JP4967261B2

JP4967261B2 - プローブ担体

Info

Publication number: JP4967261B2
Application number: JP2005184309A
Authority: JP
Inventors: 義和田代; 和裕丹羽; 寛仁島北; 卓也岡
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: JP2007003363A

Description

本発明は、検出用物質、具体的にはＤＮＡ、たんぱく質や抗体などのプローブが支持体に固相化されたプローブ担体およびそのプローブ担体のプローブに蛍光標識された検体と反応して蛍光発色した測定部の蛍光を読み取る蛍光読み取り装置に関するものである。

遺伝子発現頻度を検出する方法として、プローブアレイを使用した解析が行われており、このプローブアレイ解析において、核酸ハイブリダイゼーション反応による検出である、いわゆるＤＮＡチップなどが用いられており、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析などにも利用され、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用されている。このようなプローブアレイは検体から採取したＤＮＡサンプルの遺伝子多型を含む領域をＰＣＲで増幅し、その増幅産物をターゲットとしてプローブ担体にあらかじめ固相化された既知の塩基配列とハイブリダイゼーションを行うことによってその結果からＳＮＰｓの存在を検知することが一般的である。またこの他にも抗体をプローブとしてプローブ担体に固相化し、検体中の抗原との抗原抗体反応を行うこともなされている。従来、この種のプローブ担体は、スライドガラスに既知の塩基配列である多種類のプローブＤＮＡを高密度に固相する方法や半導体製造プロセスを応用して基板上でＤＮＡプローブを直接合成する方法が知られている。これらのＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップといわれるものは、主として遺伝子発現頻度解析などの利用を目的としていることから、検知対象とする塩基配列が数万配列になることもある。つまり、多種、多数のＤＮＡオリゴマーやｃＤＮＡなどがプローブ担体上に高密度に集積されている。生体から得られる検体はその採取量に制限がある場合が多く、少量のサンプルで計測ができることが望ましい。したがって、プローブ担体上で少量のサンプルと多数のＤＮＡプローブが接触することを実現するために、ＤＮＡプローブをできるだけ狭い領域に高密度に固相化することが必要とされており、その中には円盤状の基板担体や独立した反応部を設けるなどが検討されているものもある（特許文献１、２参照）。しかしながら、近年このようなＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップは前述の遺伝子発現頻度解析などの研究目的から、特定の微生物、ウイルス、ＤＮＡなどの有無を検出するような検査の目的にも使用されるようになり、この場合は、必ずしも数万配列もの多くのＤＮＡプローブなどを必要としていない。例えば、１種類の微生物を検出するのに、数十のＤＮＡプローブで特定が可能である事が多く、検査目的に応じて数種類の菌やウイルスなどの検出に使いやすいプローブ担体が望まれている。

また、プローブ担体に染色試薬などで発色したターゲットとする核酸の特異的な配列が反応し、その発色を検出する装置は、レーザー方式でプローブ担体をスキャニングし、発色あるいは蛍光した光を光電子増感管などで検出する方法が一般的に用いられている。レーザー方式でスキャンする場合、測定面積が大きくなると、プローブ担体とプローブからの発光を受光するための光学系との距離が、プローブ担体の中央部分と周囲部分では異なる事があり、プローブ担体表面での測定位置により光学系との距離を修正する必要がある。また同様に、プローブ担体の歪みやたわみの影響によりプローブからの受光量が変化してしまうので、その対策として、励起光を照射する光学系に励起ピンホールを設置し、さらにプローブからの発光を受光する光学系に受光ピンホールを設置してその影響を低減した蛍光読み取り装置などが開発されている（特許文献３参照）。

以下、従来の蛍光読み取り装置について図１０を参照しながら説明する。

図１０において、平行光束光源１０１の光路上には、励起ピンホール１０２、投光レンズ１０３、及び波長選択素子（ダイクロイックミラー）１０４が備えられている。なお、励起ピンホール１０２はピンホールが設けられた板部材からなり、投光レンズ１０３の前側焦点位置に設置されている。また、波長選択素子１０４の反射光路上には、対物レンズ１０５と試料（プローブ担体）１０６とが備えられている。波長選択素子１０４の透過光路上には、結像レンズ１０７、受光ピンホール１０８、及び光検出装置１０９が備えられている。なお、受光ピンホール１０８はピンホールが設けられた板部材からなり、結像レンズ１０７の後側焦点位置に設置されている。

