WO2005005594A1 - 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 - Google Patents

核酸増幅装置及び核酸増幅方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005005594A1
WO2005005594A1 PCT/JP2004/009942 JP2004009942W WO2005005594A1 WO 2005005594 A1 WO2005005594 A1 WO 2005005594A1 JP 2004009942 W JP2004009942 W JP 2004009942W WO 2005005594 A1 WO2005005594 A1 WO 2005005594A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
region
template
flow path
primer
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/009942
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Naoto Hagiwara
Original Assignee
Taiyo Yuden Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taiyo Yuden Co., Ltd. filed Critical Taiyo Yuden Co., Ltd.
Priority to EP04747408A priority Critical patent/EP1659170A1/en
Priority to JP2005511563A priority patent/JPWO2005005594A1/ja
Priority to US10/564,060 priority patent/US20060257878A1/en
Publication of WO2005005594A1 publication Critical patent/WO2005005594A1/ja
Priority to HK06112676.0A priority patent/HK1092175A1/xx
Priority to US12/018,905 priority patent/US20080139408A1/en

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B01L2300/1822—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using Peltier elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B01L2300/1827—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using resistive heater
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1861—Means for temperature control using radiation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplifying apparatus and a nucleic acid amplifying method using a PCR method, and more particularly, has at least one flow path therein, and at least a nucleic acid serving as a template and a nucleic acid serving as a primer in the flow path
  • the present invention relates to a nucleic acid amplification apparatus and a nucleic acid amplification method for introducing a reaction solution containing a nucleic acid and a phosphate compound and a metal ion, and amplifying the nucleic acid by a nucleic acid synthetase immobilized in the channel.
  • the PCR (Polymerase Chain Reaction) method is widely used for efficient replication and amplification of a very small amount of template DNA.
  • a double-stranded DNA serving as a template is thermally transformed into single-stranded DNA, a step of annealing primers each complementary to the obtained single-stranded template DNA, a DNA having heat resistance
  • the process of synthesizing double-stranded DNA by synthesizing a complementary strand from primers by the action of a polymerase is defined as one cycle, and this cycle is repeated several times to amplify the target DNA.
  • Each of the above steps is performed by controlling the temperature of the reaction solution and the reaction time.
  • heat denaturation of double-stranded DNA serving as a template to single-stranded DNA is performed at about 94 ° C.
  • Annealing of the primer to the single-stranded DNA is performed at about 55 ° C, and synthesis of the complementary strand by the DNA polymerase is performed at about 72 ° C.
  • a reaction solution containing template DNA, primers, dNTPs, DNA polymerase, and the like is placed in an eppendorf-type tube, and the tube is inserted into a well provided in an aluminum block.
  • An apparatus which performs a reaction by changing the temperature of the aluminum block using a heater and a cooler.
  • Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 1 below disclose a flow PCR method.
  • a PCR is performed by sending a reaction solution containing DNA polymerase, ⁇ -type DNA, primer DNA, dNTPs, etc., to a flow path provided with a heating section and a cooling section, thereby performing PCR. Is the way.
  • Patent Document 2 discloses a method for amplifying a nucleic acid sequence, comprising: (a) at least one kind of primer which is substantially complementary to a nucleic acid of type ⁇ , which is substantially complementary to a base sequence of the nucleic acid; And a DNA polymerase to synthesize a primer-extended strand complementary to the type III; wherein the primer is a chimeric oligonucleotide primer containing deoxyribonucleotides and ribonucleotides, The nucleotide is located at the 3 ′ end or 3 ′ end of the primer for cleavage by endonuclease; (b) the ribonucleotide-containing site of the primer extension strand of the double-stranded nucleic acid obtained in step (a) is endonucleated.
  • a method for amplifying a nucleic acid sequence comprising: extending a nucleic acid sequence complementary to type I with a DNA polymerase having the following to perform strand displacement. According to this method (ICAN method), DNA can be amplified without performing thermal cycling, so that an enzyme having no heat resistance can be used, and there is no restriction on the reaction scale due to thermal fluctuation.
  • Patent Document 1 JP-A-6-30776
  • Patent Document 2 JP-A-2003-70490
  • Non-Patent Document 1 “Science” (1998) No. 280, Vol. 5366, pp. 1046-1048 (by Kopp MU, Mello AJ, Manz A.)
  • nucleic acid synthesizing enzyme such as a DNA polymerase
  • a reaction product since a nucleic acid synthesizing enzyme such as a DNA polymerase is mixed in a reaction product, it is not only time-consuming to purify the amplified DNA, but also a costly nucleic acid synthesizing enzyme can be re-used. Use was almost impossible.
  • an object of the present invention is to provide a method for continuously and efficiently performing PCR using not only a heat-stable nucleic acid synthase but also a heat-stable nucleic acid synthase. It is an object of the present invention to provide a nucleic acid amplification apparatus and a nucleic acid amplification method which can be used continuously, can be used easily, can easily separate and purify the amplified nucleic acid, and can be scaled up. Means for solving the problem
  • the nucleic acid amplifier of the present invention has at least one flow path therein, and the flow path has at least a nucleic acid serving as a template, a nucleic acid serving as a primer, and a phosphorylated compound.
  • nucleic acid amplifier of the present invention at least one nucleic acid serving as a template, a nucleic acid serving as a primer, a phosphate compound, and a metal ion are provided in at least one flow path having the denatured region and the regenerated region.
  • a nucleic acid synthesis reaction is performed by introducing a reaction solution containing the nucleic acid, the nucleic acid synthetase immobilized in the regeneration region is affected by heating or the like when the template nucleic acid is melted and denatured into a single strand.
  • nucleic acid synthetase includes both natural and non-natural nucleic acids.
  • the nucleic acid amplification device of the present invention preferably includes a temperature control means capable of heating the denatured region and maintaining the regeneration region at a temperature lower than the temperature of the denatured region.
  • a temperature control means capable of heating the denatured region and maintaining the regeneration region at a temperature lower than the temperature of the denatured region.
  • a series of PCR cycles comprising the steps of causing the primer chain to perform complementary strand synthesis by acting can be continuously and efficiently performed.
  • the nucleic acid synthase is immobilized on beads, and the beads are filled at least in the regeneration region. According to this embodiment, the immobilized nucleic acid synthetase and the reaction solution can be efficiently contacted, so that the reaction efficiency can be increased.
  • the nucleic acid synthase may be fixed on at least the inner wall surface of the regeneration region.
  • the flow path on which the nucleic acid synthase is immobilized can be easily formed.
  • the nucleic acid synthase may be immobilized on the entire surface of the flow path to form the entire flow path.
  • the enzyme in the regeneration region is maintained in an active state, a desired flow path can be easily formed.
  • the denatured regions and the regenerated regions are provided alternately in the flow channel. According to this embodiment, since the PCR cycle can be performed a plurality of times, the target nucleic acid can be efficiently amplified.
  • nucleic acid synthase having an optimum temperature of 30 to 40 ° C can be used.
  • the range of use of nucleic acid synthases can be expanded, and relatively inexpensive enzymes that could not be used in conventional PCR can be selected.
  • an enzyme other than other general nucleic acid synthases can be used in combination. Therefore, it is possible to correct mismatches in enzymes that have been difficult to use together during PCR, such as synthesized nucleic acids.
  • the reliability of amplification can be improved as compared with conventional PCR by using a combination of enzymes and the like.
  • the channel may have a circulation channel, and the circulation channel may have the regeneration region and the denaturation region.
  • the circulation channel is a channel for circulating the reaction solution and alternately passing through the denaturation region and the regeneration region in the circulation channel.
  • the template nucleic acid, the primer nucleic acid, the phosphate compound, and the like can be repeatedly sent to the denaturation region and the regeneration region while circulating in the predetermined region.
  • the reaction solution can be positively reused, so that the running cost can be reduced.
  • the nucleic acid amplifier of the present invention has a liquid sending device for controlling the direction of the flow of the reaction solution, and the liquid sending device is controlled so as to periodically reverse the direction of the flow of the reaction solution. It is preferred that the According to this embodiment, it is possible to use various liquid supply devices capable of supplying liquid within a limited volume, to simplify the liquid supply device, and to reduce the size of the device. It can respond appropriately.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is a method for amplifying a template nucleic acid in a reaction solution containing at least a template nucleic acid, a primer nucleic acid, a phosphate compound and a metal ion.
  • A a denaturation step of melting a double strand formed in a molecule of the nucleic acid serving as a template and between Z or between molecules in a predetermined region; and (b) the denaturation step obtained in the step (a).
  • the denaturing step and the regenerating step can be performed in different regions, respectively, and the nucleic acid can be immobilized in a region including the region where the regenerating step is performed.
  • the nucleic acid synthase obtained is not affected by heating or the like at the time of denaturing the nucleic acid serving as a template, so that inactivation of the nucleic acid synthase is suppressed, and even if a nucleic acid synthase having no heat resistance is used.
  • PCR can be performed continuously.
  • the nucleic acid synthesizing enzyme is immobilized, the amplified nucleic acid can be easily separated and purified, and the nucleic acid synthesizing enzyme can be reused and continuously used, thereby facilitating the scale-up of the reaction.
  • a double-stranded region formed by melting a double strand formed within a molecule of a nucleic acid and between Z or between molecules is denatured into a single strand, and the nucleic acid in which the double strand is melted is a double strand.
  • a reaction solution containing at least a nucleic acid serving as a template, a nucleic acid serving as a primer, a phosphoric acid compound, and a metal ion is introduced into a flow path having a regeneration region for reforming a nucleic acid, and the nucleic acid synthesis reaction is performed, the regeneration region is used.
  • the nucleic acid synthase immobilized on the nucleic acid is not affected by heating when denaturing the nucleic acid used as a template. However, PCR can be performed continuously. In addition, since the nucleic acid synthetase is immobilized, the amplified nucleic acid can be easily separated and purified, and the nucleic acid synthase can be reused and continuously used, thereby facilitating the scale-up of the reaction.
  • FIG. 1 is a diagram showing one embodiment of a nucleic acid amplifier of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view of a part of a channel of the nucleic acid amplifier.
  • FIG. 3 is a diagram showing another embodiment of the nucleic acid amplifier of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view of a circulation channel of the nucleic acid amplifier.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a denaturing temperature control unit and a regeneration temperature control unit for forming the denaturation region and the regeneration region.
  • FIG. 6 is a view showing still another embodiment of the nucleic acid amplifier of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic view showing a nucleic acid synthetase immobilized in a capillary in the nucleic acid amplifier.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing one unit of the flow channel of the nucleic acid amplifier used in the example of the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph showing the result of amplifying a nucleic acid by the nucleic acid amplifier and detecting the nucleic acid by agarose gel electrophoresis.
  • nucleic acid amplification method of the present invention at least one nucleic acid serving as a template (hereinafter simply referred to as a template), a nucleic acid serving as a primer (hereinafter simply referred to as a primer), a phosphate compound and a metal ion are provided in at least one flow path.
  • a reaction solution containing the mixture denaturation of the template, annealing of the denatured template and the primer, and synthesis of nucleic acid by a nucleic acid synthase are performed in the channel.
  • a denaturing region for performing a denaturing reaction of the double-stranded template nucleic acid and an annealing reaction between the single-stranded template nucleic acid and the primer are performed together with a nucleic acid synthesis reaction by a nucleic acid synthase. And a nucleic acid synthase is fixed in at least a part of the flow path of the regeneration region. It is.
  • the denaturation of the template means that the double-stranded nucleic acid is melted to form a single strand.
  • the denatured region is set in an environment necessary for denaturation of the template. ) Set to above the melting temperature of nucleic acid, 2) Set to basic or acidic, 3) Do not contain cations, 4) Mix with hydrogen bond inhibitors (such as urea or guanidium salt). Set.
  • the temperature is set to a temperature equal to or higher than the melting temperature of the nucleic acid, which can be set repeatedly among the above conditions (heating is effective as a means), or It is particularly preferable to set the temperature to be “basic” or “acidic” because it is most efficient to set the temperature to be higher than the melting temperature of nucleic acid.
