JPH0690756A - ２段サーモサイクルｐｃｒ法 - Google Patents
２段サーモサイクルｐｃｒ法Info
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- JPH0690756A JPH0690756A JP4241798A JP24179892A JPH0690756A JP H0690756 A JPH0690756 A JP H0690756A JP 4241798 A JP4241798 A JP 4241798A JP 24179892 A JP24179892 A JP 24179892A JP H0690756 A JPH0690756 A JP H0690756A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来法より簡単、正確なＰＣＲ法を提供する
こと。 【構成】 第１段として、標的配列含有２本鎖ＤＮＡを
含む試料中の上記ＤＮＡの変性反応を、ＰＣＲ法におい
てＤＮＡの変性に通常用いられる温度で行い、第２段と
して、それぞれ３５塩基以上の長さをもつ正方向および
逆方向プライマー、４種の塩基ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下
に、上記標的配列を含む変性ＤＮＡに対する両プライマ
ーのアニーリング反応とＤＮＡポリメラーゼによるプラ
イマー鎖の伸長反応を、ＰＣＲ法においてプライマー鎖
の伸長反応に通常用いられる温度で行うことを特徴とす
る、２段サーモサイクルＰＣＲ法。
こと。 【構成】 第１段として、標的配列含有２本鎖ＤＮＡを
含む試料中の上記ＤＮＡの変性反応を、ＰＣＲ法におい
てＤＮＡの変性に通常用いられる温度で行い、第２段と
して、それぞれ３５塩基以上の長さをもつ正方向および
逆方向プライマー、４種の塩基ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下
に、上記標的配列を含む変性ＤＮＡに対する両プライマ
ーのアニーリング反応とＤＮＡポリメラーゼによるプラ
イマー鎖の伸長反応を、ＰＣＲ法においてプライマー鎖
の伸長反応に通常用いられる温度で行うことを特徴とす
る、２段サーモサイクルＰＣＲ法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）法の変則法による感染症の診断法に関する
ものである。
応（ＰＣＲ）法の変則法による感染症の診断法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＰＣ
Ｒ法は、目的とするＤＮＡ領域（標的配列）を挾む２種
のプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる鋳型特
異的なＤＮＡ合成反応をインビトロでくり返すことによ
って、特定のＤＮＡ断片を短時間で数十万倍に及ぶ数に
増幅する方法である。現在行われているＰＣＲ法は、標
的配列を含む２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分離（変性）する
第１段、分離した１本鎖に正方向および逆方向のプライ
マーを結合（アニーリング）させる第２段、および結合
したプライマー標的配列に相補的な塩基をＤＮＡポリメ
ラーゼの作用により順に結合（伸長）する第３段からな
っている。標準的なＰＣＲ法では、ＤＮＡ試料、緩衝
液、２０塩基程度のプライマー２種およびポリメラーゼ
を含む反応系を、ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、
９４℃２０秒間（第１段：変性）、５５℃２０秒間（第
２段：アニーリング）および７２℃、３０秒間（第３
段：伸長）の３段のサーモサイクルに３０〜３５回程度
さらすことにより行われる。この方法により増幅したＤ
ＮＡ断片を適当な手段により発色させると、僅かな数し
か存在しなかったＤＮＡまたはそのＤＮＡを含む微生物
の検出が可能となるので、この方法は、遺伝子工学、医
学、農学、法医学等の分野で広く応用されつつある。
Ｒ法は、目的とするＤＮＡ領域（標的配列）を挾む２種
のプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼによる鋳型特
異的なＤＮＡ合成反応をインビトロでくり返すことによ
って、特定のＤＮＡ断片を短時間で数十万倍に及ぶ数に
増幅する方法である。現在行われているＰＣＲ法は、標
的配列を含む２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分離（変性）する
第１段、分離した１本鎖に正方向および逆方向のプライ
マーを結合（アニーリング）させる第２段、および結合
したプライマー標的配列に相補的な塩基をＤＮＡポリメ
ラーゼの作用により順に結合（伸長）する第３段からな
っている。標準的なＰＣＲ法では、ＤＮＡ試料、緩衝
液、２０塩基程度のプライマー２種およびポリメラーゼ
を含む反応系を、ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、
９４℃２０秒間（第１段：変性）、５５℃２０秒間（第
２段：アニーリング）および７２℃、３０秒間（第３
段：伸長）の３段のサーモサイクルに３０〜３５回程度
さらすことにより行われる。この方法により増幅したＤ
ＮＡ断片を適当な手段により発色させると、僅かな数し
か存在しなかったＤＮＡまたはそのＤＮＡを含む微生物
の検出が可能となるので、この方法は、遺伝子工学、医
学、農学、法医学等の分野で広く応用されつつある。
【０００３】この方法によってゲノムの少なくとも一部
について配列が判明している微生物の存在を証明しよう
とする場合、検体中に微生物のみを含む単純な系では検
出が成功するが、臨床検査検体（血液、尿、組織ホモジ
ネート等）のような種々雑多なＤＮＡが共存する系で
は、多数のバンドによる広範な発色が見られ、検出困難
となることがわかった。
について配列が判明している微生物の存在を証明しよう
とする場合、検体中に微生物のみを含む単純な系では検
出が成功するが、臨床検査検体（血液、尿、組織ホモジ
ネート等）のような種々雑多なＤＮＡが共存する系で
は、多数のバンドによる広範な発色が見られ、検出困難
となることがわかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この発明者は、上記の困
難を克服しようとして種々の検討を重ねた結果、プライ
マーとして従来の約２倍程度の長いものを用い、アニー
リング温度を従来より高くして伸長反応の温度と同程度
にし、それによってアニーリングと伸長反応を同時に行
うようにすると、臨床検査検体のような系でも微生物の
ＤＮＡを特異的に検出できることを見出し、この発明を
完成したのである。
難を克服しようとして種々の検討を重ねた結果、プライ
マーとして従来の約２倍程度の長いものを用い、アニー
リング温度を従来より高くして伸長反応の温度と同程度
にし、それによってアニーリングと伸長反応を同時に行
うようにすると、臨床検査検体のような系でも微生物の
ＤＮＡを特異的に検出できることを見出し、この発明を
完成したのである。
【０００５】すなわち、この発明は、第１段として、標
的配列含有２本鎖ＤＮＡを含む試料中の上記ＤＮＡの変
性反応を、ＰＣＲ法においてＤＮＡの変性に通常用いら
れる温度で行い、第２段として、それぞれ３５塩基以上
の長さをもつ正方向および逆方向プライマー、４種の塩
基ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＤＮ
Ａポリメラーゼの存在下に、上記標的配列を含む変性Ｄ
ＮＡに対する両プライマーのアニーリング反応とＤＮＡ
ポリメラーゼによるプライマー鎖の伸長反応を、ＰＣＲ
法においてプライマー鎖の伸長反応に通常用いられる温
度で行うことを特徴とする、２段サーモサイクルＰＣＲ
法、および上記方法を実施し、増幅生成物を検索するこ
とを特徴とする核酸検出法を提供するものである。
的配列含有２本鎖ＤＮＡを含む試料中の上記ＤＮＡの変
性反応を、ＰＣＲ法においてＤＮＡの変性に通常用いら
れる温度で行い、第２段として、それぞれ３５塩基以上
の長さをもつ正方向および逆方向プライマー、４種の塩
基ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＤＮ
Ａポリメラーゼの存在下に、上記標的配列を含む変性Ｄ
ＮＡに対する両プライマーのアニーリング反応とＤＮＡ
ポリメラーゼによるプライマー鎖の伸長反応を、ＰＣＲ
法においてプライマー鎖の伸長反応に通常用いられる温
度で行うことを特徴とする、２段サーモサイクルＰＣＲ
法、および上記方法を実施し、増幅生成物を検索するこ
とを特徴とする核酸検出法を提供するものである。
【０００６】従来、プライマーの鎖長は広く見積もって
も１５〜３０塩基と考えられていたが、これは、鎖長が
それより短いとポリメラーゼによる伸長反応の温度で鋳
型とアニーリングしなくなること、および必要以上に長
くすると却ってミスアニールの確率が高くなると考えら
れていたからである（共立出版株式会社発行、「遺伝子
増幅ＰＣＲ法−基礎と新しい展開」第２０７頁左欄末行
〜右欄３行）。すなわち、長鎖のプライマーでは特異性
が低くなると考えられていたにもかかわらず、この発明
において長鎖のプライマーを使用することにより、標準
的なプライマーでは検出不可能なＤＮＡが検出可能にな
る程高い特異性が得られることは、意外なことである。
も１５〜３０塩基と考えられていたが、これは、鎖長が
それより短いとポリメラーゼによる伸長反応の温度で鋳
型とアニーリングしなくなること、および必要以上に長
くすると却ってミスアニールの確率が高くなると考えら
れていたからである（共立出版株式会社発行、「遺伝子
増幅ＰＣＲ法−基礎と新しい展開」第２０７頁左欄末行
〜右欄３行）。すなわち、長鎖のプライマーでは特異性
が低くなると考えられていたにもかかわらず、この発明
において長鎖のプライマーを使用することにより、標準
的なプライマーでは検出不可能なＤＮＡが検出可能にな
る程高い特異性が得られることは、意外なことである。
【０００７】
【実施態様】この発明の方法は、まず、第１段として、
標的配列含有２本鎖ＤＮＡを含む試料中の上記ＤＮＡの
変性反応を、緩衝液のような媒体中において、ＰＣＲ法
においてＤＮＡの変性に通常用いられる温度で行うこと
により実施される。標的配列とは、増幅を意図する配列
を意味する。このような配列は、原核生物のＤＮＡおよ
び真核生物の核内もしくは核外ＤＮＡの一部分または合
成核酸であり得、ウイルス、リケッチア、細菌、真菌、
藻類、高等植物、原虫、下等動物、軟体動物、節足動
物、脊椎動物から、または合成により得られる。２本鎖
ＤＮＡとは、互いに完全または実質的に相補的な一対の
ＤＮＡを意味し、これは通常相補的な塩基間の結合によ
りアニーリングしている。試料とは、２本鎖ＤＮＡを含
む限り任意のものであり得る。代表的なものは、臨床検
査検体、例えば血液およびそれに由来するフラクショ
ン、リンパ液、髄液、唾液、喀痰、器官または組織、毛
髪、精液、尿、その他の身体由来物、および細胞培養
物、汚染の疑がある物品の洗浄液等である。ＤＮＡの変
性に通常用いられる温度とは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖Ｄ
ＮＡに解離させるに足る温度であり、通常９０〜９５℃
程度である。この発明の反応は、通常温度と時間のプロ
グラム入力が可能な自動増幅装置を用いて行われるの
で、上記第１段の反応を行う際には、反応液にＤＮＡ試
料以外に第２段で用いるプライマー、塩基、ＤＮＡポリ
メラーゼ等も加えておくのが普通である。反応時間は２
０秒以上が好ましい。
標的配列含有２本鎖ＤＮＡを含む試料中の上記ＤＮＡの
変性反応を、緩衝液のような媒体中において、ＰＣＲ法
においてＤＮＡの変性に通常用いられる温度で行うこと
により実施される。標的配列とは、増幅を意図する配列
を意味する。このような配列は、原核生物のＤＮＡおよ
び真核生物の核内もしくは核外ＤＮＡの一部分または合
成核酸であり得、ウイルス、リケッチア、細菌、真菌、
藻類、高等植物、原虫、下等動物、軟体動物、節足動
物、脊椎動物から、または合成により得られる。２本鎖
ＤＮＡとは、互いに完全または実質的に相補的な一対の
ＤＮＡを意味し、これは通常相補的な塩基間の結合によ
りアニーリングしている。試料とは、２本鎖ＤＮＡを含
む限り任意のものであり得る。代表的なものは、臨床検
査検体、例えば血液およびそれに由来するフラクショ
ン、リンパ液、髄液、唾液、喀痰、器官または組織、毛
髪、精液、尿、その他の身体由来物、および細胞培養
物、汚染の疑がある物品の洗浄液等である。ＤＮＡの変
性に通常用いられる温度とは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖Ｄ
ＮＡに解離させるに足る温度であり、通常９０〜９５℃
程度である。この発明の反応は、通常温度と時間のプロ
グラム入力が可能な自動増幅装置を用いて行われるの
で、上記第１段の反応を行う際には、反応液にＤＮＡ試
料以外に第２段で用いるプライマー、塩基、ＤＮＡポリ
メラーゼ等も加えておくのが普通である。反応時間は２
０秒以上が好ましい。
【０００８】第２段は、第１段から得た変性ＤＮＡ、２
種のプライマー、４種の塩基およびＤＮＡポリメラーゼ
存在下、アニーリング反応と伸長反応を、ＰＣＲ法にお
いてプライマー鎖の伸長反応に通常用いられる温度で行
うことにより実施される。この発明の方法で使用する２
種（正方向および逆方向）のプライマーは、３５塩基以
上の鎖長をもつものであり、通常４５塩基以下、好まし
くは４０±３または４０±２、特に４０塩基鎖長をも
つ。プライマーは、標的配列を挾む以外に、次のような
条件をできるだけ保有することが望ましい。（１）塩基
がランダムに配列する、（２）ＧＣ含量は増幅部分と同
程度または５０％内外である、（３）３’末端で２次構
造をとらない、（４）２つのプライマーが互いに相補的
でない、（５）他の領域とのホモロジーが低い。プライ
マーは５’末端のラベル（ＦＩＴＣ：フルオレスセイン
イソチオシアナート、ビオチン等）、ＤＭＴｒ（ジメト
キシトリチル）等が結合していてもよい。また、プライ
マーは少数（１、２個）の非相補塩基を含んでいてもよ
い。このようなプライマーは、例えばＤＮＡ自動合成機
を用いて合成することができる。自動合成機は通常固相
シアノエチルホスホアミダイト法に基づくもので、固相
担体としてＣＰＧ（コントロールポアグラス）が広く用
いられる。固相担体に、３’末端に相当する塩基をエス
テル結合させ、その５’保護基（例えばＤＭＴｒ）を酸
で除去して次の塩基を結合させる。合成したフラグメン
トはアンモニアで担体から切り離す。精製は、例えば逆
相ＨＰＬＣによる。塩基ｄＮＴＰは、ｄＧＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを含む。ＤＮＡポリメラー
ゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えばファルマ
シア社から販売されているＴthＤＮＡポリメラーゼや、
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大
腸菌で発現させたもの]が適当である。そのほか、反応
液には通常ＰＣＲ反応に用いられる種々の成分を含ませ
ることができる。例えば、マグネシウムイオンはポリメ
ラーゼの活性およびプライマーのアニーリングを促進す
る。塩化カリウムもポリメラーゼ活性を促進するが、高
濃度では阻害的に作用する。そのほか、ＤＭＳＯ、ゼラ
チン、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤が加えられる場合も
ある。
種のプライマー、４種の塩基およびＤＮＡポリメラーゼ
存在下、アニーリング反応と伸長反応を、ＰＣＲ法にお
いてプライマー鎖の伸長反応に通常用いられる温度で行
うことにより実施される。この発明の方法で使用する２
種（正方向および逆方向）のプライマーは、３５塩基以
上の鎖長をもつものであり、通常４５塩基以下、好まし
くは４０±３または４０±２、特に４０塩基鎖長をも
つ。プライマーは、標的配列を挾む以外に、次のような
条件をできるだけ保有することが望ましい。（１）塩基
がランダムに配列する、（２）ＧＣ含量は増幅部分と同
程度または５０％内外である、（３）３’末端で２次構
造をとらない、（４）２つのプライマーが互いに相補的
でない、（５）他の領域とのホモロジーが低い。プライ
マーは５’末端のラベル（ＦＩＴＣ：フルオレスセイン
イソチオシアナート、ビオチン等）、ＤＭＴｒ（ジメト
キシトリチル）等が結合していてもよい。また、プライ
