(예를 들어, 염료) 간의 상호작용에 의한 시그널 변화를 포함하는 모든 또는 어떠한 경우를 포함한다.
특히, 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 발생되며, 보다 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중 표지 시스템)에 의해 발생된다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 일 구현예에서, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 연장되어 연장 이합체를 형성한다. 연장 이합체가 형성되기 전, 즉 제1 프라이머가 제2 프라이머와 혼성화되기 전 또는 다이머의 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 연장되기 전에는, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 대조적으로, 연장 이합체가 형성되는 경우 제1 프라이머의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적(conformationally)으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여 상호작용적 이중 표지로부터 시그널의 변화를 초래한다. 따라서, 이러한 시그널 변화는 연장 이합체의 형성 및 존재를 나타내고, 상기 연장 이합체의 형성 및 존재는 다이머-형성 프라이머의 증폭을 나타낸다.
연장 이합체가 해리되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공된다. 따라서, 상기 상호작용적 이중 표지 시스템을 사용하는 경우, 시그널은 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 의해 검출될 수 있다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 일 구현예에서, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 어느 하나를 갖고, 3'-다이머 형성 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나를 갖는다. 연장 이합체가 형성되기 전에는 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 그러나, 연장 이합체가 형성되는 경우, 제1 프라이머 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여 상호작용적 이중 표지로부터 시그널의 변화를 초래한다.
본 명세서에서 사용된 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 근접한다"는 것은 제1 프라이머 또는 제2 프라이머의 형태적 구조(conformational structure), 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 서로 인접하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격된다"는 것은 연장 이합체의 형성시의 형태적 구조의 변화에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 연장 이합체의 형성에 의해 표지로부터의 시그널이 언퀀칭되는 한, 표지는 제1 프라이머 또는 제2 프라이머 상의 어떠한 위치에도 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 프라이머 또는 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위에 연결된다. 전술한 바와 같이, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위가 이중 표지로 표지되는 경우, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 혼성화는 시그널을 제공할 수 있다. 이러한 표지 시스템에서, 연장 이합체는 다이머와 상이한 Tm 값을 가지므로, 연장 이합체 및 다이머의 Tm 값의 차이를 이용하여 연장 이합체의 시그널을 다이머의 시그널과 구별할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 나머지 하나는 제1 프라이머의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하도록 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 그의 3'-말단 또는 그의 3'-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 나머지 하나는 제1 프라이머의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 또는 언퀀칭하도록 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 이하의 뉴클레오타이드, 60 이하의 뉴클레오타이드, 30 이하의 뉴클레오타이드, 25 이하의 뉴클레오타이드, 또는 20 이하의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 8 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드, 최소 12 뉴클레오타이드, 최소 15 뉴클레오타이드 또는 최소 17 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 동일한 또는 상이한 조합의 이중 표지를 가질 수 있다.
(b) 가닥간 상호작용적 이중 표지
일 구현예에서, 제1 프라이머는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호 작용적 이중 표지 중 하나를 가지며, 제2 프라이머는 상기 상호작용적 이중 표지의 나머지를 갖는다.
예를 들어, 제1 프라이머는 3'-다이머 형성 부위에 리포터 분자를 갖고 제2 프라이머는 3'-다이머 형성 부위에 퀀처 분자를 갖는다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머 간의 혼성화 전에는 시그널 퀀칭이 발생하지 않으나, 혼성화되는 경우 리포터 분자와 퀀처 분자가 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 이러한 표지 시스템에서, 연장 이합체는 다이머와 상이한 Tm 값을 가지므로, 연장 이합체 및 다이머의 Tm 값의 차이를 이용하여 연장 이합체의 시그널을 다이머의 시그널과 구별할 수 있다. 또한, 상기 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자와 퀀처 분자가 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화가 발생한다. 시그널은 멜팅 후 혼성화에서 제공될 수 있다.
리포터 분자로부터의 시그널이 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 혼성화시에 퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 어떠한 부위에 위치할 수 있다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터의 최대 발광 파장이다. 특히, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 본 발명에 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
제1 프라이머 또는 제2 프라이머에 채택되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예컨대, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 염료 (rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
(i-2) 단일 표지
본 발명은 또한 연장 이합체의 형성시, 멜팅시, 또는 멜팅 후 혼성화시 시그널 변화를 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 단일 표지를 가지며, 단계 (b)에서의 연장 이합체의 형성은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 시그널을 제공한다.
단일 표지 시스템의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는 단일 형광 표지를 갖는다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 연장되어 연장 이합체를 형성한다. 연장 이합체가 형성되기 전, 즉 제1 프라이머가 제2 프라이머와 혼성화되기 전, 또는 다이머의 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 연장되기 전에는, 단일 형광 표지로부터의 형광 강도는 감소되는 반면, 연장 이합체의 형성에 의해, 단일 형광 표지로부터의 형광 강도는 증가하게 되고, 이에 의해 시그널이 제공되어 연장 이합체의 존재를 나타낸다. 택일적으로, 연장 이합체가 멜팅되는 경우 단일 형광 표지로부터의 시그널 강도는 감소되고, 이에 의해 시그널이 제공되어 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 연장 이합체의 형성에 따라 단일 표지로부터의 시그널 수준이 변화되는 한, 단일 표지는 제1 프라이머 상의 어떠한 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단일 표지는 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위에 연결된다. 3'-다이머 형성 부위가 단일 표지로 표지되는 경우, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 간의 다이머는 시그널을 제공할 수 있다. 이러한 표지 시스템에서, 연장 이합체는 다이머와 상이한 Tm 값을 가지므로, 연장 이합체 및 다이머의 Tm 값의 차이를 이용하여 연장 이합체의 시그널을 다이머의 시그널과 구별할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 동일하거나 상이한 단일 표지를 가질 수 있다.
본원에 사용되는 단일 표지는 이중 가닥 상에 또는 단일 가닥 상에 존재하는지 여부에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다. 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다. 특히, 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 유형 및 바람직한 결합 위치는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 그의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 특히, 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 표지되는 뉴클레오타이드의 잔기는 5'-말단 또는 3'-말단보다 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명할 수 있다.
(ⅱ) 연장 이합체에 혼입된 표지
본 발명은 연장 이합체의 형성시, 멜팅시, 또는 멜팅 후 혼성화시 타겟 시그널을 제공하기 위하여, 연장 반응 동안 연장 이합체에 혼입된 표지를 이용할 수 있다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머가 표지를 갖지 않음에도 불구하고, 연장반응 동안 연장 이합체에 혼입된 표지는 연장 이합체를 표지시키는데 성공적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널은 연장 반응 동안 연장 이합체에 혼입된 단일 표지에 의하여 제공되며; 상기 혼입된 단일 표지는 연장 반응 동안 혼입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있고; 단계 (b)에서의 상기 연장 이합체의 형성은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하거나, 단계 (b)에서의 연장 이합체의 멜팅은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 연장 반응 동안 혼입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 제1 프라이머는 상기 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는다. 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 상의 어떠한 부위에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비-자연 염기"는 수소-결합 염기 쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연적 염기의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비-자연 염기"는 모 화합물(mother compound)로서 자연적 염기와 상이한 염기 쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 자연적 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 특정한 방식으로도 형성된다.
비-자연 염기의 특정한 예는 다음 염기들의 염기 쌍 조합을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J 및 M/N (미국특허 제7,422,850호 참조).
제2 프라이머는 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 프라이머와 혼성화된다. 연장은 단일 형광 표지로 표지된 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 실시되어, 연장 이합체를 형성한다. 연장 반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 반대쪽 부위에 혼입된다.
(ⅲ) 연장 이합체 내에 혼입된 표지와 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지
본 발명은 연장 반응 동안 연장 이합체 내에 혼입된 표지와 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지의 조합을 이용한 표지 시스템을 이용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널은 연장 반응 동안 연장 이합체 내에 혼입된 표지와 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지에 의하여 제공되고; 혼입된 표지는 상기 연장 반응 동안 혼입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 두 개의 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 상기 단계 (b)에서의 연장 이합체의 형성은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 시그널을 제공한다.
일 예로서, 하나의 표지는 제1 프라이머(특히, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위)에 연결되고, 다른 표지에 연결된 뉴클레오타이드가 제2 프라이머의 연장 반응 동안 제2 프라이머의 연장 가닥에 혼입되어 상호작용적 이중 표지로부터 시그널 변화를 유도한다. 다른 예로서, 하나의 표지는 제1 프라이머(특히, 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위)에 연결되고, 다른 표지에 연결된 뉴클레오타이드가 제1 프라이머의 연장 반응 동안 제1 프라이머의 연장 가닥에 혼입되어 상호작용적 이중 표지로부터 시그널 변화를 유도한다.
제1 프라이머 상에서의 표지의 부위 및 혼입되는 표지의 혼입 부위는, 상기 두 개의 표지가 시그널의 변화를 유도하는 상호작용적 이중 표지로서 작용하는 범위 내에서 결정된다.
보다 특히, 연장 반응 동안 혼입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, 혼입되는 뉴클레오타이드의 주형으로 작동하는 프라이머는 제1 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 예로서, 제1 프라이머(특히, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위)는 리포터 및 퀀처 중 하나의 표지 및 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 나머지 하나의 표지 및 제1 프라이머 내의 제2 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장 반응이 실시된다. 연장 반응에서, 제1 프라이머는 제2 프라이머와 혼성화되고, 제2 프라이머는 연장되고, 이 동안 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드가 제1 프라이머 내의 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 반대쪽 부위에 혼입된다. 그 결과, 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭되어 시그널 변화를 유도한다.
연장 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널이 제공되어 연장 이합체의 존재를 나타낸다.
다른 예로서, 제1 프라이머(특히, 제1 프라이머의 3'-다이머 형성 부위)는 리포터 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 가지며, 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 단계 (b)의 연장 반응은 나머지 하나의 표지 및 제2 비-자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시된다. 연장 반응에서, 제1 프라이머는 제2 프라이머와 혼성화되고, 제1 프라이머는 연장되며, 이 동안 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 프라이머 내의 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 반대쪽 부위에 혼입된다. 그 결과, 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의하여 퀀칭되어 시그널 변화를 유도한다.
제1 프라이머 상의 하나의 표지의 부위 및 제1 프라이머 또는 제2 프라이머 내의 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 부위는 다른 표지의 혼입시 두 표지 간의 상호작용에 의해 시그널 변화가 발생할 수 있는 범위 내에서 결정된다.
(ⅳ) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명은 연장 이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 인터컬레이팅 표지를 사용할 수 있다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 표지의 예는, SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM 43, SYTO TM 44, SYTOTM 45, SYTOXTM Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM 1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 티아졸 오렌지를 포함한다.
인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 발생시킨다. 연장 이합체의 형성 전에는 시그널 강도가 감소되는 반면, 연장 이합체의 형성에 의해, 단일 형광 표지로부터의 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 연장 이합체의 형성시 증가하는 시그널 변화를 실시간으로 검출할 수 있다. 택일적으로, 연장 이합체의 멜팅에 의해 감소하는 시그널 변화를 검출할 수 있다.
(v) 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지
본 발명은 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하기 위해 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지를 이용할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "검출 올리고뉴클레오타이드(detection oligonucleotide)"는 검출되는 시그널의 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 실제 시그널 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 용어는 제1 다이머-형성 프라이머, 제2 다이머-형성 프라이머 및 그의 연장 가닥을 배제하는 것으로 의도된다.
이러한 표지 시스템에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이합체의 형성시 또는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공될 수 있다. 상기 표지 시스템이 상세히 설명된다.
(v-1) 검출 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이합체의 형성시 시그널 제공
시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이합체의 형성시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공된다.