  • the denaturation of the template is performed by heating it above the melting temperature of the nucleic acid, it cannot be said unconditionally because it differs depending on the length and sequence of the template. , Preferably heated to 92-97 ° C.
  • the conventional PCR method does not use a basic environment as a template denaturing condition.
  • the region where the synthase is immobilized can be set in a neutral environment, and if the environment is neutralized in this way, the denaturation region can be set in a basic environment and the template can be denatured.
  • the above-mentioned regenerating region is set in an environment necessary for regenerating nucleic acid, and is, for example, 1) set at a temperature lower than the melting temperature of nucleic acid (as a means of non-heating or cooling), 2) a weakly acidic weak base.
  • the temperature conditions for performing nucleic acid regeneration cannot be unconditionally determined because the temperature differs depending on the melting temperature of the template and the primer. For example, when a 15-30 mer primer is used, the temperature is 30-70 ° C. In the present invention, 30 to 40 ° C. is particularly preferred.
  • Regeneration of nucleic acid means that single-stranded nucleic acids complementary to each other form a double strand. Regeneration of nucleic acid in an environment in which PCR is performed substantially anneals the template and the primer. means.
  • the reaction solution introduced into the flow channel moves to the denaturation region, whereby the reaction solution is exposed to an environment set in the denaturation region, and the reaction solution is transferred to the regeneration region. By moving, the reaction solution is exposed to the environment set in the regeneration area.
  • the denaturing region is provided outside the flow channel so that the reaction solution moving in the flow channel can be heated to a temperature equal to or higher than the melting temperature of the nucleic acid.
  • the regenerating region which is preferably formed by providing control means, has a regenerating temperature outside the flow channel so that the reaction solution moving in the flow channel can be adjusted to the melting temperature of the nucleic acid or lower. It is preferable to form by providing a control means.
  • the nucleic acid synthetase used in the method of the present invention is an enzyme that can be used for nucleic acid amplification, and can be used without particular limitation as long as it is a commonly available enzyme. Ligase, reverse transcriptase, RNA polymerase and the like. Further, these nucleic acid synthases can be used in combination.
  • the conventional PCR method PCR ligase chain reaction (ligase chain)
  • a nucleic acid synthase having heat resistance which is used in the reaction: LCR) method, can also be used. Since the nucleic acid synthetase is fixed in the flow path of the regeneration region and is not exposed to heating or the like performed when the template is modified, it is possible to use a nucleic acid synthase having no heat resistance.
  • a nucleic acid synthase having an optimum temperature of 30 to 40 ° C Since it can be suitably used, a relatively inexpensive enzyme that could not be used in conventional PCR can be selected. In addition, an enzyme other than other general nucleic acid synthases can be used in combination. Therefore, by using an enzyme which was difficult to be used at the time of the conventional PCR, for example, an enzyme that corrects a mismatch of the synthesized nucleic acid, the reliability of amplification can be improved as compared with the conventional PCR.
  • enzymes having high reaction efficiency, enzymes and easy availability are preferably used, and specifically, DNA polymerase I derived from Escherichia coli having high replication reliability is preferably used. .
  • DNA polymerase I derived from Escherichia coli having high replication reliability is preferably used.
  • Klenow fragment or the like may be used except for the exonuclease active site of DNA polymerase I.
  • the nucleic acid synthetase may be immobilized on the bead surface and directly immobilized on the inner wall surface of the flow channel to be filled in at least a part of the flow channel in the regeneration region.
  • the immobilized nucleic acid synthase and the reaction solution can be efficiently contacted, so that the reaction efficiency can be increased.
  • the configuration of the device of the present invention can be simply formed. That is, when such a flow path is formed, first, the nucleic acid synthase can be immobilized on the entire surface of the flow path to form the entire flow path. In this embodiment, even if the enzyme in the denatured region is inactivated. However, since the enzyme in the regeneration region is maintained in the active state, a desired flow path can be easily formed.
  • the material of the beads for immobilizing the nucleic acid synthase is not particularly limited! However, metal fine particles, glass particles, resin particles and the like can be preferably exemplified, and in particular, biological materials such as latex beads and chitosan beads can be used. Beads that are easy to immobilize enzymes that have good compatibility with molecules are preferably used.
  • the size of the beads can be appropriately set as long as the size is such that the beads can be filled in the flow channel, and usually has a diameter of 0.4 to 100 ⁇ m, and preferably a diameter of 1-150 ⁇ m.
  • the flow path is formed of a material that has a relatively high thermal conductivity, is stable in a temperature range required for PCR, and is hardly adsorbed by nucleic acids and proteins that are eroded by an electrolyte solution or an organic solvent.
  • materials having heat resistance and corrosion resistance include glass, stone, silicon, and various plastics.
  • the inner wall surface to be touched is coated with a material that is generally difficult to absorb nucleic acids and proteins, such as polyethylene and polypropylene, or shares molecules with many hydrophilic functional groups, such as polyethylene glycol (PEG). It is preferable to introduce by bonding or the like to suppress the adsorption of nucleic acids and proteins.
  • a known method such as a supporting method, an inclusive method, a covalent bonding method, a crosslinking method, and an electrostatic adsorption method is employed.
  • a covalent bonding method or a cross-linking method is particularly preferable for repeatedly carrying out the enzymatic reaction.
  • the covalent bonding method can be carried out by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • a relatively highly reactive functional group for example, Mouth carboxyl group (carboxylic acid chloride), carboxyl group, amino group, thiol group (sulfanyl group), epoxy group, etc.
  • a relatively highly reactive functional group for example, Mouth carboxyl group (carboxylic acid chloride), carboxyl group, amino group, thiol group (sulfanyl group), epoxy group, etc.
  • the functional group and carbonyl group amino group on the surface of nucleic acid synthase By reacting with a thiol group (sulfanyl group).
  • the reaction solution used in the present invention contains at least a template, a primer, a phosphorylated compound and a metal ion.
  • the template is a nucleic acid to be amplified, and a natural or non-natural nucleic acid prepared by a conventional method can be used.
  • the concentration of the template in the reaction solution is usually 0.01-— ⁇ force, preferably 0.1- ⁇ force! / ⁇ .
  • the primer is a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to at least a part of the nucleotide sequence of the template, and may be any nucleic acid that can be used in a general PCR method or LCR method. It is preferable that the DNA is designed so that it can be efficiently amplified. Usually, a 15-30 mer is preferably used. For example, a nucleic acid serving as a primer can be easily prepared by using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • the concentration of the primer in the reaction solution is usually preferably 0.01-1 ⁇ m, more preferably 0.1-0.2 ⁇ m.
  • the above primers also include non-natural nucleic acids that have been chemically modified and modified for subsequent detection or separation.
  • the non-natural nucleic acid is not particularly limited, but may be an oligonucleic acid labeled with biotin or FITC, an oligonucleic acid having a phosphothioate bond, or ⁇ ( ⁇ Peptide nucleic acid) and a chimeric nucleic acid containing a natural nucleic acid.
  • the above phosphoric acid compound is a component serving as a substrate when amplifying nucleic acid.
  • dNTP DNA polymerase ⁇ reverse transcriptase
  • dNTP DNA polymerase ⁇ reverse transcriptase
  • a mixture containing dATP, dCTP, dGTP and dTTP at an arbitrary ratio, preferably an equal mixture of four kinds of deoxynucleotide triphosphates is used.
  • ligase NTP is preferably used, and ATP and GTP are particularly preferred.
  • the concentration of the phosphoric acid conjugate in the reaction solution can be set as appropriate. Usually, 0.01 to ImM is preferred, and 0.1 to 0.5 mM is more preferred.
  • Examples of the metal ion include potassium ion (K +), sodium ion (Na +), magnesium ion (Mg2 +) and the like. By including such a metal ion, effects such as stabilization of double-stranded nucleic acid, activation of an enzyme, and improvement in fidelity of a synthesized nucleic acid can be obtained.
  • the concentration of the metal ion in the reaction solution is usually 10-200 mM for potassium ion or sodium ion, and more preferably 50-100 mM power.
  • magnesium ion is preferably 1.5 mM, more preferably 1.5-2.5 mM.
  • the feeding rate and flow rate of the reaction solution are set so that denaturation of the template, annealing of the denatured template and the primer, and nucleic acid synthesis can be performed efficiently in the flow channel. It is preferable to appropriately adjust the conditions such as the length of the road. These conditions cannot be said unconditionally because they are affected by the length of the template, the length of the nucleic acid to be synthesized, the reaction speed of the nucleic acid synthase to be used, and the like.
  • the time for passing once is 1-160 seconds, preferably 5 to 30 seconds, and the time for passing once through the reproduction area is 5 to 300 seconds, preferably 10 to 120 seconds.
  • nucleic acid amplifying device used in the nucleic acid amplifying method of the present invention will be described with reference to the drawings, but basically the same portions will be denoted by the same reference numerals and description thereof will be omitted.
  • FIG. 1 shows one embodiment of the nucleic acid amplifier of the present invention.
  • the nucleic acid amplifying device 10 includes a substrate 1 having a denaturation temperature region A and a regeneration temperature region B, wherein the denaturation temperature region A and the regeneration temperature region B alternately meander to form the denaturation temperature region A.
  • a flow path 2 having a predetermined inner diameter is formed so as to pass through the regeneration temperature region B a plurality of times, whereby the flow path 2 is denatured from the nucleic acid serving as the template to form a single strand.
  • a flow path having a denaturing region for performing a denaturing reaction to be performed and a regeneration region for annealing the single-stranded nucleic acid and the nucleic acid serving as the primer and further performing a nucleic acid synthesis reaction can be provided.
  • a part of the regeneration area of the flow path is provided with a plurality of bead filling portions 3 each of which is filled with a bead having a nucleic acid synthase immobilized on the surface.
  • an injection hole 2a for injecting the reaction solution into the flow channel, and a takeout hole 2b for taking out the reaction solution after the amplification reaction of the nucleic acid is provided, You.
  • FIG. 2 is a schematic diagram in which a part of the flow path of the nucleic acid amplification device is enlarged.
  • the nucleic acid synthetase 5 is immobilized on the surface of the beads 4.
  • the immobilized nucleic acid synthase 6 filled with the immobilized nucleic acid synthesizing enzyme 6 can be brought into contact with the reaction solution that has moved through the flow path and the nucleic acid synthesizing enzyme 5 immobilized on the immobilized nucleic acid synthesizing enzyme 6.
  • a filter having an appropriate sieve size should be installed at the inlet and the outlet of the bead filling unit 3 so that the immobilized nucleic acid synthase 6 does not leak.
  • the material of the filter is not particularly limited, but preferred examples thereof include cellulose, which hardly causes nucleic acid adsorption, and the like.
  • this nucleic acid amplifier 10 When this nucleic acid amplifier 10 is used, at least a template, a primer, a reaction solution containing a phosphate compound and metal ions are supplied by an external liquid sending device (not shown) such as a pump. Feed the solution in the direction of the arrow.
  • an external liquid sending device such as a pump. Feed the solution in the direction of the arrow.
  • the flow path 2 is formed so as to pass through the denaturation temperature region and the regeneration temperature region of the substrate at least once, respectively.
  • the nucleic acid is formed so as to pass 20 to 40 times.
  • the size of the flow path 2 is such that the diameter is reduced and the specific surface area is increased so that heat conduction is performed, and heat flow is easily performed so that thermal fluctuation does not occur.
  • the optimal channel width is 20-200 ⁇ m, preferably 50-100 ⁇ m, and the depth is 20-200 m, preferably 40-100 / zm.
  • the width of the flow channel in the portion filled with the immobilized nucleic acid synthase 6 is 20 to 3000 ⁇ m, preferably 50 to 1000 ⁇ m, and the depth is 20 to 100 m, preferably 40 to 500 ⁇ m. m.
  • the flow channel 2 is made of a material that has a relatively high thermal conductivity, is stable in a temperature range required for PCR, and is hardly adsorbed by nucleic acids and proteins that are eroded by an electrolyte solution or an organic solvent.
  • materials having heat resistance and corrosion resistance include glass, quartz, silicon, and various plastics.
  • their surfaces are generally made of nucleic acids such as polyethylene and polypropylene. It is preferable to suppress the adsorption of nucleic acids and proteins by coating with materials that are not likely to adsorb proteins and proteins, or by introducing molecules containing many hydrophilic functional groups such as polyethylene glycol (PEG) by covalent bonds or the like. .
  • the substrate having the flow path can be formed, for example, as follows. That is, a groove having the above-mentioned predetermined width and depth is formed on one substrate having the above-mentioned material strength by a cutting process or the like, and another substrate or the like is formed so as to cover the groove. A method of attaching a film can be suitably employed.
