JP2009268432A - 標的核酸の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＣＲ反応溶液を流路に流しながらリアルタイムＰＣＲを行い、標的核酸の量を蛍光で測定する方法において、より正確な蛍光値を測定する方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る標的核酸の測定方法は、少なくとも標的核酸を含むＰＣＲ反応溶液を流路に流し、該流路中を流れる前記ＰＣＲ反応溶液に温度サイクルを与えてＰＣＲ増幅を行い、前記温度サイクル毎に前記ＰＣＲ反応溶液の蛍光を測定することにより、前記ＰＣＲ反応溶液中の標的核酸を測定する方法であって、前記流路に校正用溶液を流して前記温度サイクルを与え、該温度サイクル毎に前記校正用溶液の蛍光を背景蛍光として測定し、前記ＰＣＲ反応溶液の各温度サイクルの蛍光値を対応する前記背景蛍光の蛍光値を用いて補正することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、標的核酸を含むＰＣＲ反応溶液を流しながらＰＣＲ増幅し、蛍光でその標的核酸の量を測定する方法に関する。

近年、試料に含まれる特定のＤＮＡを短時間で増幅可能なＰＣＲ法が一般的に利用されている。ＰＣＲ法は、検体中のＤＮＡが微量である場合でも、指数的増幅により検出することができるため、感染性疾患および病理学的染色体異常、並びにポリヌクレオチド多型現象の検知または診断を含む数多くの臨床的適用において有用である。そして、例えば特許文献１では、反応溶液を流路に流すだけで、高温の変性温度や中温の伸長温度、低温のアニーリング温度等の間で加熱冷却を繰り返し所定のＰＣＲサイクルを行なうことのできるＰＣＲプレートが提案されている。

また、ＰＣＲ増幅法によるＤＮＡ増幅は生物学の分野では基本的な技術であり、ＰＣＲ増幅中のＤＮＡ量をリアルタイムに測定しそれを解析して検体中のＤＮＡ量を定量化する方法としてリアルタイムＰＣＲ法がある。特許文献２では、上述のＰＣＲプレートの上方に光学ヘッドを移動可能に配置し、ＰＣＲプレートの流路中を流れる反応溶液の蛍光を、任意のサイクル回数の段階において測定可能なＰＣＲ装置を提案している。

ここで、増幅中の反応溶液のＤＮＡ量を蛍光標識からの蛍光を測定して解析し、検体中のＤＮＡ量を正確に定量化するためには、ＤＮＡにつけた蛍光標識からの微弱な蛍光から背景からの蛍光（以下、背景蛍光と略す）を除くことが望ましい。

例えば特許文献３では、微弱な光の検出信号から背景蛍光などのノイズを除去する方法が提案されている。
特開平６−３０７７６号公報 特開２００７−３００８９６号公報 特開２０００−２０５９５１号明細書

特許文献３に記載の技術では、同じ場所で測定用溶液が在る時と無い時の信号の差を測定することにより補正している。しかし、ＤＮＡを含む反応溶液を流しながらＰＣＲ増幅を行う場合は、測定する反応溶液は移動していて測定箇所により背景蛍光が違うため、正しく補正することができない。

また、測定する反応溶液はＰＣＲ増幅のために非常にゆっくり流しているため短時間に反応溶液を取り除くことはできない。そのため、検査の途中で背景蛍光の変化を調べるには、検査を中断し、長い時間をかけて反応溶液を取り除かなければならない。

したがって、本発明の目的は、上記課題の少なくとも一つを解決することである。

そこで、本発明に係る標的核酸の測定方法は、
少なくとも標的核酸を含むＰＣＲ反応溶液を流路に流し、該流路中を流れる前記ＰＣＲ反応溶液に温度サイクルを与えてＰＣＲ増幅を行い、前記温度サイクル毎に前記ＰＣＲ反応溶液の蛍光を測定することにより、前記ＰＣＲ反応溶液中の標的核酸を測定する方法であって、
前記流路に校正用溶液を流して前記温度サイクルを与え、該温度サイクル毎に前記校正用溶液の蛍光を背景蛍光として測定し、前記ＰＣＲ反応溶液の各温度サイクルの蛍光値を対応する前記背景蛍光の蛍光値を用いて補正することを特徴とする。