マーは少数（１、２個）の非相補塩基を含んでいてもよ
い。このようなプライマーは、例えばＤＮＡ自動合成機
を用いて合成することができる。自動合成機は通常固相
シアノエチルホスホアミダイト法に基づくもので、固相
担体としてＣＰＧ（コントロールポアグラス）が広く用
いられる。固相担体に、３’末端に相当する塩基をエス
テル結合させ、その５’保護基（例えばＤＭＴｒ）を酸
で除去して次の塩基を結合させる。合成したフラグメン
トはアンモニアで担体から切り離す。精製は、例えば逆
相ＨＰＬＣによる。塩基ｄＮＴＰは、ｄＧＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを含む。ＤＮＡポリメラー
ゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えばファルマ
シア社から販売されているＴthＤＮＡポリメラーゼや、
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大
腸菌で発現させたもの]が適当である。そのほか、反応
液には通常ＰＣＲ反応に用いられる種々の成分を含ませ
ることができる。例えば、マグネシウムイオンはポリメ
ラーゼの活性およびプライマーのアニーリングを促進す
る。塩化カリウムもポリメラーゼ活性を促進するが、高
濃度では阻害的に作用する。そのほか、ＤＭＳＯ、ゼラ
チン、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤が加えられる場合も
ある。
【０００９】鎖の伸長反応に通常用いられる温度とは、
ＤＮＡポリメラーゼによる塩基配列伸長反応が行われる
温度であるが、この発明の方法ではＤＮＡに対するプラ
イマーのアニーリングもこの温度で行われる。このよう
な温度は通常７０〜８０℃であり、７０〜７５℃、特に
約７２℃が好ましい。この発明の方法ではアニーリング
と伸長が同時に行われるので、アニーリングのための時
間を考慮する必要がなく、第２段は通常の伸長時間すな
わち約３０秒以上が適当である。サイクル数は特に制限
されないが、３０〜３５サイクルが適当である。
ＤＮＡポリメラーゼによる塩基配列伸長反応が行われる
温度であるが、この発明の方法ではＤＮＡに対するプラ
イマーのアニーリングもこの温度で行われる。このよう
な温度は通常７０〜８０℃であり、７０〜７５℃、特に
約７２℃が好ましい。この発明の方法ではアニーリング
と伸長が同時に行われるので、アニーリングのための時
間を考慮する必要がなく、第２段は通常の伸長時間すな
わち約３０秒以上が適当である。サイクル数は特に制限
されないが、３０〜３５サイクルが適当である。
【００１０】上記第１段および第２段を含むこの発明の
方法は、通常、例えば自動増幅装置を用いて、例えば緩
衝液のような適当な媒質中で鋳型ＤＮＡ、各塩基、プラ
イマーおよびＤＮＡポリメラーゼを温度変換サイクルに
かける等の方法により行なうことができる。好ましい実
施方法の一例を示すと次の通りである。 (１)０.５mlの遠心管に下記組成の反応液を入れる。好
ましくは、ミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５
１６)で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.３〜０.５μＭの順方向プライマー ０.３〜０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl2 ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。 (２)自動増幅装置に反応液をセットし、１：熱変性、
２：アニーリングおよび伸長からなるサイクルを２０サ
イクル以上、好ましくは３０サイクル以上行なう。自動
増幅装置は、例えばパーキン・エルマー・シータス社か
ら販売されている。
方法は、通常、例えば自動増幅装置を用いて、例えば緩
衝液のような適当な媒質中で鋳型ＤＮＡ、各塩基、プラ
イマーおよびＤＮＡポリメラーゼを温度変換サイクルに
かける等の方法により行なうことができる。好ましい実
施方法の一例を示すと次の通りである。 (１)０.５mlの遠心管に下記組成の反応液を入れる。好
ましくは、ミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５
１６)で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.３〜０.５μＭの順方向プライマー ０.３〜０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl2 ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。 (２)自動増幅装置に反応液をセットし、１：熱変性、
２：アニーリングおよび伸長からなるサイクルを２０サ
イクル以上、好ましくは３０サイクル以上行なう。自動
増幅装置は、例えばパーキン・エルマー・シータス社か
ら販売されている。
【００１１】増幅生産物は、２種のプライマーにはさま
れた塩基配列およびそのアンチセンス鎖であり、これら
は例えばアガロースゲル電気泳動のような分離手段によ
り分離される。また、生産物はマーカーとの比較による
バンドの長さにより検出されるが、さらに標識プローブ
を用いるサザンハイブリダイゼーションにより確認する
ことができる。標識としては、32Ｐ、ビオチン、ジゴキ
シゲニン等が用いられる。これらを用いる実験方法は文
献に記載されている。増幅生産物の存在は、標的配列の
存在を示し、したがって標的配列が由来する細胞または
微生物存在の指標となる。上記の方法を実施するには、
実施に必要な試剤および器具をまとめてキットにしてお
くのが便利である。このようなキットは、下記のものの
中から選ばれたものを含むことができる。(１)順方向プ
ライマー、(２)逆方向プライマー、(３)緩衝液、(４)Ｋ
Ｃl、(５)ＭgＣl2、(６)ゼラチン、(７)４種類のdＮＴ
Ｐ、(８)ＤＮＡポリメラーゼ、(９)ミネラル・オイル、
(１０)遠心管、(１１)発色試薬(例えばエチジウムブロ
ミド)等。
れた塩基配列およびそのアンチセンス鎖であり、これら
は例えばアガロースゲル電気泳動のような分離手段によ
り分離される。また、生産物はマーカーとの比較による
バンドの長さにより検出されるが、さらに標識プローブ
を用いるサザンハイブリダイゼーションにより確認する
ことができる。標識としては、32Ｐ、ビオチン、ジゴキ
シゲニン等が用いられる。これらを用いる実験方法は文
献に記載されている。増幅生産物の存在は、標的配列の
存在を示し、したがって標的配列が由来する細胞または
微生物存在の指標となる。上記の方法を実施するには、
実施に必要な試剤および器具をまとめてキットにしてお
くのが便利である。このようなキットは、下記のものの
中から選ばれたものを含むことができる。(１)順方向プ
ライマー、(２)逆方向プライマー、(３)緩衝液、(４)Ｋ
Ｃl、(５)ＭgＣl2、(６)ゼラチン、(７)４種類のdＮＴ
Ｐ、(８)ＤＮＡポリメラーゼ、(９)ミネラル・オイル、
(１０)遠心管、(１１)発色試薬(例えばエチジウムブロ
ミド)等。
【００１２】
【効果】この発明のＰＣＲ法は、２段サーモサイクルで
行われるので、３段サーモサイクルで行う従来法に較べ
て簡単であり、短時間で完了する。また、プライマーが
長いことと、アニーリング温度が高いことにより、汚染
ＤＮＡの増幅がなく、特異性が向上する。その結果、従
来のプライマーでは非特異的生成物が多く検出不可能で
あった微生物も検出することが可能となった。このよう
に、この発明の方法は従来法に比較してすぐれたもので
あり、大きな利点をもたらすものである。
行われるので、３段サーモサイクルで行う従来法に較べ
て簡単であり、短時間で完了する。また、プライマーが
長いことと、アニーリング温度が高いことにより、汚染
ＤＮＡの増幅がなく、特異性が向上する。その結果、従
来のプライマーでは非特異的生成物が多く検出不可能で
あった微生物も検出することが可能となった。このよう
に、この発明の方法は従来法に比較してすぐれたもので
あり、大きな利点をもたらすものである。
【００１３】
実施例１(プライマーの合成) アプライド・バイオシステムズ・ジャパン株式会社製モ