  • FIG. 3 shows another embodiment of the nucleic acid amplifier of the present invention.
  • the nucleic acid amplifier 20 has a configuration in which a plurality of other substrates lb, lc, Id, le, lf, and lg are connected in a branched manner to the substrate la shown in FIG. Note that the connection form of these substrates is not limited to the form shown in FIG. 3, but may be connected in various forms so that nucleic acid amplification can be performed efficiently.
  • the nucleic acid amplifier 20 uses a reaction solution comprising at least a first reaction solution containing the template, at least the primer, a second reaction solution containing a phosphate compound and a metal ion, and sends it from an external liquid sending device 11 such as a pump.
  • the first reaction liquid and the second reaction liquid are supplied to the substrate la from the first reaction liquid tank 14 and the second reaction liquid tank 15, respectively, and the substrates lb, lc, Id, To le, lf, and lg, the reaction solution that has passed through the substrate la is supplied as it is as a template by the external liquid supply device 12, and the primers and phosphoric acid condensed by the reaction in the substrate la are also supplied.
  • the reaction substrate such as The liquid is supplied from the second reaction liquid tank 15.
  • reaction solution that has passed through the above-mentioned substrates lb, lc, Id, le, If can be directly recovered and purified for nucleic acid, and can be further connected to a plurality of substrates as needed to amplify the nucleic acid. Just go.
  • a part of the reaction solution passing through the substrate la and a portion of the reaction solution passing through the substrate lg are used as the first reaction solution in the flow paths 7 and 8 and the pump. 13 are provided.
  • the substrates are connected in a branched manner as described above, at least one substrate in each stage, for example, the substrate immediately before branching (substrate la) or the reaction solution that has passed through the substrate is subjected to the first reaction. It is preferable that a nucleic acid synthase having high reliability of replication is immobilized on a substrate having a route to be reused as a reaction solution (substrate lg). As a result, the template can be accurately amplified, and thus the template can be accurately amplified even if PCR is repeated.
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) show the nucleic acid amplifier of the present invention, in which the reaction solution is circulated and a circulation channel for alternately passing the denaturation region and the regeneration region in the circulation channel. The structure is shown.
  • a circulation flow path is formed by a branch flow path 2c branched at a predetermined location in the flow path 2, and the liquid sent to the branch flow path 2c is a reaction liquid. It can be controlled by an external liquid sending device 13a that controls the direction of flow of the liquid.
  • the reaction solution that entered the branch channel 2c at the branch of the flow path passed through the denaturation area in the circulation flow path in the denaturation temperature area A, returned to the regeneration temperature area B from the junction of the flow paths, and passed once. It is possible to pass through the regeneration area in the circulation channel again.
  • the circulation channel may have a structure in which the channel 2 is formed in a ring shape and has no branch channel.
  • a reaction solution tank 16 serving as a supply / removal portion of the reaction solution is disposed in the middle of the annular flow path 2, and the reaction solution introduced from the reaction solution tank 16 is supplied by an external solution sending device 13 a in the figure. Circulate in the flow path 2 in the direction of the arrow.
  • the reaction solution circulates through the circulation channel, and alternately and repeatedly passes through the denaturing region and the regeneration region in the circulation channel, whereby the nucleic acid amplification reaction proceeds. In (a), it can be collected from the outlet of the flow channel, and in FIG. 4 (b), it can be collected from the reaction solution tank 16.
  • the denaturing temperature region and the regeneration temperature region of the substrate are, for example, as shown in FIG. 5 (a), a thermostatic bath 31 having a denaturation temperature control means 34 and a regeneration temperature control. It can be formed by placing the substrate 1 in a temperature control device 33 having a structure in which a constant temperature bath 32 having means 35 is partitioned by a partition plate 38. In each of the constant temperature baths, stirrers 36 and 37 are provided to stir the medium in the constant temperature bath and keep the temperature uniform.
  • a plurality of substrates 1 are stacked, and denaturing temperature control means 39 and regeneration temperature control means 40 are provided between each substrate or between several substrates. May be arranged to form a denaturing temperature region and a regeneration temperature region of the substrate.
  • the denaturing temperature control means and the regeneration temperature control means may be a thermoelectric element, a thermostat, a heating wire as long as the temperature can be kept constant by an arbitrary temperature control device. And a lamp heater. Further, the denaturing temperature control means and the regeneration temperature control means may be arranged so as not to contact the substrate.
  • FIG. 6 shows still another embodiment of the nucleic acid amplifier of the present invention.
  • this nucleic acid amplifier 50 two capillaries 51 are used as flow paths.
  • the capillary 51 is provided in a temperature control device 52 having a denaturing temperature region A and a regeneration temperature region B. It is spirally wound and installed so that it passes through the temperature region and the regeneration temperature region alternately.
  • the nucleic acid synthetase 5 is directly fixed as shown in FIG.
  • the material of the above capillaries is not particularly limited, but has a relatively high thermal conductivity, is stable in a temperature range required for PCR, and is hardly adsorbed to nucleic acids and proteins by erosion by an electrolyte solution or an organic solvent.
  • glass, plastic, and the like which are preferably formed of a resin, can be exemplified.
  • a capillary having a material strength that is semipermeable and has a property of allowing only low molecules to pass therethrough without passing through a polymer can also be used.
  • a low temperature medium is used as a medium in a constant temperature bath in which the capillary is installed.
  • a solution containing a high molecular weight substrate eg dNTP, NTP, etc.
  • Preferred examples of the semipermeable cavities include hollow fibers that are also sold by Mitsubishi Rayon and Toray.
  • the size of the cavities is an outer diameter force of 100 to 1000 m, preferably 200 to 500 ⁇ m, and an inner diameter force of 0 to 600 ⁇ m, preferably 50 to 150 ⁇ m.
  • the immobilization of the nucleic acid synthetase on the inner wall surface of the capillaries can be performed in the same manner as the method for immobilizing the nucleic acid synthase described above, and the nucleic acid synthase is immobilized on the entire inner wall surface of the capillary. Should be fixed.
  • the nucleic acid synthase immobilized in the denatured region is usually inactivated by heating or the like and does not affect the nucleic acid synthesis reaction. There is no practical problem as long as the nucleic acid synthase immobilized on the enzyme has activity.
  • the labor for loading beads or immobilizing the nucleic acid synthetase only at a specific location can be omitted, and the production becomes easy.
  • one region of the substrate is subjected to a denaturation temperature region.
  • a flow path substrate in which another area is defined as a regeneration temperature area one flow path is formed on the surface in a meandering manner, and arranged so as to alternately pass through these areas, Molded like [0065] That is, a thin plate-like substrate (35 mm long x 70 mm wide) having a thickness of lmm was prepared by injection molding polyethylene, and had a width and a depth shown in Table 1, and was not interrupted in the length direction. The grooves were formed on the substrate surface by cutting to form a flow path substrate. At that time, the flow path portion occupied by one adjacent denaturation region and one regeneration region was set to one unit.
  • Fig. 8 shows a schematic diagram of the groove for one unit of the flow channel.
  • the length along the flow path of the groove that becomes the change area in the denaturation temperature area A of the substrate is 12 mm
  • the length along the flow path of the groove that becomes the reproduction area in the reproduction temperature area B of the substrate is 50mm.
  • the width of the groove of the enlarged diameter portion 3a of the flow path filled with the immobilized nucleic acid synthase is 1000 m
  • the width of the groove in the other portion is 200 m.
  • the uninterrupted grooves in the length direction formed by cutting on the polyethylene substrate are formed such that the grooves for one unit of the flow path are connected in series for 40 units.
  • the immobilized nucleic acid synthesizing enzyme to be filled in the enlarged diameter portion 3a of the flow path of the substrate was adjusted as follows.
  • a chitosan bead carrier having an average particle size of 100 ⁇ m (trade name “Chitopearl BCW-3001”; manufactured by Fuji Boseki Co., Ltd.) Na2HP04, 2.68 mM KCL, 1.47 mM KH2P04, pH 7.2), 4. Equilibrated with C for 8 hours.
  • the PBS buffer was removed by filtration, 2 ml of a 2.5% aqueous dartal aldehyde solution was added, and the mixture was activated at 4 ° C for 2 hours. Then, after filtering a 2.5% aqueous solution of dartaraldehyde, the beads were washed three times with 5 ml of a PBS buffer.
  • the immobilized nucleic acid synthase prepared as described above was dropped and filled into the bead-filled portion of the channel substrate at a rate of 2.5 ⁇ l per unit of the channel using a micropipette. In this case, it was considered that immobilized nucleic acid synthase occupies approximately half of the volume of the bead-filled portion.
  • a veltier element On the surface on the side opposite to the surface on which the groove of the flow path substrate was formed, a veltier element was disposed as temperature control means.
  • the Peltier device required to make the constant area of the substrate a denaturation temperature region of 94 ° C, and the Peltier device necessary to make the constant area of the substrate a regeneration temperature region of 37 ° C. were placed on the surface of the flow path substrate.
  • a liquid sending tube from a high-performance liquid chromatography pump which is a liquid sending device, was joined to a connector adhered to a flow path inlet of the nucleic acid amplification reaction substrate to obtain the nucleic acid amplifier.
  • a PCR reaction was performed using the nucleic acid amplification device prepared in Example 1. At that time, an aqueous solution containing the following contents was used as the reaction solution.
  • Negative strand of type II double-stranded DNA SEQ ID NO: 2
  • a solution containing no type II double-stranded DNA (73 base pairs) in the above reaction solution was used as a control.
  • the reaction solution or the control solution was previously denatured at 94 ° C for 2 minutes, cooled to 37 ° C, and then sent to the nucleic acid amplifier of Example 1 at a liquid sending rate of 1 ⁇ m using the liquid sending device.
  • the solution was sent at lZmin.
  • the ratio of the portion occupied by the regeneration region and the denatured region in the volume of the channel in one unit of the channel arranged on the channel substrate of the nucleic acid amplification device of Example 1 described above is the ratio in the regeneration region. Taking into account that a part is occupied by immobilized nucleic acid synthase, it is about 7: 1.
  • reaction solution or control solution that passed through the flow path for 40 units was subjected to 40 cycles of PCR in which the denaturation reaction was performed at 94 ° C for 30 seconds, the annealing Z extension reaction was performed at 37 ° C for 3 minutes 30 seconds. It is considered equivalent.
  • a 3% agarose gel (TAE buffer: TAE buffer solution) is prepared by passing a part of the control solution together with the reaction solution and the nucleic acid molecular weight marker before introducing a part of the control solution into the flow path of the nucleic acid amplifier.
  • the gel was electrophoresed in 40 mM Tris, 19 mM acetic acid, ImMEDTA), and the obtained gel was stained with 0.5 g Zml ethidium bromide aqueous solution.
  • Fig. 9 shows a photographic image during UV (302nm) irradiation.
  • 1 is a lane for electrophoresis of the reaction solution before introduction into the flow path of the nucleic acid amplifier
  • 2 is a lane for electrophoresis of the reaction solution passed through the flow path for 40 units
  • 3 is a nucleic acid molecular weight marker ( The lane in which a 50 bp ladder was electrophoresed, and the lane 4 in which a control solution passed through a channel for 40 units was electrophoresed.
  • the type ⁇ ⁇ double-stranded DNA (73 base pairs) contained in the reaction solution before introduction into the flow path of the nucleic acid amplifier was very small and was not detected (lane 1). ). In addition, no DNA was detected in the control solution that passed through the flow path for 40 units (lane 4). On the other hand, from the reaction solution that passed through the flow path for 40 units, the mobility ( Using lane 3) as an index, DNA was detected at a position near 70-75 bases in length, confirming that type II double-stranded DNA (73 base pairs) in the reaction solution was amplified (lane 2).
  • SEQ ID NO: 1 Positive strand of type III double-stranded DNA having a length of 73 bases, which is type II in a PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 2 Minus strand of type III double-stranded DNA having a length of 73 bases, which is type II in a PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 3 PCR forward primer DNA for amplifying type I DNA.
  • SEQ ID NO: 4 Reverse primer DNA for PCR to amplify type I DNA.
  • the present invention can be used for efficient replication and amplification of template nucleic acids and the like.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　耐熱性のない核酸合成酵素を利用してもＰＣＲを効率よく行うことができ、核酸合成酵素の再利用やスケールアップ等が可能で、増幅した核酸の分離・精製も容易な核酸増幅装置及び核酸増幅方法を提供する。 　核酸の分子内及び／又は分子間で形成された二重鎖を融解し一本鎖状に変性する領域と、該二重鎖が融解した核酸が二重鎖を再形成する再生領域とを有する流路に、少なくともテンプレートとなる核酸と、プライマーとなる核酸と、リン酸化合物及び金属イオンを含む反応液を流し、前記変性領域で前記テンプレートとなる核酸の分子内及び／又は分子間で形成された二重鎖を融解し一本鎖状に変性させた後、前記再生領域で該二重鎖を融解したテンプレートとなる核酸と前記プライマーとなる核酸との間に二重鎖を形成させると共に前記再生領域内に固定された核酸合成酵素によって核酸合成を行う。