平行光束光源１０１から照射された平行光は、その一部が励起ピンホール１０２のピンホールを通り、投光レンズ１０３を介して波長選択素子１０４で反射され、対物レンズ１０５の後焦点位置付近に集光された後、対物レンズ１０５を介して試料１０６にテレセントリックに照射される。試料１０６から発した蛍光は、対物レンズ１０５を介して波長選択素子１０４を透過し、結像レンズ１０７によって結像され、その結像位置に設置された受光ピンホール１０８のピンホールを通り、光検出装置１０９に入射され検出される。
特開２００４−２８９９２号公報特開２００４−３０１５５９号公報特開２００２−３５７５４９号公報

このような従来のプローブ担体では、ＤＮＡプローブがプローブ担体上のどの場所に固相化されているのかが目視ではわかりにくいために、ＰＣＲなどで目的の配列を増幅させた検体を滴下すべき場所がわかりにくいという課題を有していた。特に複数の検体の検査目的で使用する場合、ひとつのプローブ担体に数種類の検体を滴下することがあり、検体どうしが混合してしまうことは避けなくてはならない。通常、検体は５〜１０μｌと非常に微量であるため、取扱いも難しく、正確な作業が必要になる。そのため、検体を滴下する位置と測定する位置（多くはＤＮＡプローブが固相化されている場所）をできるだけ分かりやすく明示することが要望されている。また、その染色されたプローブを測定する場合、広範囲のプローブ担体からＤＮＡプローブが固相化された領域を特定できることによって、ＤＮＡプローブが固相化されていない領域などの測定に関係のない場所をスキャンしなくてもよいため、効率的に測定できることも要望されている。また、このようなＤＮＡチップにおいて、ＤＮＡプローブと検知対象物との反応結果を示す発色は非常に微量な発光であることが多いため、反応結果に関係なく発光するプローブ担体自体からの発光をできるだけ低く抑えることが必要であり、低く抑えることができれば、それだけ高精度にＤＮＡプローブと検知対象物との反応結果を測定することができる。

また、蛍光読み取り装置では、レーザー方式が一般的であるが、この方式はレーザー光源による励起光を微小な面積に照射し、その照射領域を走査することでプローブ担体の広範囲に励起光を照射する方法である。しかし、この方式では、レーザー光源で一度に照射できる範囲が限定されており、ＤＮＡプローブが固相化された一定面積に対して一度に励起光を照射することには適していない。また、出力が大きいため、染色試薬による発光を退色させることや、熱による乾燥が与える発光への影響なども考慮することが必要である。更に、レーザー光源を搭載することによる装置の大型化、高価格化など商品面での課題も多い。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、プローブが支持体に固相化されたプローブ担体において、検体を滴下すべき場所をわかりやすく表示して作業ミスを防止することを目的とする。

また、プローブが支持体に固相化されたプローブ担体において、測定すべき場所を特定して効率良く測定することを目的とする。

また、プローブが支持体に固相化されたプローブ担体において、プローブ担体からの発光をできるだけ低く抑えることでプローブと検知対象物との反応結果を高精度に測定することを目的とする。

また、簡易な構造で安価な蛍光読み取り装置を提供することを目的とする。

本発明のプローブ担体は、上記目的を達成するために、プローブが支持体に固相化されたプローブ担体において、試料を滴下する場所を指定する１ヶ所以上の滴下場所指定表示部を有し、その指定された場所に測定するプローブが固相化され、前記支持体に支持体からの自家蛍光を防止する蛍光防止手段として、金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成され、薄膜の特性に関しては前記支持体からの蛍光波長に合わせて設定し、前記滴下場所指定表示部が測定する位置を推測する位置特定手段を備え、前記プローブと検体との反応結果である蛍光を検出する場合に前記位置特定手段も発光させ、前記位置特定手段による測定する位置の特定と前記プローブの発光を一度の検出操作で行なえることを特徴としたプローブ担体と、するものである。これにより、測定する位置の特定とプローブの発光を一度の検出操作で行なえることができる。効率良く測定することが可能になる。特にＤＮＡプローブの数が多くなるとどの位置のプローブが発光しているのかを確認する手段（例えばポジティブコントロールなど）が必要になり、その手段を兼ねる効果もある。検体を滴下する位置がわかり、ハイブリダイゼーションさせるときにその検体を延ばす必要があるが、その位置も作業者がわかるため、検体が接触しないことによる作業ミスを防止できるプローブ担体が得られる。これにより反応結果に関係なく発光するプローブ担体自体からの発光をできるだけ低く抑えることができ、高精度にＤＮＡプローブと検知対象物との反応結果を測定することができるプローブ担体が得られる。広範囲のプローブ担体からＤＮＡプローブが固相化された領域を特定できるので、ＤＮＡプローブが固相化されていない領域などの測定に関係のない場所をスキャンしなくてもよいため、効率的に測定することができるプローブ担体が得られる。