본원에 사용된 용어 "검출 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이합체"는 이합체의 어느 하나의 가닥이 검출 올리고뉴클레오타이드인 이합체를 지칭한다. 상기 용어는 (i) 검출 올리고뉴클레오타이드 및 제1 다이머-형성 프라이머 또는 제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥 사이의 이합체, 및 (ii) 제1 다이머-형성 프라이머 또는 제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체를 포함하는 것으로 의도되나, 전술한 바와 같은 제1 프라이머 및 제2 프라이머 사이의 다이머 또는 이의 연장 이합체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
제1 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥은 (i) 제1 프라이머 서열 부위 및 연장 서열 부위를 포함한다. 제1 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥 내의 연장 서열은 제2 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위와 상보적인 서열을 가질 수 있다.
제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥은 (i) 제2 프라이머 서열 부위 및 연장 서열 부위를 포함한다. 제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥 내의 연장 서열은 제1 다이머-형성 프라이머의 5'-템플레이팅 부위와 상보적인 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드 및 제1 다이머 형성 프라이머 또는 제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥 사이의 이합체의 형성시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 상보적인 서열, 특히 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위에 상보적인 서열 사이의 이합체의 형성시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머, 특히 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 사이의 이합체의 형성시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공된다.
검출 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 상보적인 서열 간의 이합체 형성 또는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머 간의 이합체 형성에 의한 시그널은 시그널은 럭스 방법(미국 특허 제7,537,886호), 분자 비콘 방법(Tyagi 등, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), Hybeacon 방법(French DJ 등, Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 인접한 혼성화 프로브 방법(Bernard P.S. 등, Anal. Biochem., 273:221(1999)) 및 LNA 방법(미국 특허 제6,977,295호)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
특정 구현예에서, 시그널은 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 가닥과 또는 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 상보적인 서열과 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드(mediation oligonucleotide)의 절단에 의존적인 방식으로 이합체의 형성시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생된다.
본원에 사용되는 용어 "매개 올리고뉴클레오타이드"는 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하지 않는 이합체의 생성을 매개하는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단 자체로는 시그널이 발생하지 않고, 매개 올리고뉴클레오타이드에 의해 형성된 단편이 시그널 발생을 위한 연속적인 반응에 관여한다.
일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 절단 자체로는 시그널이 발생하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 제1 프라이머 또는 제2 프라이머(특히, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위)와 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 제1 프라이머 또는 제2 프라이머의 연장 가닥 내의 연장 서열(특히, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위에 상보적인 서열)과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 절단되어 단편을 방출하고, 이는 이합체의 생성의 매개를 초래한다. 특히, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 단편의 연장에 의해 이합체의 생성을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 가닥에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열(특히, 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 또는 제2 프라이머 서열의 5'-템플레이팅 부위에 상보적인 서열)을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 가닥에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 가닥 내의 연장 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 가닥에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단은 단편을 방출하며, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화되고 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 연장된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머와 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드는 절단되어 단편을 방출하고, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화되며, 상기 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하고, 이는 상기 연장 가닥 및 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 또 다른 연장 이합체의 형성을 야기하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 연장 가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 및 연장 가닥의 혼성화는 다른 유형의 이합체를 형성하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 제3의 올리고뉴클레오타이드 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성은 상기 연장 가닥 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성에 의해 억제되어 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단편, 상기 연장 가닥, 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드, 상기 제3의 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로 작용할 수 있다.
본 발명에서, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널을 제공하기 위해, PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442) 및 PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(PCT/KR2013/012312)을 포함하는 다양한 공지된 방법이 참조될 수 있다.
상기 참고문헌에 개시된 용어와 관련하여, 올리고뉴클레오타이드의 상응하는 예는 다음과 같다: 매개 올리고뉴클레오타이드는 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)에 상응하고, 캡처 올리고뉴클레오타이드는 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)에 상응하며, 제3의 올리고뉴클레오타이드는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO) 또는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridization Oligonucleotide; HO)에 각각 상응한다. SO, HO, CTO, 연장 가닥 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로서 역할을 할 수 있다.
상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 다른 이합체의 형성이 억제됨으로써 제공된 시그널(예컨대, PCE-NH)을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 단편-연장된 가닥과 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(PCE-SH 방법 참고) 및 CTO와 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(PCE-NH 방법 참고)를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 반응 동안 생성된 단편-연장된 가닥 또는 CTO를 포함한다.
용어 "PTOCE-기반 방법"은 PTO의 절단 및 연장을 통한 연장 가닥의 형성을 포함하여 시그널을 제공하는 다양한 방법을 포괄하는 것을 의도하기 위해 본원에 사용된다.
일 구현예에 따르면, 이합체의 형성에 의해 발생한 시그널은 이합체의 혼성화(예컨대, 이합체 자체의 혼성화 또는 제3의 올리고뉴클레오타이드의 혼성화)에 의해 유도된 시그널 또는 이합체의 형성으로 인한 제3의 올리고뉴클레오타이드의 혼성화의 억제에 의해 유도된 시그널을 포함한다.
특정 구현예에서, 시그널은 제1 및 제2 프라이머의 연장 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 이합체의 형성시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 및/또는 제2 프라이머는 엔도뉴클레오리틱(endonucleolytic) 부위 또는 제한 인식 부위를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 연장 이합체는 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위를 포함한다. 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위는 본 발명의 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장에 의해 생성될 수 있다. 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위는 상기 부위에 특이적인 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소의 작용에 의해 절단되어 단편을 방출시킬 수 있다. 특히, 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서의 단편의 연장에 의해 이합체의 생성을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장 이합체의 절단은 단편을 방출하고, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하여 캡처 올ㄹ고뉴클레오타이드 상에서 연장된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장 이합체는 절단되어 단편을 방출하고, 상기 단편은 처 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하고, 상기 단편은 연장되어 연장 이합체를 형성하고, 이는 연장 가닥 및 캡처 올리고뉴클레오타이드 사이에 또 다른 연장 이합체의 형성을 초래하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장 가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 제3의 올리고뉴클레오타이드와 연장 가닥의 혼성화는 다른 유형의 이합체를 형성하여 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 제3의 올리고뉴클레오타이드와 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성은 상기 연장 가닥 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성에 의해 억제되어 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단편, 상기 연장 가닥, 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드, 상기 제3의 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로 작용할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 연장 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널을 제공하기 위해, 다양한 공지된 방법이 참고될 수 있다(대한민국 특허출원 제10-2017-0121700호 참고).
연장 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 연장 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 다른 이합체의 형성의 억제에 의해 제공된 시그널을 포함한다(PCE-NH 참고).
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 연장 가닥과 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(PCE-SH 방법 참고) 및 CTO와 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(PCE-NH 방법 참고)를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 반응 동안 생성된 연장 가닥 또는 CTO를 포함한다.
(v-2) 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널 제공
시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드가 제1 다이머-형성 프라이머 또는 제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥과 혼성화한 다음 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시에 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
특정 구현예에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드가 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머, 특히 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위와 혼성화한 다음 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시에 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
특정 구현예에서, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드가 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 상보적인 서열, 특히 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위에 상보적인 서열과 혼성화한 다음 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시에 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
검출 올리고뉴클레오타이드와 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 혼성화 또는 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위에 상보적인 서열과의 혼성화 이후 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널은 TaqMan 프로브 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 미국 특허 제5,538,848호)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
상기 시그널이 TaqMan 프로브 방법에 의해 발생되는 경우, 적합한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소가 사용된다. 제1 프라이머 및/또는 제2 프라미어와 혼성화된 검출 올리고뉴클레오타이드는 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장 동안 절단되고, 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다.
특정 구현예에서, 시그널은 제1 다이머-형성 프라이머 또는 제2 다이머-형성 프라이머의 연장 가닥과 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
특정 구현예에서, 시그널은 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머, 특허 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위와 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
특정 구현예에서, 시그널은 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 상보적인 서열, 특허 제1 프라이머의 5'-템플레이팅 부위 및/또는 제2 프라이머의 5'-템플레이팅 부위에 상보적인 서열과 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머와 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화되고 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머와 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 연장되어 캡처 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 검출 올리고뉴클레이드를 절단한다.
본 발명의 방법에서, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널을 제공하기 위해, Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PCEC(PTO 절단 및 연장-의존적 절단) 방법(WO 제2012/134195호) 및 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법을 포함하는 다양한 공지된 방법이 참조될 수 있다. 특히, 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법은 절단에 의한 시그널 발생을 이용하는 PTOCE-기반 방법 중 하나로서 간주될 수 있고, 상기 방법에서, 연장 이합체의 형성은 연장 가닥의 형성에 의해 CTO와 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 검출될 수 있다. Invader 분석은 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 단편을 형성하고 단편의 연장 없이 연속적인 절단 반응을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 발생하는 경우, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단은 시그널 변화를 유도하거나 검출될 표지된 단편을 방출한다.
시그널이 검출 올리고뉴클레오타이드에 의해 발생하는 경우, 절단에 의해 방출된 표지는 어떠한 온도에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 표지를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드가 복수의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 경우, 그것은 다양한 방식으로 표지를 가질 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 표지를 가질 수 있거나, 복수의 올리고뉴클레오타이드 모두는 최소 하나의 표지를 가질 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오타이드의 한 부위는 최소 하나의 표지를 가질 수 있고 다른 부위는 표지를 갖지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 시그널은 제1 및 제2 프라이머의 연장 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 및/또는 제2 프라이머는 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장 이합체는 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위를 함유한다. 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위는 본 발명의 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머의 연장에 의해 발생할 수 있다. 엔도뉴클레오리틱 부위 또는 제한 인식 부위는 상기 부위에 특이적인 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소의 작용에 의해 절단될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장 이합체는 절단되어 단편을 방출한다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 이용하는 방법은 시그널 발생에 적용될 수 있다.
단계 (c): 시그널의 검출( 130 )
다음으로, 증폭 반응 동안 또는 후에 검출가능한 시그널이 검출된다. 상기 시그널의 검출은 연장 이합체의 존재를 나타내고, 연장 이합체의 존재는 연장 이합체의 증폭(연장)을 나타낸다.
상술한 바와 같이, 연장 이합체의 형성, 검출 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 이합체의 형성, 또는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단은 표지로부터의 시그널링을 통해 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다. 따라서, 연장 이합체 또는 검출 올리고뉴클레오타이드의 표지는 연장 이합체 또는 검출 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 이합체의 형성시 실시간으로 검출가능한 시그널을 제공할 수 있거나, 그것은 연장 이합체 또는 검출 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 시그널의 검출은 실시간 방식, 종료점(end-point) 방식 또는 미리 결정된 시간 간격(interval) 방식으로 실시된다. 본원에서 시그널의 실시간 검출은 연장 이합체의 형성, 검출 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 이합체의 형성, 또는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 제공되는 시그널을 각 반복 사이클에 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 시그널의 검출은 하나 이상의 온도에서 실시된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 시그널의 검출은 증폭 반응 동안 또는 후에 하나 이상의 온도에서 실시된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 시그널의 검출은 증폭 반응 동안 1개, 2개 또는 3개의 온도에서 실시된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 시그널의 검출은 증폭 반응 동안 온도를 점진적으로 증가시키거나 감소시키면서 온도 구간에서 실시된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 시그널의 검출은 증폭 반응 후에 온도를 점진적으로 증가시키거나 감소시키면서 온도 구간에서 실시된다.
증폭 반응 동안 또는 후에 온도를 점진적으로 증가시키거나 감소시키면서 온도 구간에서 시그널의 검출하는 것은 본원에서 멜팅 분석으로 지칭될 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 시그널의 검출은 멜팅 분석에 의해 실시된다.
본 발명에서 사용된 용어 "멜팅 분석"은 연장 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 연장 이합체의 멜팅 또는 검출 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 이합체의 멜팅에 의해 얻는 것을 의미하며, 두 개의 다른 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 멜팅 곡선 분석, 멜팅 패턴 분석 및 멜팅 피크 분석을 포함한다. 특히 멜팅 분석은 멜팅 곡선 분석이다.