本発明では、ＰＣＲ反応溶液を流路に流しながらリアルタイムＰＣＲを行い、標的核酸の量を蛍光で測定する方法において、校正用溶液を流して背景蛍光を測定し補正することで、より正確な標的核酸の量を測定することができる。

最近の医療、分子生物学の分野では、標的核酸の初期数を特定するために、リアルタイムＰＣＲなどの解析方法の重要性が高まっている。リアルタイムＰＣＲ法では標的核酸を含むＰＣＲ溶液に対する温度変化による増幅を繰り返し行い、増幅量の変化を測定し、その増幅量の変化を演算することによって標的核酸の初期数を特定することができる。

リアルタイムＰＣＲでは、増幅前にＤＮＡ染料または蛍光プローブ等の蛍光標識物質をＰＣＲ反応溶液に加えることにより、標的核酸の増幅と増幅産物の分析が同時に行える。また、蛍光の測定を、ＰＣＲ装置内で増幅と同時に行うことができるため、サンプルを取り出す必要がない。その結果、サンプル取り扱いの手間を省き、時間を節約し、後続反応に対し不純物混入の危険を低下させることができる。

まず、図６を用いてリアルタイムＰＣＲ法の概要を示す。ＰＣＲでは、１サイクルごとに標的核酸が指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。横軸はＰＣＲのサイクル数を表し、縦軸は反応溶液からの蛍光量（蛍光値）を表している。この蛍光量は増幅産物量を示すことになる。図示の曲線は増幅曲線を示しており、これはサイクルごとに蛍光量、つまり標的核酸の増幅量をモニタリングすることによりグラフに示すことができる。初発のＤＮＡ量（初期数）が多いほど、増幅産物量は早く検出可能な量に達し、増幅曲線が早いサイクルで立ち上がる。よって、段階希釈したスタンダードサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、図６のような初発ＤＮＡが多い順番から並んだ増幅曲線が得られる。サンプルは既に初期数がわかっているサンプルと比較することで初期鋳型量を知ることができ、検体中のＤＮＡを定量することができる。

リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法の２種類がある。インターカレーター法では一般的に蛍光試薬としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用する。インターカレーター（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。蛍光標識プローブ法における蛍光プローブとしては、代表的なものに、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ及びサイクリングプローブがある。インターカレーターを用いる方法は二本鎖ＤＮＡを全て検出するために、ターゲット遺伝子ごとにプローブを用意する必要がなく、検出コストが安く反応系の構築も容易だが、検出特異性はあまり高くない。反対に、蛍光標識プローブを用いる方法は、プローブ設計のための専用ソフトが必要でコストも高いが、検出特異性が高い。相同性の高い配列同士の区別やＳＮＰＳタイピングのようにマルチプレックス検出には、蛍光標識プローブが適している。

一方、上述のように、最近では、ＰＣＲ反応溶液を流路に流すだけで、高温の変性温度や中温の伸長温度、低温のアニーリング温度等の間で加熱冷却を繰り返し所定のＰＣＲサイクルを行なうことのできるＰＣＲ装置が開発されている。

ここで、本発明に係る標的核酸の測定方法は、
少なくとも標的核酸を含むＰＣＲ反応溶液を流路に流し、該流路中を流れる前記ＰＣＲ反応溶液に温度サイクルを与えてＰＣＲ増幅を行い、前記温度サイクル毎に前記ＰＣＲ反応溶液の蛍光を測定することにより、前記ＰＣＲ反応溶液中の標的核酸を測定する方法であって、
前記流路に校正用溶液を流して前記温度サイクルを与え、該温度サイクル毎に前記校正用溶液の蛍光を背景蛍光として測定し、前記ＰＣＲ反応溶液の各温度サイクルの蛍光値を対応する前記背景蛍光の蛍光値を用いて補正することを特徴とする。

本発明では、ＰＣＲ反応溶液を流路に流しながらリアルタイムＰＣＲを行い、標的核酸の量を蛍光で測定する方法において、校正用溶液を流して背景蛍光を測定し補正することで、より正確な標的核酸の量を測定することができる。そして、正確な標的核酸の量を測定することができるため、より正確な検体に含まれる標的核酸の定量を行うことができる。つまり、ＰＣＲ反応溶液を流路に流しながら温度サイクルを与えＰＣＲ増幅させる場合においては、流路の違いや流路の場所によって背景蛍光が異なる。また、流路の内壁に蛍光標識物質が付着し、その付着具合は流路の位置によって異なってくる。さらに、温度サイクルにより蛍光標識物質の蛍光が変化又は劣化してしまう。これらの原因による背景蛍光の違いが測定結果に与える影響は大きく、測定される蛍光値を適切に補正することが必要である。そこで、本発明は、校正用溶液を流して背景蛍光の蛍光値を取得し、その蛍光値を用いて補正することにより、流路間や流路の位置、温度サイクル等の違いからくる誤差を低減することができる。