Description

明 細 書
核酸増幅装置及び核酸増幅方法
技術分野
[0001] 本発明は、 PCR法を利用した核酸増幅装置及び核酸増幅方法に関し、更に詳しく は、内部に少なくとも一の流路を有し、該流路に少なくともテンプレートとなる核酸と プライマーとなる核酸とリン酸化合物及び金属イオンとを含む反応液を導入し、該流 路内に固定された核酸合成酵素により核酸の増幅を行う核酸増幅装置及び核酸増 幅方法に関する。
背景技術
[0002] 微量のテンプレート DNAの効率的な複製'増幅には、 PCR (Polymerase Chain Reaction)法が広く用いられている。 PCR法は、テンプレートとなる 2本鎖 DNAを熱変 性して 1本鎖 DNAにする工程、得られた 1本鎖テンプレート DNAに各々相補的なプ ライマーをアニーリングする工程、耐熱性を有する DNAポリメラーゼを作用させて、 プライマーから相補鎖合成を行うことにより 2本鎖 DNAを合成する工程を 1サイクルと し、このサイクルを複数回繰り返すことによって目的の DNAを増幅する方法である。
[0003] 上記各工程は、反応液の温度及び反応時間を管理することにより行われており、通 常、テンプレートとなる 2本鎖 DNAの 1本鎖 DNAへの熱変性は約 94°C、 1本鎖 DN Aへのプライマーのアニーリングは約 55°C、 DNAポリメラーゼによる相補鎖の合成は 約 72°Cで行われる。
[0004] 従来、 PCR法を自動的に行う装置として、テンプレート DNA、プライマー、 dNTP、 DNAポリメラーゼ等を含む反応液をエツペンドルフ型チューブに入れ、このチューブ をアルミ製のブロックに設けられたゥエルに挿入して該アルミブロックの温度をヒータ 一と冷却器を用いて変化させることにより反応を行う装置が知られている。
[0005] し力しながら、上記 PCR法は熱サイクルを高 、精度の温度コントロール下で行う必 要があり、上記のようなバッチ式での反応ではスケールの増大とともに反応系の熱摇 らぎが著しくなるためスケールアップに限界があった。
[0006] そのため、熱サイクルの温度コントロールを高い精度で行い、かつスケールアップも 可能な PCR法として、下記特許文献 1及び下記非特許文献 1には、フロー式 PCR法 が開示されている。このフロー式 PCR法は、加熱部と冷却部を設けた流路に、 DNA ポリメラーゼ、铸型 DNA、プライマー DNA、 dNTP等を含む反応液を送液することに よって熱サイクルを行い、 PCRを行う方法である。
[0007] また、下記特許文献 2には、核酸配列を増幅するための方法であって、（a)铸型と なる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも 1種類のプライマーと D NAポリメラーゼにより処理して該铸型に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工程 ；ここで該プライマーはデォキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するキ メラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ による切断のために該プライマーの 3'末端又は 3'末端側に配置され；（b) (a)工程 で得られる二本鎖核酸のプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌク レアーゼで切断する工程;および (c) (b)工程で得られるプライマー伸長鎖が切断さ れたニ本鎖核酸のプライマー部分の 3'末端より、鎖置換活性を有する DNAポリメラ ーゼによって铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行う工程;を包含すること を特徴とする核酸配列の増幅方法が開示されている。この方法 (ICAN法）によれば 、熱サイクルを行わずに DNAを増幅することができるので、耐熱性のない酵素を用 いることができ、また、熱揺らぎによる反応スケールの制限もない。
特許文献 1：特開平 6— 30776号公報
特許文献 2：特開 2003— 70490号公報
非特許文献 1：「Science」（1998年） 280号 5366卷、 1046-1048頁（Kopp MU、 Mello AJ 、 Manz A.著）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] しかしながら、上記バッチ式の PCR法、上記特許文献 1や上記非特許文献 1に記 載された PCR法は、 2本鎖テンプレート DNAを 1本鎖 DNAに変性させる際に加熱 する必要があるため、耐熱性を有する特殊な DNAポリメラーゼを用いる必要があり、 普遍的に存在する耐熱性のな ヽ DNAポリメラーゼが使用できな 、と 、う欠点があつ た。 [0009] また、上記特許文献 2に開示された方法では、プライマーに RNAと DNAのキメラプ ライマーを用いたり、 DNAの二重鎖をほどきながら DNAを合成する exo-Bca DNA polymeraseやキメラプライマーから新たに伸長された DNAとキメラプライマー RNAと の接点を切断する RNase H等の特殊な酵素を必要とするため、コストが高くなつてし まつといつ欠点^あった。
[0010] 更に、上記従来の方法では、反応生成物中に DNAポリメラーゼ等の核酸合成酵 素が混在するため、増幅した DNAの精製に手間が力かるだけでなぐ高価な核酸合 成酵素の再利用がほとんど不可能であった。
[0011] したがって、本発明の目的は、耐熱性を有する核酸合成酵素だけでなく耐熱性の ない核酸合成酵素を利用しても連続的に PCRを効率よく行うことができ、核酸合成 酵素の再利用、連続的利用が可能であり、更に増幅した核酸の分離'精製が容易で 、スケールアップも可能な核酸増幅装置及び核酸増幅方法を提供することにある。 課題を解決するための手段
[0012] 上記目的を達成するため、本発明の核酸増幅装置は、内部に少なくとも一の流路 を有し、該流路に少なくともテンプレートとなる核酸とプライマーとなる核酸とリン酸ィ匕 合物及び金属イオンとを含む反応液を流し、該流路内で核酸を増幅する核酸増幅 装置であって、
前記流路が、前記テンプレートとなる核酸の分子内及び Z又は分子間で形成され た二重鎖を融解する変性反応を行う変性領域と、該二重鎖が融解したテンプレートと なる核酸と前記プライマーとなる核酸とが二重鎖を形成する再生領域とを有すると共 に、前記再生領域には核酸合成酵素が固定されていることを特徴とする。
[0013] 本発明の核酸増幅装置によれば、上記変性領域と上記再生領域とを有する少なく とも一の流路内に、少なくともテンプレートとなる核酸とプライマーとなる核酸とリン酸 化合物及び金属イオンとを含む反応液を導入し核酸合成反応を行う際、上記再生領 域に固定された上記核酸合成酵素が、テンプレートとなる核酸を融解し一本鎖状に 変性させる際の加熱等の影響を受けることがないので、核酸合成酵素の失活が抑制 され、耐熱性のない核酸合成酵素を利用しても連続的に PCRを行うことができる。ま た、上記核酸合成酵素が固定されているので、増幅した核酸の分離'精製が容易に できると共に上記核酸合成酵素の再利用、連続的利用が可能となり、反応のスケー ルアップも容易である。なお、本発明において、核酸と言う場合には、天然型及び非 天然型の双方の核酸を含む意味である。
[0014] 本発明の核酸増幅装置においては、上記変性領域を加熱し、且つ、上記再生領 域を上記変性領域の温度より低温に保持できる温度制御手段を備えていることが好 ましい。この態様によれば、分子内及び Z又は分子間で形成された二重鎖を有する テンプレートとなる核酸を熱によって融解して一本鎖状に変性する工程、前記変性領 域の温度より低温の環境下、得られた該二重鎖が融解したテンプレートとなる核酸と 各々相補的なプライマーとの間で二重鎖形成を行う工程、前記変性領域の温度より 低温の環境下、核酸合成酵素を作用させてプライマーカゝら相補鎖合成を行う工程か らなる一連の PCRサイクルを連続して効率よく行うことができる。
[0015] また、前記核酸合成酵素はビーズに固定され、該ビーズが少なくとも前記再生領域 に充填されていることが好ましい。この態様〖こよれば、固定された核酸合成酵素と反 応液とを効率よく接触させることができるので反応効率を高めることができる。
[0016] あるいは、上記核酸合成酵素は、少なくとも前記再生領域の内壁面に固定されたも のであってもよい。この態様によれば、核酸合成酵素が固定ィ匕した流路を簡単に形 成することができる。即ち、このような流路を形成する場合、まず、流路の全面に核酸 合成酵素を固定化させて全流路を形成してもよぐこの態様により、たとえ変性領域 の酵素が失活しても、再生領域の酵素は活性状態が保持されるので、所望の流路を 容易に形成することができる。
[0017] 更にまた、上記流路内に、上記変性領域と上記再生領域が交互に設けられている ことが好ましい。この態様によれば、 PCRサイクルを複数回行うことができるので、目 的の核酸を効率よく増幅することができる。
[0018] 本発明の核酸増幅装置においては、上記核酸合成酵素として、温度 30— 40°Cに 至適温度を有するものを用いることができる。この態様によれば、核酸合成酵素の使 用選択範囲が広がり、従来の PCRで使用できなかった比較的安価な酵素を選択で きる。また、他の一般的な核酸合成酵素以外の酵素の併用も可能にする。従って、 従来 PCR時に併用が困難だった酵素、例えば、合成された核酸のミスマッチを修正 する酵素等を併用することにより、従来の PCRに比べて増幅の信頼性を向上させる ことができる。
[0019] また、本発明の核酸増幅装置においては、上記流路が、循環流路を有すると共に 該循環流路が上記再生領域及び上記変性領域を有してなる構造であってもよい。
[0020] ここで、循環流路とは、反応液を循環させ、該循環流路内の変性領域と再生領域を 交互に通過させるための流路のことを 、、上記流路が所定の場所で分岐し該分岐 した流路がお互いに再び連結されて環状構造を有する流路や、上記流路の全体が 一つまたは複数の環状構造を有する流路であって、該環状構造の流路によって流 れの一部もしくは全てが環状構造を通って循環する流路のことである。
[0021] この態様によれば、テンプレートとなる核酸、プライマーとなる核酸、リン酸化合物等 を所定領域で循環させながら変性領域、再生領域に繰り返し送液させることができる ので、テンプレートの枯渴を防ぎ、反応液を積極的に再利用することができるので、ラ ンユングコストを低減することができる。
[0022] 更に、本発明の核酸増幅装置は、反応液の流れの方向を制御する送液装置を有 し、該送液装置が反応液の流れの方向を周期的に反転させるように制御されたもの であることが好ましい。この形態によれば、限られた容積内での送液が可能な種々の 送液装置を使用することができ、送液装置の簡略ィ匕を容易にすることができ、装置の 小型化に好適に対応できる。
[0023] また、本発明の核酸増幅方法は、少なくともテンプレートとなる核酸とプライマーとな る核酸とリン酸化合物及び金属イオンとを含む反応液中のテンプレートとなる核酸を 増幅させるための方法であって、（a)所定の領域で、前記テンプレートとなる核酸の分 子内及び Z又は分子間で形成された二重鎖を融解する変性工程と、 (b)工程 (a)で 得られる該二重鎖が融解したテンプレートとなる核酸と前記プライマーとなる核酸との 間に工程 (a)とは別の領域で二重鎖を形成させる再生工程と、 (c)工程 (b)がなされる 領域を含む領域に固定され活性状態に保持された核酸合成酵素と、工程 (b)中及び Z又は直後に反応液とを接触させる工程とを包含することを特徴とする。
[0024] 本発明の核酸増幅方法によれば、上記変性工程と上記再生工程とをそれぞれ異 なる領域で行うことが可能であり、上記再生工程がなされる領域を含む領域に固定さ れた核酸合成酵素が、テンプレートとなる核酸を変性させる際の加熱等の影響を受 けることがないので、核酸合成酵素の失活が抑制され、耐熱性のない核酸合成酵素 を利用しても連続的に PCRを行うことができる。また、上記核酸合成酵素が固定され ているので、増幅した核酸の分離'精製が容易にできると共に上記核酸合成酵素の 再利用、連続的利用が可能となり、反応のスケールアップも容易になる。