예를 들어, 연장 이합체가 멜팅되는 경우, 단일 가닥의 제1 프라이머 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 대조적으로, 2개의 프라이머가 다시 서로 혼성화되어 이합체를 형성하는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널의 언퀀칭을 유도하며, 시그널의 변화를 초래한다.
일 구현예에 따르면, 증폭 반응은 연장 이합체를 변성시키는 단계, 변성된 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머와 혼성화시키는 단계, 및 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 연장시켜 연장 이합체를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 이론에 구속되지 않으면서, 연장 이합체는 2가지 방식으로 형성될 수 있다: (a) 2개의 프라이머 간의 혼성화 및 이의 연장에 의해 형성된 연장 이합체; 및 (b) 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 연장 산물 간의 혼성화(또는 제2 프라이머 및 제1 프라이머의 연장 산물 간의 혼성화) 및 제1 프라이머의 연장에 의해 형성된 연장 이합체. 상기 2개의 연장 이합체의 구조는 동일하므로, 상기 2개의 연장 이합체는 본 발명의 연장 이합체에 의해 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 연장 이합체를 멜팅시키거나 연장 이합체를 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계는 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 의해 제공된 시그널을 검출함으로써 실시된다.
멜팅 곡선 또는 혼성화 곡선은 종래의 기술들, 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같이 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 곡선 또는 혼성화 곡선은 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 곡선 또는 혼성화 곡선은, 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 형광이, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅(plotting) 된 아웃풋 시그널을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 반복 사이클 사이에 변성과정을 포함하여 상기 단계 (b)-(c)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 반복은 다이머-형성 프라이머 쌍 및/또는 시그널을 증폭시킨다.
단계 (d): 증폭을 나타내는 지표(indicator)의 수득( 140 )
다음으로, 단계 (c)에서 제공된 시그널로부터 증폭을 나타내는 지표를 수득한다.
본원에서 사용된 용어 "증폭을 나타내는 지표(indicator)"는 단계 (c)에서 검출된 시그널로부터 얻을 수 있는, 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭(또는 연장)의 발생과 밀접한 관련이 있는 지표를 의미한다. 상기 지표는 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭에 의존적으로 생성되는 값을 의미할 수 있다. 상기 지표는 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭이 증가할수록 더 큰 수치 또는 더 작은 수치를 제공할 수 있다. 상기 지표는 증폭을 나타내는 한 어떠한 지표일 수 있다.
상기 지표는 단계 (e)의 성능 평가에 직접적으로 사용될 수도 있다. 택일적으로, 상기 지표는 이의 추가적인 변형 및 가공 후 간접적으로 사용될 수 있다. 상기 지표는 수치이거나, 형태이거나, 또는 임의의 다른 표현일 수 있다.
상기 지표는 증폭 곡선 또는 멜팅 곡선으로부터 수득된 것을 포함할 수 있다. 특히, 상기 지표는 증폭 곡선에서 특정 사이클에서의 시그널의 값(예컨대, RFU), 각 사이클에서의 시그널의 값, 또는 특정 사이클 간의 시그널의 값의 차이, 또는 멜팅 곡선에서 최대 멜팅 피크의 높이, 면적 또는 폭을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 지표는 Ct(cycle threshold), ΔRFU(예를 들어, 두 사이클의 RFU 차이), RFU 비율(예를 들어, 두 사이클에서의 RFU 비율), End-RFU(종료점(end-point)에서의 RFU) 및 멜팅 피크 높이(예를 들어, 멜팅 곡선에서 최대 피크의 높이), 멜팅 피크 폭(예를 들어, 멜팅 곡선에서 최대 피크의 폭), 멜팅 피크 면적(예를 들어, 멜팅 곡선에서 최대 피크하 면적), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭을 나타내는 지표는 Ct 값이다. Ct 값은 증폭 곡선과 역치 선(threshold line) 간의 교차점이다. Ct 값은 일차 도함수 최대 또는 이차 도함수 최대일 수 있다. Ct 값은 당업계에 널리 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭을 나타내는 지표는 증폭 곡선에서 ΔRFU 또는 RFU 비율이다. 예를 들어, 상기 지표는 두 사이클에서의 RFU 간의 차이(빼기) 또는 비율(나누기)이다. 예를 들어, 상기 지표는 증폭 곡선에서 초기 사이클 또는 배경 영역에서의 RFU 값과 마지막 사이클 또는 정체기(plateau) 영역에서의 RFU 값 사이의 차이 또는 비율이다. RFU 비율은 실시간 PCR 결과의 시그널 대 노이즈 비율을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭을 나타내는 지표는 End-RFU이다. End-RFU는 증폭 반응의 종료점, 즉 증폭 곡선의 마지막 사이클에서의 RFU 값을 가리킨다. End-RFU 값의 개념은 당업계에 널리 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭을 나타내는 지표는 멜팅 피크 높이이다. 멜팅 피크 높이는 멜팅 분석을 위해 수득된 멜팅 곡선의 도함수에서 최대 피크의 높이를 가리킨다. 상기 멜팅 분석은 증폭 반응의 완료 후 형성된 이합체의 멜팅에 의해 발생되는 시그널을 검출하거나, 형성된 이합체의 멜팅 후 혼성화에 의해 발생되는 시그널을 검출하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "멜팅 분석"은 달리 명시하지 않는 한 좁은 의미의 멜팅 분석뿐만 아니라 혼성화 분석을 포괄하는 의미로 사용된다. 좁은 의미의 멜팅 분석은 온도 조절에 의해 증가하는 엄격 조건하에서 이합체의 해리를 측정하는 방법을 의미한다. 좁은 의미의 혼성화 분석은 온도 조절에 의해 감소하는 엄격 조건하에서 이합체의 결합을 측정하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭을 나타내는 지표는 멜팅 피크 폭 또는 면적이다. 상기 멜팅 피크 폭 또는 면적은 멜팅 분석을 위해 수득된 멜팅 곡선의 도함수에서 최대 피크의 폭 또는 면적을 가리킨다. 상기 멜팅 피크 폭 또는 면적은 당업계에 널리 알려져 있다.
전술한 지표는 증폭 반응에서 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭(또는 연장)의 발생과 밀접한 관련이 있다. 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소의 성능의 변화는 증폭 반응에 영향을 미쳐 지표의 변화를 초래한다. 예를 들어, 상대적으로 우수한 성능을 갖는 구성요소는 상대적으로 좋지 않은 성능을 갖는 구성요소와 비교하여 Ct 값 감소, End-RFU 증가, 또는 멜팅 피크 높이, 폭, 또는 면적의 증가를 가질 것이다. 따라서, 구성요소의 성능은 수득된 지표에 의해 용이하게 평가할 수 있다.
단계 (e): 구성요소의 성능의 평가( 150 )
마지막으로, 단계 (d)에서 수득된 지표에 의해 구성요소의 성능을 평가한다.
본원에 사용된 문구 "지표에 의해 구성요소의 성능을 평가하는 것"은 상기 지표를 직접 사용하거나 상기 지표를 추가적인 변형 및 가공 후에 간접적으로 사용하여 구성요소의 성능을 평가하는 것을 의미한다.
상기 지표는 Ct(사이클 역치), ΔRFU, RFU 비율, End-RFU 및 멜팅 피크 높이, 멜팅 피크 폭, 멜팅 피크 면적, 및 이의 조합을 포함하며, 상기 지표의 대소는 구성요소의 성능을 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "구성요소(component)"는 증폭 반응에 관여하는 요소를 가리킨다. 특히, 본원에서 구성요소는 증폭 반응 또는 그 결과 또는 그 결과의 해석에 유의한 영향을 미치는 요소를 가리킨다.
일 구현예에서, 본원에서 구성요소는 증폭 반응용 조성물 내의 임의의 구성요소뿐만 아니라 증폭 장치 내의 임의의 구성요소이다. 일 구현예에서, 구성요소는 관심 핵산 서열의 검출을 위해 준비된 임의의 샘플이다.
한편, 본원에서 사용되는 용어 "관심 구성요소" 또는 "평가될 구성요소"는 성능을 평가하고자 선택된 구성요소를 가리킨다. 상기 관심 구성요소는 본 발명의 실시자에 의해 본 발명의 방법을 실시하기 전에 선택될 수 있다.
관심 구성요소와 관련하여 본원에 사용된 용어 "성능"은 증폭 반응 또는 검출 반응을 촉진 또는 저해하는 구성요소의 능력 또는 활성, 또는 관심 구성요소가 증폭 반응 또는 검출 반응에 미치는 영향을 가리킨다. 상기 성능은 선택된 구성요소에 따라 다르게 정의될 수 있다.
예를 들어, 핵산 중합효소의 성능은 그의 중합 활성이고; 표지의 성능은 그의 시그널링 성능이며; dNTP의 성능은 새로운 연장 가닥의 형성 동안 혼입되는 능력이고; 완충액의 성능은 증폭(연장)을 위한 환경을 제공하는 능력이며; 마그네슘 이온의 성능은 핵산 중합효소의 활성을 보조하는 능력이고; 첨가제의 성능은 증폭 반응에 기여하는 능력이며; 증폭 장치의 성능은 증폭 반응에서 온도 조절 능력 및/또는 검출 감도이다.
본 발명의 일 구현예에서, 평가될 구성요소는 핵산 중합효소이고, 상기 구성요소의 성능은 그의 중합 활성이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 평가될 구성요소는 표지이고, 상기 구성요소의 성능은 표지의 시그널링 성능이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 평가될 구성요소는 열순환기 및/또는 검출기이고, 상기 구성요소의 성능은 증폭 반응에서 그의 온도 조절 능력 및/또는 검출 감도이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 평가될 구성요소는 반응 용기이고, 상기 구성요소의 성능은 그의 온도 전달 능력 또는 빛 투과능이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 평가될 구성요소는 샘플이고, 상기 구성요소의 성능은 증폭 반응에 대한 그의 저해 활성이다. 샘플은 구성요소의 성능에 대한 저해 요소, 특히 사용될 프라이머 또는 프로브를 분해하는 저해 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 증폭 조성물은 관심 핵산 서열의 검출을 위해 준비된 샘플을 추가로 포함하고, 샘플은 샘플 내에 이러한 저해 요소가 존재하는지 조사된다.
상기 구성요소의 성능은 다양한 방식으로 평가될 수 있다. 본 발명의 방법의 특징은 전술한 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용하여 구성요소의 성능을 평가하는 것이다. 따라서, 본 발명은 특정 지표의 사용에 특별히 제한되지 않는다. 일부 예가 하기에 기재되어 있으나, 당업자에 의해 다양한 변형이 이뤄질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
구체적으로, 구성요소의 성능은 단계 (d)에서 수득된 지표 자체에 의해 결정되거나, 단계 (d)에서 수득된 지표를 참조 지표와 비교함으로써 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 구성요소의 성능은 단계 (d)에서 수득된 지표 자체에 의해 결정될 수 있다.
상기 평가는 평가될 증폭 관련 인자를 제외한 표준 조건 하에서 증폭 반응으로부터 지표를 수득하고 상기 수득된 지표를 구성요소의 성능으로 간주함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 중합효소의 성능을 평가하고자 하는 경우, 증폭 반응은 핵산 중합효소를 사용하여 미리 결정된 조건 하에서 수행된다. 상기 미리 결정된 조건은 구성요소의 유형 및 양 및 증폭 장치의 유형뿐만 아니라 증폭 반응을 위한 온도 등이 동일한 조건을 가리킨다. 이후, 상기 증폭 반응으로부터 지표를 수득하고, 상기 지표를 상기 핵산 중합효소의 성능으로 간주한다. 상기 지표는 미리 결정된 조건 하에서의 상기 핵산 중합효소의 성능을 가리킨다. 이와 마찬가지로 다른 핵산 중합효소 역시 상기 미리 결정된 조건 하에서 또 다른 증폭 반응에 의해 수득된 지표에 기초하여 평가될 수 있다.