以下、本発明に係る標的核酸の測定方法について詳細に説明する。

前記標的核酸は、核酸であれば特に限定されるものではない。その由来としては、例えば、人工合成産物、ヒトやマウスなどの動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物等を挙げることができる。例えば、感染症起炎菌由来の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲを行う場合、血液中に存在する細菌の核酸が標的核酸となる。これらの標的核酸は、その血液の前処理を行い検体とした後、リアルタイムＰＣＲに供することができる。なお、感染症起炎菌由来の標的核酸についてのリアルタイムＰＣＲは、その試料に含まれる標的核酸のコピー数（初期数）を測定することができるため、発症の有無の判定などに有効である。

前記ＰＣＲ反応溶液とは、少なくとも、増幅対象としての標的核酸及びリアルタイムＰＣＲ用試薬を含んで構成される溶液である。リアルタイムＰＣＲ用試薬は、少なくとも、標的核酸を増幅するための試薬と増幅した標的核酸の量を測定可能にする試薬を含む。標的核酸を増幅するための試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などが挙げられ、一例として以下を含む。
１．標的核酸に特異的に結合するプライマー
２．標的核酸に結合したプライマーから標的配列に相補的にＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ（標的がＲＮＡの場合はＲＮＡポリメラーゼ）
３．ＤＮＡ合成に必要な各種ヌクレオチド（ｄＮＴＰなど）
４．塩化マグネシウムや塩化カリウム等の塩類
５．トリス等のバッファー
なお、プライマーやｄＮＴＰは、蛍光あるいはその他の標識をしているものも含む。また、標的核酸の量を測定可能にする試薬としては、上述のように、インターカレータや蛍光プローブなどがある。

前記校正用溶液としては、校正に用いることができる溶液ならば特に制限されない。例えば、ＰＣＲ試薬で検体ＤＮＡを含まない溶液が考えられる。ＰＣＲ試薬としては蛍光標識を含ませてもよい。この場合、検体ＤＮＡが含まれていないので標識は蛍光を発しないはずだが、実際には微弱な蛍光を発するのでそれを背景光として測定する。また、他にも、例えば、蛍光標識を含まないＰＣＲ試薬で基準となるＤＮＡを含む溶液も用いることができる。この場合、ＰＣＲ増幅が起こるため増幅されたＤＮＡや副生成物で白濁が起こるが蛍光標識がないので蛍光を出さないはずである。また、他にも、例えば、純水や、蛍光標識を含まないＰＣＲ試薬なども考えられる。

次に、本発明を適用可能なＰＣＲ装置の構成の一例について説明し、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、ＰＣＲ装置の構成例は本発明を説明するために記載するものであり、本発明を以下のＰＣＲ装置を用いる場合に限定するものではない。

＜装置の構成例＞
図２は本発明を適用できるＰＣＲ反応装置の構成例の概要を示す図である。２１は標的核酸（例えばＤＮＡ）とＰＣＲ試薬等を混合したＰＣＲ反応溶液である。２２はＰＣＲ反応溶液２１を流しながら増幅を行う流路が形成されているＰＣＲプレートである。２３はＰＣＲ増幅に必要な温度サイクルをＰＣＲプレート中の流路を流れる反応溶液２１に与える、例えばペルチェ素子等の温度制御手段である。２４は温度制御手段２３の反対側に発生する熱を空気中に放熱するヒートシンクである。２５は反応溶液２１をＰＣＲプレート２２の流路中に流す圧力を発生させるポンプである。２６は蛍光標識を励起するための励起光を発生する励起光発生手段である。２７は励起光発生手段２６から出た励起光でＰＣＲプレート２２の検出エリアを照明するための光学系である。２８はＰＣＲプレート２２の検出エリアから出た蛍光を集光するレンズである。２９は、励起光の波長を阻止し、蛍光標識からの蛍光波長を透過するフィルタである。３０は蛍光標識からの蛍光を受光して電気信号に変換する、例えばＣＣＤなどの撮像装置等の蛍光測定手段である。３１は蛍光測定手段３０からの画像信号を取り込むための手段、例えばＡ／Ｄ変換器である。３２は取り込んだ画像を一時的に記憶しておく画像メモリである。３３は画像メモリ３２のデータの数値化などの演算を行う演算手段である。３４は処理のためのデータを蓄積しておく蓄積メモリである。３５はアクチュエータ類を制御するための制御手段である。

