CN113574161A

CN113574161A - 核酸扩增方法

Info

Publication number: CN113574161A
Application number: CN202080021631.5A
Authority: CN
Inventors: 永井秀典; 岩浪哲
Original assignee: Kyorin Pharmaceutical Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Kyorin Pharmaceutical Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2021-10-29
Also published as: WO2020189581A1; US20220145360A1; EP3940053A4; EP3940053A1; JPWO2020189581A1

Abstract

一种往复流动型核酸扩增方法，该方法通过使样品液体在微通道内的两个空间独立的温度区之间往复来进行热循环，所述微通道连接两个温度区，其中所述两个温度区为变性温度区和延伸‑退火温度区；所述微通道至少包括对应于所述变性温度区的弯曲通道，对应于所述延伸‑退火温度区的弯曲通道，直线或弯曲的中介通道，所述中介通道连接对应于所述变性温度区的弯曲通道和对应于所述延伸‑退火温度区的弯曲通道；以及连接器，其连接至能够使样品液体移动的液体输送机构；所述方法包括通过液体输送机构移动微通道内的样品液体，其中当停止液体输送时所述液体输送机构向大气压开放，以及在对应于变性温度区的通道上的预定点处和对应于延伸‑退火温度区的通道上的预定点处测量每个热循环的荧光强度，以进行实时PCR。

Description

核酸扩增方法

技术领域

相关专利申请的交叉引用

本申请请求于2019年3月15日递交的日本专利申请No.2019-049009的优先权的权益，其全部内容以引用的方式并入本文。本发明涉及一种核酸扩增方法。

背景技术

核酸检测是包括药物研发、法医学、临床检验以及作物和病原微生物物种识别等诸多领域的核心。通过分子系统发育分析来检测各种疾病(如癌症)、微生物感染和遗传标志物的能力是疾病和发育风险的诊断、标志物搜索、食品和环境安全评价、犯罪证据以及许多其它技术方面的通用技术。

用于以高灵敏度检测少量核酸(基因)的最强大的基础技术之一是分析通过指数复制并扩增核酸序列的一部分或整个序列而获得的产物。

聚合酶链反应(PCR)是一种对DNA的特定区域进行选择性扩增的强大技术。利用PCR，可以针对模板DNA中的目标DNA序列，由单模板DNA产生数百万拷贝的DNA片段。PCR重复采用两相或三相温度条件(称为“热循环”)而依次重复以下各个反应：DNA变性为单链、引物退火形成变性的DNA单链、以及通过热稳定DNA聚合酶的引物的延伸。重复该循环直至得到足够的拷贝数量用于分析的。原则上，在PCR的单个循环中，拷贝数量可以翻倍。实际上，随着热循环的继续，所需反应试剂的浓度降低，由此扩增的DNA产物的累积最终会停止。关于PCR大致细节，参见Clinical Applications of PCR,Dennis Lo(编辑)，Humana Press(新泽西州托托瓦)(1998年)；和PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,M.A.Innis等(编辑)，Academic Press Inc.(加利福尼亚州圣地亚哥)(1990年)。

尽管PCR是一种能够选择性扩增目标DNA的强大技术，但是在PCR完成后，扩增的DNA需要经单独进行的另一操作，如凝胶电泳，来确认。为了改善PCR，开发了根据扩增的目标DNA的量产生或淬灭荧光的实时PCR。实时PCR简化了对样品中是否存在目标DNA的确认。在常规PCR技术中，在PCR前的样品中超出预定量的模板DNA往往会导致PCR后DNA的扩增量达到平台期；这阻碍了PCR前的模板DNA量的定量。然而，实时PCR能够在PCR过程中，在扩增的DNA数量达到平台期之前实时检测扩增的DNA数量；因此，可以从DNA扩增的进程中量化PCR前的模板DNA的数量。这就是实时PCR也称为“定量PCR”的原因。

通过实时PCR的目标DNA量的定量在临床实践中，例如，在监测病毒水平的变化以确认对诸如AIDS病毒(HIV)等的病毒感染的治疗功效中，特别有用。通过实时PCR的DNA定量在机会性感染，比如疱疹病毒(HHV)(许多患者自婴儿期就经常受到亚临床感染并在身体虚弱时由于病毒的增殖而发展为感染)的诊断方面也是有效的。

尽管PCR和实时PCR是通过热循环以指数方式扩增基因的强大技术，但由于用作加热器的铝块的巨大热容量，因此PCR中采用的常规热循环装置在温度控制方面缓慢；并且通常需要1到2小时，甚至在某些情况下需要更长时间，来执行30到40个循环的PCR。因此，即使使用最先进的基因测试设备，分析通常仍需要总共超过1个小时。自该技术问世以来，使PCR操作加速一直是一个巨大的挑战。