また、本発明のプローブ担体は、上記目的を達成するために、滴下場所指定表示部が滴下する場所の外枠の表示であることとしたものである。

これにより検体を滴下する位置がわかり、ハイブリダイゼーションさせるときにその検体を延ばす必要があるが、その位置も作業者がわかるため、検体が接触しないことによる作業ミスを防止できるプローブ担体が得られる。

本発明によれば、測定する位置の特定とプローブの発光を一度の検出操作で行なえることができるプローブ担体を提供できる。効率良く測定することが可能になる。特にＤＮＡプローブの数が多くなるとどの位置のプローブが発光しているのかを確認する手段（例えばポジティブコントロールなど）が必要になり、その手段を兼ねる効果もある。サンプル滴下時の作業ミスを防止することができるという効果のあるプローブ担体を提供できる。

また、本発明によれば、測定に関係のない場所をスキャンしなくてもよいため、効率的に測定することができるという効果のあるプローブ担体を提供できる。

また、本発明によれば、反応結果に関係なく発光するプローブ担体自体からの発光をできるだけ低く抑えることができるので、高精度にＤＮＡプローブと検知対象物との反応結果を測定することができるという効果のあるプローブ担体を提供できる。

本発明の請求項１記載の発明は、プローブが支持体に固相化されたプローブ担体において、試料を滴下する場所を指定する１ヶ所以上の滴下場所指定表示部を有し、その指定された場所に測定するプローブが固相化され、前記支持体に支持体からの自家蛍光を防止する蛍光防止手段として、金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成され、薄膜の特性に関しては前記支持体からの蛍光波長に合わせて設定し、前記滴下場所指定表示部が測定する位置を推測する位置特定手段を備え、前記プローブと検体との反応結果である蛍光を検出する場合に前記位置特定手段も発光させ、前記位置特定手段による測定する位置の特定と前記プローブの発光を一度の検出操作で行なえることを特徴としたプローブ担体としたものであり、測定する位置の特定とプローブの発光を一度の検出操作で行なえることができる。効率良く測定することが可能になる。特にＤＮＡプローブの数が多くなるとどの位置のプローブが発光しているのかを確認する手段（例えばポジティブコントロールなど）が必要になり、その手段を兼ねる効果もある。滴下場所指定表示部により試料を滴下する場所を明確にするという作用を有する。また、反応結果に関係なく発光するプローブ担体自体からの発光を低く抑えるという作用を有する。

また、滴下場所指定表示部が滴下する場所の外枠の表示であることを特徴とするプローブ担体としたものであり、滴下場所指定表示部により試料を滴下する場所を明確にするという作用を有する。