일 구현예에서, 구성요소의 성능은 단계 (d)에서 수득된 지표를 참조(reference) 반응으로부터 수득된 참조 지표와 비교함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "참조 반응"은 평가될 구성요소를 사용한 증폭 반응과 대비되는 임의의 반응을 지칭한다. 상기 참조 반응은 평가될 구성요소 대신에 참조 구성요소를 사용한 별개의 반응을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "참조 구성요소"는 관심 구성요소와 비교하기 위하여 사용되는 요소를 가리킨다. 상기 참조 구성요소는 본 발명의 방법에 의해 평가될 구송요소와 유형, 양 또는 제조 시간과 같은 어떠한 상이한 특징이 상이한 구성요소를 가리킨다. 예를 들어, 박테리오파아지 DNA 중합효소의 성능을 평가하고자 하는 경우, 참조 구성요소는 Taq 중합효소일 수 있고; Taq 중합효소의 특정 양의 성능을 평가하고자 하는 경우, 참조 구성요소는 Taq 중합효소의 상이한 양일 수 있다.
참조 반응은 관심 구성요소 대신에 참조 구성요소를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 참조 구성요소는 관심 구성요소에 대응되는 구성요소일 수 있다. 참조 구성요소는 공지된 성능을 갖는 구성요소, 또는 공지된 성능을 갖지는 않지만 비교를 위해 사용자에 의해 선택된 대조군 구성요소일 수 있다.
상기 참조 구성요소를 사용한 증폭 반응에 의해 "참조 지표"가 수득된다. 본원에서 사용된 "참조 지표"는 관심 구성요소의 지표와 비교하기 위하여 참조 구성요소를 사용한 증폭 반응으로부터 수득된 지표를 가리킨다.
구체적으로, 참조 반응은 관심 구성요소 대신에 참조 구성요소를 사용하여 본 발명의 방법을 실시함으로써 수행될 수 있고, 상기 참조 반응으로부터 참조 지표를 수득할 수 있다.
상기 참조 지표는 하나의 참조 구성요소를 사용한 하나의 반응으로부터 수득된 것일 수 있거나, 또는 하나의 참조 구성요소를 사용한 복수의 참조 반응으로부터 수득된 것일 수 있다. 참조 지표가 복수의 참조 반응으로부터 수득되는 경우, 상기 참조 지표는 복수의 참조 반응으로부터 수득된 참조 지표들의 평균이거나, 복수의 참조 반응으로부터 수득된 참조 지표들의 범위 또는 상기 범위 중 임의의 값일 수 있다.
일 예로서, 공지된 활성을 갖는 참조 핵산 중합효소를 사용하여 본 발명의 방법을 실시한 후, 수득된 Ct 값을 "참조 지표"로서 사용할 수 있다. 다른 예로서, 공지된 활성을 갖는 참조 핵산 중합효소를 사용하여 본 발명의 방법을 반복 실시한 후, 수득된 Ct 값들의 평균, 수득된 Ct 값들의 범위, 또는 상기 범위 내의 임의의 값을 참조 지표로 사용할 수 있다.
상기 참조 지표는 관심 구성요소에 대하여 수득된 지표와 비교된다. 상기 비교는 두 개의 지표의 대소를 결정하는 것 또는 상기 두 개의 지표로부터 또 다른 값을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 참조 지표와의 비교는 관심 구성요소의 성능이 참조 지표와 비교하여 우수 또는 열악한지 결정할 수 있다.
관심 구성요소의 성능의 결정은 사용된 지표에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 사용된 지표가 Ct 값인 경우, 큰 지표는 열악한 성능을 나타낼 수 있는 반면, 사용된 지표가 End-RFU 또는 멜팅 피크 높이인 경우, 큰 지표는 우수한 성능을 나타낼 수 있다.
참조 지표를 사용하는 일 구현예에서, 구성요소의 성능은 표준 곡선과의 비교를 통해 결정될 수 있다.
상기 표준 곡선은 공지된 성능을 갖는 복수의 참조 구성요소를 사용한 증폭 반응에 의해 복수의 지표를 얻은 다음, 상기 복수의 지표를 상기 성능에 대해 플롯팅하여 준비될 수 있다. 이후, 관심 구성요소를 사용하여 지표를 얻고, 상기 지표를 상기 표준 곡선과 비교하여 구성요소의 성능을 결정할 수 있다.
일 예로서, 관심 핵산 중합효소의 성능은 하기와 같이 표준 곡선을 사용하여 평가될 수 있다.
먼저, 다양한 유닛의 핵산 중합효소를 사용하여 증폭 반응을 수행하여 둘 이상의 Ct 값을 수득한다. 이후, 상기 수득된 Ct 값을 핵산 중합효소의 유닛에 대해 플롯팅하여 표준 곡선을 수득한다.
다음으로, 관심 핵산 중합효소를 사용하여 또 다른 증폭 반응을 수행하여 Ct 값을 수득한다. 이후, 상기 수득된 Ct 값을 표준 곡선과 비교하여 대응하는 핵산 중합효소의 유닛을 계산한다. 상기 결과를 바탕으로, 관심 핵산 중합효소의 유닛을 계산할 수 있다.
구체적으로, 다양한 구성요소의 성능은 다음과 같이 평가될 수 있다.
(1-1) 핵산 중합효소의 성능 평가
관심 핵산 중합효소의 성능은 미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표 자체에 의해 또는 미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표와 참조 지표와의 비교에 의해 결정될 수 있다.
지표 자체에 의한 성능 평가는, 관심 핵산 중합효소를 미리 결정된 조건 하에서 증폭 반응시킨 후, 수득된 지표(예컨대, Ct 값, ΔRFU, RFU 비율, End-RFU 또는 멜팅 피크, 멜팅 피크 폭, 멜팅 피크 면적, 및 이의 조합)를 상기 핵산 중합효소의 성능으로 간주할 수 있다.
미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표와 참조 지표와의 비교에 의한 성능 평가는 다음과 같이 수행될 수 있다.
먼저, 공지된 중합 활성(또는 유닛)을 갖는 참조 핵산 중합효소를 선택한다. 상기 참조 핵산 중합효소를 사용한 증폭 반응을 반복하여 수행하여 복수의 지표를 수득한다. 상기 수득된 지표의 평균을 "참조 지표"로 간주한다.
다음으로, 관심 핵산 중합효소를 사용하여 본 발명의 방법을 실시하여 참조 지표와 대응되는 지표를 수득한다. 상기 관심 핵산 중합효소를 사용한 반응은 앞서 실시된 참조 반응과 별개의 반응으로 진행한다. 상기 수득된 지표를 참조 지표와 비교한다.
상기 비교 결과, 관심 핵산 중합효소에 대한 지표가 참조 핵산 중합효소에 대한 참조 지표와 비교하여 우수한 증폭을 나타내는 경우, 상기 관심 핵산 중합효소는 참조 핵산 중합효소보다 우수한 것으로 결정되는 반면, 관심 핵산 중합효소에 대한 지표가 참조 핵산 중합효소에 대한 참조 지표와 비교하여 열악한 증폭을 나타내는 경우, 상기 관심 핵산 중합효소의 성능은 참조 핵산 중합효소보다 열악한 것으로 결정된다.
예를 들어, 참조 핵산 중합효소를 이용한 증폭 반응에 의해 수득된 Ct 값이 "30"이라고 가정할 때, Ct 값 "20"을 갖는 핵산 중합효소는 참조 핵산 중합효소보다 우수한 성능을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 다른 예로서, 참조 핵산 중합효소를 이용한 증폭 반응에 의해 수득된 Ct 값이 "30"이라고 가정할 때, Ct 값 "40"을 갖는 핵산 중합효소는 참조 핵산 중합효소보다 열악한 성능을 갖는 것으로 결정될 수 있다.
상기 핵산 중합효소의 성능의 우수한 성능은 상기 핵산 중합효소가 참조 핵산 중합효소보다 더 높은 중합 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
전형적으로, 구성요소의 성능의 평가는 표준 균주로부터의 주형 DNA 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 및 표지된 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법에 의해 수행되었다. 하지만, 상기 방법은 (i) 반응 조건 및 사용되는 프라이머 및 프로브의 서열을 최적화하는 어려움; (ii) 사용된 구성요소들 간의 비특이적 간섭(interference) 가능성; (iii) 반응의 낮은 민감도와 같은, 실제 구성요소의 성능을 정확히 결정하는데 심각한 단점이 있다.
대조적으로, 본 발명의 방법은 주형, 프라이머(들) 및 프로브(들) 대신에 다이머-형성 프라이머 쌍을 사용하여 상기 단점을 극복할 수 있다.
(1-2) 열순환기 및/또는 검출기의 성능 평가
열순환기 및/또는 검출기의 성능은 미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표 자체에 의해 또는 미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표와 참조 지표와의 비교에 의해 결정될 수 있다.
지표 자체에 의한 성능 평가는, 미리 결정된 조성 및 농도를 갖는 증폭 조성물을 관심 증폭 장치에서 미리 결정된 조건 하에서 열순환기 및/또는 검출기에 적용한 다음, 수득된 지표를 상기 열순환기 및/또는 검출기의 성능으로 간주함으로써 달성될 수 있다.
미리 결정된 조건 하에서 지표와 참조 지표와의 비교에 의한 성능 평가는 다음과 같이 달성될 수 있다.
먼저, 공지된 온도 조절 능력 및/또는 검출 감도를 갖는 참조 열순환기 및/또는 검출기를 선택한다. 참조 열순환기 및/또는 검출기를 사용한 증폭 반응을 반복적으로 수행하여 복수의 지표를 수득한다. 상기 수득된 지표의 평균을 "참조 지표"로 간주한다.
다음으로, 관심 참조 열순환기 및/또는 검출기를 사용한 또 다른 증폭 반응을 수행하여 지표를 수득한다. 상기 수득된 지표를 참조 지표와 비교한다.
상기 비교 결과, 관심 증폭 장치에 대한 지표가 참조 증폭 장치에 대한 참조 지표와 비교하여 우수한 증폭을 나타내는 경우, 상기 관심 열순환기 및/또는 검출기의 성능은 참조 증폭 장치보다 우수한 것으로 결정되는 반면, 관심 증폭 장치에 대한 지표가 참조 증폭 장치에 대한 참조 지표와 비교하여 열악한 증폭을 나타내는 경우, 관심 증폭 장치에 대한 성능은 참조 증폭 장치보다 열악한 것으로 결정된다.
예를 들어, 참조 열순환기 및/또는 검출기를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 End-RFU 값이 "5000"이라고 가정할 때, End-RFU 값 "4000"을 갖는 열순환기 및/또는 검출기는 참조 열순환기 및/또는 검출기보다 열악한 성능을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 다른 예로서, 참조 열순환기 및/또는 검출기를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 End-RFU 값이 "5000"이라고 가정할 때, End-RFU 값 "6000"을 갖는 열순환기 및/또는 검출기는 참조 열순환기 및/또는 검출기보다 우수한 성능을 갖는 것으로 결정될 수 있다.
증폭 장치의 우수한 성능은 증폭 장치가 증폭 반응에서 더 높은 온도 조절 능력 및/또는 검출 감도를 갖는다는 것을 의미한다.
(1-3) 표지의 성능 평가
특정 표지의 성능은 미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표 단독에 의해 또는 참조 지표와의 비교에 의해 결정될 수 있다.
지표 자체의 의한 성능 평가는 관심 표지를 미리 결정된 조건 하에 증폭 반응시킨 다음, 수득된 지표를 상기 표지 시스템의 성능으로 간주함으로써 달성될 수 있다.
미리 결정된 조건 하에서 수득된 지표와 참조 지표와의 비교에 의한 성능 평가는 다음과 같이 수행될 수 있다.