为了使PCR操作加速的目的，本发明的发明人开发了一种往复流动型核酸扩增装置，该装置采用了微型鼓风机或类似设备作为液体输送机构(PTL 1)。

与此同时，通过在单个PCR反应体系中使用多个引物对来同时扩增多个基因区域的多重PCR已受到人们的关注。从多重PCR发展而来的实时多重PCR旨在在受其他目标基因的影响(串扰)较小并且不降低灵敏度的同时，区分并检测多个不同目标基因并获得定量结果。然而，据报道，由于诸如可用于标记以避免荧光波长重叠的荧光物质的组合有限等问题，两个以上目标的定量多重反应通常很困难。

PTL 1报道了通过采用能够同时测量三种类型荧光的多色荧光检测器作为多重PCR的实例在微通道的线性通道上的一个点(检测点)处的测量结果。

引用列表

专利文献

PTL 1：WO2016/006612A

发明内容

技术问题

然而，如果如PTL1中那样，在多重PCR中采用多色荧光检测器在线性通道上的一个检测点上同时测量多个探针的荧光强度，则从其中一个探针发射的荧光波长的光谱会与来自同时测量的另一个探针的荧光波长的光谱或用于激发标记其它探针的荧光染料的光源的波长的光谱部分地重叠，使这些光谱无法相互区分。因此，为了准确测量荧光强度，希望在荧光发射之间或荧光发射和激发光之间没有这种干扰。

为了防止这样干扰，可以在线性通道上布置3个测量点，并且可以在不同的时间间隔打开激发光源来测量荧光强度。但不方便的是，必须减慢液体输送速度以避免干扰。

本发明的一个目的在于提供一种即使在进行多重PCR时仍快速且低噪的实时PCR方法。

技术方案

为了实现上述目的，经深入研究后发明人发现，可以在执行实时PCR时通过在微通道的两个空间独立的温度区的预定点处测量每个热循环的荧光强度来实现所述目的。基于这一发现，发明人进一步进行了研究并完成了本发明。

本发明包括以下实施方式。

项目1、一种往复流动型核酸扩增方法，所述方法通过使样品液体在微通道内的两个空间独立的温度区之间往复(reciprocating)来进行热循环，所述微通道连接两个温度区，其中

所述两个温度区为变性温度区和延伸-退火温度区，

所述微通道至少包括

对应于所述变性温度区的弯曲通道，

对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道，

直线或弯曲的中介通道，其连接对应于所述变性温度区的弯曲通道和对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道；以及

连接器，其可连接至能够使样品液体移动的液体输送机构；

所述方法包括

通过所述液体输送机构来移动微通道内的样品液体，其中，当停止液体输送时，所述液体输送机构向大气压开放，以及

在对应于变性温度区的通道上的预定点处和对应于延伸-退火温度区的通道上的预定点处测量每个热循环的荧光强度，以进行实时PCR。

项目2、一种核酸扩增方法，其包括如下步骤：

步骤1：将核酸扩增用芯片安装在往复流动型核酸扩增装置的基板上，所述往复流动型核酸扩增装置能够通过测量每个热循环的荧光强度来进行实时PCR，

所述往复流动型核酸扩增装置包括：

加热器，其形成变性温度区和延伸-退火温度区；

荧光检测器，其测量变性温度区中存在的样品液体的荧光强度；

荧光检测器，其测量延伸-退火温度区中存在的样品液体的荧光强度；

液体输送机构，其允许所述样品液体在变性温度区和延伸-退火温度区之间移动，并且当停止液体输送时，所述液体输送机构对大气压开放；

基板，其上安装有核酸扩增用芯片；以及

控制机构，其接收来自所述荧光检测器的与所述样品液体的移动有关的电信号来控制所述液体输送机构的驱动；

所述核酸扩增用芯片包括至少一个微通道，所述至少一个微通道包括：

对应于所述变性温度区的弯曲通道，

对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道，

连接器，其将所述核酸扩增装置的液体输送机构连接至所述微通道的一端或两端；

步骤2：将微通道上的液体输送机构的连接器连接至所述液体输送机构；

步骤3：通过所述液体输送机构使所述样品液体在所述微通道的两个弯曲通道之间往复来进行热循环；以及

步骤4：通过荧光检测器在对应于变性温度区的弯曲通道上的预定点处和在对应于延伸-退火温度区的弯曲通道上的预定点处测量每个热循环的样品液体的荧光强度。

项目3、根据项目1或项目2所述的核酸扩增方法，其中所述液体输送机构为微型鼓风机或风扇。

项目4、根据项目1至3中任一项所述的核酸扩增方法，其中连接所述弯曲通道的中介通道为直线通道。

项目5、根据项目4所述的核酸扩增方法，其中所述往复流动型核酸扩增装置进一步包括荧光检测器，该荧光检测器测量流经所述中介通道的样品液体的荧光强度，所述中介通道连接对应于变性温度区的弯曲通道和对应于延伸-退火温度区的弯曲通道，