本発明は、ＤＮＡプローブなどが固相化されたプローブ担体であり、サンプルを滴下する場所を明確にする滴下場所指定表示部を有するものである。目的のＤＮＡの塩基配列をＰＣＲなどの手法を用いて増幅させた後、この検体をプローブが固相化されている領域に滴下し、通常、数時間程度ハイブリダイゼーションを実施する。ただし、検体を滴下しただけでは表面張力により小さな玉のような状態になるだけであるため、固相化されたプローブ全体に検体を広げる必要がある。このハイブリダイゼーションは、プローブが固相化されたプローブ担体に検体を滴下した後、設定された温度（通常、高温）の恒温槽に設定された時間静置する作業である。ＰＣＲなどの手法を用いて増幅させた後、プローブ担体に滴下する検体の量としては、５〜１０μｌ程度である。このような微量の検体をプローブ担体に滴下すると、表面張力で盛り上がった状態になるため、その上からカバーガラスなどを載せることで、検体を広がらせ、固相化されたプローブ全体に行き渡るようにする。このカバーガラスは、ハイブリダイゼーション時の乾燥を防止する役目もある。プローブ担体上に固相化されたプローブを目視では正確に位置をつかむことは困難であるため、固相化された全てのプローブに検体が接触するように行き渡っているかを確認することが難しい。検体を滴下する位置が明示されており、検体が行き渡る面積を予め把握していれば、その面積内にプローブを固相化しておけば、作業ミスを起こす可能性が非常に低くなる。検体量は１０μｌと仮定した場合、検体は約２ｃｍ×２ｃｍに広がる。そのため、約２ｃｍ×２ｃｍの外枠を明示することで、その中心に検体を滴下することも可能である。遺伝子発現頻度解析などの場合は、非常に多くのプローブを必要とするが、ある特定の微生物だけを測定するような場合、数１０〜数１００のプローブで十分対応できることもあり、この場合は、１つのプローブは、せいぜい５００μｍであり、１００μｍ以下の大きさであるため、数ｍｍ角の面積内にプローブを固相化することが可能である。むしろ、スライドガラスのプローブを固相化したＤＮＡチップの場合、１つのプローブ担体で、３〜５検体分の検査が可能であり、それぞれの検体の滴下する位置を明示することで検体同士が物理的に混ざらない、接触することがないようにすることができる。この滴下場所指定表示部として、検体を滴下する位置を視覚的に明示したものや滴下する場所に凹を設けることや外枠に相当する位置に凸を設け、検体がその面積からはみださないようにする方法でも良い。また、ハイブリダイゼーションを行う場合、カバーガラスなどを載せて検体を広げることと、乾燥防止を行っているが、プローブ担体のプローブを固相化された部分、検体の滴下する位置、検体をカバーガラスで広げる範囲およびカバーガラスを載せる位置をプローブ担体にひとつの滴下場所指定表示部を設けることで全てまかなえることができる。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
図１にプローブ担体１とその拡大図および断面図を示す。図１（ａ）はプローブ担体１とその拡大図であり、図１（ｂ）は同断面図である。図１（ｂ）の断面図で示されるように支持体２にプローブ３が固相化されている。図１（ａ）の拡大図ではプローブが固相化されている場所を複数の円形で示したが、実際にはプローブ３が固相化されている場所を目視により特定するのは困難である。拡大図で示すように複数のプローブ３が任意の間隔で固相化されており、滴下場所指定表示部４が試料を滴下すべき領域の角部分に記されている。プローブ３の固相化場所は滴下場所指定表示部４で囲まれた内側の領域のみなので、増幅した検体を滴下する場合はその内側の領域を覆うように滴下すれば、全てのプローブ３に検体を接触させることができ、検体が接触しないことによる作業ミスを防止することができる。

なお、本実施の形態ではプローブ担体１を光学顕微鏡用のスライドガラスと同等の形状としたが、この形状に限ったものではなく、プローブ３を固相化でき、さらにサンプルを滴下できる形状であればその形状、厚さ、素材などの条件に制限はない。ただし、プローブ３検体の反応結果を微弱な蛍光発光として検知することになるので、検出光学系の焦点合わせを容易にするためには均一の厚さであることが望ましい。図１に示した滴下場所指定表示部４は、プローブ担体１に対して１つであるが、プローブ担体１の大きさや検体を滴下する面積に応じて複数個の滴下場所指定表示部を設けることができる。

また、本実施の形態ではプローブ３を固相化する場所を均一の間隔で配置しているが、この方法に限ったものではなく、限られた領域に目的のプローブ３を固相化することができれば、どのような配置方法であっても良い。ただし、プローブ３と検体の反応結果を蛍光として検出する場合に隣あったプローブ３からの蛍光発光が干渉しないような位置に固相化することが望まれる。

また、本実施の形態では滴下場所指定表示部４の形成方法に関しては特に詳細を説明しなかったが、図１に示すように濃色の塗装でスライドガラス上に形成してもよく、またスライドガラスの表面に微細な凹凸を形成することですりガラス状の表面にしてもよく、目視によりその位置を認識できるような方法であれば同様の効果を得ることができる。