먼저, 관심 표지에 대응되는 참조 표지를 갖는 다이머-형성 프라이머 쌍을 선택한다. 상기 대응되는 참조 표지는 관심 표지와 동일한 시그널링 방식을 갖는 표지일 수 있다. 예를 들어, 관심 표지가 단일 표지인 경우, 대응되는 참조 표지도 단일 표지이다. 관심 표지가 상호작용적 이중 표지인 경우, 대응되는 참조 표지도 상호작용적 이중 표지이다. 상기 대응되는 참조 표지는 관심 표지와 상이한 시그널링 방식을 갖는 표지일 수 있다.
참조 표지는 상이한 유형 또는 상이한 조합의 표지일 수 있거나, 관심 표지와 비교하여 올리고뉴클레오타이드 상의 상이한 부위에 연결될 수 있다.
참조 표지를 사용한 증폭 반응은 반복적으로 수행되어 복수의 지표를 수득한다. 상기 수득된 지표의 평균을 "참조 지표"로 간주한다.
다음으로, 관심 표지를 사용한 또 다른 증폭 반응을 수행하여 지표를 수득한다. 상기 수득된 지표를 참조 지표와 비교한다.
상기 비교 결과, 관심 표지 시스템에 대한 지표가 참조 표지에 대한 참조 지표와 비교하여 우수한 증폭을 나타내는 경우, 상기 관심 표지의 성능은 참조 표지보다 우수한 것으로 결정되는 반면; 관심 표지에 대한 지표가 참조 표지와 비교하여 열악한 증폭을 나타내는 경우, 상기 관심 표지의 성능은 참조 표지와 비교하여 열악한 것으로 결정된다.
예를 들어, 참조 표지를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 End-RFU 값이 "5000"이라고 가정할 때, End-RFU 값 "4000"을 갖는 표지는 참조 표지보다 열악한 성능을 갖는 것으로 결정할 수 있다. 다른 예로서, 참조 표지를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 End-RFU 값이 "5000"이라고 가정할 때, End-RFU 값 "6000"을 갖는 표지는 참조 표지보다 우수한 성능을 갖는 것으로 결정할 수 있다.
상기 표지의 우수한 성능은 상기 표지가 참조 표지보다 더 높은 시그널링 성능을 갖는다는 것을 의미한다.
전술한 구성요소의 성능 평가 방법은 종래의 다양한 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 조합될 수 있는 종래의 방법은 문헌[Richardson, C. D. et al. (1964) J. Biol . Chem . 239, 222-232; Griep, M. A. (1995) Anal. Biochem . 232, 180-189; Seville, M., et al. (1996) Biotechniques 21, 664, 668, 670, 672; Tveit, J. et al. (2001) Anal. Biochem . 289, 96-98; Yu, Liming, et al. (2002) Biotechniques 33, 938-941; Ma, C. et al. (2006) Anal. Biochem . 353, 141-143); Luo, X. et al. (2011) Electroanalysis 23 923-926]에서 발견된다.
II. 본 발명의 방법의 응용
본 발명에 따른 구성요소의 성능 평가 방법은 다양한 방식으로 응용될 수 있다.
(1) 품질 관리
본 발명의 방법은 구성요소의 품질 관리(quality control)에도 적용될 수 있다. 구성요소의 품질은 배치(batch)마다 또는 시간이 경과함에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 구성요소의 품질은 본 발명의 방법을 사용하여 각 배치에서의 구성요소의 성능을 평가함으로써, 또는 시간 경과에 따라 구성요소의 성능을 평가함으로써 제어될 수 있다.
예를 들어, 참조 배치 및 새로운 배치에서 생상된 핵산 중합효소의 성능을 본 발명의 방법에 의해 평가한다. 이후, 상기 새로운 배치에서 생산된 핵산 중합효소의 성능을 참조 배치에서의 핵산 중합효소의 성능과 비교함으로써 새로운 배치에서의 핵산 중합효소가 사용에 적합한지 결정한다.
택일적으로, 핵산 중합효소의 활성이 시간 경과에 따라 감소하는지 결정하기 위해, 핵산 중합효소의 활성은 미리 결정된 시간의 경과 전후에 비교될 수 있다.
(2) 유통 기한 설정
본 발명의 방법은 구성요소의 유통 기한을 설정하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 중합효소의 활성은 초기 생산으로부터 미리 결정된 시간 간격으로 평가된다. 활성이 특정 기간 후에 미리 결정된 수준 미만으로 떨어지는 경우, 상기 시간이 핵산 중합효소의 유통 기한으로 결정될 수 있다.
(3) 내부 대조군
본 발명의 방법에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 내부 대조군(internal control)로서 사용될 수 있다.
일반적으로, 내부 대조군은 증폭 반응 또는 핵산 추출 과정에 대한 샘플의 저해 활성을 모니터링하는데 사용된다. 내부 대조군은 (i) 샘플에 함유될 것으로 의심되는 표적 핵산 서열과 무관한 주형 및 (ii) 주형을 증폭 및 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 포함한다. 내부 대조군으로서의 요건을 만족하기 위해서는, 내부 대조군의 증폭 효율이 샘플 내에 포함된 타겟 핵산 서열의 증폭에 의해 영향을 받지 않아야 하거나 그 반대이다.
상기 내부 대조군의 증폭은 샘플이 증폭 반응에 대해 저해 활성이 없다는 것, 즉 샘플이 증폭 반응을 저해하는 물질이 없다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 종래 내부 대조군의 구성요소, 즉 주형, 프라이머 및 프로브를 대체할 수 있다. 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 샘플 내의 타겟 핵산 서열의 증폭 반응에 추가로 첨가되어, 상기 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭이 타겟 핵산 서열의 증폭과 동시에 일어날 수 있다. 상기 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭은 샘플 내에 증폭 반응에 대한 저해 물질이 존재하는지 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍의 사용은 다음과 같이 구현될 수 있다.
먼저, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서, 관심 핵산 서열의 검출을 위해 준비된 샘플을 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하는 증폭 조성물에 추가로 첨가한다.
상기 증폭 조성물은 다이머-형성 프라이머 쌍을 증폭하기 위한 구성요소뿐만 아니라 샘플 내에 포함된 타겟 핵산 서열을 증폭하기위한 구성요소를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 증폭 조성물은 다이머-형성 프라이머 쌍 및 상기 다이머-형성 프라이머 쌍을 증폭하기 위한 핵산 중합효소, dNTPs, 완충액, 염 등뿐만 아니라 샘플 및 타겟 핵산 서열을 증폭하기 위한 프라이머, 프로브, 핵산 중합효소, dNTPs, 완충액, 염 등을 포함할 수 있다. 상기 구성요소 중에서, 핵산 중합효소, dNTPs, 완충액, 염 등은 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭 및 타겟 핵산 서열의 증폭 모두에 공통적으로 사용될 수 있다. 그러나, 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭에 의해 발생하는 시그널과 타겟 핵산 서열의 증폭에 의해 발생하는 시그널을 구별하기 위하여, 다이머-형성 프라이머 쌍에서 사용되는 표지 시스템과 상기 타겟 핵산 서열을 증폭하기 위한 프로브에 사용되는 표지 시스템은 서로 상이한 것이 바람직하다. 예를 들어, 다이머-형성 프라이머에 사용된 표지는 상기 프로브에 사용된 표지와 상이한 파장의 빛을 방출할 수 있다.
다음으로, 단계 (b)에서 상기 증폭 반응용 조성물을 증폭 반응에 적용한다. 이 반응 동안, 샘플이 저해 물질이 갖지 않는 경우, 다이머-형성 프라이머 쌍은 연장 이합체를 형성하여 검출가능한 시그널을 제공할 것이다. 그러나, 샘플이 저해 물질을 갖는 경우, 다이머-형성 프라이머 쌍은 연장 이합체를 형성하지 못하여 유의하게 낮은 시그널을 제공할 것이다. 따라서, 상기 다이머-형성 프라이머 쌍으로부터 유래된 시그널을 측정함으로써 샘플 내에 저해 물질의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 내부 대조군으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머 쌍을 내부 대조군으로 사용하는 구현예에 따르면, 평가될 구성요소는 샘플이고, 상기 구성요소의 성능은 증폭 반응에 대한 저해 활성이다.
(4) 정량 표준
본 발명의 방법에 다른 다이머-형성 프라이머 쌍은 정량 표준으로서 사용될 수 있다.
일반적으로, 타겟 핵산 서열의 정량은 공지된 표준물질의 희석 시리즈를 사용하여 증폭 반응을 수행하여 타겟 핵산 서열의 초기 양의 로그 값이 Ct 값에 대해 플롯팅된 표준 곡선을 수득한 다음, 미지의 샘플로부터 수득된 Ct 값을 표준 곡선과 비교하여 샘플 내 타겟 핵산 서열의 양을 계산함으로써 달성된다. 다이머-형성 프라이머 쌍은 표준물질을 대신에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍은 복수의 연장 이합체를 형성하여, 서로 구별되는 시그널을 발생할 수 있다.
예를 들어, 2개의 다이머-형성 프라이머 쌍, 예컨대 제1 프라이머 및 제2 프라이머로 구성된 제1 프라이머 쌍 및 제3 프라이머 및 제4 프라이머로 구성된 제2 프라이머 쌍이 사용되는 경우, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 제1 연장 이합체를 형성하고, 상기 제3 프라이머 및 제4 프라이머는 제2 연장 이합체를 형성하며, 상기 제1 연장 이합체 및 상기 제2 연장 이합체 각각은 상이한 시그널을 발생시킬 수 있는 표지 시스템을 갖는다.
복수의 다이머-형성 프라이머 쌍의 사용은 단일 다이머-형성 프라이머 쌍에 비해 핵산 중합효소의 중합 활성을 더욱 민감하게 측정할 수 있다. 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍이 증폭에 대해 상이한 우선 순위, 즉 상이한 증폭 정도를 갖는 경우, 각 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭은 핵산 중합효소의 중합 활성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 높은 중합 활성을 갖는 중합효소는 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍 모두를 유의하게 증폭시키는 반면, 낮은 중합 활성을 갖는 중합효소는 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍 중 일부를 증폭시킬 것이다. 따라서, 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍의 증폭을 모니터링함으로써 핵산 중합효소의 활성을 평가할 수 있다. 즉, 복수의 다이머-형성 프라이머 쌍을 사용하는 경우, 각 다이머-형성 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 중합효소의 활성을 측정하고 결과를 종합함으로써 핵산 중합효소의 활성을 평가할 수 있다.
III.
키트
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소의 성능을 평가하기 위한 키트를 제공한다:
제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 다이머-형성 프라이머(dimer-forming primer) 쌍,
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 3'-다이머 형성 부위를 포함하고, 상기 제1 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이며; 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 증폭 조건 하에서 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 각각 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 설명은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은, 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화가 유의한 영향을 받지 않는 한, 2개 이하의 비상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위는 서로 완전히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위는 각각 3 내지 50 뉴클레오타이드 길이이다. 본 발명의 일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40 또는 50 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위는 각각 3-50, 3-40, 3-35, 3-30, 3-25, 3-20, 3-17, 3-15, 3-12, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-50, 4-40, 4-35, 4-30, 4-25, 4-20, 4-17, 4-15, 4-12, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-50, 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-17, 5-15, 5-12, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-50, 6-40, 6-35, 6-30, 6-25, 6-20, 6-17, 6- 15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-50, 7-40, 7-35, 7-30, 7-25, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8-17, 8-15, 8- 12, 8-10, 8-9, 9-50, 9-40, 9-35, 9-30, 9-25, 9-20, 9-17, 9-15, 9-12, 9-10, 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-17, 10-15, 10-12, 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-25, 12-20, 12-17, 12-15, 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-25, 15-20, 15-17 또는 17-20 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정한 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위는 각각 5 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 8 뉴클레오타이드, 9 뉴클레오타이드 또는 10 뉴클레오타이드 길이이다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 2개의 부위: (i) 5'-템플레이팅 부위(5'-templating portion); 및 (ii) 3'-다이머 형성 부위로 구성된다. 상기 5'-템플레이팅 부위는 또 다른 다이머-형성 프라이머의 3'-다이머 형성 부위와 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머는 증폭을 위해 연장되도록 3' 말단이 블록킹(blocking)되지 않아야 한다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머 쌍을 구성하는 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 어떤 특정 길이를 요구하지 않는다. 일 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 7 내지 100 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 길이는 최소 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60 또는 80 내지 최대 100, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 7-40, 7-60, 7-80, 7-100, 10-40, 10-60, 10-80, 10-100, 15-40, 15-60, 15-80, 15-100, 20-40, 20-60, 20-80, 20-100, 30-40, 30-60, 30-80 또는 30-100 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머에 포함되는 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 다이머-형성 부위를 제외하고 임의의 특정 서열을 요구하지 않는다.