デル３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用し、同
社のオペレーターズマニュアルに従って塩基の結合と脱
保護を行い、この発明で使用する下記プライマーを合成
した。
デル３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用し、同
社のオペレーターズマニュアルに従って塩基の結合と脱
保護を行い、この発明で使用する下記プライマーを合成
した。
【化２】 （ＳＡ：スタフイロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)） [配列番号:１] 5'- ATTCTGTCGTCCGTGCCTCATGCCATGTGCAACAATGATA -3' [配列番号:２] 5'- GGCGATTTAGGTGTGATCATGCGCAAAGTATTGATACCCG -3' [配列番号:３] 5'- GGTTGGCCTAATATTGTTTCGTCAAAGCGCTCGGGTATCA -3' [配列番号:４] 5'- GGCAGTTACTTTAGGTACATCTGCAAGATTGCATCCGTGG -3' [配列番号:５] 5'- GGATTTGTCGCAAACCACCAGACAAAAGGATAGCCCGAAA -3' [配列番号:６] 5'- CATCTCTATGCAATTCAAAGGCGGCTTAACAAAGGCATTC -3' （ＳＥ：スタフイロコッカス・エピデルミディス(St.epdermidis)） [配列番号:７] 5'- TCATGGTGCAAATGGGATGGATGAGGCCACGCTTTCTGGT -3' [配列番号:８] 5'- GATCACGTTGCGGTAATTGAGGTACAGATGGGCTTTTCGA -3' [配列番号:９] 5'- TTAGAAAGCGGACCCATTTGGGGGTTTGACACATCTGTAC -3' [配列番号:10] 5'- GAGCCTTGACCTAGTAATGCAACAATTTCTGCACCACCCT -3' [配列番号:11] 5'- AGTGGTATTAGCGATGGGTATTGCAGCCCCTGTTGTTCTG -3 [配列番号:12] 5'- CTCGAGGCATCAAATGATACAACTCTATCAGCAGTAGTGG -3' また、比較のため、下記２０塩基プライマーを合成し
た。
た。
【化３】（ＳＡ：スタフイロコッカス・アウレウス(Sta
phylococcus aureus)） [配列番号:13] 5'- TGCCATGTGCAACAATGATA -3' [配列番号:14] 5'- GCGCAAAGTATTGATACCCG -3' [配列番号:15] 5'- GTCAAAGCGCTCGGGTATCA -3' [配列番号:16] 5'- CTGCAAGATTGCATCCGTGG -3' [配列番号:17] 5'- GACAAAAGGATAGCCCGAAA -3' [配列番号:18] 5'- GCGGCTTAACAAAGGCATTC -3' (ＳＥ：スタフイロコッカス・エピデルミディス(St.epd
ermidis)） [配列番号:19] 5'- ATGAGGCCACGCTTTCTGGT -3' [配列番号:20] 5'- GGTACAGATGGGCTTTTCGA -3' [配列番号:21] 5'- GGGGTTTGACACATCTGTAC -3' [配列番号:22] 5'- AACAATTTCTGCACCACCCT -3' [配列番号:23] 5'- TTGCAGCCCCTGTTGTTCTG -3' [配列番号:24] 5'- AACTCTATCAGCAGTAGTGG -3' なお、２０塩基プライマー（配列番号：１３〜２４）
は、対応する４０塩基プライマー（配列番号１〜１２）
の後半部分と全く同一である。通常正方向プライマーの
5'末端をビオチン−ＯＮ−ホスホルアミダイドでラベル
し、逆方向プライマーの5'末端をアミノリンク−ＩＩ
（ＡＢＩ社）でリンカーのついた状態にして、下記方法
にしたがいジゴキシゲニンでラベルした。
phylococcus aureus)） [配列番号:13] 5'- TGCCATGTGCAACAATGATA -3' [配列番号:14] 5'- GCGCAAAGTATTGATACCCG -3' [配列番号:15] 5'- GTCAAAGCGCTCGGGTATCA -3' [配列番号:16] 5'- CTGCAAGATTGCATCCGTGG -3' [配列番号:17] 5'- GACAAAAGGATAGCCCGAAA -3' [配列番号:18] 5'- GCGGCTTAACAAAGGCATTC -3' (ＳＥ：スタフイロコッカス・エピデルミディス(St.epd
ermidis)） [配列番号:19] 5'- ATGAGGCCACGCTTTCTGGT -3' [配列番号:20] 5'- GGTACAGATGGGCTTTTCGA -3' [配列番号:21] 5'- GGGGTTTGACACATCTGTAC -3' [配列番号:22] 5'- AACAATTTCTGCACCACCCT -3' [配列番号:23] 5'- TTGCAGCCCCTGTTGTTCTG -3' [配列番号:24] 5'- AACTCTATCAGCAGTAGTGG -3' なお、２０塩基プライマー（配列番号：１３〜２４）
は、対応する４０塩基プライマー（配列番号１〜１２）
の後半部分と全く同一である。通常正方向プライマーの
5'末端をビオチン−ＯＮ−ホスホルアミダイドでラベル
し、逆方向プライマーの5'末端をアミノリンク−ＩＩ
（ＡＢＩ社）でリンカーのついた状態にして、下記方法
にしたがいジゴキシゲニンでラベルした。
【００１４】ジゴキシゲニンラベル法：リンカーのつい
たプライマーをエタノールで沈殿させ、ほう酸ナトリウ
ムをｐＨ９．５の緩衝液５０μlで溶かす。ジゴキシゲ
ニン−ＮＨＳ−エステルを１．３mg／５０μlになるよ
うにジメチルホルムアミドで溶かし、上記プライマー溶
液に加え、Voltex処理して暗所中室温で一夜反応させ
る。ＮＡＰ−１０でゲル交換後濃縮し、ＨＰＬＣ(μ Bo
ndapac C18、Waters社、商標)で分離し、再濃縮する。 （鋳型ＤＮＡの抽出と精製）臨床菌株としてスタフィロ
コッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタ
フィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus ep
idermidis)、エシェリキア・コリ(Esherichia coli)お
よびクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiellapneumoni
e)等の各菌株をＢＨＩ(Brain Heart Infusion)培地で一
晩培養し、培養菌株を遠心等によって集菌し、基本的に
は、サイトウ-ミウラ法バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・アクタ(Biochem.Biophys.Acta)、７２
巻、６１９−６２９頁(１９６３年))に従ってゲノムＤ
ＮＡを抽出する。ただし、この方法では、エシェリキア
・コリ(E.coli)、クレブシエラ・ニューモニエ(klebsie
lla pneumonie)等のグラム陰性菌をベースにした溶菌酵
素として、リゾチーム(Sigma社、商標)を用いている
が、リゾチーム耐性菌に対しては、必要に応じリゾスタ
フィン(Sigma社、商標)、アクロモペプチダーゼ(和光純
薬、商標)、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(生化学工業)等
にかえ、使い分け、溶菌させてからフェノール処理を行
う。
たプライマーをエタノールで沈殿させ、ほう酸ナトリウ
ムをｐＨ９．５の緩衝液５０μlで溶かす。ジゴキシゲ
ニン−ＮＨＳ−エステルを１．３mg／５０μlになるよ
うにジメチルホルムアミドで溶かし、上記プライマー溶
液に加え、Voltex処理して暗所中室温で一夜反応させ
る。ＮＡＰ−１０でゲル交換後濃縮し、ＨＰＬＣ(μ Bo
ndapac C18、Waters社、商標)で分離し、再濃縮する。 （鋳型ＤＮＡの抽出と精製）臨床菌株としてスタフィロ
コッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタ
フィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus ep
idermidis)、エシェリキア・コリ(Esherichia coli)お
よびクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiellapneumoni
e)等の各菌株をＢＨＩ(Brain Heart Infusion)培地で一
晩培養し、培養菌株を遠心等によって集菌し、基本的に
は、サイトウ-ミウラ法バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・アクタ(Biochem.Biophys.Acta)、７２
巻、６１９−６２９頁(１９６３年))に従ってゲノムＤ
ＮＡを抽出する。ただし、この方法では、エシェリキア
・コリ(E.coli)、クレブシエラ・ニューモニエ(klebsie
lla pneumonie)等のグラム陰性菌をベースにした溶菌酵
素として、リゾチーム(Sigma社、商標)を用いている
が、リゾチーム耐性菌に対しては、必要に応じリゾスタ
フィン(Sigma社、商標)、アクロモペプチダーゼ(和光純
薬、商標)、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(生化学工業)等
にかえ、使い分け、溶菌させてからフェノール処理を行
う。
【００１５】(ＰＣＲ反応)ＰＣＲ混合液としては、１０
mM トリス・ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、５０mM ＫＣｌ；
１．５mM ＭｇＣｌ2；０．００１％(w/v)ゼラチン；
２．５単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼまたはTth ＤＮ
Ａポリメラーゼ；２００μMずつのｄＮＴＰ類；０．３
μMのブライマー類および適当な鋳型ＤＮＡ約１μgを含
ませ全量を１００μlとした。ＰＣＲ温度条件は、２段
サーモサイクルの場合、９４℃で１５秒間変性させた
後、７２℃でアニーリングおよび伸長反応を行い、３０
サイクル繰り返した。すべての反応は、ＤＮＡサーマル
・サイクラー(パーキン−エルマー・シータス)で行い最
初の変成および最後の伸長はそれぞれ５分および７分で
行った。また、対照の３段サーモサイクルの温度条件
は、９４℃で１分間変性し、５８℃で１分間アニーリン
グを行い、７２℃で２分間伸長反応をさせた。これを３
０サイクル繰り返した。ＰＣＲ産物を３：１ヌシーブ／
シーケム(Nusieve/Seakem)アガロース(FMC バイオプロ
ダクツ社)により電気泳動を行った。
mM トリス・ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、５０mM ＫＣｌ；
１．５mM ＭｇＣｌ2；０．００１％(w/v)ゼラチン；
２．５単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼまたはTth ＤＮ
Ａポリメラーゼ；２００μMずつのｄＮＴＰ類；０．３
μMのブライマー類および適当な鋳型ＤＮＡ約１μgを含
ませ全量を１００μlとした。ＰＣＲ温度条件は、２段
サーモサイクルの場合、９４℃で１５秒間変性させた
後、７２℃でアニーリングおよび伸長反応を行い、３０
サイクル繰り返した。すべての反応は、ＤＮＡサーマル
・サイクラー(パーキン−エルマー・シータス)で行い最
初の変成および最後の伸長はそれぞれ５分および７分で
行った。また、対照の３段サーモサイクルの温度条件
は、９４℃で１分間変性し、５８℃で１分間アニーリン
グを行い、７２℃で２分間伸長反応をさせた。これを３
０サイクル繰り返した。ＰＣＲ産物を３：１ヌシーブ／
シーケム(Nusieve/Seakem)アガロース(FMC バイオプロ
ダクツ社)により電気泳動を行った。
【００１６】（プレートアッセイ）１０μg/mlのストレ
プトアビジン(ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリー社)を
１００μl/ウェルの割合で９６穴プレートに入れ、４℃
で一晩放置する。洗浄緩衝液(１００mM トリス・ＨＣ
ｌ(ｐＨ７．４)、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴ
Ａ、０．１％ツイン２０)３００μlで１回洗浄する。次
に、ブロックエース(雪印)を３００μl/ウェル加え、室
温で２時間または４℃で一晩放置する。上記洗浄緩衝液
３００μlで１回洗浄した。続いて、洗浄緩衝液で２０
００倍に希釈したアンチ−ジゴキシゲニン−ペルオキシ
ダーゼ(ベーリンガーマンハイム−山之内社)を９０μ
l、ＰＣＲ産物を１０μlをウェルに入れ(全量１００μ
l)、室温で３０分放置する。そして洗浄緩衝液３００μ
lで３回洗浄しｏ−フェニレンジアミン／Ｈ2Ｏ2で発色
させる。
プトアビジン(ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリー社)を
１００μl/ウェルの割合で９６穴プレートに入れ、４℃
で一晩放置する。洗浄緩衝液(１００mM トリス・ＨＣ
ｌ(ｐＨ７．４)、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴ
Ａ、０．１％ツイン２０)３００μlで１回洗浄する。次
に、ブロックエース(雪印)を３００μl/ウェル加え、室
温で２時間または４℃で一晩放置する。上記洗浄緩衝液
３００μlで１回洗浄した。続いて、洗浄緩衝液で２０
００倍に希釈したアンチ−ジゴキシゲニン−ペルオキシ
ダーゼ(ベーリンガーマンハイム−山之内社)を９０μ
l、ＰＣＲ産物を１０μlをウェルに入れ(全量１００μ
l)、室温で３０分放置する。そして洗浄緩衝液３００μ
lで３回洗浄しｏ−フェニレンジアミン／Ｈ2Ｏ2で発色
させる。
【００１７】実施例２ 実施例１記載のＳＡ：スタフイロコッカス・アウレウス
(Staphylococcus aureus)およびＳＥ：スタフイロコッ
カス・エピデルミディス(St.epdermidis)、を用いて、
以下の実験を行った。 ａ)２０塩基プライマー［配列番号：１５−２４］を用
い、３段サイクルＰＣＲ法（従来法）を行った。結果を
図１に示す。両端は分子量マーカー、Ｎは陰性対照、Ｐ
は標的ＤＮＡ含有試料、ＨはヒトＤＮＡである。 ｂ)２０塩基プライマー［配列番号：１５−２４］を用
い、２階サイクルＰＣＲ法（比較例）を行った。結果を
図２に示す。試料中のＤＮＡは検出されないことがわか
る。 ｃ)４０塩基プライマー［配列番号：３、４］および２
０塩基プライマー［配列番号：１５、１６］を用い、ｃ
ｈ−ＤＮＡスクリーニングの２段サイクルＰＣＲ法を比
較した。結果を図３に示す。左側が２０塩基、右側が４
０塩基の場合である。両端は分子量マーカー、Ｎは陰性
対照、ＳＡ、ＳＥ、ＥＣ、ＫＰはそれぞれスタフィロコ
ッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフ
ィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epid
ermidis)、エシェリキア・コリ(Esherichia coli)、ク
レブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonie)の鋳
型ＤＮＡを示す。標的ＤＮＡ（ＳＡ）は４０塩基では検
出されるが２０塩基では検出されないことがわかる。 ｄ)４０塩基プライマー［配列番号：５、６］および２
０塩基プライマー［配列番号：１７、１８］を用い、ｃ
ｈ−ＤＮＡスクリーニングの２段サイクルＰＣＲ法を比
較した。結果を図４に示す。標的ＤＮＡ（ＳＡ）は４０
塩基では検出されるが２０塩基では検出されないことが
わかる。
(Staphylococcus aureus)およびＳＥ：スタフイロコッ
カス・エピデルミディス(St.epdermidis)、を用いて、
以下の実験を行った。 ａ)２０塩基プライマー［配列番号：１５−２４］を用
い、３段サイクルＰＣＲ法（従来法）を行った。結果を
図１に示す。両端は分子量マーカー、Ｎは陰性対照、Ｐ
は標的ＤＮＡ含有試料、ＨはヒトＤＮＡである。 ｂ)２０塩基プライマー［配列番号：１５−２４］を用
い、２階サイクルＰＣＲ法（比較例）を行った。結果を
