JP2009106222A - 標的核酸のリアルタイムｐｃｒ方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲを行う場合に、反応が終了したＰＣＲ溶液を随時他のＰＣＲ溶液に交換することができる新規なリアルタイムＰＣＲ方法およびその装置を提供する。
【解決手段】温度サイクルを与えたそれぞれのＰＣＲ溶液について標的核酸の増幅量を測定し、増幅反応の進行具合を調べる。増幅反応が完了したＰＣＲ溶液は増幅反応を行う領域から排出し、換わりに未反応のＰＣＲ溶液を供給する。
【選択図】なし

Description

本発明は、標的核酸を含むＰＣＲ溶液に温度サイクルを付加することで標的核酸を増幅させ、その増幅量の変化により初期数を算出する際などに有用なリアルタイムＰＣＲの方法・装置に関する。

ゲノムシーケンスプロジェクトの進展に伴って、ゲノム上の特定遺伝子の検出、ＳＮＰｓ解析、発現解析等がポストゲノムの課題として注目されている。そのため、最近の医療、分子生物学の分野では、標的核酸の初期数を特定するために、リアルタイムＰＣＲなどの解析方法の重要性が高まっている。リアルタイムＰＣＲ法では標的核酸を含むＰＣＲ溶液に対する温度変化による増幅を繰り返し行い、増幅量の変化を測定し、その増幅量の変化を演算することによって標的核酸の初期数を特定する。

リアルタイムＰＣＲでは、増幅前にＤＮＡ染料、または蛍光プローブをＰＣＲ混合物に加えることにより増幅と産物分析が同時に行える。また、サンプル分析が、同じ装置の同じ密閉容器で増幅と同時に行われるため、密封容器からサンプルを取り出す必要がない。その結果、サンプル取り扱いの手間を省き、時間を節約し、後続反応に対し不純物混入の危険を顕著に低下させることができる。

ここで、複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲを行う場合は、特許文献１のように、標的核酸を含むＰＣＲ溶液をそれぞれ個別のウェルの中に分けて行う方法がある。または、特許文献２のように、流路に複数の標的核酸を連続的に流すことで処理を行う方法などもある。

また、特許文献３に開示されるように、標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液に対してそれぞれ個別に温度の調整を行うことで、ＰＣＲサイクルを必要以上に行わない構成とした装置もある。
特表２００５-５１５７９３ 特開２００３−１０７０９４ 特表２０００−５１１４３５

しかし、特許文献１や特許文献２に記載の方法では、それぞれのＰＣＲ溶液における標的核酸の初期数が異なるにも関わらず、すべてのＰＣＲ溶液について同じサイクル数反応を行う。そのため、標的核酸の初期数が多いＰＣＲ溶液に対しては過剰の反応を行うことになる。つまり、複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲを同時に行っているため、標的核酸の少ないＰＣＲ溶液によりＰＣＲのサイクル数が決定された場合、標的核酸の多いＰＣＲ溶液に対しては不必要な時間が発生する。

また、特許文献３に記載の方法では、標的核酸の増幅終了したＰＣＲ溶液はそのまま待機状態にあるので、所要時間は、標的核酸の少ないＰＣＲ溶液で決まる。従って、標的核酸の多いＰＣＲ溶液に対しては不必要な待機時間が発生する。

以上のように、従来の装置は、複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲを行う場合、全ての標的核酸についてＰＣＲ反応が終了するまで、次の標的核酸と交換することができなかった。したがって、本発明は、リアルタイムＰＣＲが終了した標的核酸に対して随時交換を行うことができる新規なリアルタイムＰＣＲ方法およびその装置を提供することである。

上記の目的を達成するための本発明に係る方法は、
複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行う方法であって、
反応領域に収納した前記標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液のそれぞれに温度サイクルを与えることにより前記標的核酸を増幅させる増幅工程と、
前記増幅工程により増幅された標的核酸を検出する検出工程と、
前記検出工程により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを個々のＰＣＲ溶液毎に判断する演算工程と、
前記演算工程により増幅反応が完了していると判断されたＰＣＲ溶液を前記反応領域から排出する排出工程と、
前記排出工程により排出されたＰＣＲ溶液と、前記増幅工程に供するための標的核酸を含む新たなＰＣＲ溶液とを、交換して前記反応領域に供給する供給工程と、
を有することを特徴とするリアルタイムＰＣＲ方法。