（実施の形態２）
実施の形態１と同一部分については同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図２にプローブ担体１とその拡大図および断面図を示す。図２（ａ）はプローブ担体１とその拡大図であり、図２（ｂ）は同断面図である。支持体２にプローブ３が固相化されている。実施の形態１と同様に複数のプローブ３が任意の間隔で固相化されており、滴下場所指定表示部４が試料を滴下すべき領域の外枠５として記されている。プローブ３の固相化場所は滴下場所指定表示部４で囲まれた内側の領域のみなので、増幅した検体を滴下する場合はその内側の領域を覆うように滴下すれば、全てのプローブ３に検体を接触させることができ、検体が接触しないことによる作業ミスを防止することができる。

また、プローブ担体１の形状や素材、プローブ３の配置方法などは実施の形態１と同様の条件を満足するものであれば同様の効果を得ることができる。

なお、本実施の形態では試料を滴下すべき領域の外枠を示すようにしたが、この方法に限ったものではなく、試料を滴下すべき領域を長方形とした場合にはその対角線を示してもよい。また、試料を滴下すべき領域の外枠の主要部分のみを直線や破線などで示してもよい。また、試料を滴下すべき領域内のみに複数の線や点を記載することでその領域を示してもよい。つまり、試料を滴下する場合に滴下すべき領域を表現できるような形状であればどのような形状であってもよい。その場合、検体を広げる範囲や乾燥防止手段であるカバーガラスなどを載せる位置も特定できる方が望ましい。本実施の形態２で示した様に外枠を明確に示した場合は確実に滴下すべき領域を理解することができる。

（実施の形態３）
実施の形態１、２と同一部分については同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図３にプローブ担体１とその拡大図および断面図を示す。図３（ａ）はプローブ担体１とその拡大図であり、図３（ｂ）は同断面図である。支持体２にプローブ３が固相化されている。実施の形態１と同様に複数のプローブ３が任意の間隔で固相化されており、滴下場所指定表示部４が試料を滴下すべき領域の角に円形の目印として記されている。プローブ３の固相化場所は滴下場所指定表示部４で囲まれた内側の領域のみなので、増幅した検体を滴下する場合はその内側の領域を覆うように滴下すれば、全てのプローブ３に検体を接触させることができ、検体が接触しないことによる作業ミスを防止することができる。

また、本実施の形態では滴下場所指定表示部４が測定する位置を推定する位置特定手段６の機能を有しているので、プローブ３と検体との反応結果である蛍光を検出する場合に、位置特定手段６も発光するものとする。つまり、位置特定手段６が発光することでプローブ３が固相化されている領域を認識することができるようになる。プローブ担体１表面のうち実際にプローブ３が固相化されている領域を推定することで、プローブ３が固相化されている領域のみの蛍光発光度を検出すればよいので、効率良く測定することが可能になる。

なお、本実施の形態では位置特定手段６は位置が特定できれば良く、蛍光試薬による円形に発光するものとしたが、この方法に限ったものではなく、線状に発光するような配置であっても、プローブ３が固相化されている領域を特定できるような配置であれば同様の効果を得ることができる。通常ＤＮＡチップは、蛍光試薬を用いて染色し、目的のＤＮＡの検出を蛍光発光で検出することが多く用いられている。したがって、位置特定手段６も同様の励起用の波長および蛍光波長を用いて発色するような試薬などを選定することで、位置の特定とＤＮＡプローブの発光を一度の検出操作で行うことができる。特にＤＮＡプローブの数が多くなるとどの位置のプローブ３が発光しているのかを確認する手段（例えばポジティブコントロールなど）が必要になり、その手段を兼ねる効果もある。位置特定手段６は、例えば滴下場所指定表示部４が角状になっている場合は、その隅の部分から内側に縦横１ｍｍの部分に最初（一番目）のプローブ３が固相化されているという情報を事前にわかっていれば、発光したプローブ３の位置などを把握できる。その他、滴下場所指定表示部４の一部の形状を●、矢印などどのような形状でも目印になるものであれば、最初あるいはどこのプローブであっても、予め距離などがわかっており、発光した画像からプローブの位置が推測でき、特定できれば良い。プローブ担体１にプローブ３を固相化する場合、一般的には、型などを用いて行うため、例えば数１００個のプローブであっても、規則正しく固相化されるため、１個のプローブの位置が特定されれば、その他のプローブの位置は容易に特定することができる。