所述方法包括通过所述荧光检测器在中介通道的预定点处测量每个热循环的样品液体的荧光强度的步骤。

项目6、根据项目5所述的核酸扩增方法，其中所述中介通道上的荧光测量点(P2)与变性温度区上的荧光测量点(P1)之间的距离为8mm以上。

有益效果

本发明提供了一种即使在进行多重PCR时仍快速且低噪的实时PCR方法。

附图说明

图1示出了核酸扩增装置的结构的一个实施例(2个加热器)。

图2示出了核酸扩增装置的结构的一个实施例(3个加热器)。

图3示出了PCR芯片上变性温度区和延伸-退火温度区的弯曲通道以及连接这些弯曲通道的直线中介通道的一个实施例。

图4是多重qPCR的图(Cy5检测)。

图5是多重qPCR的图(FAM检测)。

图6是多重qPCR的图(ABY检测)。

具体实施方式

以下详细描述了根据本发明的核酸扩增方法。

根据本发明的核酸扩增方法通过使样品液体在微通道内的两个温度区之间往复(reciprocating)来进行热循环。有时也将这种类型的核酸扩增方法称为“往复流动型核酸扩增方法”。

在PCR(聚合酶链反应)技术中，根据本发明的核酸扩增方法是能够监测PCR反应期间基因扩增状态的实时PCR。PCR通过使用多个循环的变性、引物对形成相对链的退火、以及引物延伸来扩增核酸，从而导致目标核酸序列的拷贝数呈指数增加。

为了实现实时PCR，测量了每个热循环的荧光强度。具体而言，目标DNA的初始量可以通过如下来定量：记录每个循环的荧光强度随时间的变化，其中所述荧光强度随着经由热循环扩增的目标DNA而增加，以及计算荧光强度超过阈值时的循环数(Ct值)。在PCR中，基因扩增的方式(即基因产物对数增加的循环数)取决于基础模板的量。因此，可以通过将基因的扩增与具有已知浓度的外标DNA的扩增进行比较来计算样品中存在的目标基因的量。

可以采用DNA或RNA作为模板来进行本发明的核酸扩增方法。在采用DNA作为模板的情况下，通过采用如图1配置的核酸扩增装置来进行PCR。在采用RNA作为模板(实时RT-PCR)的情况下，首先通过采用如图2配置的核酸扩增装置通过逆转录酶由mRNA生成(逆转录)互补DNA(cDNA)，然后进行PCR。PCR中使用的试剂盒和方案可以从一系列已知的试剂盒和方案中选择。当根据本发明的核酸扩增方法为实时RT-PCR时，可以使用一步法RT-PCR，其可以在PCR中以一步实现快速且简便的逆转录和循环。

在优选的实施方式中，根据本发明的核酸方法是多重PCR，其通过在单个PCR反应体系中使用多个引物对来同时扩增多个基因区域。特别优选地，根据本发明的核酸扩增方法为同时扩增两种或三种不同基因区域的多重PCR。

本发明的核酸扩增方法通过允许样品液体移动经过微通道来进行。用于进行根据本发明的核酸扩增方法的微通道至少包括对应于变性温度区的弯曲通道、对应于延伸-退火温度区的弯曲通道、连接对应于所述变性温度区的弯曲通道和对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道的直线或弯曲的中介通道、以及可连接至能够使样品液体移动的液体输送机构的连接器。微通道还可包括用于引入样品液体的开口。所述用于引入样品液体的开口可以由任意选择的密封件、阀或类似部件来密封。

优选地，所述微通道由满足以下部分或全部要求的材料形成：(i)相对较高的导热性，(ii)在PCR所需的温度范围内具有稳定性，(iii)耐由电解质溶液或有机溶剂引起的腐蚀，以及(iv)核酸和蛋白质的低吸附性。材料的具体实例包括玻璃、石英、硅和各种热固性或光固化树脂，比如环烯烃聚合物(COP)。从检测荧光的角度考虑，所述材料优选具有高透光性(特别是用于进行荧光检测的激发光和发射光)(即该材料不吸收、漫射或反射大量光)，并且是透明的。