次に図２及び図３を用いてＰＣＲ反応装置の動作説明を行う。まず、ＰＣＲ反応溶液２１をＰＣＲプレート２２に注入する。なお、本発明では、注入される溶液はＰＣＲ反応溶液に限らず、校正用溶液も注入される。

ＰＣＲプレート２２には、図３のように例えば複数の流路が形成されており、流路中の反応溶液２１はポンプ２５が発生する圧力によって移動する。なお、溶液を輸送する溶液輸送手段としては、ポンプに限られず、例えば、進行波型マイクロポンプを用いることもできる。

図３において、４０は注入口である。また、図３は反応溶液２１が流路を流れている状態を示している。例えば図３のように流路を４つ設けることにより、１種類の標的核酸を含む検体に対して添加試薬が異なる４種類のＰＣＲ反応溶液を調製し、流路（１）から流路（４）を用いて４種の検査を同時に行うことができる。なお、流路の本数は１つでも、複数であっても本発明は制限されない。

４２は反応溶液同士が混ざらないようにするためのバッファ液である。流路には、前述のように、複数のＰＣＲ反応溶液を導入することができるが、この場合、各ＰＣＲ反応溶液の間にバッファ液を充填する。バッファ溶液としては、ＰＣＲ溶液と比較的混じりにくく、流路に付着したＰＣＲ溶液の洗浄を行い、各ＰＣＲ溶液間のコンタミを防止することできる溶液が好ましい。例えば、バッファ液としては、シリコンオイルなどを用いることができる。図３では、流路には、複数のＰＣＲ反応溶液と各ＰＣＲ溶液を分離するバッファ液が交互に充填されている。

４１は標的核酸（例えばＤＮＡ）の増幅エリアであり、この増幅エリア４１を溶液が通過する際に温度制御手段２３により所定の温度サイクルが与えられる。また、この増幅エリア４１に存在するＰＣＲ反応溶液については前記蛍光測定手段３０により蛍光を検出することができる。ＰＣＲ反応溶液２１は、増幅エリア４１を流れていく間に、制御手段３５によって制御された温度制御手段２３によって、例えば図４のような温度サイクルが与えられ核酸増幅が行われる。１回の温度サイクルごとに励起光発生手段２６からの励起光で検出エリア４１が照明され、反応溶液中の蛍光標識から発生した蛍光を蛍光測定手段３０で測定し、その蛍光値から核酸の量（例えばＤＮＡ量）を算出する。温度制御手段２３としては、特に限定されるものではないが、例えば、流路中を流れる溶液に所定の温度サイクルを与えられるようにペルチェ素子等の温度調節素子をＰＣＲプレート２１の下部に配置した構成とすることができる。例えば、１つの温度サイクルは、図４に示すように変性温度、アニーリング温度及び伸長温度からなるため、これらの温度の３つの温度帯を温度調節素子で形成し、その温度帯に溶液を通過させることで温度サイクルを与えることができる。

反応溶液２１はＰＣＲプレートの流路中を流れながら増幅エリア４１を通過する間に複数回の温度サイクル（例えば３０〜４０回）が与えられ、その温度サイクル毎に蛍光量が測定される。図５に色を濃く示した注目の反応液２１が流路中を流れながら増幅エリア４１を通過する間に４０回の温度サイクルが与えられる様子を示す。４０回の蛍光量の測定値から各測定毎のＤＮＡ量を算出し、そのＤＮＡ量の変化から検体の初期のＤＮＡ量の算出を行う。

図６で示すように初期ＤＮＡが多いと温度サイクルの回数が少ないうちに蛍光量が増加し始め、初期ＤＮＡが少ないと温度サイクルの回数が多くならないと蛍光量が増加し始めない。

