JP5178149B2 - 標的核酸のリアルタイムpcr方法及びその装置 - Google Patents
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Description
複数の標的核酸についてリアルタイムPCRによる増幅を行う方法であって、
反応領域に収納した前記標的核酸を含む複数のPCR溶液のそれぞれに温度サイクルを与えることにより前記標的核酸を増幅させる増幅工程と、
前記増幅工程により増幅された標的核酸を検出する検出工程と、
前記検出工程により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを個々のPCR溶液毎に判断する演算工程と、
前記演算工程により増幅反応が完了していると判断されたPCR溶液を前記反応領域から排出する排出工程と、
前記排出工程により排出されたPCR溶液と、前記増幅工程に供するための標的核酸を含む新たなPCR溶液とを、交換して前記反応領域に供給する供給工程と、
を有することを特徴とするリアルタイムPCR方法。
複数の標的核酸についてリアルタイムPCRによる増幅を行うための装置であって、
前記標的核酸を含む複数のPCR溶液を収納し得る反応領域と、該反応領域に収納した各PCR溶液に、標的核酸の増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与機構と、を有する増幅部と、
前記増幅部により増幅された標的核酸を検出する検出部と、
前記検出部により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する演算部と、
前記演算部により増幅反応が完了していると判断されたPCR溶液を前記反応領域から排出する排出機構と、
前記排出機構により排出されたPCR溶液と、標的核酸を含む新たなPCR溶液とを交換して前記反応領域に供給する供給部と、
から構成されていることを特徴とするリアルタイムPCR装置。
(1)反応領域に供給した標的核酸を含む複数のPCR溶液の各々に温度サイクルを与えることにより、各PCR溶液中で標的核酸を増幅させる増幅工程。
(2)増幅工程により増幅された標的核酸を検出する検出工程。
(3)検出工程により得られたデータから各PCR溶液中での標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを個々のPCR溶液毎に判断する演算工程。
(4)演算工程により増幅反応が完了していると判断されたPCR溶液を反応領域から排出する排出工程。
(5)排出工程により排出されたPCR溶液と交換に、前記増幅工程に供するための他の新たな標的核酸を含むPCR溶液を反応領域に供給する供給工程。
1.標的核酸に特異的に結合するプライマー
2.標的核酸に結合したプライマーから標的配列に相補的にDNAを合成するDNAポリメラーゼ
3.DNA合成に必要な各種ヌクレオチド(dNTPなど)
4.塩化マグネシウムや塩化カリウム等の塩類
5.トリス等のバッファー
なお、プライマーやdNTPは蛍光あるいはその他の標識をしているものも含む。また、標的核酸の量を測定可能にする試薬としては、上述のように、インターカレータや蛍光プローブなどがある。
(1)複数のPCR溶液を収納し得る反応領域と、反応領域に収納した各PCR溶液に、標的核酸の増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与機構と、を有する増幅部。
(2)増幅部により増幅された標的核酸を検出する検出部。
(3)検出部により得られたデータから標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する演算部。
(4)演算部により増幅反応が完了していると判断されたPCR溶液を、反応領域から排出する排出機構。
(5)排出機構により排出されたPCR溶液と交換に、標的核酸を含む新たなPCR溶液を反応領域に供給する供給機構。
図1は本発明のリアルタイムPCR装置の好適な一例を示す模式図である。
101は、基板、
102は、基板中に形成されたPCR溶液を流すための環状流路、
103は、増幅反応が完了したPCR溶液を排出する排出口、
104は、排出されたPCR溶液の領域に新しい標的核酸を含むPCR溶液を供給する供給口、
105は、標的核酸の増幅を検出する検出器、
106、107は、116および117はPCR溶液の供給又は排出を行う際に環状流路の流れを制御するバルブ、
108は、PCR溶液を環状流路への導入又は環状流路からの排出を行うポンプ、
109は、PCR溶液を環状流路102で循環させるポンプ、
110は、検出器105で得られてデータを基に増幅反応の完了の有無を算出する演算器(初期値を算出する機能も有する)、
111は、標的核酸を増幅させる温度サイクルを行う為の温度サイクル付与機構としての加熱冷却器、
となっている。
(a)流路102には、複数のPCR溶液と各PCR溶液を分離するバッファ溶液が交互に充填されている。
(b)供給口104と排出口103の周りを四つのバルブ106,107、116および117で囲み、増幅反応の完了が確認されたPCR溶液が流れてきた直後に、流路102をバルブ106,107によって閉じ、バルブ116、117を開く。
(c)導入口103と排出口104に備え付けてあるポンプ108(不図示)を駆動してバッファ液で挟まれた増幅反応が完了したPCR溶液を排出し、そして、これから増幅を行う標的核酸を含むバッファ液で挟まれたPCR溶液の供給する。
(d)バルブ106及び107を開き、バルブ116および117を閉じることで、新たなPCR溶液を流路102に流す。
圧電アクチュエータを用いた進行波型バルブレスマイクロポンプの開発、日本ATM学会誌13(2005)310−315