発明の効果
[0025] 本発明によれば、核酸の分子内及び Z又は分子間で形成された二重鎖を融解し 一本鎖状に変性する領域と、該二重鎖が融解した核酸が二重鎖を再形成する再生 領域とを有する流路に、少なくともテンプレートとなる核酸とプライマーとなる核酸とリ ン酸化合物及び金属イオンとを含む反応液を導入し核酸合成反応を行う際、上記再 生領域に固定された核酸合成酵素が、テンプレートとなる核酸を変性させる際の加 熱等の影響を受けることがないので、核酸合成酵素の失活が抑制され、耐熱性のな い核酸合成酵素を利用しても連続的に PCRを行うことができる。また、上記核酸合成 酵素が固定されているので、増幅した核酸の分離 '精製が容易にできると共に上記 核酸合成酵素の再利用、連続的利用が可能となり、反応のスケールアップも容易で める。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]本発明の核酸増幅装置の一実施形態を示す図である。
[図 2]上記核酸増幅装置の流路の一部の模式図である。
[図 3]本発明の核酸増幅装置の別の実施形態を示す図である。
[図 4]上記核酸増幅装置の循環流路の模式図である。
[図 5]上記変性領域及び再生領域を形成するための変性用温度制御手段及び再生 用温度制御手段の説明図である。
[図 6]本発明の核酸増幅装置の更に別の実施形態を示す図である。
[図 7]同核酸増幅装置におけるキヤピラリー内に固定化された核酸合成酵素を示す 模式図である。
[図 8]本発明の実施例で用いた核酸増幅装置の流路 1ユニット分を示す模式図であ る。 [図 9]同核酸増幅装置によって核酸を増幅し、ァガロースゲル電気泳動により検出し た結果を示す写真である。
符号の説明
1、 la- lg 基板
2 流路
2a 注入孔
2b 取り出し孔
2c 分岐流路
3 ビーズ充填部
3a 拡径部
4 ビーズ
5 核酸合成酵素
6 固定化核酸合成酵素
10、 20、 50 核酸増幅装置
11一 13、 13a 外部送液装置
14 第 1反応液槽
15 第 2反応液槽
16 反応液槽
31、 32 恒温槽
33、 52 温度制御装置
34、 39 変性用温度制御手段
35、 40 再生用温度制御手段
36、 37 攪拌機
38 仕切り板
51 キヤビラリ一
A 変性用温度領域
B 再生用温度領域
発明を実施するための最良の形態 [0028] まず、本発明の核酸増幅方法について説明する。
本発明の核酸増幅方法は、少なくとも一の流路内に、少なくともテンプレートとなる 核酸 (以下、単にテンプレートという）と、プライマーとなる核酸 (以下、単にプライマー という）と、リン酸化合物及び金属イオンを含む反応液を導入することにより、前記流 路内で前記テンプレートの変性、変性させた前記テンプレートと前記プライマーとの アニーリング、核酸合成酵素による核酸の合成を行うものであり、前記流路には、二 重鎖を形成した前記テンプレートとなる核酸の変性反応を行う変性領域と、一本鎖状 にした前記テンプレートとなる核酸と前記プライマーとのアニーリング反応を行うと共 に核酸合成酵素によって核酸合成反応を行う再生領域が設けられており、前記再生 領域の流路の少なくとも一部には核酸合成酵素が固定されている。なお、テンプレー トの変性とは、二重鎖を形成した核酸を融解させて、一本鎖状にすることを意味する 上記変性領域は、テンプレートの変性に必要な環境に設定され、例えば、 1)核酸 の融解温度以上に設定する、 2)塩基性'酸性に設定する、 3)陽イオンを含まない、 4 )水素結合阻害剤 (例えば尿素やグァニジゥム塩等)を混入する、等の環境に設定さ れる。
[0029] 本発明では、核酸の変性と再生を繰り返して行うため、上記条件のうち、繰り返し設 定が可能な、核酸の融解温度以上に設定する（手段としては加熱が効果的）、あるい は塩基性'酸性に設定することが好ましぐ核酸の融解温度以上に設定することが最 も効率的であるため特に好ましい。例えば、テンプレートの変性を核酸の融解温度以 上に加熱して行う場合は、テンプレートの長さや配列によって異なるため一概には言 えないが、例えば、数百 merのテンプレートの場合 90— 99°C、好ましくは 92— 97°C となるように加熱すればょ 、。
[0030] なお、核酸合成酵素に耐塩基性を付与することは困難であるため、従来の PCR法 では、テンプレートの変性条件として塩基性環境が用いられることはな力つた力 本 発明では、核酸合成酵素が固定された領域を中性環境に設定することができ、この ように中性環境にすれば変性領域を塩基性環境に設定してテンプレートの変性を行 うことも可能である。 [0031] 一方、上記再生領域は、核酸再生に必要な環境に設定され、例えば、 1)核酸の融 解温度以下に設定する（手段としては非加熱又は冷却）、 2)弱酸性一弱塩基性に設 定する (pH7± 3程度)、 3)適当な陽イオンを含む、 4)水素結合阻害剤 (例えば尿素 やグァニジゥム塩等)を含まない、等の条件をすベて満たす環境に設定される。例え ば、核酸再生を行う際の温度条件は、テンプレートとプライマーとの融解温度によつ て異なるため一概には言えないが、例えば、 15— 30merのプライマーを用いた場合 、 30— 70°Cであり、本発明においては 30— 40°Cが特に好ましい。なお、核酸再生と は、お互いに相補的な一本鎖の核酸同士が二重鎖を形成することであり、 PCRを行 う環境下における核酸再生とは実質的にテンプレートとプライマーとのアニーリングを 意味する。
[0032] 本発明においては、上記流路に導入された反応液が上記変性領域に移動すること で、該反応液が上記変性領域に設定された環境下にさらされ、また、上記再生領域 に移動することで、該反応液が上記再生領域に設定された環境下にさらされる。
[0033] また、本発明にお 、ては、上記変性領域は、流路内を移動する反応液を上記の核 酸の融解温度以上に加熱できるように、該流路の外部に変性用温度制御手段を設 けることによって形成することが好ましぐ上記再生領域は、流路内を移動する反応 液を上記の核酸の融解温度以下に調節できるように、該流路の外部に再生用温度 制御手段を設けることによって形成することが好ましい。
[0034] 本発明の方法で使用される核酸合成酵素は、核酸増幅に使用できる酵素であって 、一般に入手可能な酵素であれば特に制限なく用いることができ、具体的には、 DN Aポリメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、 RNAポリメラーゼ等が例示できる。また、これ らの核酸合成酵素を組み合わせて用いることもできる。
[0035] なお、本発明にお!/、ては、従来の PCR法ゃリガーゼ連鎖反応（ligase chain
reaction： LCR)法で使用されて!、る耐熱性を有する核酸合成酵素を用いることもで きる。核酸合成酵素が上記再生領域の流路内に固定されており、テンプレートを変 性させる際に行われる加熱等にさらされないので、耐熱性のない核酸合成酵素を用 いることがでさる。
[0036] 本発明において、核酸合成酵素として、温度 30— 40°Cに至適温度を有するものを 好適に用いることができるので、従来の PCRで使用できなかった比較的安価な酵素 を選択できる。また、他の一般的な核酸合成酵素以外の酵素の併用も可能にする。 従って、従来 PCR時に併用が困難だった酵素、例えば、合成された核酸のミスマツ チを修正する酵素等を併用することにより、従来の PCRに比べて増幅の信頼性を向 上させることができる。
[0037] 本発明にお 、ては、反応効率の高!、酵素や入手しやす 、酵素が好ましく用いられ 、具体的には、複製の信頼性の高い大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iが好ましく用い られる。また、若干複製の信頼性が低くなるが DNAポリメラーゼ Iのェキソヌクレア一 ゼ活性部位を除 、たクレノーフラグメント等を用いることもできる。
[0038] 上記核酸合成酵素は、例えば、ビーズ表面に固定化して上記再生領域の流路の 少なくとも一部に充填してもよぐ流路の内壁面に直接固定ィ匕してもよい。
[0039] ここで、ビーズに固定された核酸合成酵素を使用する場合は、固定された核酸合 成酵素と反応液とを効率よく接触させることができるので反応効率を高めることができ る。
[0040] また、核酸合成酵素が少なくとも前記再生領域の内壁面に固定されたものである場 合には、本発明の装置の構成を簡単に形成することができる。即ち、このような流路 を形成する場合、まず、流路の全面に核酸合成酵素を固定化させて全流路を形成 することができ、この態様により、たとえ変性領域の酵素が失活しても、再生領域の酵 素は活性状態が保持されるので、所望の流路を容易に形成することができる。
[0041] 核酸合成酵素を固定ィ匕するビーズの材質は特に限定されな!、が、金属微粒子、ガ ラス粒子、榭脂製粒子等が好ましく例示でき、特にラテックスビーズやキトサンビーズ のように生体分子との相性が良ぐ酵素の固定ィ匕が容易なビーズが好ましく用いられ る。上記ビーズの大きさは、上記流路内に充填可能な大きさであればよぐ適宜設定 できるが、通常、直径 0. 4— 100 μ m、好ましくは直径 1一 50 μ mである。
[0042] また、上記流路は、熱伝導性が比較的高ぐ PCRに必要な温度範囲において安定 で、電解質溶液や有機溶媒に浸食されにくぐ核酸やタンパク質を吸着しにくい材質 で形成されていることが好ましい。耐熱性や耐食性を有する材質としては、ガラス、石 英、シリコンの他、各種プラスチックが例示できる力 さらにそれらの表面 (反応液と接 触する内壁面）を、ポリエチレン、ポリプロピレン等の一般的に核酸やタンパク質を吸 着しにくいと言われる材質で被覆したり、ポリエチレングリコール (PEG)等の親水性 の官能基を多く含む分子を共有結合等で導入し、核酸やタンパク質の吸着を抑制す ることが好ましい。
[0043] 上記ビーズ表面、あるいは流路の内壁面に核酸合成酵素を固定化する方法として は、担持法や包含法、共有結合法、架橋法、静電吸着法等の公知の方法を採用す ることができるが、酵素反応を繰り返し行うためには共有結合法や架橋法が特に好ま しい。例えば、共有結合法は、特開平 3— 164177号公報等に記載された方法にした 力 て行うことができ、ビーズ表面や流路の内壁面に比較的反応性の高い官能基（ 例えば、クロ口カルボ-ル基 (カルボン酸塩化物）、カルボキシル基、アミノ基、チォー ル基 (スルファニル基)、エポキシ基等)を導入し、該官能基と核酸合成酵素の表面 にあるカルボニル基ゃァミノ基、チオール基 (スルファニル基）と反応させることにより 固定ィ匕することができる。
本発明で使用される反応液には、少なくともテンプレートと、プライマーと、リン酸ィ匕 合物及び金属イオンが含まれる。
[0044] 上記テンプレートは、増幅の目的となる核酸であり、常法によって調製された天然 型あるいは非天然型の核酸を用いることができる。反応液中における上記テンプレー 卜の濃度 ίま、通常、 0. 01— ΙΟΟρΜ力好ましく、 0. 1— ΙΟρΜ力より好まし!/ヽ。
上記プライマーは、上記テンプレートの少なくとも一部の塩基配列と相補的な塩基 配列を有する核酸であり、一般的な PCR法や LCR法にぉ 、て使用できるものであれ ばよいが、目的とする核酸を効率よく増幅できるように設計されることが好ましぐ通常 、 15— 30merのものが好ましく用いられる。例えば、プライマーとなる核酸は、核酸 自動合成機を用いることにより容易に作製することができる。反応液中における上記 プライマーの濃度は、通常、 0. 01— 1 μ Μが好ましぐ 0. 1-0. 2 μ Μがより好まし い。
[0045] また、上記プライマーには、後の検出や分離のために化学的に修飾'改変された非 天然型核酸も含まれる。上記非天然型核酸は、特に限定されないが、ピオチンや FI TCで標識されたオリゴ核酸、ホスホチォエート結合を有するオリゴ核酸や ΡΝΑ (ぺ プチド核酸)と天然型核酸とを含有するキメラ核酸等が好ましく例示できる。