図２に示す。試料中のＤＮＡは検出されないことがわか
る。 ｃ)４０塩基プライマー［配列番号：３、４］および２
０塩基プライマー［配列番号：１５、１６］を用い、ｃ
ｈ−ＤＮＡスクリーニングの２段サイクルＰＣＲ法を比
較した。結果を図３に示す。左側が２０塩基、右側が４
０塩基の場合である。両端は分子量マーカー、Ｎは陰性
対照、ＳＡ、ＳＥ、ＥＣ、ＫＰはそれぞれスタフィロコ
ッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフ
ィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epid
ermidis)、エシェリキア・コリ(Esherichia coli)、ク
レブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonie)の鋳
型ＤＮＡを示す。標的ＤＮＡ（ＳＡ）は４０塩基では検
出されるが２０塩基では検出されないことがわかる。 ｄ)４０塩基プライマー［配列番号：５、６］および２
０塩基プライマー［配列番号：１７、１８］を用い、ｃ
ｈ−ＤＮＡスクリーニングの２段サイクルＰＣＲ法を比
較した。結果を図４に示す。標的ＤＮＡ（ＳＡ）は４０
塩基では検出されるが２０塩基では検出されないことが
わかる。
【００１８】実施例３ ４０塩基プライマー［配列番号：１，２，９，１０］お
よび２７種の菌およびヒトのＤＮＡを鋳型として用い、
２段サイクルＰＣＲ反応を行った。結果を図５，６，７
および８に示す。左側が２０塩基、右側が４０塩基の場
合である。標的ＤＮＡ（ＳＡまたはＳＥ）が検出される
ことがわかる。
よび２７種の菌およびヒトのＤＮＡを鋳型として用い、
２段サイクルＰＣＲ反応を行った。結果を図５，６，７
および８に示す。左側が２０塩基、右側が４０塩基の場
合である。標的ＤＮＡ（ＳＡまたはＳＥ）が検出される
ことがわかる。
【００１９】実施例４ ４０塩基プライマー［配列番号：３，４，７，８，９，
１０，１１，１２］およびＳＡ、ＳＥ、ＥＣ、ＫＮ、Ｈ
ｕ（ヒト）のＤＮＡを鋳型として用い２段サイクルＰＣ
Ｒを行った。結果を図９および図１０に示す。それぞれ
標的ＤＮＡが検出されることがわかった。
１０，１１，１２］およびＳＡ、ＳＥ、ＥＣ、ＫＮ、Ｈ
ｕ（ヒト）のＤＮＡを鋳型として用い２段サイクルＰＣ
Ｒを行った。結果を図９および図１０に示す。それぞれ
標的ＤＮＡが検出されることがわかった。
【００２０】実施例５ ４０塩基プライマー［配列番号：１，２］および実施例
３と同じ２７菌種およびヒトの鋳型ＤＮＡを用いて２段
サイクルＰＣＲを行い、その産物をプレートアッセイに
より調べた。結果を図１１に示す。図１１において、実
験はデュプリケート（左右に並ぶ）で行い、左上から対
照、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、シトロバクタ
ー・アマロナティクス(C.amalonatics)、シトロバクタ
ー・ジベルサス(C.diversus)、エシェリキア・コリ(E.c
oli)、エンテロバクター・アグロメランズ(E.agglomera
ns)、エンテロコッカス・デュランズ(E.durans)、エン
テロコッカス・ファカリス(E.faecalis)、エンテロバク
ター・エスピー(E.sp)、ヘモフィリス・インフルエンザ
(H.influenzae)、ヘモフィリス・パラインフルエンザ
(H.parainfluenzae)、クレブシエラ・オキシトカ(K.oxy
toca)、クレブシエラ・ニューモニエ(K.pneumonie)、ミ
クロコッカス・ルテウス(M.luteus)、シュードモナス・
アエルギノーザ(P.aeruginosa)、シュードモナス・アル
カリジェネス(P.alkaligenes)、シュードモナス・フルオ
レッセンス(P.fluorescens)、セラチア・マルセッセン
ス(S.marcescens)、スタフィロコッカス・アウレウス
(S.aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス
(S.epidermidis)、ストンプトロコッカス・ヒクス(S.hy
icus)、ストレプトロコッカス・ボビス(S.bovis)、スト
レプトコッカス・ラクティス(S.lactis)、ストレプトコ
ッカス・ミティス(S.mitis)、ストレプトコッカス・ピ
オゲネス(S.pyogenes)、ストレプトコッカス・サリバリ
ウス(S.salivarius)、ストレプトコッカス・サンギス
(S.sanguis)、エルシェニア・エンテロコリチカ(Y.ente
rocolitica)、ヒト鋳型ＤＮＡの順であり、発色してい
るのはスタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus)の
みである。したがって、標準ＤＮＡが検出されることが
わかった。
３と同じ２７菌種およびヒトの鋳型ＤＮＡを用いて２段
サイクルＰＣＲを行い、その産物をプレートアッセイに
より調べた。結果を図１１に示す。図１１において、実
験はデュプリケート（左右に並ぶ）で行い、左上から対
照、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、シトロバクタ
ー・アマロナティクス(C.amalonatics)、シトロバクタ
ー・ジベルサス(C.diversus)、エシェリキア・コリ(E.c
oli)、エンテロバクター・アグロメランズ(E.agglomera
ns)、エンテロコッカス・デュランズ(E.durans)、エン
テロコッカス・ファカリス(E.faecalis)、エンテロバク
ター・エスピー(E.sp)、ヘモフィリス・インフルエンザ
(H.influenzae)、ヘモフィリス・パラインフルエンザ
(H.parainfluenzae)、クレブシエラ・オキシトカ(K.oxy
toca)、クレブシエラ・ニューモニエ(K.pneumonie)、ミ
クロコッカス・ルテウス(M.luteus)、シュードモナス・
アエルギノーザ(P.aeruginosa)、シュードモナス・アル
カリジェネス(P.alkaligenes)、シュードモナス・フルオ
レッセンス(P.fluorescens)、セラチア・マルセッセン
ス(S.marcescens)、スタフィロコッカス・アウレウス
(S.aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス
(S.epidermidis)、ストンプトロコッカス・ヒクス(S.hy
icus)、ストレプトロコッカス・ボビス(S.bovis)、スト
レプトコッカス・ラクティス(S.lactis)、ストレプトコ
ッカス・ミティス(S.mitis)、ストレプトコッカス・ピ
オゲネス(S.pyogenes)、ストレプトコッカス・サリバリ
ウス(S.salivarius)、ストレプトコッカス・サンギス
(S.sanguis)、エルシェニア・エンテロコリチカ(Y.ente
rocolitica)、ヒト鋳型ＤＮＡの順であり、発色してい
るのはスタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus)の
みである。したがって、標準ＤＮＡが検出されることが
わかった。
【００２１】実施例６ エシェリキア・コリ(E.coli)、クレブシエラ・ニューモ
ネア(Klebsiella pneumonea)、スタフィロコッカス・ア
ウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカ
ス・エピデルミディス(S.epidermidis)を培養し、集
菌、洗浄後２mlのヒト正常血に１×１０8細胞/mlになる
ように加え、３７℃、６０分インキュベートした。Ｍ−
ＰＲＭ試薬(フロー・ラボラトリー社)１．５mlに反応血
液１．７５mlを重層し、２０００rpm、３０分、室温で
遠心分離後、定法に従いＰＭＮ(白色好中球：Polymorph
onuclear Neutrophil)の画分を分取しＰＢＳで洗浄後、
再懸濁した。バクテリアル・ライシス・エンザイム(Bac
terial Lysis Enzyme)〔Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧ
(生化学)、リゾスタフィン(Sigma社)、リゾチーム(Sigm
a社)〕等を１mgまたは１ml溶解した変性用緩衝液(５０m