蛍光測定手段３０で測定した蛍光値から反応溶液中のＤＮＡ量を算出する際、その蛍光値にはＤＮＡの蛍光標識が発生する蛍光以外にもいろいろな蛍光が背景蛍光として加算されている。背景蛍光としては、例えば、ＰＣＲプレート２２の材料から発せられる蛍光や、ＰＣＲプレート２２の外側に付着した汚れから発せられる蛍光、ＰＣＲプレート２２の流路内に付着した蛍光標識、その他物質から発せられる蛍光などが考えられる。これら背景蛍光は、多数の検体を検査している間に、励起光による退色、増幅のために加える温度サイクルの付与又は蛍光標識等の付着量の変化などにより、徐々に変化する。したがって、背景蛍光を定期的に測定し、補正を行うことが望ましい。図１０にプラスチック（ＰＥＴ及びＰＥ）から発せられる蛍光（Ａ）と、ＰＥＴから発せられる蛍光が劣化により変化した後の例（Ｂ）を示す。なお、流路壁面に付着する物質としては、蛍光標識、プライマ、増幅されたＤＮＡ等が考えられる。

なお、上記の注入口と排出口とを別に設けたＰＣＲ装置以外にも、流路が環状であり、溶液を流路内に循環させるタイプのＰＣＲ装置を使用することができる。

なお、溶液の送液は、送液可能な方法であれば任意であり、例えば、インジェクターを備えたマイクロポンプ、シリンジポンプ等が使用できる。送液速度は、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーションに適した送液速度であれば任意であるが、例えば、検体を含む溶液の導入から検出までの一連の操作を、概ね１５〜６０分で完結させるような速度が好ましい。

なお、温度サイクルは適宜調節することができる。例えば、標的核酸がＤＮＡの場合、通常、９０〜９５℃で標的ＤＮＡを変性し、４０〜６０℃でプライマーと標的ＤＮＡのアニーリングを行い、続いて７０〜７５℃でＤＮＡの伸長反応を行うという温度サイクルを２０〜５０回程度繰り返すことが有効である。なお、温度条件はプライマーの種類、例えばプライマーの長さやＧＣ含量などによって変動しうる。

なお、流路や注入口、排出口は、基板中に、フォトリソグラフィや成型などの公知技術を用いることにより形成することができる。基板の材料は、ＰＣＲ反応溶液や校正用溶液等の溶液の蛍光を測定できるものであれば特に限定されないが、例えば、シリコンウェハ、石英ガラス又はプラスチックなどを用いることができる。

なお、流路は、図３のような直線状の流路でなくとも、同一平面上で複数回折り曲げた形状とすることもできる。

なお、蛍光測定手段としては、例示したＣＣＤに限られず、例えば、ＰＣＲプレート上を移動可能に設置された蛍光を測定可能な光学ヘッドを用いることもできる。しかし、容易かつ迅速に蛍光を測定できる観点から、ＣＣＤ等の撮像装置を用いることが好ましい。

以下に、本発明に係る標的核酸の定量方法の実施形態を説明する。特に、背景蛍光の測定方法や測定した蛍光値の補正方法について説明する。

＜実施形態１＞
図１１に、一つの流路にＰＣＲ反応溶液２１を注入し、４０回の温度サイクルを与えてＰＣＲ増幅を行う工程について示す。（Ａ）はＰＣＲ反応溶液を注入直後の概念図である。（Ｂ）はＰＣＲ反応溶液が温度サイクル１回目から２回目に移行している状況を示す概念図である。（Ｃ）はＰＣＲ反応溶液が温度サイクル２回目から３回目に移行している状況を示す概念図である。（Ｄ）はＰＣＲ反応溶液の約半分が４０回の温度サイクルを終えている状況を示す概念図である。各温度サイクルが終わる段階（各温度サイクルにおいて伸長反応が終わった段階）で、そのＰＣＲ反応溶液について前記蛍光測定手段３０にて蛍光が測定される。なお、図１では、簡略化のため、一つのＰＣＲ反応溶液のみを示し、他のＰＣＲ反応溶液やバッファ液等は省略している。

図１において、例えばｎ回目（ｎは１から４０）の温度サイクル後のＰＣＲ反応溶液について測定した蛍光データをＳ（ｎ）とする。

次に、ＰＣＲ反応溶液２１を校正用溶液に変え、図１１と同じように温度サイクルを与えた後の校正用溶液について蛍光（背景蛍光）を測定する。例えばｎ回目（ｎは１から４０）の温度サイクル後の校正用溶液について測定した蛍光データをＢ（ｎ）とする。