본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머에 포함되는 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 자가-상보적인(self-complementary) 서열을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 본 발명의 다이머-형성 프라이머가 자가-상보적인 서열을 갖는 경우, 이는 상기 자가-상보적인 서열의 혼성화에 의해 이차 구조, 예컨대 헤어핀-스템(hairpin-stem) 구조를 형성할 수 있다. 본 발명의 다이머-형성 프라이머가 자가-상보적인 서열을 갖지 않는 경우, 상기 다이머-형성 프라이머는 랜덤 코일(random-coil)을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 표지를 추가로 포함한다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성하며, 상기 연장 이합체의 존재에 의존적인 방식으로 검출가능한 시그널이 제공된다.
표지는 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 적어도 하나의 표지, (ii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지, (iii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지, (iv) 인터컬레이팅 표지, 또는 (v) 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지이다.
상기 표지는 다이머-형성 프라이머가 연장 이합체의 형성에 의해 시그널을 제공할 수 있는 한 공지된 표지일 수 있다. 상기 표지는 본 발명에서 상세히 설명된다.
일 구현예에서, 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지이고, 상기 상호작용적 이중 표지는 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된다.
다른 구현예에서, 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지이고, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 어느 하나는 제1 프라이머에 연결되고, 다른 하나는 제2 프라이머에 연결된다.
본 발명의 다이머-형성 프라이머 쌍은 추가적인 주형을 사용하지 않고 서로 간의 혼성화에 의해 증폭될 수 있음이 확인되었다(실시예 1 참고). 또한, 본 발명의 방법은 주형 및 프라이머(들)을 사용하는 종래 방식과 비교하여 핵산 중합효소의 유닛에 더 민감한 방식으로 핵산 중합효소의 성능을 측정하는데 유용한 것으로 확인되었다(실시예 2 참고). 나아가, 본 발명의 다이머-형성 프라이머 쌍은 타겟 핵산 서열의 증폭에 영향을 미치지 않으면서 타겟 핵산 서열과 동시에 증폭될 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 CesA3 내부 대조군과 대등한 효과를 나타낸다.
이와 같이, 본 발명에 따른 다이머-형성 프라이머 쌍은 핵산 중합효소를 포함하는 구성요소의 성능을 평가하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 타겟 핵산 서열의 검출시 내부 대조군(internal control)으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 장점은 다음과 같이 요약될 것이다:
(1) 핵산 중합효소의 활성을 평가하기 위한 종래의 방법은 상기 핵산 중합효소를 주형, 상기 주형을 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 및 상기 프라이머의 연장시 시그널을 발생하기 위한 프로브와 반응시키는 것을 필요로 한다. 이에 반해, 본 발명의 방법은 상기 주형, 프라이머 쌍, 및 프로브와 같은 복잡한 구성요소 대신에 다이머-형성 프라이머 쌍을 사용한 증폭 반응에 의해 핵산 중합효소의 활성을 평가할 수 있다.
(2) 종래 방법은 주형과 프라이머 쌍 간의 혼성화 및 주형과 프로브 간의 혼성화와 같은 특이적 혼성화, 및 주형과 주형 간의 혼성화, 프라이머와 프라이머 간의 혼성화, 프로브와 프로브 간의 혼성화 및 프라이머와 프로브 간의 혼성화와 같은 비특이적 혼성화를 고려한, 주형 및 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 프라이머 쌍 및 프로브)의 복잡하고 정교한 설계를 필요로 한다. 이에 반해, 본 발명의 방법은 다이머-형성 프라이머 쌍만을 사용하며, 이는 고려할 사항을 대폭 감소시켜 간단하다.
(3) 종래 방법과 달리, 본 발명에 의해 수득된 지표(예컨대, Ct 값)는 핵산 중합효소의 유닛의 변화에 매우 민감하다. 따라서, 본 발명의 방법은 미지의 핵산 중합효소의 유닛을 추정하는데 유용하다.
(4) 본 발명의 다이머-형성 프라이머 쌍은 타겟 핵산 서열의 검출시 내부 대조군으로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 증폭 반응에 의해 구성요소의 성능을 평가하는 과정을 나타내는 흐름도(100)이다.
도 2는 다이머-형성 프라이머 쌍에 의해 시그널이 발생하는 과정의 일 구현예를 나타낸다. 본 발명의 방법에 따르면, 2개의 프라이머는 3'-다이머-형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성한 다음, 각각 연장되어 연장 이합체를 형성함으로써 시그널을 발생시킨다.
도 3은 다양한 길이의 다이머-형성 부위를 갖는 DFP 쌍 #1, DFP 쌍 #2 및 DFP 쌍 #3을 이용한 증폭 반응에 의하여 수득된 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4는 다양한 유닛의 핵산 중합효소 및 DFP 쌍 #4(DFP 5 및 DFP 6로 구성됨)를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 증폭 곡선(상부 패널); 및 다양한 유닛의 핵산 중합효소 및 DFP 쌍 #1(NG 주형, NG-F, NG-R 및 NG-P로 구성됨)을 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 증폭 곡선(하부 패널)을 나타낸다.
도 5는 내부 대조군의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도(100 pg, 10 pg, 1 pg 또는 NTC)의 타겟 핵산 서열(NG)을 이용한 증폭 반응에 의해 수득된, 타겟 핵산 서열("-O-"로 표시됨) 및 내부 대조군("-△-" or "-□-"로 표시됨)에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 도면에서, "대조군 #1"은 내부 대조군의 부재 하에 다양한 농도의 타겟 핵산 서열(NG)을 사용하여 수득된 증폭 결과를 나타내고(좌측 패널); "대조군 #1+CesA3"은 내부 대조군으로서 CesA3의 존재 하에 다양한 농도의 타겟 핵산 서열(NG)을 사용하여 수득된 증폭 결과를 나타내며(중간 패널); "대조군 #1+DFP 쌍 #1"은 내부 대조군으로서 DFP 쌍 #1의 존재 하에 다양한 농도의 타겟 핵산 서열(NG)을 사용하여 수득된 증폭 결과를 나타낸다(우측 패널).
도 2는 다이머-형성 프라이머 쌍에 의해 시그널이 발생하는 과정의 일 구현예를 나타낸다. 본 발명의 방법에 따르면, 2개의 프라이머는 3'-다이머-형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성한 다음, 각각 연장되어 연장 이합체를 형성함으로써 시그널을 발생시킨다.
도 3은 다양한 길이의 다이머-형성 부위를 갖는 DFP 쌍 #1, DFP 쌍 #2 및 DFP 쌍 #3을 이용한 증폭 반응에 의하여 수득된 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4는 다양한 유닛의 핵산 중합효소 및 DFP 쌍 #4(DFP 5 및 DFP 6로 구성됨)를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 증폭 곡선(상부 패널); 및 다양한 유닛의 핵산 중합효소 및 DFP 쌍 #1(NG 주형, NG-F, NG-R 및 NG-P로 구성됨)을 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 증폭 곡선(하부 패널)을 나타낸다.
도 5는 내부 대조군의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도(100 pg, 10 pg, 1 pg 또는 NTC)의 타겟 핵산 서열(NG)을 이용한 증폭 반응에 의해 수득된, 타겟 핵산 서열("-O-"로 표시됨) 및 내부 대조군("-△-" or "-□-"로 표시됨)에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 도면에서, "대조군 #1"은 내부 대조군의 부재 하에 다양한 농도의 타겟 핵산 서열(NG)을 사용하여 수득된 증폭 결과를 나타내고(좌측 패널); "대조군 #1+CesA3"은 내부 대조군으로서 CesA3의 존재 하에 다양한 농도의 타겟 핵산 서열(NG)을 사용하여 수득된 증폭 결과를 나타내며(중간 패널); "대조군 #1+DFP 쌍 #1"은 내부 대조군으로서 DFP 쌍 #1의 존재 하에 다양한 농도의 타겟 핵산 서열(NG)을 사용하여 수득된 증폭 결과를 나타낸다(우측 패널).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 다이머 형성 프라이머(DFP)의 셀프 증폭의 확인
본 발명의 다이머 형성 프라이머(Dimer-forming primer; DFP)가 추가적인 주형(template)의 부재 하에서도 셀프-증폭에 의해 증폭 산물을 생성할 수 있는지 확인하기 위해, DFP 쌍을 포함하는 증폭 조성물을 사용하여 증폭 반응을 실시하였다.
<1-1> DFP 쌍 #1, #2 및 #3의 제조
하기 표 1에 나타낸 바와 같이 다양한 길이의 다이머 형성 부위(dimer-forming portion)를 갖는 3개의 DFP 쌍을 제조하였다. 구체적으로, DFP 쌍 #1은 3'-말단 부분에 5개의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 DFP 쌍(즉, DFP-1 및 DFP-2)으로 구성되었고(즉, DFP-1의 3'-말단 부분의 "5'-CTGAT-3'"가 DFP-2의 3'-말단 부분의 "5'-ATCAG-3'"와 상보적임); DFP 쌍 #2는 3'-말단 부분에 6개의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 DFP 쌍(즉, DFP-1 및 DFP-3)로 구성되었으며(즉, DFP-1의 3'-말단 부분의 "5'-GCTGAT-3'"가 DFP-3의 3'-말단 부분의 "ATCAGC"와 상보적임); DFP 쌍 #3은 3'-말단 부분에 7개의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 DFP 쌍(즉, DFP-1 및 DFP-4)로 구성되었다(즉, DFP-1의 3'-말단 부분의 "5'-AGCTGAT-3'"가 DFP-4의 3'-말단 부분의 "5'-ATCAGCT-3'"와 상보적임).
각 DFP 쌍으로부터 증폭을 나타내는 시그널을 얻기 위해, 각 DFP 쌍의 하나의 프라이머(DFP-1)를 내부에 형광 리포터 분자(FAM)로 표지하고 5'-말단에 퀀처 분자(BHQ-1)로 표지하였다.
각 쌍의 2개의 DFP는 증폭 조건(특히 어닐링 조건) 하에서 다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 핵산 중합효소의 중합 활성에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성하여, 검출가능한 시그널을 제공한다(도 2 참조).
| 명칭 | 타입 | 서열 (5' → 3') | 서열번호 |
| DFP 쌍 #1 | DFP-1 | 5'-[BHQ-1]TTGGCTTGGCTTGGC[T(FAM)]TTAG CTGAT -3' | 서열번호 1 |
| DFP-2 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAAT ATCAG -3' | 서열번호 2 | |
| DFP 쌍 #2 | DFP-1 | 5'-[BHQ-1]TTGGCTTGGCTTGGC[T(FAM)]TTA GCTGAT -3' | 서열번호 1 |
| DFP-3 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAAT ATCAGC -3' | 서열번호 3 | |
| DFP 쌍 #3 | DFP-1 | 5'-[BHQ-1]TTGGCTTGGCTTGGC[T(FAM)]TT AGCTGAT -3' | 서열번호 1 |
| DFP-4 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAAT ATCAGCT -3' | 서열번호 4 |
(밑줄 친 문자: 다이머-형성 부위)
<1-2>
DFP
쌍 #1, #2 및 #3을 이용한 증폭 반응
실시예 <1-1>에서 제조된 DFP 쌍 #1, #2 및 #3 각각을 포함하는 증폭 조성물을 사용하여 실시간 PCR에 의해 증폭 반응을 수행하였다. 상기 DFP 쌍은 주형의 부재 하에 증폭되어 형광 시그널을 생성하고, 시그널은 실시간으로 검출되어 증폭 곡선을 수득한다.