本発明を適用できる構造として第2の実施形態を示す。図6は本発明のリアルタイムPCR装置の他の実施例を示す模式図である。
601は、PCR溶液が入った容器602を保持するホルダー、
602は、PCR溶液を入れるための容器、
603は、増幅反応にかける前のPCR溶液が入った容器を保管する処理前ケース、
604は、増幅反応が完了したPCR溶液が入った容器を保管する処理後ケース、
605は、標的核酸の増幅を検出するための検出器、
607は、標的核酸を含むPCR溶液を保持した容器602の移動を行うための供給機構及び排出機構を兼ねる容器搬送部、
610は、検出器605で得られてデータを基に増幅反応の完了の有無を算出する演算器(標的核酸の初期値を算出する機能も有する)、
611は、標的核酸を増幅させるために温度変化を行う反応領域を構成する加熱冷却器、
となっている。
本発明を適用できる構造として第3の実施形態を示す。図7は本発明のリアルタイムPCR装置の他の実施形態を示す模式図である。
701は、基板、
702は、PCR溶液について増幅反応を行うための反応領域を構成するチャンバー、
703は、増幅反応が完了したPCR溶液を排出するための排出口、
704は、チャンバー702にPCR溶液を供給するための供給口、
705は、標的核酸の増幅を検出するための検出器、
706および707は、複数のチャンバー702からPCR溶液毎に使用するチャンバー702を選択するバルブ、
708および709は、PCR溶液の移動を行うためのポンプ、
710は、検出器705で得られてデータを基に増幅反応の完了の有無を算出する演算器(標的核酸の初期数を算出する機能も有する)、
711は、チャンバー702に入ったPCR溶液に温度サイクルを与えるための加熱冷却器、
712は、PCR溶液が移動する流路、
である。本実施形態における供給機構は、供給口704、バルブ706、流路712及びポンプ708を有して構成されている。また、本実施形態における排出機構は、排出口703、バルブ707、流路712及びポンプ709を有して構成されている。
102 流路
103、703 排出口
104、704 導入口
105、605、705 検出器
106、706 バルブ
107、707 バルブ
108、708 ポンプ
109、709 ポンプ
110、610、710 演算器
111、611、711 加熱冷却器
601 ホルダー
602 容器
603 処理前ケース
604 処理後ケース
607 容器搬送部
702 チャンバー
712 流路
116 バルブ
117 バルブ
Claims (7)
- 複数の標的核酸についてリアルタイムPCRによる増幅を行う方法であって、
反応領域に収納した前記標的核酸を含む複数のPCR溶液のそれぞれに温度サイクルを与えることにより前記標的核酸を増幅させる増幅工程と、
前記増幅工程により増幅された標的核酸を検出する検出工程と、
前記検出工程により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを個々のPCR溶液毎に判断する演算工程と、
前記演算工程により増幅反応が完了していると判断されたPCR溶液を前記反応領域から排出する排出工程と、
前記排出工程により排出されたPCR溶液と、前記増幅工程に供するための標的核酸を含む新たなPCR溶液とを、交換して前記反応領域に供給する供給工程と、
を有することを特徴とするリアルタイムPCR方法。 - 前記増幅工程が、前記反応領域を設けた流路中に前記複数のPCR溶液を循環させ、各PCR溶液が前記流路を1周する間に少なくとも1回の温度サイクルを与えて増幅反応を行うことを特徴とする請求項1に記載のリアルタイムPCR方法。
- 前記検出工程が、前記温度サイクルを与えた直後のPCR溶液における標的核酸を検出することを特徴とする請求項1又は2に記載のリアルタイムPCR方法。
- 複数の標的核酸についてリアルタイムPCRによる増幅を行うための装置であって、
前記標的核酸を含む複数のPCR溶液を収納し得る反応領域と、該反応領域に収納した各PCR溶液に、標的核酸の増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与機構と、を有する増幅部と、
前記増幅部により増幅された標的核酸を検出する検出部と、
前記検出部により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する演算部と、
前記演算部により増幅反応が完了していると判断されたPCR溶液を前記反応領域から排出する排出機構と、
前記排出機構により排出されたPCR溶液と、標的核酸を含む新たなPCR溶液とを交換して前記反応領域に供給する供給部と、
から構成されていることを特徴とするリアルタイムPCR装置。 - 前記検出部が、前記温度サイクルを与えた直後のPCR溶液における標的核酸を検出するように配置されたことを特徴とする請求項4に記載のリアルタイムPCR装置。
- 前記増幅部が、
前記反応領域を設けた流路と、
前記流路中に流れるPCR溶液に、前記反応領域において温度サイクルを与えることができるように、前記流路に沿って複数の温度制御手段を配置した加熱冷却器と、
前記PCR溶液を前記流路中に循環させるための循環ポンプと、
からなることを特徴とする請求項4又は5に記載のリアルタイムPCR装置。 - 前記排出機構と供給機構が、
前記流路を閉じる少なくとも二つのバルブと、
前記バルブによって前記流路から遮断された増幅反応が完了したPCR溶液を、まだ増幅反応を行っていない新たなPCR溶液に入れ替えるために使用するポンプと、
前記新たなPCR溶液を保持させておく供給口と、
前記増幅反応が完了したPCR溶液を排出する排出口と、
からなることを特徴とする請求項5又は6に記載のリアルタイムPCR装置。
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