[0046] 上記リン酸ィヒ合物は、核酸を増幅する際の基質となる成分であり、例えば、核酸合 成酵素として DNAポリメラーゼゃ逆転写酵素を使用する場合には、 dNTP、すなわ ち dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを任意の割合で含む混合物、好ましくは 4種類 のデォキシヌクレオチド 3リン酸の等量混合物が用いられる。一方、リガーゼを使用す る場合は、 NTPを使用することが好ましぐ特に ATPや GTPが好ましく例示できる。 反応液中における上記リン酸ィ匕合物の濃度は、適宜設定することができる力 通常、 0. 01— ImMが好ましぐ 0. 1—0. 5mMがより好ましい。
[0047] 上記金属イオンとしては、カリウムイオン (K+)、ナトリウムイオン (Na + )、マグネシ ゥムイオン (Mg2 + )等が例示できる。このような金属イオンを含むことにより、二重鎖 核酸の安定化、酵素活性化、合成された核酸の忠実性向上等の効果を得ることがで きる。反応液中における上記金属イオンの濃度は、通常、カリウムイオンやナトリウム イオンは 10— 200mMが好ましぐ 50— lOOmM力より好ましい。また、マグネシウム イオンは 1一 5mMが好ましぐ 1. 5-2. 5mMがより好ましい。
[0048] 本発明の方法においては、流路内でテンプレートの変性、変性させたテンプレート とプライマーとのアニーリング、及び核酸合成を効率よく行うことができるように、上記 反応液の送液速度や流路の長さ等の条件を適宜調整することが好ましヽ。これらの 条件は、テンプレートの長さや合成する核酸の長さ、用いる核酸合成酵素の反応速 度等によって影響を受けるため一概には言えないが、通常、上記反応液が、上記変 性領域を 1回通過する際の時間は 1一 60秒、好ましくは 5— 30秒であり、上記再生領 域を 1回通過する際の時間は 5— 300秒、好ましくは 10— 120秒である。
[0049] 以下、本発明の核酸増幅方法に用いられる核酸増幅装置を図面に基づいて説明 するが、基本的に同一の部分には同じ符号を付してその説明を省略する。
図 1には、本発明の核酸増幅装置の一実施形態が示されている。核酸増幅装置 10 は、変性用温度領域 Aと再生用温度領域 Bを有する基板 1に、前記変性用温度領域 Aと前記再生用温度領域 Bを交互に蛇行して、前記変性用温度領域 Aと前記再生用 温度領域 Bをそれぞれ複数回通過するように所定の内径を有する流路 2が形成され ており、これによつて該流路 2を、上記テンプレートとなる核酸を変性させて一本鎖に する変性反応を行う変性領域と、該一本鎖にした核酸と上記プライマーとなる核酸と がアニーリングされ更に核酸合成反応を行う再生領域とを有する流路とすることがで きる。上記流路の再生領域の一部には、表面に核酸合成酵素が固定化されたビー ズが充填されているビーズ充填部 3が複数個所設けられている。また、上記流路 2の 両端には、該流路内に反応液を注入するための注入孔 2aと、核酸の増幅反応が終 了した反応液を取り出すための取り出し孔 2bが設けられて 、る。
[0050] また、図 2には、上記核酸増幅装置の流路の一部を拡大した模式図が示されており 、上記ビーズ充填部 3には、核酸合成酵素 5がビーズ 4の表面に固定ィ匕された固定 化核酸合成酵素 6が充填され、流路を移動してきた反応液と固定化核酸合成酵素 6 に固定された核酸合成酵素 5が接触できるようになつている。なお、固定化核酸合成 酵素 6を流路内に充填する場合、該固定ィ匕核酸合成酵素 6が漏れないようにビーズ 充填部 3の入口および出口に適当なふるいサイズを有するフィルターを設置すること が好ましい。フィルターの材質としては、特に限定されないが、核酸の吸着が起こりに くいものが好ましぐセルロースなどが好ましく例示できる。
[0051] この核酸増幅装置 10を使用する場合は、ポンプ等の外部送液装置（図示せず）に より、少なくともテンプレートと、プライマーと、リン酸化合物及び金属イオンを含む反 応液を図中矢印の方向に送液する。これにより、上記流路 2の変性領域で前記テン プレートが熱変性により一本鎖にされた後、上記流路の再生領域で前記一本鎖のテ ンプレートと、該テンプレートに相補的なプライマーとのアニーリング反応が行われ、 更に上記ビーズ充填部 3で固定ィヒ核酸合成酵素 6により前記一本鎖のテンプレート の相補鎖の合成が行われ、上記流路の変性領域と再生領域をそれぞれ 1回通過す る毎に 1サイクルの PCRが行われる。
[0052] 本発明にお 、て、上記流路 2は、上記基板の変性用温度領域と再生用温度領域を それぞれ 1回以上通過するように形成されて!ヽればよ!/ヽが、核酸増幅を効率よく行う ためには、 20— 40回通過するように形成されて 、ることが好まし 、。
また、上記流路 2の大きさは、径を小さくして比表面積を大きくすることにより熱伝導 を行 、やすくして熱揺らぎが生じな 、ようにすることが好まし 、（Science (1998年) 2 80号 5366卷、 1046-1048頁（Kopp MU、 Mello AJ、 Manz A.著）参照）。本発明におい て最適な流路の幅は 20— 200 μ m、好ましくは 50— 100 μ mであり、深さは 20— 20 0 m、好ましくは 40— 100 /z mである。また、固定ィ匕核酸合成酵素 6を充填する部 分の流路の幅は 20— 3000 μ m、好ましくは 50— 1000 μ mであり、深さは 20— 100 m、好ましくは 40— 500 μ mである。
[0053] 上記流路 2は、熱伝導性が比較的高ぐ PCRに必要な温度範囲において安定で、 電解質溶液や有機溶媒に浸食されにくぐ核酸やタンパク質を吸着しにくい材質で 形成されていることが好ましい。例えば、耐熱性や耐食性を有する材質としては、ガラ ス、石英、シリコンの他、各種プラスチックが例示できる力 さらにそれらの表面 (反応 液と接触する面）を、ポリエチレン、ポリプロピレン等の一般的に核酸やタンパク質を 吸着しにくいと言われる材質で被覆したり、ポリエチレングリコール (PEG)等の親水 性の官能基を多く含む分子を共有結合等で導入し、核酸やタンパク質の吸着を抑制 することが好ましい。
上記流路を有する基板は、例えば、以下のようにして形成することができる。すなわ ち、上記の材質力もなる 1枚の基板上に、上記所定の幅と深さを有する溝を切削加 ェ等により形成し、前記溝に蓋をするように、もう 1枚の基板やフィルムを貼り付ける方 法を好適に採用し得る。
[0054] 図 3には、本発明の核酸増幅装置の別の実施形態が示されている。この核酸増幅 装置 20は、図 1に示した基板 laに対して他の基板 lb、 lc, Id, le、 lf、 lgが、枝分 かれ状に複数接続されたものである。なお、これら基板の接続形態は、図 3に示す形 態に限定されるものではなぐ核酸増幅を効率よく行うことができるように様々な形態 で接続することができる。
核酸増幅装置 20は、少なくとも上記テンプレートを含む第 1反応液と、少なくとも 上記プライマーと、リン酸化合物及び金属イオンを含む第 2反応液からなる反応液を 用い、ポンプ等の外部送液装置 11より、まず、基板 laに前記第 1反応液と前記第 2 反応液がそれぞれ第 1反応液槽 14と第 2反応液槽 15から供給されるようになってお り、基板 lb、 lc, Id, le、 lf、 lgには、前記基板 laを通過した反応液が外部送液装 置 12によりそのままテンプレートとして供給されると共に、前記基板 laでの反応で消 費されたプライマーやリン酸ィ匕合物等の反応基質を補充するために、前記第 2反応 液が第 2反応液槽 15から供給されるようになって 、る。
[0055] そして、上記基板 lb、 lc, Id, le、 Ifを通過した反応液は、そのまま回収して核酸 の精製を行ってもよぐ必要に応じて更に複数の基板へ接続して核酸増幅を行って ちょい。
なお、本実施形態においては、上記基板 laを通過した反応液の一部、及び上記 基板 lgを通過した反応液を、上記第 1反応液として再利用するための流路 7、 8とポ ンプ 13が設けられている。このような再送流路を設けることにより、テンプレートの枯 渴を防ぐことができ、連続した核酸増幅を安定して行うことができると共にランニングコ ストの低減を図ることができる。
[0056] なお、このように枝分かれ状に基板を接続した場合は、各段の少なくとも一つの基 板、例えば、枝分かれする直前の基板 (基板 la)や、基板を通過した反応液を第 1反 応液として再利用する経路を有する基板 (基板 lg)には、複製の信頼性の高い核酸 合成酵素が固定されていることが好ましい。これにより、テンプレートの増幅を正確に 行うことができるので、 PCRを繰り返し行っても正確にテンプレートを増幅することが できる。
[0057] 図 4 (a)及び (b)には、本発明の核酸増幅装置において、反応液を循環させ、循環 流路内の変性領域と再生領域を交互に通過させるための循環流路の構造が示され ている。
図 4 (a)に示す循環流路では、流路 2の所定の場所で分岐した分岐流路 2cによつ て循環流路が形成されており、分岐流路 2cへの送液は反応液の流れの方向を制御 する外部送液装置 13aによって制御できるようになつている。流路の分岐部で分岐流 路 2cに進入した反応液は変性用温度領域 Aで循環流路内の変性領域を通過し、流 路の合流部から再生用温度領域 Bにもどり、一度通過した循環流路内の再生領域を もう一度通過できるようになって 、る。
[0058] また、上記循環流路は、図 4 (b)に示すように、流路 2を環状に形成して分岐流路を 有さない構造とすることもできる。ここで、反応液の供給、取出し部となる反応液槽 16 力 環状の流路 2の途中に配置されており、前記反応液槽 16から導入される反応液 は外部送液装置 13aによって図中矢印の方向に流路 2内を循環する。 [0059] 反応液が上記循環流路を循環し、上記循環流路内の変性領域と再生領域を交互 に繰り返し通過することで核酸増幅反応が進行し、その結果得られる増幅産物は、 図 4 (a)では、流路の出口から、図 4 (b)では、前記反応液槽 16から採取することがで きる。
本発明の核酸増幅装置において、上記基板の変性用温度領域及び再生用温度 領域は、例えば、図 5 (a)に示すように、変性用温度制御手段 34を有する恒温槽 31 と再生用温度制御手段 35を有する恒温槽 32とが仕切り板 38で仕切られた構造を有 する温度制御装置 33内に基板 1を設置することにより形成することができる。なお、 上記各恒温槽には、恒温槽内の媒体を撹拌し、温度を均一に保っために撹拌機 36 及び 37がそれぞれ設置されて ヽる。
[0060] また、図 5 (b)に示すように、複数の基板 1を積層し、各基板の間あるいは数枚毎の 基板間に、変性用温度制御手段 39と再生用温度制御手段 40とを配置して、上記基 板の変性用温度領域及び再生用温度領域を形成してもよい。
[0061] なお、上記変性用温度制御手段及び上記再生用温度制御手段は、任意の温度制 御装置により温度を一定に保つことができればよぐ具体的には熱電素子、恒温装 置、電熱線、ランプヒーター等が好ましく例示できる。また、上記変性用温度制御手 段及び上記再生用温度制御手段は、基板に接触しな!、ように配置してもよ 、。
図 6には、本発明の核酸増幅装置の更に別の実施形態が示されている。この核酸 増幅装置 50は、流路として 2本のキヤピラリー 51が用いられており、キヤピラリー 51は 、変性用温度領域 Aと再生用温度領域 Bとを有する温度制御装置 52内に、前記変 性用温度領域と再生用温度領域を交互に通過するように、螺旋状に巻かれて設置さ れている。
上記キヤピラリー 51の内壁面には、図 7に示すように核酸合成酵素 5が直接固定ィ匕 されている。
[0062] 上記キヤビラリ一の材質は特に制限されないが、熱伝導性が比較的高ぐ PCRに 必要な温度範囲において安定で、電解質溶液や有機溶媒に浸食されにくぐ核酸や タンパク質を吸着しにくい材質で形成されていることが好ましぐ例えば、ガラス、ブラ スチック等が例示できるが、さらにそれらの表面 (反応液と接触する面）を、ポリエチレ ン、ポリプロピレン等の一般的に核酸やタンパク質を吸着しにくいと言われる材質で 被覆したり、ポリエチレングリコール (PEG)等の親水性の官能基を多く含む分子を共 有結合等で導入し、核酸やタンパク質の吸着を抑制することが好まし 、。
また、半透性で高分子を通過させず低分子のみを透過するような性質を有する素材 力もなるキヤピラリーを用いることもでき、その場合は、該キヤビラリ一を設置する恒温 槽の媒体として、低分子量の基質 (例えば dNTPや NTP等）を含む溶液を用いること によって、キヤピラリー内に常に反応基質を供給することも可能となる。半透性のキヤ ビラリ一としては、三菱レーヨンや東レ等カも発売されている中空糸が好ましく例示で きる。