구체적으로, DFP 쌍 #1(DFP-1 5 pmole 및 DFP-2 5 pmole), DFP 쌍 #2(DFP-1 5 pmole 및 DFP-3 5 pmole) 및 DFP 쌍 #3(DFP-1 5 pmole 및 DFP-4 5 pmole) 각각 및 2.5 mM MgCl2, 200 uM dNTPs 및 2 유닛의 Taq DNA 중합효소를 함유하는 5 ㎕의 4X 마스터 믹스를 포함한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 수행하였고, 상기 반응 혼합물을 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 95℃에서 15분 후, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널을 매 사이클의 57℃에서 측정하였다. 증폭 곡선에 역치(RFU = 200)을 적용하였다.
상기 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, DFP 쌍 #1, #2 및 #3은 증폭 사이클이 진행됨에 따라 전형적인 S자 증폭 곡선을 생성하였다. 상기 결과는 본 발명의 DFP 쌍이 추가적인 주형의 부재 하에서 증폭되었음을 입증한다.
한편, 본 발명의 DFP 쌍은 다이머 형성 부위의 길이에 따라 상이한 증폭 효율을 나타내었다. 구체적으로, DFP 쌍 #1, #2 및 #3을 사용하여 수득된 증폭 곡선은 각각 31.23, 24.93 및 20.37의 CT 값을 나타내었다. 상기 결과는 증폭 효율이 DFP 쌍의 다이머 형성 부위의 길이에 의해 조절될 수 있음을 입증한다.
이와 같이, 본 발명의 DFP 쌍은 추가적인 주형의 이용없이 서로 간의 혼성화에 의해 증폭될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 DFP 쌍은 증폭 반응에 의해 구성요소(예를 들어, 핵산 중합효소, 시그널 제공을 위한 표지, 증폭 용기, 열 블록, 열 순환기, 검출기 등)의 성능을 평가하는데 사용될 수 있다.
실시예
2:
DFP
쌍을 사용한 핵산 중합효소의 성능 평가
본 실시예에서는 본 발명에 따른 DFP 쌍이 핵산 중합효소의 성능, 즉 중합 활성을 평가하는데 사용될 수 있는지 살펴보았다.
<2-1>
DFP
쌍 #4의 제조
핵산 중합효소의 성능을 평가하기 위해, 본 발명에 따른 DFP 쌍 #4를 제조하였다(표 2 참조).
상기 DFP 쌍 #4는 3'-말단 부분에 5개의 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는 2개의 DFP, 즉 DFP-5(서열번호 5) 및 DFP-6(서열번호 6)으로 구성되었다.
DFP 쌍으로부터 증폭을 나타내는 시그널을 얻기 위해, DFP-5를 내부에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지하고 5'-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지하였다.
한편, 주형(Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA), 상기 주형을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍, 즉 정방향 프라이머(NG-F; 서열번호 7) 및 역방향 프라이머(NG-R; 서열번호 8), 및 상기 증폭을 검출하기 위한 프로브 NG-P(서열번호 9)를 대조군으로서 제조하였다. 상기 프로브를 5'-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지하고 3'-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지하였다. 상기 혼합물을 "대조군 #1"로 명명하였다.
| 명칭 | 타입 | 서열 (5' → 3') | 서열번호 |
| DFP 쌍 #4 | DFP-5 | 5'-[Cal Fluor Red 610]TTACCATACCATACC[T(BHQ-2)]TTTT GCGAG -3' | 서열번호 5 |
| DFP-6 | 5'-CAATGGATCGGTATCA CTCGC -3' | 서열번호 6 | |
| 대조군 #1 | NG-F | 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' | 서열번호 7 |
| NG-R | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' | 서열번호 8 | |
| NG-P | 5'-[Cal Fluor Red 610]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' | 서열번호 9 | |
| 주형 | Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA | - |
(밑줄 친 문자: 다이머-형성 부위)
(I: 데옥시이노신)
<2-2>
DFP
쌍을 사용한 핵산 중합효소의 중합 활성 평가
실시예 <2-1>에서 제조된 DFP 쌍 #4를 포함하는 증폭 조성물을 사용하여 실시간 PCR에 의해 증폭 반응을 수행하였다. 비교를 위해, 실시예 <2-1>에서 제조된 대조군 #1을 포함하는 증폭 조성물을 사용하여 동일한 조건 하에 추가적인 증폭 반응을 수행하였다.
특히, 상기 DFP 쌍 #4 및 대조군 #1이 핵산 중합효소의 유닛의 변화에 의해 상이한 지표를 야기할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 증폭 반응에 다양한 유닛의 핵산 중합효소를 사용하였다.
구체적으로, DFP 쌍 #4(DFP-4 5 pmole 및 DFP-5 5 pmole) 및 대조군 #1(NG 지놈 DNA 10 pg, NG-F 5 pmole, NG-R 5 pmole, NG-P 3 pmole) 각각, 2 ㎕의 10X Hot-start PCR 완충액(Thermo Scientific, USA), 2 ㎕의 10X MgCl2(2 mM MgCl2), 200 uM dNTPs 및 4 ㎕의 Maxima Hot Start Taq DNA 중합효소(4 U, 2 U, 1 U, 0.5 U, 0.25 U, 및 0.1 U)(Thermo Scientific, USA)를 포함한 20 ㎕의 최종 부피에서 반응을 수행하였고, 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 반응 혼합물을 95℃에서 4분 동안 변성시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 45 사이클을 수행하였다. 시그널을 매 사이클의 57℃에서 측정하였다. 증폭 곡선에 역치(RFU = 500)를 적용하였다. 증폭을 나타내는 지표로서 Ct(cycle threshold) 값을 사용하였다.
상기 실험 결과를 도 4에 나타내었다. 상부 패널은 DFP 쌍 #4를 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 증폭 곡선을 나타내고, 하부 패널은 대조군 #1을 사용한 증폭 반응에 의해 수득된 증폭 곡선을 나타낸다.
상기 도 4에서 보는 바와 같이, DFP 쌍 #4 및 대조군 #1 모두는 PCR에 의해 S자형 증폭 곡선을 생성하였다. 그러나, 핵산 중합효소의 유닛 변화와 관련하여, 대조군 #1은 핵산 중합효소의 유닛의 증가에도 불구하고 일정한 Ct 값(일정한 증폭 효율)을 나타낸 반면, DFP 쌍 #4는 핵산 중합효소의 유닛이 증가함에 따라 Ct 값의 감소(증폭 효율의 증가)를 나타내었다.
핵산 중합효소의 유닛에 따른 증폭 효율의 변화를 하기와 같이 계산하였다.
핵산 중합효소의 유닛에 따른 증폭 효율의 변화 (△Ct) = (0.1 유닛의 핵산 중합효소에 대한 Ct 값) - (4 유닛의 핵산 중합효소에 대한 Ct 값)
상기 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 중합효소의 유닛 | Ct | △Ct | ||||||
| 4 U | 2 U | 1 U | 0.5 U | 0.25 U | 0.1 U | |||
| 조성물 | DFP 쌍 #4 | 17.74 | 16.97 | 18.02 | 19.39 | 21.39 | 24.46 | 6.72 |
| 대조군 #1 | 33.35 | 33.42 | 33.05 | 33.35 | 33.06 | 33.58 | 0.23 | |
상기 표 3에서 보는 바와 같이, DFP 쌍 #4의 경우, 증폭 효율의 변화(△Ct)는 6.72였으며, 이는 증폭 효율이 핵산 중합효소의 유닛이 변화에 민감하였음을 나타낸다. 이에 반해, 대조군 #1의 경우, 증폭 효율의 변화(△Ct)는 0.23이었으며, 이는 증폭 효율이 핵산 중합효소의 유닛의 변화에도 불구하고 변하지 않았음을 나타낸다.
상기 결과는 대조군 #1과 같이 주형 및 프라이머 등을 사용하는 종래 방법이 핵산 중합효소의 중합 활성을 정확히 확인하는데 한계가 있음을 보여준다. 이에 반해, 본 발명에 따른 DFP 쌍을 사용한 방법은 증폭 효율이 핵산 중합효소의 유닛 변화에 민감하므로 핵산 중합효소의 중합 활성을 측정하는데 더 유용한 것으로 확인되었다.
본 발명에 따르면, 핵산 중합효소의 성능은 DFP 쌍을 일정량의 핵산 중합효소와 반응시켜 Ct 값과 같은 증폭을 나타내는 지표를 수득함으로써 평가될 수 있다. 또한, 핵산 중합효소의 중합 활성의 성능은 상기 핵산 중합효소를 사용하여 수득된 지표를 참조 핵산 중합효소를 사용한 참조 반응으로부터 수득된 지표와 비교함으로써 평가될 수 있다.
실시예
3:
DFP
쌍의 내부 대조군(internal control)으로서의 용도
본 발명에 따른 DFP 쌍이 타겟 핵산 서열의 검출에서 내부 대조군으로서 사용될 수 있는지 살펴보았다.
이를 위해, DFP 쌍 및 NG 타겟 핵산 서열(표적-특이적 프라이머 및 표적-특이적 프로브 사용)의 동시 증폭을 수행하여 상기 DFP 쌍의 증폭이 상기 NG 타겟 핵산 서열의 증폭에 독립적인지 확인하였다.
DFP 쌍이 타겟 핵산 서열의 증폭 반응을 위한 내부 대조군으로서 이용되기 위해서는, NG 타겟 핵산 서열의 증폭 효율이 상기 DFP 쌍의 존재에 의해 영향을 받지 않아야 하며, 그 반대로 마찬가지이다.
<3-1> 대조군 #1, 대조군 #1+
CesA3
및 대조군 #1+
DFP
쌍 #1의 제조
이 실험을 위해, 3개의 조성물인 (i) 타겟 핵산 서열만을 증폭하기 위한 조성물; (ii) 타겟 핵산 서열 및 내부 대조군으로서 CesA3을 동시에 증폭하기 위한 조성물; 및 (iii) 타겟 핵산 서열 및 내부 대조군으로서 본 발명의 DFP 쌍을 동시에 증폭하기 위한 조성물을 제조하였다.
구체적으로, 타겟 핵산 서열만을 증폭하기 위한 조성물은 NG 타겟 핵산 서열, 이를 증폭하기 위한 프라이머(NG-F, 서열번호 7; NG-R, 서열번호 8) 및 증폭된 타겟을 검출하기 위한 프로브(NG-P, 서열번호 9)로 구성되었고, 이를 "대조군 #1"로 명명하였다.
또한, 타겟 핵산 서열 및 CesA3을 동시에 증폭하기 위한 조성물은 대조군 #1, 및 아라비돕시스(Arabidopsis)의 CesA3(셀룰로오스 합성효소 3) 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA, CesA3을 증폭시키기 위한 프라이머(CesA3-F, 서열번호 10; CesA3-R, 서열번호 11) 및 증폭된 CesA3을 검출하기 위한 프로브(CesA3-P, 서열번호 12)로 구성되었고, 이를 "대조군 #1 + CesA3"으로 명명하였다. 상기 프로브(CesA3-P)는 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670)로 표지되고 3'-말단에 퀀처 분자(BHQ-3)로 표지되었다.
또한, 타겟 핵산 서열 및 DFP 쌍을 동시에 증폭하기 위한 조성물은 대조군 #1, 및 실시예 <1-1>에서 제조한 DFP 쌍(DFP-1, 서열번호 1; DFP-2, 서열번호 2)으로 구성되었고, 이를 "대조군 #1 + DFP 쌍 #1"로 명명하였다.