所述微通道可以具有这样的结构，在该结构中通过，例如，诸如数控加工切割的机械处理、注塑成型、纳米压印或软光刻在材料中形成沟槽；并且在该结构中通过密封件(优选由，例如，聚烯烃形成的透明密封件)密封所述沟槽。可选地，所述微通道可以通过三维打印形成。所述微通道的横截面可以是任何形状；所述形状可以是，例如，半圆形、圆形、矩形、楔形、梯形或多边形。所述微通道的横截面可为，例如，约10至1000μm宽且约10至1000μm深。所述微通道的宽度和深度可以是恒定的，或者所述宽度或深度可以部分地改变。

所述微通道中对应于变性温度区的弯曲通道和对应于延伸-退火温度区的弯曲通道可以是具有环形形状的蜿蜒微通道，或螺旋弯曲微通道。将对应于变性温度区的弯曲通道连接至对应于延伸-退火温度区的弯曲通道的所述中介通道可以是直线或弯曲的形状。

优选地，对应于变性温度区的弯曲通道和对应于延伸-退火温度区的弯曲通道各自具有20mm以上的长度。

所述微通道中对应于变性温度区的弯曲通道和对应于延伸-退火温度区的弯曲通道中的每一个均保持在预定的温度。输送至所述温度区的样品液体的温度会被改变为所述温度区的温度。

将所述变性温度区维持在PCR中DNA变性反应所需的温度。优选地，所述变性温度区的温度为约90至100℃，和更优选地为约95℃。将所述延伸-退火温度区维持在PCR中DNA的退火和延伸反应所需的温度。优选地，所述延伸-退火温度区的温度为约40至75℃，和更优选地为约55至65℃。

优选地，所述变性温度区和所述延伸-退火温度区各自维持在恒定的温度。温度的维持可以通过热源来实现。所述热源，例如，放置在所述微通道内或与之接触。所述热源的具体实例包括筒形加热器、薄膜加热器和珀耳帖(Peltier)加热器。

在根据本发明的核酸扩增方法中，样品液体以栓状形式流经微通道。流经微通道的样品液体可以是任何体积，优选为约5至50μL，更优选为约15至20μL。

所述样品液体包含PCR反应所需的组份和荧光检测所需的组份，以实现实时PCR。例如，所述样品液体含有主要由如下组成的水性基质：水、诸如模板核酸(DNA或RNA)聚合酶和逆转录酶的酶，可选地标记的脱氧核苷酸三磷酸腺苷，和相应靶基因区域的引物集作为PCR反应所需的组份；以及荧光探针(如TaqMan探针、Cycleave探针、E-探针(注册商标))和染料(如SYBR GREEN)作为荧光检测所需的组份。所述样品液体可包含缓冲液组份以调节pH和盐浓度。

当本发明的PCR为多重PCR时，所述样品液体包含两种以上的类型的引物集。一般而言，“引物集”是指正向引物和反向引物的组合；典型地，将一种类型的正向引物和一种类型的反向引物用于一个靶标基因区域。即使本发明的引物集仅包含一种反向引物并与两种以上的正向引物组合(作为引物对)能够产生对应于相应基因区域的扩增产物，则该引物集可以用作用作多重PCR的引物集。

用在荧光检测中的染料(荧光染料)的实例包括ABY、吖啶、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor647、ATTO(ATTO-TEC荧光染料)、Biosearch Blue、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、香豆素、DANSYL、FAM(如5-FAM、6-FAM)、FITC、GPF、5-HEX、6-HEX、JOE、JUN、海蓝(Marina Blue)、NED、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、PET、Pulsar、Quasar 570、Quasar 670、Quasar 705、罗丹明绿、罗丹明红、5-ROX、6-ROX、5-TAMRA、6-TAMRA、5-TET、6-TET、德克萨斯红、TRITC和VIC。

优选地，在本发明中，用在多重PCR中的染料包含选自ABY和HEX中的至少一个成员，比如ABY、Cy5和FAM的组合；和HEX、Cy5和FAM的组合。

根据本发明的核酸扩增方法中的样品液体的移动通过液体输送机构来实现，其中当液体输送停止时，所述液体输送机构对大气压开放。特别地，替代于使用需要将通道内部形成为封闭系统以防止压力逸出的机构(例如，注射器泵)，本发明使用了配置成甚至在液体输送期间形成开放系统的液体输送机构。这种液体输送机构在气流停止时，使通道内的压力瞬间与通道外的压力相等，并消除了作用在栓状样品液体上的压力，由此即刻停止液体输送。这可以实现精确的位置控制，而无需多个用于控制样品液体位置的卸压阀。