そして、本発明において補正された蛍光データをＲ（ｎ）とすると、Ｒ（ｎ）は下記式で表すことができる。

Ｒ（ｎ）＝Ｓ（ｎ）−Ｂ（ｎ）・・・（１）
以上のように、校正用溶液を流路に流し背景蛍光を測定し、その背景蛍光を用いて補正することにより、ＰＣＲ反応溶液について正確な蛍光値を取得することができる。したがって、この方法により得られた補正後の蛍光値を用いて、増幅した標的核酸の量を算出することで、より正確な標的核酸の定量を行うことができる。

＜実施形態２＞
次に、図３を用い、流路が４つある場合について説明する。

図３のように、ＰＣＲ反応溶液を注入口４０から注入し検査をする場合、増幅エリア４１を通過する間に複数回（例えば４０回）の温度サイクルを加えながら、各温度サイクル毎に蛍光の測定を行う。つまり、ＰＣＲ反応溶液が１回の温度サイクル分進んだときに蛍光測定手段３０によりＰＣＲ反応溶液の蛍光を測定する。

ここで、測定した結果をＳ（ｍ，ｎ）（Ｓ：蛍光値、ｍ：流路の番号、ｎ：蛍光を測定した反応溶液の温度サイクル回数）と表す。例えば、流路の数を４つとし、温度サイクル回数を４０回とした場合、図１（Ａ）の様な結果が得られる。つまり、流路（１）に反応溶液を流し４０回の温度サイクルを与える場合、流路（１）の蛍光データとして、Ｓ（１，１）、Ｓ（１,２）、Ｓ（１，３）・・・、Ｓ（１，３９）、Ｓ（１，４０）が得られる。同様に流路（２）の蛍光データとして、Ｓ（２，１）、Ｓ（２,２）、Ｓ（２，３）・・・、Ｓ（２，３９）、Ｓ（２，４０）が得られる。

次に、背景蛍光を測定するために、図７のように反応溶液２１の代わりに校正用溶液４３を注入口４０から注入し、増幅エリア４１を通過する間に複数回（例えば４０回）の温度サイクルを加えながら、各温度サイクル毎に蛍光の測定を行う。ここで、校正用溶液を流して得られた結果をＢ（ｍ，ｎ）（Ｂ：蛍光値、ｍ：流路の番号、ｎ：蛍光を測定した反応溶液の温度サイクル回数）と表す。例えば、流路の数を４つとし、温度サイクルを４０回与える場合、図１（Ｂ）の様な結果が得られる。つまり、流路（１）に校正用溶液を流し４０回の温度サイクルを与える場合、流路（１）の蛍光データとして、Ｂ（１，１）、Ｂ（１,２）、Ｂ（１，３）・・・、Ｂ（１，３９）、Ｂ（１，４０）が得られる。同様に、流路（２）の蛍光データとして、Ｂ（２，１）、Ｂ（２,２）、Ｂ（２，３）・・・、Ｂ（２，３９）、Ｂ（２，４０）が得られる。なお、Ｂは背景蛍光の蛍光値となる。

これらの蛍光値のデータを用いて、補正された蛍光データＲ（ｍ，ｎ）を以下の式で求める。

Ｒ（ｍ，ｎ）＝Ｓ（ｍ，ｎ）−Ｂ（ｍ，ｎ）・・・（２）
例えば、流路の数を４つとし、温度サイクルを４０回与える場合、図１（Ｃ）のようなデータが得られる。得られた補正後の蛍光データＲ（ｍ，ｎ）を用いて検体の初期の標的核酸の量（例えばＤＮＡ量）の算出を行う。

なお、背景蛍光の測定は最初に行う必要は無く、特に限定されるものではない。例えば、背景蛍光の測定を検体の検査の間に行ってもよい。保存しておいた各検体における蛍光データから初期のＤＮＡ量の算出を行うときまでに、背景蛍光の測定を済ませておけば、補正を行うことができる。

校正用溶液で背景蛍光の測定を行う間隔が長く、図８のように複数の検体を測定している間（ＰＣＲ反応溶液を流している間）に背景蛍光が変化する場合、背景蛍光の測定を一定間隔で複数回行い、検体測定時の背景蛍光を計算して求め、補正することが望ましい。