상기 제조된 조성물의 올리고뉴클레오타이드 유형 및 서열을 하기 표 4에 열거하였다.
| 명칭 | 타입 | 서열 (5' → 3') | 서열번호 |
| 대조군 #1 | NG-F | 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' | 서열번호 7 |
| NG-R | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' | 서열번호 8 | |
| NG-P | 5'-[Cal Fluor Red 610]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' | 서열번호 9 | |
| 타겟 | Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA | - | |
| 대조군 #1 + CesA3 |
NG-F | 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' | 서열번호 7 |
| NG-R | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' | 서열번호 8 | |
| NG-P | 5'-[Cal Fluor Red 610]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' | 서열번호 9 | |
| 타겟 | Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA | - | |
| CesA3-F | 5'-ATGGAATCCGAAGGAGAAACCIIIIIAAAGCCGATG-3' | 서열번호 10 | |
| CesA3-R | 5'-TCCTCTCATACTCGTAGCAAGGCIIIIIAACTGGGAATG-3' | 서열번호 11 | |
| CesA3-P | 5'-[Quasar 670]TCTGGCAAGTCTGCGGAACAATG[BHQ-3]-3' | 서열번호 12 | |
| 내부 대조군 주형 | CesA3 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA | - | |
| 대조군 #1 + DFP 쌍 #1 |
NG-F | 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' | 서열번호 7 |
| NG-R | 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' | 서열번호 8 | |
| NG-P | 5'-[Cal Fluor Red 610]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' | 서열번호 9 | |
| 타겟 주형 | Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA | - | |
| DFP-1 | 5'-[BHQ-1]TTGGCTTGGCTTGGC[T(FAM)]TTAGCTGAT-3' | 서열번호 1 | |
| DFP-2 | 5'-GGTTCTCAAGCAACAATATCAG-3' | 서열번호 2 |
(I: 데옥시이노신)
<3-2>
DFP
쌍 및 NG
타겟
핵산 서열의 동시 증폭
실시예 <3-1>에서 제조된 각 조성물을 사용하여 실시간 PCR에 의해 증폭 반응을 수행하였다. DFP 쌍 및 타겟 핵산 서열의 동시 증폭과 프로브의 절단을 위해 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
구체적으로, 대조군 #1(NG-F 5 pmole, NG-R 5 pmole, NG-P 3 pmole 및 NG 지놈 DNA 100, 10, 1, 또는 0 pg), 대조군 #1+CesA3(NG-F 5 pmole, NG-R 5 pmole, NG-P 3 pmole, NG 지놈 DNA 100, 10, 1, 또는 0 pg, CesA3-F 5 pmole, CesA3-R 5 pmole, CesA3-P 3 pmole 및 CesA3 플라스미드 DNA 0.1 pg) 및 대조군 #1+DFP 쌍 #1(NG-F 5 pmole, NG-P 3 pmole, NG 지놈 DNA 100, 10, 1, 또는 0 pg, DFP-1 5 pmole 및 DFP-2 5 pmole) 각각, 및 2 mM MgCl2, 200 uM dNTPs 및 2 U의 Taq DNA 중합효소(Enzynomics, Korea)를 포함하는 5 ㎕의 4X 마스터 믹스를 포함한 20 ㎕의 최종 부피에서 반응을 수행하였고, 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 PCR 열순환기(CFX96 Real-time Cycler, Bio-Rad)에 넣고, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 95℃에서 15분 반응시키고, 95℃에서 10초, 57℃에서 60초, 72℃에서 10초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널을 매 사이클의 57℃에서 측정하였다. FAM 표지, AL Fluor Red 610 표지 및 Quasar 670 표지를 사용하여 수득된 증폭 곡선에 각각 RFU 400, RFU 500 및 RFU 100의 역치를 적용하였다.
상기 결과를 도 5 및 표 5에 나타내었다.
| 조성물 | 대조군 #1 | 대조군 #1 + CesA3 | 대조군 #1 + DFP 쌍 #1 | |||
| 검출 | 타겟 Ct | 타겟 Ct | 내부 대조군 Ct (CesA3) |
타겟 Ct | 내부 대조군 Ct (DFP 쌍) |
|
| 주형 농도 |
100 pg | 26.60 | 26.61 | 28.67 | 26.59 | 32.01 |
| 10 pg | 31.28 | 31.42 | 28.51 | 31.31 | 31.85 | |
| 1 pg | 36.22 | 36.28 | 28.42 | 36.17 | 32.08 | |
| NTC | - | - | 28.40 | - | 31.84 | |
(NTC: 타겟이 없는 대조군(No Target Control))
도 5 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 대조군 #1, 대조군 #1+CesA3, 및 대조군 #1+DFP 쌍 #1 각각을 사용하여 수득된 타겟 핵산 서열에 대한 증폭 곡선(도면에서 "-○-"로 표시됨)은 NG 지놈의 농도가 증가함에 따라 감소된 Ct 값을 나타내었고 NG 타겟 지놈의 동일한 농도에서는 유사한 Ct 값을 나타내었다.
한편, 각 내부 대조군에 대한 증폭 곡선(도면에서 "-△-" 또는 "-□-"로 표시됨)은 NG 타겟 지놈의 농도에 관계없이 유사한 Ct 값을 나타내었다.
구체적으로, 타겟 핵산 서열의 Ct 값은 타겟 핵산 서열 100 pg, 10 pg 또는 1 pg에 대해 대조군 #1 및 대조군 #1+CesA3 사이에서 0.01, 0.14 및 0.06(△Ct)의 차이를 나타내었다. 또한, 타겟 핵산 서열의 Ct 값은 타겟 핵산 서열 100 pg, 10 pg 또는 1 pg에 대해 대조군 #1 및 대조군 #1+DFP 쌍 #1 사이에서 -0.01, 0.03 및 -0.05(△Ct)의 차이를 나타내었다. 상기 결과는 타겟 핵산 서열의 증폭이 내부 대조군 CesA3 또는 DFP 쌍의 존재 또는 증폭에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다.
한편, 내부 대조군 (CesA3)의 Ct 값은 타겟 핵산 서열 100 pg, 10 pg 또는 1 pg 사이에 0.27(△Ct)의 최대 차이를 나타내었고, 내부 대조군 (DFP 쌍)의 Ct 값은 타겟 핵산 서열 100 pg, 10 pg 또는 1 pg 사이에 0.24(△Ct)의 최대 차이를 나타내었다. 상기 결과는 내부 대조군의 증폭이 내부 대조군 CesA3 또는 DFP 쌍의 존재 또는 증폭에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다.
이와 같이, 본 발명에 따른 DFP 쌍은 타겟 핵산 서열의 증폭에 영향을 미치거나 영향을 받지 않으면서 타겟 핵산 서열과 동시에 증폭된 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 DFP 쌍은 종래의 내부 대조군 CesA3과 대등한 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이는 본 발명에 따른 DFP 쌍이 CesA3과 동등한 내부 대조군으로서 사용될 수 있음을 입증한다. 또한, 본 발명의 DFP 쌍은 종래의 내부 대조군과 비교하여 멀티플렉스 PCR과 같이 다수의 타겟 핵산 서열을 증폭하는 조건 하에서 비특이적인 다이머 형성을 감소시키는데 더 효과적일 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: DFP-1
<400> 1
ttggcttggc ttggctttag ctgat 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: DFP-2
<400> 2
ggttctcaag caacaatatc ag 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: DFP-3
<400> 3
ggttctcaag caacaatatc agc 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: DFP-4
<400> 4
ggttctcaag caacaatatc agct 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: DFP-5
<400> 5
ttaccatacc ataccttttt gcgag 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: DFP-6
<400> 6
caatggatcg gtatcactcg c 21
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-F
<400> 7
tacgcctgct actttcacgc tgtaatcaga tg 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-R
<400> 8
caatggatcg gtatcactcg ccgagcaaga ac 32
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: NG-P
<400> 9
tgcccctcat tggcgtgttt cg 22
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CesA3-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n is deoxyinosine
<400> 10
atggaatccg aaggagaaac cnnnnnaaag ccgatg 36
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CesA3-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(28)
<223> n is deoxyinosine
<400> 11
tcctctcata ctcgtagcaa ggcnnnnnaa ctgggaatg 39
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide: CesA3-P
<400> 12
tctggcaagt ctgcggaaca atg 23
Claims (21)
- 다음 단계를 포함하는, 다이머-형성 프라이머(dimer-forming primer) 쌍을 이용한 증폭 반응에 의해 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소(component)의 성능(performance)을 평가하는 방법:
(a) 다이머-형성 프라이머 쌍을 포함하는 증폭 조성물을 제공하는 단계; 상기 다이머-형성 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하며; 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 3'-다이머 형성 부위를 포함하고, 상기 제1 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이며;
(b) 증폭 장치에서 상기 증폭 조성물을 사용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 증폭 조건 하에 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 각각 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성하며; 상기 연장 이합체에 의존적인 방식으로 검출가능한 시그널이 제공되고; 상기 증폭 조성물은 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 혼성화가능한 추가적인 주형을 포함하지 않으며;
(c) 증폭 반응 동안 또는 후에 상기 검출가능한 시그널을 검출하는 단계;
(d) 상기 검출된 시그널로부터 증폭을 나타내는 지표(indicator)를 수득하는 단계; 및
(e) 상기 수득된 지표에 기초하여 구성요소의 성능을 평가하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 평가될 구성요소는 핵산 중합효소이고, 상기 구성요소의 성능은 그의 중합 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 평가될 구성요소는 표지이고, 상기 구성요소의 성능은 그의 시그널링 성능인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 증폭 조성물은 관심 핵산 서열의 검출을 위해 준비된 샘플을 포함하며, 상기 구성요소의 성능은 증폭 반응에 대한 그의 저해 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 평가될 구성요소는 열순환기 및/또는 검출기이고, 상기 구성요소의 성능은 증폭 반응에서 그의 온도 조절 능력 및/또는 검출 감도인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구성요소의 성능은 상기 수득된 지표를 참조(reference) 반응으로부터 수득된 참조 지표와 비교함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 지표는 Ct(cycle threshold), ΔRFU, RFU 비율, End-RFU, 멜팅 피크 높이, 멜팅 피크 폭, 멜팅 피크 면적, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 7 내지 100 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3 내지 50 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 하나 이상의 비상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 검출가능한 시그널은 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 적어도 하나의 표지, (ii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지, (iii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지, (iv) 인터컬레이팅 표지, 또는 (v) 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이합체의 형성시 또는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단시 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 증폭 반응은 연장 이합체를 변성시키는 단계, 변성된 가닥을 제1 프라이머 및 제2 프라이머와 혼성화시키는 단계, 및 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 연장시켜 연장 이합체를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시그널의 검출은 하나 이상의 검출 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 및 (c) 사이에 연장 이합체를 멜팅시키거나 연장 이합체를 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (c)는 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 의해 제공된 시그널을 검출함으로써 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는, 증폭 조성물 또는 증폭 장치 내의 구성요소의 성능을 평가하기 위한 키트:
제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 다이머-형성 프라이머(dimer-forming primer) 쌍;
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 3'-다이머 형성 부위를 포함하고, 상기 제1 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 프라이머 내의 3'-다이머 형성 부위의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이며; 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 증폭 조건 하에서 3'-다이머 형성 부위 간의 혼성화를 통해 다이머를 형성하고, 각각 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장 이합체를 형성하며, 상기 키트는 제1 프라이머 및 제2 프라이머가 혼성화가능한 추가적인 주형을 포함하지 않는다.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각은 7 내지 100 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 3 내지 50 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3'-다이머 형성 부위 각각은 하나 이상의 비상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제16항에 있어서, 표지를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제20항에 있어서, 상기 표지는 (i) 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 적어도 하나의 표지, (ii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지, (iii) 연장 동안 연장 이합체에 혼입된 표지 및 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머에 연결된 표지, (iv) 인터컬레이팅 표지, 또는 (v) 검출 올리고뉴클레오타이드에 연결된 적어도 하나의 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
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Also Published As
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