また、本実施の形態では位置特定手段６の発光状態について詳細は記載しなかったが、プローブ担体１からの蛍光を検出する手段で検出可能な発光状態であれば、位置特定手段６を検出するための手段を別途設ける必要がないので望ましい。

ただし、位置特定手段６の発光を検出する手段を別途設けても、検出装置の機能や大きさ、価格などに大きな影響を与えることがないのであれば、プローブ担体１からの蛍光と全く異なる発光状態であっても同様の効果を得ることができる。

（実施の形態４）
実施の形態１乃至３と同一部分については同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図４にプローブ担体１とその拡大図および断面図を示す。図４（ａ）はプローブ担体１とその拡大図であり、図４（ｂ）は同断面図である。支持体２の表面には蛍光防止手段７が形成されている。

蛍光防止手段７は支持体２からの蛍光を防止する手段であり、支持体２からの蛍光波長に合わせてその特性を設定すればよい。

蛍光防止手段７を設けたことにより、支持体２からの自家蛍光を減らすことができるので、プローブ３と検体との反応結果である蛍光を高感度に検知することができるようになる。通常ハイブリダイゼーション後、蛍光色素などを有している目的のＤＮＡなどがプローブ３と反応した場合、発光の強度は比較的弱い。したがって、プローブ担体１からの蛍光があると発光したプローブ３の光の検知が難しくなるため、プローブ担体１からの自家蛍光を防止することで高感度に検知できる。自家蛍光を防止するなどの蛍光防止手段７としては、反射防止加工であるＡＲ加工などを施すことで、プローブ担体１が樹脂製のときは有効である。

（実施の形態５）
実施の形態１乃至４と同一部分については同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図５にプローブ担体１とその拡大図および断面図を示す。図５（ａ）はプローブ担体１とその拡大図であり、図５（ｂ）は同断面図である。支持体２の表面には薄膜８が形成されている。

薄膜８は金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜であり、支持体２からの蛍光を防止する手段である。薄膜の特性に関しては支持体２からの蛍光波長に合わせて設定すればよい。

蛍光防止手段としての上記金属は、励起光の反射を防止する効果があり、プローブ担体１の表面に薄膜を設けたことにより、支持体２からの自家蛍光を減らすことができるので、プローブ３と検体との反応結果である蛍光を高感度に検知することができるようになる。また、上記金属薄膜は、プローブ３を固相化する場合に非常に固相化しやすく、プローブ担体１の表面を平滑にし、かつプローブ担体１の表面のゴミなども覆い隠すなどの効果もある。

（参考の形態１）
図６に蛍光読み取り装置９の構造を示す。プローブ担体１に励起光を照射する光源１０とプローブ担体１の測定対象部１１からの発光を受光する受光手段１２と蛍光判断手段１３と移動手段１４を備えている。受光手段１２はプローブ担体１から励起光により発光する予め定められた波長域の光を受光する。励起光の波長としては、検知目的のＤＮＡまたはプローブ３に標識された蛍光色素により異なるものである。一例として汎用的な蛍光色素であるＣｙ３を使用した場合には５５０ｎｍの波長の励起光を照射する方法が最も適しており、その場合には５７０ｎｍに発光ピークを持つ蛍光が観察される。また別の蛍光色素として同様に広く用いられているＣｙ５を使用した場合には、励起光は６４９ｎｍが最適であり、その場合には６７０ｎｍに発光ピークを持つ蛍光が観察される。蛍光判断手段１３は、受光手段１２が一定の時間内に受光した光量が設定したしきい値の範囲内で、かつ設定した面積の範囲内のときに蛍光していると判断する。通常は、受光手段で撮影した光を画像として取得する。その画像から画像処理ソフトなどを用いて、蛍光判断手段１３である発光点の大きさ、発光輝度などからプローブ３の発光を判断する。より具体的には、蛍光判断手段１３では受光手段１２で受光した光量を１から２５５の２５６段階の数値に変換して受光光量値として記憶する。さらにその受光光量値を予め設定されたしきい値と比較することで、受光光量値がしきい値よりも大きい場合には、プローブ担体１から受光した光が検知目的のＤＮＡからの発光であると判断する。蛍光判断手段１３としては、上記信号処理を予めプログラミングされたマイコンなどがある。予め設定されたしきい値は自家蛍光値より高い値に設定する。例えば、自家蛍光値が上記変換した数値で５の場合は、しきい値を７に設定して、その設定したしきい値より大きい場合は検知目的のＤＮＡからの発光と判断する。自家蛍光値を予め計測しておき、その値よりも大きく、その値の変動を考慮した差を有する値としてしきい値を設定することで、自家蛍光とＤＮＡからの蛍光を的確に区別して検出できるものである。本実施の形態６では、しきい値の設定を自家蛍光値がプローブ担体１の違いにより変動することを考慮して、７とした。移動手段１４はプローブ担体１を連続的あるいは断続的に移動させ、測定対象部の測定に必要な面積を移動させる。移動手段１４の構造について詳細は説明しないが、モーターなどの軸の回転運動をねじ機構により一定方向への水平移動に変換する構造であり、雄ねじであるシャフトが回転することで、プローブ担体１の設置された台座の下部に設けられた雌ねじ部が水平移動するような機構であっても同様の効果を得ることができる。