上記の目的を達成するための本発明に係る装置は、
複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行うための装置であって、
前記標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液を収納し得る反応領域と、該反応領域に収納した各ＰＣＲ溶液に、標的核酸の増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与機構と、を有する増幅部と、
前記増幅部により増幅された標的核酸を検出する検出部と、
前記検出部により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する演算部と、
前記演算部により増幅反応が完了していると判断されたＰＣＲ溶液を前記反応領域から排出する排出機構と、
前記排出機構により排出されたＰＣＲ溶液と、標的核酸を含む新たなＰＣＲ溶液とを交換して前記反応領域に供給する供給部と、
から構成されていることを特徴とするリアルタイムＰＣＲ装置。

本発明のリアルタイムＰＣＲ方法および装置により、複数の標的核酸に対して、個々の標的核酸が増幅完了に達するまで増幅を行い、完了したものを排出し、その場所に新たな標的核酸を含むＰＣＲ溶液を供給して増幅させることができる。したがって、従来よりも効率よくリアルタイムＰＣＲが可能となる。

まず、図２を用いてリアルタイムＰＣＲ法の概要を示す。ＰＣＲでは、１サイクルごとに標的核酸が指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。横軸はＰＣＲのサイクル数を表し、縦軸はＰＣＲの産物量を表している。図示の曲線は増幅曲線を示している。これはサイクルごとに増幅量をモニタリングしてグラフに示している。初発のＤＮＡ量（初期数）が多いほど、増幅産物量は早く検出可能な量に達し、増幅曲線が早いサイクルで立ち上がる。よって、段階希釈したスタンダードサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、図２のような初発ＤＮＡが多い順番から並んだ増幅曲線が得られる。サンプルは既に初期数がわかっているサンプルと比較することで初期鋳型量を知ることが出来る。

リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法の２種類がある。

インターカレーター法では一般的に蛍光試薬としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用する。インターカレーター（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。

蛍光標識プローブ法における蛍光プローブとしては、代表的なものに、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ及びサイクリングプローブがある。

インターカレーターを用いる方法は二本鎖ＤＮＡを全て検出するために、ターゲット遺伝子ごとにプローブを用意する必要がなく、検出コストが安く反応系の構築も容易だが、検出特異性はあまり高くない。反対に、蛍光標識プローブを用いる方法は、プローブ設計のための専用ソフトが必要でコストも高いが、検出特異性が高い。相同性の高い配列同士の区別やＳＮＰＳタイピングのようにマルチプレックス検出には、蛍光標識プローブが適している。

ここで、複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行うための本発明に係るリアルタイムＰＣＲ方法は、以下の工程を少なくとも有する。
（１）反応領域に供給した標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液の各々に温度サイクルを与えることにより、各ＰＣＲ溶液中で標的核酸を増幅させる増幅工程。
（２）増幅工程により増幅された標的核酸を検出する検出工程。
（３）検出工程により得られたデータから各ＰＣＲ溶液中での標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを個々のＰＣＲ溶液毎に判断する演算工程。
（４）演算工程により増幅反応が完了していると判断されたＰＣＲ溶液を反応領域から排出する排出工程。
（５）排出工程により排出されたＰＣＲ溶液と交換に、前記増幅工程に供するための他の新たな標的核酸を含むＰＣＲ溶液を反応領域に供給する供給工程。

本発明の方法によれば、複数の標的核酸について効率良くリアルタイムＰＣＲを行うことができる。つまり、増幅反応が完了したＰＣＲ溶液を選択し、そのＰＣＲ溶液を、増幅工程を行う反応領域から排出する。そして、さらにその反応領域に他の標的核酸を含む新たなＰＣＲ溶液を供給し増幅反応を行うことで、個々のＰＣＲ溶液について最適な増幅反応を行うことができ、かつ、連続して効率的に多数のＰＣＲ溶液についてリアルＰＣＲ反応を行うことができる。