当液体输送停止时对大气压开放的液体输送机构的实例包括微型鼓风机和风扇。

微型鼓风机，也称为“压电微型鼓风机”，是一种已知的吸入和喷射空气的装置，其特征在于其非密封结构(无止逆阀)。典型的微型鼓风机通过施加到压电元件的电压使其隔膜弯曲和变形，以吸入和喷射空气。例如，可以使用由村田制作所(Murata ManufacturingCo.,Ltd)制造的微型鼓风机(MZB1001T02、MZB3004T04)。

风扇是指通过叶轮的旋转运动吹出空气的装置。由于叶轮的结构特点，通道不是封闭系统。

在根据本发明的核酸扩增方法中，通过以下[1]至[4]作为一个循环来进行往复流动型核酸扩增：

[1]操作液体输送机构以将样品液体从延伸-退火温度区通过中介通道移动到变性温度区的步骤，

[2]停止液体输送机构以使样品液体在变性温度区保持预定的时间段的步骤，

[3]操作液体输送机构以将样品液体从变性温度区通过中介通道移动到延伸-退火温度区的步骤，以及

[4]操作液体输送机构以使样品液体在延伸-退火温度区保持预定的时间段的步骤。

将该循环进行至少1次，优选约30至50次，和更优选地约35至50次以进行热循环。可根据模板核酸的浓度、目标基因的类型等适当确定循环的次数。

在本发明的核酸扩增方法中，样品液体移动的速度，特别是所述样品液体流经中介通道的速度可以是，例如约25mm/秒至2.2m/秒、更优选地约40mm/秒至1m/秒、或约60mm/秒至300mm/秒。

可以根据目标基因区域(如基因的类型和基因区域的长度)分别适当地确定样品液体在变性温度区保持的时间段和样品液体在延伸-退火温度区保持的时间段。例如，样品液体在变性温度区保持的时间段可以为约2至10秒，以及样品液体在延伸-退火温度区保持的时间段可以为约2至60秒。

所述液体输送机构通过，例如，连接器连接至微通道。

在本发明的一个实施方式中，将两个液体输送机构连接至微通道，一个机构连接至所述微通道的一端和另一个机构连接至另一端。具体而言，在上述步骤[1]中操作为了将液体从延伸-退火温度区输送至变性温度区而连接的第一液体输送机构，以及在上述步骤[3]中操作为了将液体从变性温度区输送至延伸-退火温度区而连接的第二液体输送机构。

在本发明的另一个实施方式中，将单个液体输送机构通过具有切换阀(switchingvalve)的分支连接通道连接至所述微通道的两端。具体地，在步骤[1]中，通过由切换阀构成的通路操作液体输送机构，从而将液体从延伸-退火温度区输送至变性温度区。在步骤[3]中，通过通路结构操作液体输送机构，从而将液体经由切换阀从变性温度区输送至延伸-退火温度区。如果所述切换阀为3通阀，则该3通阀连接至当液体输送停止时对大气压开放的微型鼓风机或风扇。通过位于在分支点分成2个方向的空气流路的两端的2个3通阀向通向微通路的两端的2个连接通路交替送风，可以使样品液体在微通道内往复。在这种情况下，3通阀在一个阀嘴(mouth)关闭且剩余阀嘴开放的情况下送气以允许样品液体流动。尽管优选地是使用单个3通阀，但是根据连接通道的组合也可以使用2通阀的组合，或多通阀，比如3通、4通或5通阀。

在本发明的另一个实施方式中，通过具有切换阀的分支连接通道将两个液体输送机构(空气喷射装置和空气吸入装置)连接至微通道的一端(在延伸-退火温度区侧)。具体而言，在步骤[1]中，操作液体输送机构(空气喷射装置)从而将液体通过切换阀从延伸-退火温度区向变性温度区输送。在步骤[3]中，操作液体输送机构(空气吸入装置)从而将液体通过切换阀从变性温度区向延伸-退火温度区输送。