本発明において、上記キヤビラリ一のサイズは、外径力 100— 1000 m、好ましく は 200— 500 μ mであり、内径力 0— 600 μ m、好ましくは 50— 150 μ mである。
[0063] 上記キヤビラリ一の内壁面への核酸合成酵素の固定化は、上述した核酸合成酵素 を固定ィ匕する方法と同様の方法で行うことができ、キヤピラリーの全内壁面に核酸合 成酵素を固定すればよい。キヤピラリーの全内壁面に核酸合成酵素を固定ィ匕した場 合、変性領域に固定化された核酸合成酵素は通常加熱等により失活し、核酸合成 反応に影響を与えることはないので、再生領域に固定化された核酸合成酵素が活性 を有していればよぐ実用上の問題はない。
このキヤビラリ一構造によれば、ビーズを装填したり、特定の場所にだけ核酸合成 酵素を固定ィ匕したりする手間を省くことができ、製造も容易になる。
実施例
[0064] 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の 範囲を限定するものではな 、。
く実施例 1〉
(核酸増幅装置の作製）
上記図 1や図 2で説明されるように、一の流路内に、変性領域と再生領域が交互に 複数設けられている構造体を得るために、基板の一の領域を変性用温度領域とし、 又、別の一の領域を再生用温度領域とし、表面に一の流路が蛇行して形成され、そ れらの領域を交互に通過するように配された流路基板を、以下のようにして成形した [0065] すなわち、ポリエチレンを射出成型することで厚さ lmmの薄板状の基板 (縦 35mm X横 70mm)を作製し、表 1に示す幅と深さを有し、長さ方向に途切れのない溝を、切 削加工によって基板表面に成形し流路基板とした。その際、隣り合う一の変性領域と 一の再生領域が占める流路部分を 1ユニット分とした。
[0066] [表 1]
Figure imgf000020_0001
流路 1ユニット分の溝の模式図を図 8に示す。ここで、基板の変性用温度領域 Aで変 性領域となる溝の流路に沿った長さは 12mmであり、基板の再生用温度領域 Bで再 生領域となる溝の流路に沿った長さは 50mmである。また、固定化核酸合成酵素を 充填する流路の拡径部 3aの溝の幅は 1000 mであり、それ以外の部分の溝の幅 は 200 mである。上記ポリエチレン基板上に切削加工によって成形した長さ方向に 途切れのない溝は、上記流路 1ユニット分の溝が 40ユニット分直列して構成されるよ うに成形されている。
[0067] 一方、上記基板の流路の拡径部 3aに充填する固定化核酸合成酵素を以下のよう にして調整した。
[0068] すなわち、平均粒径 100 μ mのキトサンビーズ担体（商品名「キトパール BCW-3001 」；富士紡績株式会社製） lg (湿重量）を 5mlの PBS緩衝液（137mM NaCl、 8. 1 mM Na2HP04、 2. 68mM KCL、 1. 47mM KH2P04、 pH7. 2)中、 4。Cで 8時間平衡化した。 PBS緩衝液をろ過により取り除き、 2mlの 2. 5%ダルタルアルデ ヒド水溶液を加え、 4°Cで 2時間活性ィ匕した。その後、 2. 5%ダルタルアルデヒド水溶 液をろ過後、ビーズを 5mlの PBS緩衝液で 3回洗浄した。次に、 PBS緩衝液をろ過 後、ビーズに酵素溶液として 0. 1 μ &/ μ 1DNAポリメラーゼ 'クレノーフラグメント（タ カラバイオ株式会社製) ZPBS緩衝液を lml加え、 4°Cで 2時間反応させ固定ィ匕した 。酵素溶液をろ過し、 5mlの PBS緩衝液で 3回洗浄した後、 PBS緩衝液で 50%スラ リー状に調整した。
[0069] このように調製した固定ィ匕核酸合成酵素を、流路 1ユニット分当り 2. 5 μ 1で上記流 路基板のビーズ充填部分にマイクロピペットによって滴下し充填した。この場合、ビー ズ充填部分の容積のうち固定ィ匕核酸合成酵素がそのおよそ半分を占めるものと考え られた。
上記流路基板の溝を形成する表面の対向側の表面には、温度制御手段としてべ ルチェ素子を配した。すなわち、基板の一定面積を 94°Cの変性用温度領域とするた めに必要なペルチェ素子を、また、基板の一定面積を 37°Cの再生用温度領域とする ために必要なペルチェ素子を、それぞれ流路基板表面上に設置した。
上記流路基板の溝に蓋をして流路とするために、もう 1枚のポリエチレン基板を重ね てクリップで挟み、核酸増幅反応用基板とした。
[0070] 更に、送液装置である高速液体クロマトグラフィー用ポンプからの送液チューブを、 上記核酸増幅反応用基板の流路入り口部分に接着したコネクタに接合し、上記核酸 増幅装置とした。
く実施例 2〉
(核酸増幅反応）
実施例 1で作製した核酸増幅装置を用いて PCR反応を行った。その際、以下の内 容物を含有する水溶液をその反応液とした。
[0071] 反応液：
铸型ニ本鎖 DNA (73塩基対） ΙΟρΜ
forwardプライマー DNA ( 18塩基） 1 M
reverseプライマー DNA ( 18塩基） 1 M
dATPゝ dGTP、 dCTP、 dTTP 各 5 M
MgS04 lOmM
ジチオスレィトール 0. ImM Tris-HCl(pH7. 2 at 25°C) 50mM
DNA配列：
铸型ニ本鎖 DNAのプラス鎖：配列番号 1
铸型ニ本鎖 DNAのマイナス鎖：配列番号 2
forwardプライマー DNA:配列番号 3
reverseプライマー DNA:配列番号 4
また上記反応液のうち铸型ニ本鎖 DNA (73塩基対)を含まない溶液を対照として 用いた。
[0072] 反応液あるいは対照溶液は予め 94°Cで 2分間変性させた後、 37°Cまで冷却し、送 液装置で上記実施例 1の核酸増幅装置の流路内に送液速度 1 μ lZminで送液した 。ここで、上記実施例 1の核酸増幅装置の流路基板上に配された流路の 1ユニット分 の流路内容積のうち、再生領域と変性領域が占める部分の比は、再生領域中の一 部を固定ィ匕核酸合成酵素が占めていることを勘案すれば、およそ 7 : 1である。よって 、 40ユニット分の流路を通過した反応液あるいは対照溶液は、変性反応 94°C、 30秒 、アニーリング Z伸長反応 37°C、 3分 30秒とする PCRサイクルを 40回繰り返したこと に相当すると考えられる。
40ユニット分の流路を通過した反応液ある 、は対照溶液の一部を、核酸増幅装置 の流路内に導入する前の反応液及び核酸分子量マーカーとともに、 3%ァガロース ゲル（TAE緩衝液： 40mMTris、 19mM酢酸、 ImMEDTA)中に電気泳動し、得 られたゲルを染色 0. 5 gZmlェチジゥムブロマイド水溶液で染色した。図 9に UV( 302nm)照射時の写真像を示す。図中、 1は核酸増幅装置の流路内に導入する前 の反応液を電気泳動したレーン、 2は 40ユニット分の流路を通過した反応液を電気 泳動したレーン、 3は核酸分子量マーカー（50bpラダー）を電気泳動したレーン、 4 は 40ユニット分の流路を通過した対照溶液を電気泳動したレーンである。
[0073] 図 9から分かるように、核酸増幅装置の流路内に導入する前の反応液に含有する 铸型ニ本鎖 DNA (73塩基対）は微量であり検出されな力つた (レーン 1)。また、 40 ユニット分の流路を通過した対照溶液からも DNAは検出されなカゝつた（レーン 4)。一 方、 40ユニット分の流路を通過した反応液からは、核酸分子量マーカーに移動度（ レーン 3)を指標にして 70— 75塩基長付近の位置に DNAが検出され、反応液中の 铸型ニ本鎖 DNA (73塩基対）が増幅されたことが確認された (レーン 2)。
[0074] 「配列表フリーテキスト」
配列番号 1： PCR反応の铸型となる 73塩基長の铸型ニ本鎖 DNAのプラス鎖。 配列番号 2： PCR反応の铸型となる 73塩基長の铸型ニ本鎖 DNAのマイナス鎖。 配列番号 3：铸型 DNAを増幅するための PCR用 forwardプライマー DNA。
配列番号 4：铸型 DNAを増幅するための PCR用 reverseプライマー DNA。
産業上の利用可能性
[0075] テンプレート核酸等の効率的な複製 '増幅に利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 内部に少なくとも一の流路を有し、該流路に少なくともテンプレートとなる核酸とブラ イマ一となる核酸とリン酸ィ匕合物及び金属イオンとを含む反応液を流し、該流路内で 核酸を増幅する核酸増幅装置であって、
前記流路が、前記テンプレートとなる核酸の分子内及び Z又は分子間で形成され た二重鎖を融解する変性反応を行う変性領域と、該二重鎖が融解したテンプレートと なる核酸と前記プライマーとなる核酸とが二重鎖を形成する再生領域とを有すると共 に、前記再生領域には核酸合成酵素が固定されていることを特徴とする核酸増幅装
[2] 前記変性領域を加熱し、且つ、前記再生領域を前記変性領域の温度より低温に保 持できる温度制御手段を備えた請求項 1記載の核酸増幅装置。
[3] 前記核酸合成酵素がビーズに固定され、該ビーズが少なくとも前記再生領域に充 填されて!、る請求項 1又は 2記載の核酸増幅装置。
[4] 前記核酸合成酵素が、少なくとも前記再生領域の内壁面に固定されたものである 請求項 1又は 2記載の核酸増幅装置。
[5] 前記流路内に、前記変性領域と前記再生領域が交互に設けられている請求項 1一 4の 、ずれか一つに記載の核酸増幅装置。
[6] 前記核酸合成酵素が、温度 30— 40°Cに至適温度を有する請求項 1一 5のいずれ か一つに記載の核酸増幅装置。
[7] 前記流路が循環流路を有すると共に該循環流路が前記再生領域及び前記変性領 域を有する請求項 1一 6のいずれか一つに記載の核酸増幅装置。
[8] 更に、反応液の流れの方向を制御する送液装置を有し、該送液装置が反応液の 流れの方向を周期的に反転させるように制御されたものである請求項 1一 7のいずれ か一つに記載の核酸増幅装置。
[9] 少なくともテンプレートとなる核酸とプライマーとなる核酸とリン酸ィ匕合物及び金属ィ オンとを含む反応液中のテンプレートとなる核酸を増幅させるための方法であって、（ a)所定の領域で、前記テンプレートとなる核酸の分子内及び Z又は分子間で形成さ れた二重鎖を融解する変性工程と、 (b)工程 (a)で得られる該二重鎖が融解したテン プレートとなる核酸と前記プライマーとなる核酸との間に工程 (a)とは別の領域で二 重鎖を形成させる再生工程と、（c)工程 (b)がなされる領域を含む領域に固定され活 性状態に保持された核酸合成酵素と、工程 (b)中及び Z又は直後に反応液とを接触 させる工程とを包含することを特徴とする核酸増幅方法。
PCT/JP2004/009942 2003-07-11 2004-07-12 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 WO2005005594A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04747408A EP1659170A1 (en) 2003-07-11 2004-07-12 Nucleic acid amplifier and method of nucleic acid amplification
JP2005511563A JPWO2005005594A1 (ja) 2003-07-11 2004-07-12 核酸増幅装置及び核酸増幅方法
US10/564,060 US20060257878A1 (en) 2003-07-11 2004-07-12 Nucleic acid amplifier and method of nucleic acid amplification
HK06112676.0A HK1092175A1 (en) 2003-07-11 2006-11-17 Nucleic acid amplifier and method of nucleic acid amplification
US12/018,905 US20080139408A1 (en) 2003-07-11 2008-01-24 Nucleic acid amplifier and method of nucleic acid amplification