M ＫＣｌ、１０mM トリス・ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、
２．５mM ＭｇＣｌ2、０．４５％ＮＰ−４０、０．１m
g/mlゼラチン、０．４５％ツイン−２０)２５０μlを加
えた。３７℃、３０分インキュベート後、プロテイナー
ゼＫ(メルク社)(１mg/ml)１．５μlを加え、５５℃、１
時間反応させた。１００℃、５分間で反応を止め、各サ
ンプルから５０μlをとり、ＰＣＲ(反応)に供した。 条件：９４℃、５分(９４℃、１５秒、７５℃、３０秒
×３０サイクル)７２℃、７分。プライマー：[配列番
号：１，２，９，１０］ 結果を図１２および図１３に示す。それぞれ標的ＳＡお
よびＳＥのＤＮＡが検出され、この結果からこの発明の
方法ではヒトのゲノムＤＮＡ存在下でも標的ＤＮＡが検
出できることがわかる。
ネア(Klebsiella pneumonea)、スタフィロコッカス・ア
ウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカ
ス・エピデルミディス(S.epidermidis)を培養し、集
菌、洗浄後２mlのヒト正常血に１×１０8細胞/mlになる
ように加え、３７℃、６０分インキュベートした。Ｍ−
ＰＲＭ試薬(フロー・ラボラトリー社)１．５mlに反応血
液１．７５mlを重層し、２０００rpm、３０分、室温で
遠心分離後、定法に従いＰＭＮ(白色好中球：Polymorph
onuclear Neutrophil)の画分を分取しＰＢＳで洗浄後、
再懸濁した。バクテリアル・ライシス・エンザイム(Bac
terial Lysis Enzyme)〔Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧ
(生化学)、リゾスタフィン(Sigma社)、リゾチーム(Sigm
a社)〕等を１mgまたは１ml溶解した変性用緩衝液(５０m
M ＫＣｌ、１０mM トリス・ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、
２．５mM ＭｇＣｌ2、０．４５％ＮＰ−４０、０．１m
g/mlゼラチン、０．４５％ツイン−２０)２５０μlを加
えた。３７℃、３０分インキュベート後、プロテイナー
ゼＫ(メルク社)(１mg/ml)１．５μlを加え、５５℃、１
時間反応させた。１００℃、５分間で反応を止め、各サ
ンプルから５０μlをとり、ＰＣＲ(反応)に供した。 条件：９４℃、５分(９４℃、１５秒、７５℃、３０秒
×３０サイクル)７２℃、７分。プライマー：[配列番
号：１，２，９，１０］ 結果を図１２および図１３に示す。それぞれ標的ＳＡお
よびＳＥのＤＮＡが検出され、この結果からこの発明の
方法ではヒトのゲノムＤＮＡ存在下でも標的ＤＮＡが検
出できることがわかる。
【００２２】
【００２３】配列番号：１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ATTCTGTCGT CCGTGCCTCA TGCCATGTGC AACAATGATA 40
【００２４】配列番号：２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGCGATTTAG GTGTGATCAT GCGCAAAGTA TTGATACCCG 40
【００２５】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GGTTGGCCTA ATATTGTTTC GTCAAAGCGC TCGGGTATCA 40
【００２６】配列番号：４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGCAGTTACT TTAGGTACAT CTGCAAGATT GCATCCGTGG 40
【００２７】配列番号：５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GGATTTGTCG CAAACCACCA GACAAAAGGA TAGCCCGAAA 40
【００２８】配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 CATCTCTATG CAATTCAAAG GCGGCTTAAC AAAGGCATTC 40
【００２９】配列番号：７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 TCATGGTGCA AATGGGATGG ATGAGGCCAC GCTTTCTGGT 40
【００３０】配列番号：８ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GATCACGTTG CGGTAATTGA GGTACAGATG GGCTTTTCGA 40
【００３１】配列番号：９ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 TTAGAAAGCG GACCCATTTG GGGGTTTGAC ACATCTGTAC 40
【００３２】配列番号：１０ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GAGCCTTGAC CTAGTAATGC AACAATTTCT GCACCACCCT 40
【００３３】配列番号：１１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 AGTGGTATTA GCGATGGGTA TTGCAGCCCC TGTTGTTCTG 40
【００３４】配列番号：１２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 CTCGAGGCAT CAAATGATAC AACTCTATCA GCAGTAGTGG 40
【００３５】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 TGCCATGTGC AACAATGATA 20
【００３６】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GCGCAAAGTA TTGATACCCG 20
【００３７】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GTCAAAGCGC TCGGGTATCA 20
【００３８】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 CTGCAAGATT GCATCCGTGG 20
【００３９】配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GACAAAAGGA TAGCCCGAAA 20
【００４０】配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GCGGCTTAAC AAAGGCATTC 20
【００４１】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ATGAGGCCAC GCTTTCTGGT 20
【００４２】配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 GGTACAGATG GGCTTTTCGA 20
【００４３】配列番号：２１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GGGGTTTGAC ACATCTGTAC 20
【００４４】配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AACAATTTCT GCACCACCCT 20
【００４５】配列番号：２３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 TTGCAGCCCC TGTTGTTCTG 20
【００４６】配列番号：２４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AACTCTATCA GCAGTAGTGG 20
【図１】実施例２において２０塩基プライマーを用いた
場合の電気泳動の写真である。
場合の電気泳動の写真である。