光源１０としてはレーザー光源や高圧水銀ランプなどが用いられ、通常光学フィルターを用いて一定波長の光が照射されるように調節されている。使用される光学フィルターとしては短波長カットフィルターや長波長カットフィルターやバンドパスフィルターが利用され、前述したような波長を有する励起光としては５５０ｎｍや、６４９ｎｍ程度の励起光が単独または複数で使用されるが、これ以外の波長域であっても蛍光分子に対して励起可能な波長域であれば何れの波長域であっても使用できる。

受光手段１２としては光電子増倍管などが用いられ、プローブ担体１からの微弱な蛍光発光を効率良く検知できるものが利用される。

なお、本実施の形態では移動手段１４はプローブ担体１を移動させるものとしたが、その方式に限ったものではなく、光源１０と受光手段１２を一体で移動させるものとしても良く、プローブ担体１上の任意の場所にある測定対象部に励起光を照射し、その蛍光発光を検知できる機能を有していれば良い。

（参考の形態２）
参考の形態１と同一部分は同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図７に参考の形態２の蛍光読み取り装置９の構造を示す。参考の形態２において参考の形態１と異なるところは、光源１０をＬＥＤ１５により形成した点である。ＬＥＤ１５から照射され、励起光によってプローブ担体１から発せられる反射光を受光手段１２が受光する。ＬＥＤ１５としては、青、緑、黄色、赤色のＬＥＤ等が単独または複数で使用され、ＬＥＤ１５の構造としてはダブルへテロ接合構造や量子井戸接合構造が用いられている。蛍光分子がＣｙ３の場合は緑色のＬＥＤがＣｙ５の場合は赤色のＬＥＤが使用される。また、励起光の波長をより限定し蛍光シグナルを特異的に認知するために光学フィルターを併用して励起光の波長を限定することもできる。

上記構成において、ＬＥＤ１５が少ない消費電流で励起光を照射し、プローブ担体１からの発光を撮像することができる。蛍光色素は一度測定すると消光現象が起き、次に照射しても発光が非常に小さくなり、２回測定することが困難であり、また、励起光を測定する部分のみに照射することは非常に困難であり、目的以外の部分にも照射することになる。したがって、スキャンなどをする場合には、ひとつのプローブ３に何度も励起光を照射することになり、結果的に消光を起し、測定する時には発光しない恐れもある。光源にＬＥＤ１５を用いることで、励起光のエネルギーが低いために蛍光分子が劣化しにくいため、プローブ担体１の再計測が可能となり、スキャンするときに何度も照射しても消光を起す可能性が低いので精度良く測定することが可能である。また、発熱量が少なく装置への負担が少ないため装置寿命が長くなる。また、光源１０が小さくなるため蛍光読み取り装置９自体が小型可能になる。