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003273430 2003-07-11
JP2003-273430 2003-07-11

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/018,905 Continuation US20080139408A1 (en) 2003-07-11 2008-01-24 Nucleic acid amplifier and method of nucleic acid amplification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005005594A1 true WO2005005594A1 (ja) 2005-01-20

Family

ID=34056021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/009942 WO2005005594A1 (ja) 2003-07-11 2004-07-12 核酸増幅装置及び核酸増幅方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20060257878A1 (ja)
EP (1) EP1659170A1 (ja)
JP (1) JPWO2005005594A1 (ja)
CN (1) CN100434502C (ja)
HK (1) HK1092175A1 (ja)
WO (1) WO2005005594A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007126565A (ja) * 2005-11-04 2007-05-24 Dainippon Toryo Co Ltd 亜鉛めっき鋼板又は亜鉛合金めっき鋼板用塗料組成物及びその塗装鋼板
JP2009268432A (ja) * 2008-05-09 2009-11-19 Canon Inc 標的核酸の測定方法
CN106148181A (zh) * 2015-05-12 2016-11-23 厦门大学 一种可控制液体环流路径的核酸扩增反应管

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3527671A1 (en) * 2006-10-06 2019-08-21 Applied DNA Sciences Inc. System for a continuous rapid thermal cycle system
WO2015078755A1 (en) * 2013-11-29 2015-06-04 Koninklijke Philips N.V. Optical controlling of a chemical reaction
CN107271240A (zh) * 2017-07-07 2017-10-20 黑龙江然得基尔医学科技发展有限公司 一种细胞dna的染色方法
CN109266516B (zh) * 2018-09-28 2022-04-05 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 Dna扩增装置、dna扩增装置的制作方法及检测装置
CN113528333B (zh) * 2021-07-20 2022-03-08 北京擎科生物科技有限公司 核酸合成反应装置及核酸合成方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0630776A (ja) * 1992-07-13 1994-02-08 Rikagaku Kenkyusho Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置
JPH0690756A (ja) * 1992-09-10 1994-04-05 Fuso Yakuhin Kogyo Kk ２段サーモサイクルｐｃｒ法
WO2000056877A1 (fr) * 1999-03-19 2000-09-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique
JP2003174900A (ja) * 2001-12-11 2003-06-24 Miyagi Prefecture ピロリン酸と核酸の定量方法およびその装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8917963D0 (en) * 1989-08-05 1989-09-20 Scras Apparatus for repeated automatic execution of a thermal cycle for treatment of biological samples
US5863801A (en) * 1996-06-14 1999-01-26 Sarnoff Corporation Automated nucleic acid isolation
WO1998022625A1 (en) * 1996-11-20 1998-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microfabricated isothermal nucleic acid amplification devices and methods

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0630776A (ja) * 1992-07-13 1994-02-08 Rikagaku Kenkyusho Ｄｎａ増幅方法及びｄｎａ増幅装置
JPH0690756A (ja) * 1992-09-10 1994-04-05 Fuso Yakuhin Kogyo Kk ２段サーモサイクルｐｃｒ法
WO2000056877A1 (fr) * 1999-03-19 2000-09-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique
JP2003174900A (ja) * 2001-12-11 2003-06-24 Miyagi Prefecture ピロリン酸と核酸の定量方法およびその装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHUCHARD M. ET AL: "Two-step "hot" PCR amplification of GC-rich avian c-myc", BIOTECHNIQUES, vol. 14, no. 3, 1993, pages 390 - 394, XP000349335 *
WELCH D. ET AL: "Detection of plasmid DNA from all Chlamydia trachomatis serovars with a two-step polymerase chain reaction", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 56, no. 8, 1990, pages 2494 - 2498, XP002977745 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007126565A (ja) * 2005-11-04 2007-05-24 Dainippon Toryo Co Ltd 亜鉛めっき鋼板又は亜鉛合金めっき鋼板用塗料組成物及びその塗装鋼板
JP2009268432A (ja) * 2008-05-09 2009-11-19 Canon Inc 標的核酸の測定方法
CN106148181A (zh) * 2015-05-12 2016-11-23 厦门大学 一种可控制液体环流路径的核酸扩增反应管

Also Published As

Publication number Publication date
US20080139408A1 (en) 2008-06-12
EP1659170A1 (en) 2006-05-24
US20060257878A1 (en) 2006-11-16
CN1820067A (zh) 2006-08-16
HK1092175A1 (en) 2007-02-02
JPWO2005005594A1 (ja) 2006-10-26
CN100434502C (zh) 2008-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7203893B2 (ja) 固形支持体でのサンプル調製
US9938553B2 (en) Methods and devices for nucleic acid synthesis
CN107406890B (zh) 用于分析细胞组分的方法和组合物
US20080139408A1 (en) Nucleic acid amplifier and method of nucleic acid amplification
KR100488281B1 (ko) 열 대류를 이용한 염기서열 증폭 방법 및 장치
US9415368B2 (en) Devices and systems for creation of DNA cluster arrays
WO2005075683A1 (en) High throughput device for performing continuous-flow reactions
KR20120089476A (ko) 마이크로어레이 선택을 위한 장치 및 방법
US20140228245A1 (en) Method for the spatial arrangement of sample fragments for amplification and immobilization for further derivatizations
EP2646154A2 (en) The design, fabrication and use of a microfluidics multitemperature flexible reaction device
WO2013028643A1 (en) Preparation of polynucleotides on a solid substrate for sequencing
US20160369266A1 (en) Methods for on-array fragmentation and barcoding of dna samples
US20240117416A1 (en) Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides
US20140087955A1 (en) Devices and methods for efficient capture of nucleic acids
WO2017015348A1 (en) Sequence-independent nucleic acid assembly

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200480019643.5

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004747408

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006257878

Country of ref document: US

Ref document number: 2005511563

Country of ref document: JP

Ref document number: 10564060

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004747408

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10564060

Country of ref document: US