【図２】実施例２において４０塩基プライマーを用いた
場合の電気泳動の写真である。
場合の電気泳動の写真である。
【図３】実施例２において４０塩基プライマーおよび２
０塩基プライマーを用いて比較した電気泳動の写真であ
る。
０塩基プライマーを用いて比較した電気泳動の写真であ
る。
【図４】実施例２において別の４０塩基プライマーおよ
び２０塩基プライマーを用いて比較した電気泳動の写真
である。
び２０塩基プライマーを用いて比較した電気泳動の写真
である。
【図５】実施例３において種々の鋳型と４０塩基プライ
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図６】実施例３において種々の鋳型と４０塩基プライ
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図７】実施例３において種々の鋳型と別の４０塩基プ
ライマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
ライマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図８】実施例３において種々の鋳型と４０塩基プライ
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図９】実施例４において種々の鋳型と４０塩基プライ
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
マーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図１０】実施例４において種々の鋳型と４０塩基プラ
イマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
イマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図１１】実施例５のプレートアッセイの結果を示す図
である。
である。
【図１２】実施例６において種々の鋳型と４０塩基プラ
イマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
イマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
【図１３】実施例６において種々の鋳型と４０塩基プラ
イマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
イマーを用いた場合の電気泳動の写真である。
Claims (5)
- 【請求項１】 第１段として、標的配列含有２本鎖ＤＮ
Ａを含む試料中の上記ＤＮＡの変性反応を、ＰＣＲ法に
おいてＤＮＡの変性に通常用いられる温度で行い、第２
段として、それぞれ３５塩基以上の長さをもつ正方向お
よび逆方向プライマー、４種の塩基ｄＧＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼの存
在下に、上記標的配列を含む変性ＤＮＡに対する両プラ
イマーのアニーリング反応とＤＮＡポリメラーゼによる
プライマー鎖の伸長反応を、ＰＣＲ法においてプライマ
ー鎖の伸長反応に通常用いられる温度で行うことを特徴
とする、２段サーモサイクルＰＣＲ法。 - 【請求項２】 下記配列から選ばれた塩基配列を有する
化合物。 【化１】 [配列番号:１] 5'- ATTCTGTCGTCCGTGCCTCATGCCATGTGCAACAATGATA -3' [配列番号:２] 5'- GGCGATTTAGGTGTGATCATGCGCAAAGTATTGATACCCG -3' [配列番号:３] 5'- GGTTGGCCTAATATTGTTTCGTCAAAGCGCTCGGGTATCA -3' [配列番号:４] 5'- GGCAGTTACTTTAGGTACATCTGCAAGATTGCATCCGTGG -3' [配列番号:５] 5'- GGATTTGTCGCAAACCACCAGACAAAAGGATAGCCCGAAA -3' [配列番号:６] 5'- CATCTCTATGCAATTCAAAGGCGGCTTAACAAAGGCATTC -3' [配列番号:７] 5'- TCATGGTGCAAATGGGATGGATGAGGCCACGCTTTCTGGT -3' [配列番号:８] 5'- GATCACGTTGCGGTAATTGAGGTACAGATGGGCTTTTCGA -3' [配列番号:９] 5'- TTAGAAAGCGGACCCATTTGGGGGTTTGACACATCTGTAC -3' [配列番号:10] 5'- GAGCCTTGACCTAGTAATGCAACAATTTCTGCACCACCCT -3' [配列番号:11] 5'- AGTGGTATTAGCGATGGGTATTGCAGCCCCTGTTGTTCTG -3' [配列番号:12] 5'- CTCGAGGCATCAAATGATACAACTCTATCAGCAGTAGTGG -3' - 【請求項３】 請求項２記載の化合物からなるプライマ
ー。 - 【請求項４】 請求項３記載のプライマーを用いたＰＣ
Ｒ反応で得られる増幅生産物であるヌクレオチド。 - 【請求項５】 請求項１記載のＰＣＲ反応を実施し、増
幅生産物を検索することを特徴とする、核酸検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4241798A JPH0690756A (ja) | 1992-09-10 | 1992-09-10 | ２段サーモサイクルｐｃｒ法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4241798A JPH0690756A (ja) | 1992-09-10 | 1992-09-10 | ２段サーモサイクルｐｃｒ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690756A true JPH0690756A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=17079673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4241798A Pending JPH0690756A (ja) | 1992-09-10 | 1992-09-10 | ２段サーモサイクルｐｃｒ法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690756A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005005594A1 (ja) * | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Taiyo Yuden Co., Ltd. | 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 |
| US7214485B2 (en) | 2000-08-25 | 2007-05-08 | Lovelace Respiratory Research Institute | Nested methylation-specific polymerase chain reaction cancer detection method |
-
1992
- 1992-09-10 JP JP4241798A patent/JPH0690756A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214485B2 (en) | 2000-08-25 | 2007-05-08 | Lovelace Respiratory Research Institute | Nested methylation-specific polymerase chain reaction cancer detection method |
| WO2005005594A1 (ja) * | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Taiyo Yuden Co., Ltd. | 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060206 |