（参考の形態３）
参考の形態１、２と同一部分は同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図８に参考の形態３の蛍光読み取り装置９の構造を示す。参考の形態３において参考の形態１と異なるところは、プローブ担体１の測定対象部１１の一定面積を０．０６２５〜４ｍｍ↑２としたものである。これは受光手段を例えばＣＣＤなどにしたときに、１回の視野（撮影画像）を０．５×０．５ｍｍ〜２×２ｍｍの面積にすると高精度でかつ効率的に蛍光発光した点を撮影することができる。１つのプローブの大きさは直径０．０２〜０．５ｍｍの大きさであり、視野の面積が０．５×０．５ｍｍの以下の大きさでは、スキャン回数が多くなり単に計測時間が長くなるだけでなく、画像と画像を繋ぐことが面倒になる。なぜなら、スキャンさせるためにプローブ担体を移動させるがその距離をミクロン単位で誤差なく移動させることが難しいので、どうしても画像と画像の重ねしろを設けることが必要になり、重ねしろを片方で０．１ｍｍ程度とると、実際の測定画像の大きさが０．３ｍｍ角程度になり、非効率的である。２ｍｍ角以上の面積では、解像度の問題だけでなく、発光点が非常に小さくなり、発光点の認識が非常に困難になり、上記面積の範囲が効率的かつ高精度に測定することができる。

（参考の形態４）
参考の形態１乃至３と同一部分は同一番号を附し、詳細な説明は省略する。図９に参考の形態４の蛍光読み取り装置９の構造を示す。参考の形態４において参考の形態１と異なるところは、受光手段１２の前段に反射光を集光する集光レンズ１６を設けた点である。使用される集光レンズ１６としては、ストレートタイプのものや、多分岐タイプのガラスレンズが使用される。

プローブ担体１からの反射光は通常様々な方向へ拡散するので、受光手段１２が受光する光量はプローブ担体１から発せられる反射光のうち一部となる。集光レンズ１６を設けることによって受光手段１２に到達できなかった反射光を集めて受光手段１２にて受光できるようになるため、反射光が少ない場合であっても検知できるようになる。

上記構成において、集光レンズ１６を受光手段１２の前段に配置することによって、高感度な蛍光読み取り装置９ができるようになる。

なお、集光レンズ１６に光学フィルターを併設することによっても検出したい反射光をより特異的に検知することができるようになり、より高感度になる蛍光読み取り装置９ができるようになる。

計測時の作業ミスを防止することができるプローブ担体と、効率的に高精度な測定が可能である小型で安価な読み取り装置を用いることで、従来は医療機関や研究機関など専門家のみが膨大な塩基配列の解析に利用していたＤＮＡ検知技術を、専門家以外の人にも利用可能な検知技術としてさらに普及することができる。

本発明の実施の形態１のプローブ担体を示す図本発明の実施の形態２のプローブ担体を示す図本発明の実施の形態３のプローブ担体を示す図本発明の実施の形態４のプローブ担体を示す図本発明の実施の形態５のプローブ担体を示す図本発明の参考の形態１の蛍光読み取り装置を示す図本発明の参考の形態２の蛍光読み取り装置を示す図本発明の参考の形態３の蛍光読み取り装置を示す図本発明の参考の形態４の蛍光読み取り装置を示す図従来の蛍光読み取り装置を示す図

符号の説明

１プローブ担体
２支持体
３プローブ
４滴下場所指定表示部
５外枠
６位置特定手段
７蛍光防止手段
８薄膜
９蛍光読み取り装置
１０光源
１１測定対象部
１２受光手段
１３蛍光判断手段
１４移動手段
１５ＬＥＤ
１６集光レンズ

Claims

プローブが支持体に固相化されたプローブ担体において、試料を滴下する場所を指定する１ヶ所以上の滴下場所指定表示部を有し、その指定された場所に測定するプローブが固相化され、前記支持体に支持体からの自家蛍光を防止する蛍光防止手段として、金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成され、薄膜の特性に関しては前記支持体からの蛍光波長に合わせて設定し、前記滴下場所指定表示部が測定する位置を推測する位置特定手段を備え、前記プローブと検体との反応結果である蛍光を検出する場合に前記位置特定手段も発光させ、前記位置特定手段による測定する位置の特定と前記プローブの発光を一度の検出操作で行なえることを特徴としたプローブ担体。
前記滴下場所指定表示部が滴下する場所の外枠の表示であることを特徴とする請求項１記載のプローブ担体。