ＰＣＲプレート２２が注入口４０と増幅エリア４１の間に別の処理があり、流路が長い構造だと、溶液の流速に差があると図９に示すように注目する反応溶液２１や校正用溶液４２の位置がずれて増幅エリア４１に流れてくる場合がある。測定時に注目の反応溶液２１がＰＣＲの何サイクル目かは蛍光測定手段３０の測定画像で反応溶液２１が増幅エリア４１中のどこの位置にあるかで判断することができる。図９のような場合は注目する反応溶液２１の２サイクル目の蛍光量を得るためには図９（Ａ）のＮサイクル目の測定画像の流路２、３と図９（Ｂ）のＮ＋１サイクル目の測定画像の流路１、４とから求めればよい。

校正用溶液４２を流して背景蛍光の蛍光値を測定する場合も同様に図９のようなことが起きる場合がある。例えば、流路に付着したゴミなどによって、所定の位置から強い蛍光が発する場合などである。この対処法として、測定時の校正用溶液４２の位置と蛍光量から流路ごとに図９（Ｃ）のように背景蛍光の分布を得て、これを補正係数に加えてもよい。

この場合、背景蛍光を補正した蛍光データＲ（ｍ，ｎ）を得るには、例えば以下のように反応溶液２１蛍光量を測定した時の位置ｘの背景蛍光の蛍光データＢ（ｍ，ｘ）を用いて計算すればよい。

Ｒ（ｍ，ｎ）＝Ｓ（ｍ，ｎ）−Ｂ（ｍ，ｘ）・・・（３）

本発明に係る標的核酸の測定方法を説明する概要図である。 本実施形態における標的核酸の測定装置の構成を表す概略図である。 ＰＣＲプレートの構成及びＰＣＲ反応溶液の流れる様子を表す概略図である。 ＰＣＲ反応時に加える温度サイクルの例を表す図である。 ＰＣＲ反応溶液が温度サイクルを加えられながら流路を流れる状態を説明する概略図である。 蛍光量の測定値から検体の初期のＤＮＡ量の算出を行う説明図である。 校正用試薬を流路中に流して背景蛍光を測定する説明図である。 複数回の背景蛍光を測定し、その蛍光値を用いて補正する方法を説明する図である。 反応溶液の位置がずれて増幅エリアに流れてくる状態を説明する概略図である。 プラスチックが出す蛍光を説明する図である。 流路にＰＣＲ反応溶液を注入し、４０回の温度サイクルを与えてＰＣＲ増幅を行う工程を説明する概略図である。

符号の説明

２１、ＰＣＲ反応溶液
２２、ＰＣＲプレート
２３、温度制御手段
２４、ヒートシンク
２５、溶液輸送手段
２６、レーザ
２７、照明光学系
２８、集光光学系
２９、フィルタ
３０、撮像装置
３１、Ａ／Ｄ変換器
３２、画像メモリ
３３、演算手段
３４、蓄積メモリ
３５、制御手段
４０、注入口
４１、増幅エリア及び検出エリア
４２、バッファ液
４３、校正用試薬

Claims (4)

1. 少なくとも標的核酸を含むＰＣＲ反応溶液を流路に流し、該流路中を流れる前記ＰＣＲ反応溶液に温度サイクルを与えてＰＣＲ増幅を行い、前記温度サイクル毎に前記ＰＣＲ反応溶液の蛍光を測定することにより、前記ＰＣＲ反応溶液中の標的核酸を測定する方法であって、
   前記流路に校正用溶液を流して前記温度サイクルを与え、該温度サイクル毎に前記校正用溶液の蛍光を背景蛍光として測定し、前記ＰＣＲ反応溶液の各温度サイクルの蛍光値を対応する前記背景蛍光の蛍光値を用いて補正することを特徴とする標的核酸の測定方法。
2. 前記温度サイクルは、少なくとも変性温度、アニーリング温度及び伸長温度からなることを特徴とする請求項１に記載の標的核酸の測定方法。
3. 前記標的核酸はＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の標的核酸の測定方法。
4. 前記流路は複数設けられており、複数の前記流路に前記校正用溶液を流して前記背景蛍光の蛍光値を取得することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの請求項に記載の標的核酸の測定方法。

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