在一个典型的实施方式中，在根据本发明的核酸扩增方法中，在三个通道中的至少两个通道上的预定点处测量每个热循环的样品液体的荧光强度，所述三个通道为：对应于变性温度区的通道、对应于延伸-退火温度区的通道和直线或弯曲的中介通道。例如，在本发明的实施方式中，在对应于变性温度区的通道上的预定点处和在对应于延伸-退火温度区的通道上的预定点处，和可选地在直线或弯曲的中介通道上的预定点处测量每个热循环的样品液体的荧光强度。在对应于变性温度区的通道上的预定点没有特别限制。然而优选地，预定点为距所述中介通道1至几(2至4)圈或弯曲部分之后的位置，例如图3中的P1。在对应于延伸-退火温度区的通道上的预定点没有特别限制。然而优选地，预定点为距所述中介通道1至几(2至4)圈或弯曲部分之后的位置，例如图3中的P3。直线中介通道上的预定点没有特别限制，可以是图3中的P2。如上所述，每个热循环的荧光强度的测量使实时PCR成为可能。

如果在两个点处测量荧光强度，则测量荧光强度的点还可以是对应于延伸-退火温度区的通道上的点和直线或弯曲的中介通道上的点。

如果在三个点处测量荧光强度，则测量荧光强度的点为对应于变性温度区的通道上的点、对应于延伸-退火温度区的通道上的点和直线或弯曲的中介通道上的点。

一个点处的荧光强度的检测优选为一种荧光类型(一种波长)的检测。

除了监测PCR反应期间基因扩增的状态外，优选地将至少一种荧光强度的测量用于样品液体移动的检测。例如，可以在变性温度区和在延伸-退火温度区检测样品液体的移动，并且可以通过荧光检测器发出的与样品液体移动相关的电信号来控制液体样品输送机构的驱动。

以下示出了样品液体输送的控制实例。

[1]打开照亮变性温度区通道的光源(LED)，并通过液体输送机构将样品从延伸-退火温度区通过中介通道移动至变性温度区的步骤；

[2]在控制机构中接收来自荧光检测器的指示变性温度区内的样品液体检测的电信号，并停止液体输送机构的步骤；

[3]打开照亮延伸-退火温度区通道的光源(LED)，并通过液体输送机构将样品从变性温度区通过中介通道移动至延伸-退火温度区的步骤；和

[4]在控制机构中接收来自荧光检测器的指示延伸-退火温度区内的样品液体检测的电信号，并停止液体输送机构的步骤。

可以采用荧光检测器通过检测由于光源向微通道内的样品液体照射的激发光而产生的发射光(荧光)来测量荧光强度。在测量所述中介通道内的荧光强度时，优选测量从样品液体开始通过中介通道上的荧光强度检测点(P2)的时间点至样品液体通过变性或延伸-退火温度区上的荧光强度检测点(P1或P3)的时间点的荧光强度。与通过即使在样品液体已经通过P1或P3之后测量荧光强度获得的结果相比，通过按照如上所述指定荧光强度的测量时间(周期)获得的测量结果可以是稳定的且噪音更少。

可以例如通过使用以下所述的核酸扩增装置和核酸扩增用芯片来进行本发明的核酸扩增方法。

核酸扩增装置

一种往复流动型核酸扩增装置，包括：

加热器，其能够形成变性温度区和延伸-退火温度区；

液体输送机构，其允许所述样品液体在两个温度区之间移动，并且当停止液体输送时，所述液体输送机构对大气压开放；

基板，其上安装有核酸扩增用芯片；以及

控制机构，其接收来自所述荧光检测器的指示样品液体移动的电信号并控制所述液体输送机构的驱动；

所述往复流动型核酸扩增装置通过测量每个热循环的荧光强度来进行实时PCR。

核酸扩增用芯片

核酸扩增用芯片，包括

至少一个微通道，所述至少一个微通道包括：

对应于所述变性温度区的弯曲通道，

对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道，

直线或弯曲的中介通道，其连接弯曲通道；以及

连接器，其将所述核酸扩增装置的液体输送机构连接至所述微通道的一端或两端。

具体而言，本发明的核酸扩增方法可以通过以下步骤1至4进行：

步骤1：将核酸扩增用芯片安装在核酸扩增装置的基板上；

步骤2：将微通道一端或两端上的液体输送机构的连接器连接至液体输送机构；

步骤3：通过液体输送机构使样品液体在微通道的两个弯曲通道之间往复来进行热循环；以及

步骤4：通过荧光检测器在对应于变性温度区的通道上的预定点处和在对应于延伸-退火温度区的通道上的预定点处测量每个热循环的样品液体的荧光强度。

以下参照附图描述了核酸扩增装置和核酸扩增用芯片的实施例。

如图1所示，核酸扩增装置可包括其上安装了核酸扩增用芯片的基板(未示出)、核酸扩增用芯片的温度控制单元、液体输送机构(以微型鼓风机为例)、荧光检测器和为作为控制机构的控制计算机提供电源的小型电池。

在图1中，核酸扩增用芯片的温度控制单元包括筒形加热器，该两个筒形加热器以10mm的间隔并列设置从而与核酸扩增用芯片的两个弯曲通道的密封面侧接触。为了控制两个加热器的温度，每个加热器均连接K型热电偶。

通过控制计算机将筒形加热器1控制到DNA变性反应所需的温度。通过控制计算机将筒形加热器2控制到DNA的退火反应和延伸反应所需的温度。可以通过PID(比例-积分-微分)控制使DNA变性反应的温度区和退火反应和延伸反应的温度区，例如保持在恒定温度。

将荧光检测器用于测量变性温度区的微通道的直线通道上的一个点、延伸-退火温度区的微通道的直线通道上的一个点(图3中的P1和P3)，和中介通道上的一个点(图3中的P2)作为检测点的荧光强度。在所输送的样品液体由于压力的施加从一个弯曲通道到达检测点P1或P3的时间点，或紧接该时间点之后，可以停止液体输送结构以允许其他弯曲通道保留样品液体达预定的时间段。

控制计算机能够对液体输送机构进行程序控制。在连续监测每个微通道中心上述检测点处的荧光强度的同时，控制计算机通过交替切换液体输送机构使样品液交替向位于加热器上的每个弯曲通道移动达设定的时间，从而进行热循环。控制计算机还同时记录每个循环的荧光强度改变，其中所述荧光强度随着在实时PCR中通过热循环而扩增的目标DNA而增加，并计算荧光强度超过阈值时的循环数(Ct值)以定量目标DNA的初始量。

图3示出了配备了微通道的核酸扩增用芯片。在图3所示的核酸扩增用芯片中，通过直线中介通道连接两个弯曲通道(蜿蜒通道)，其中一个为对应于变性温度区的通道和另一个为对应于延伸-退火温度区的通道；并在检测点P1、P2和P3检测样品液体的荧光。

实施例

以下，结合实施例详细地描述了本发明。然而本发明并不限于这些实施例。

实施例：肺炎致病菌群的定量

使用用于高速实时PCR的PCR芯片和根据本发明的装置对肺炎致病菌群(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae))的目标基因进行定量。所使用的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎支原体的模板DNA为AmpliRun(注册商标)肺炎链球菌DNA对照、AmpliRun(注册商标)嗜血杆菌DNA对照和AmpliRun(注册商标)肺炎支原体DNA对照，它们均为商购可获得的对照DNA。对于阴性对照(NTC)，将无菌水用于混合。使用它们进行高速实时PCR。

将以下序列的引物和探针用于三个不同的靶标。对于肺炎链球菌，正向引物序列为5’-AACTCTTACGCAATCTAGCAGATGAA-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物序列为5’-CGTGCAATACTCGTGCGTTTTA-3’(SEQ ID NO:2)，和TaqMan(注册商标)探针序列为5’-CCGAAAACGCTTGATACA-3’(SEQ ID NO:3)。对于流感嗜血杆菌，正向引物序列为5’-GGAATCCCAATGCACAAGAAC A-3’(SEQ ID NO:11)，反向引物序列为5’-GCTTTGGTCAACACATCAACCTT-3’(SEQ ID NO:12)和TaqMan(注册商标)探针序列为5’-CATTATTAGTTGCAGGTTCT-3’(SEQ ID NO:13)。对于肺炎支原体，正向引物序列为5’-CTTGGTCTCCATACTTAACTAAATAAAAAACTC-3’(SEQ ID NO:21)，反向引物序列为’-GAACTACAAGCCGCTAATGCAG-3’(SEQ ID NO:22)和TaqMan(注册商标)探针序列为5’-GCCTTGAAGGCTGGGTTTGCGCTA-3’(SEQ ID NO:23)。

用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎支原体的荧光探针分别为Cy5-标记的、FAM-标记的和ABY-标记的TaqMan(注册商标)探针。PCR溶液中每个荧光探针的终浓度为200nM。

PCR溶液中，用于肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的每种正向引物的终浓度和每种反向引物的终浓度为1.5μM。PCR溶液中，用于肺炎支原体的正向引物的终浓度和反向引物的终浓度为2.0μM。对于其他试剂，使用具有终浓度为0.15U/μL的SpeedSTAR(注册商标)HSDNA聚合酶(Takara Bio Inc.)。将所附的FAST缓冲液I和dNTP混合物按手册中指示的浓度混合，制成PCR预混物。

以5.0×10³拷贝/μL的量制备3种类型的对照DNA。将3种对照DNA各2μl或作为NTC的无菌水6μl加入11μl用于PCR的预混物中，将总量20μl用于实时多重PCR。

设置热循环条件以执行以下操作：在98℃下加热10秒进行热启动，然后在98℃下达2秒和62℃下达6秒进一步加热50个循环。在这些条件下，该热循环的50个循环的时间段为8分54秒。

照亮变性温度区通道(图3中的P1)的光源(LED)具有525nm的波长，照亮中介通道(图3中的P2)的光源(LED)具有470nm的波长，和照亮延伸-退火温度区通道(图3中的P3)的光源(LED)具有630nm的波长。

图4至6示出了对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎支原体采用高速实时PCR的多重PCR的结果。图4示出了Cy5-标记的TaqMan(注册商标)探针的荧光强度改变，其中实线为肺炎链球菌的扩增曲线，虚线为NTC的结果。图5示出了FAM-标记的TaqMan(注册商标)探针的荧光强度改变，其中实线为嗜血杆菌流感的扩增曲线，虚线为NTC的结果。图6示出了ABY-标记的TaqMan(注册商标)探针的荧光强度改变，其中实线为肺炎支原体的扩增曲线，虚线为NTC的结果。

如实线所示，当包含3种类型的对照DNA中的任何一种时，与虚线所示的NTC的荧光信号所示的扩增相比，实现了明确的扩增。这表明同时测量了同一样品的多个项目。

序列表

<110> 国立研究开发法人产业技术综合研究所

杏林制药株式会社

<120> 核酸扩增方法

<130> FP212532JP

<150> JP 2019-049009

<151> 2019-03-15

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 肺炎链球菌()

<400> 1

aactcttacg caatctagca gatgaa 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 肺炎链球菌()

<400> 2

cgtgcaatac tcgtgcgttt ta 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 肺炎链球菌()

<400> 3

ccgaaaacgc ttgataca 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 流感嗜血杆菌()

<400> 4

ggaatcccaa tgcacaagaa ca 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 流感嗜血杆菌()

<400> 5

gctttggtca acacatcaac ctt 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 流感嗜血杆菌()

<400> 6

cattattagt tgcaggttct 20

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 肺炎支原体()

<400> 7

cttggtctcc atacttaact aaataaaaaa ctc 33

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 肺炎支原体()

<400> 8

gaactacaag ccgctaatgc ag 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 肺炎支原体()

<400> 9

gccttgaagg ctgggtttgc gcta 24

Claims

1.一种往复流动型核酸扩增方法，所述方法通过使样品液体在微通道内的两个空间独立的温度区之间往复来进行热循环，所述微通道连接两个温度区，其中，

所述两个温度区为变性温度区和延伸-退火温度区，

所述微通道至少包括

对应于所述变性温度区的弯曲通道，

对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道，

连接器，其可连接至能够使样品液体移动的液体输送机构；

所述方法包括：

在对应于所述变性温度区的通道上的预定点处和对应于所述延伸-退火温度区的通道上的预定点处测量每个热循环的荧光强度，以进行实时PCR。

2.一种核酸扩增方法，其包括如下步骤：

所述往复流动型核酸扩增装置包括：

加热器，其能够形成变性温度区和延伸-退火温度区；

荧光检测器，其测量所述变性温度区中存在的样品液体的荧光强度；

荧光检测器，其测量所述延伸-退火温度区中存在的样品液体的荧光强度；

液体输送机构，其允许所述样品液体在所述变性温度区和所述延伸-退火温度区之间移动，并且当停止液体输送时，所述液体输送机构对大气压开放；

基板，其上安装有所述核酸扩增用芯片；以及

对应于所述变性温度区的弯曲通道，

对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道，

步骤3：通过所述液体输送机构使所述样品液体在所述微通道的两个弯曲通道之间往复从而进行热循环；以及

步骤4：通过荧光检测器在对应于所述变性温度区的弯曲通道上的预定点处和在对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道上的预定点处测量每个热循环的样品液体的荧光强度。

3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中，所述液体输送机构为微型鼓风机或风扇。

4.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中，连接弯曲通道的中介通道为直线通道。

5.根据权利要求4所述的核酸扩增方法，其中，所述往复流动型核酸扩增装置进一步包括荧光检测器，所述荧光检测器测量流经所述中介通道的样品液体的荧光强度，所述中介通道连接对应于所述变性温度区的弯曲通道和对应于所述延伸-退火温度区的弯曲通道，

6.根据权利要求5所述的核酸扩增方法，其中，所述中介通道上的荧光测量点(P2)与所述变性温度区上的荧光测量点(P1)之间的距离为8mm以上。