標的核酸は、核酸であれば特に限定されるものではない。その由来としては、例えば、人工合成産物、ヒトやマウスなどの動物、植物、細菌、真菌、古細菌、ウイルスなどの微生物等を挙げることができる。例えば、感染症起炎菌由来の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲを行う場合、血液中に存在する細菌の核酸が標的核酸となる。これらの標的核酸は、その血液の前処理を行った後、リアルタイムＰＣＲに供することができる。なお、感染症起炎菌由来の標的核酸についてのリアルタイムＰＣＲは、その試料に含まれる標的核酸のコピー数（初期数）を測定することができるため、発症の有無の判定などに有効である。

リアルタイムＰＣＲ法では標的核酸を含むＰＣＲ溶液に対する温度変化による増幅を繰り返し行い、増幅量の変化を測定し、その増幅量の変化を演算することによって標的核酸の初期数を特定する。増幅量の変化は、増幅前にＰＣＲ溶液にＤＮＡ染料や蛍光プローブをＰＣＲ混合物に加えておき、増幅産物が発する蛍光強度を経時的に測定することにより把握することができる。

本発明で用いられるＰＣＲ溶液とは、少なくとも、増幅対象としての標的核酸及びリアルタイムＰＣＲ用試薬を含んで構成される溶液である。リアルタイムＰＣＲ用試薬は、少なくとも、標的核酸を増幅するための試薬と増幅した標的核酸の量を測定可能にする試薬を含む。標的核酸を増幅するための試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などが挙げられ、一例として以下を含む。
１．標的核酸に特異的に結合するプライマー
２．標的核酸に結合したプライマーから標的配列に相補的にＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ
３．ＤＮＡ合成に必要な各種ヌクレオチド（ｄＮＴＰなど）
４．塩化マグネシウムや塩化カリウム等の塩類
５．トリス等のバッファー
なお、プライマーやｄＮＴＰは蛍光あるいはその他の標識をしているものも含む。また、標的核酸の量を測定可能にする試薬としては、上述のように、インターカレータや蛍光プローブなどがある。

前記増幅工程とは、標的核酸を含むＰＣＲ溶液に温度サイクルを与えることによりＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ溶液中に含まれる標的核酸を増幅する工程のことをいう。ディネーチャー、アニール、エクステンションに適した温度、時間で温度サイクルを与えることにより、標的核酸を増幅することができる。

前記検出工程とは、前記増幅工程により増幅した標的核酸を、ＰＣＲ溶液から発せられる蛍光強度を測定するなどして、検出する工程である。

前記演算工程とは、前記検出工程により得られたデータを基に標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する工程である。つまり、前記増幅工程の終了時を判断する工程である。上述のように、リアルタイムＰＣＲでは、１サイクルごとに標的核酸が指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。したがって、標的核酸量がプラトーに達したことを検出することで、増幅反応の完了を確認することができる。

前記排出工程とは、前記演算工程で増幅反応が完了していると判断したＰＣＲ溶液を、前記増幅工程が行われていた反応領域から排出する工程である。この排出された増幅反応が完了したＰＣＲ溶液は別の場所に保管される、又は後工程に供されることになる。

前記供給工程とは、まだ増幅反応が行われていない他の新たな標的核酸を含むＰＣＲ溶液を増幅工程に供するために、そのＰＣＲ溶液を前記排出工程で排出されたＰＣＲ溶液と交換に反応領域に供給する工程をいう。これらの排出工程と供給工程により、増幅反応が完了したＰＣＲ溶液と未反応のＰＣＲ溶液を入れ替えることができ、リアルタイムＰＣＲを連続して効率的に続行することができる。

また、複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行うための本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置は、以下の各構成要素を少なくとも有する。
（１）複数のＰＣＲ溶液を収納し得る反応領域と、反応領域に収納した各ＰＣＲ溶液に、標的核酸の増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与機構と、を有する増幅部。
（２）増幅部により増幅された標的核酸を検出する検出部。
（３）検出部により得られたデータから標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する演算部。
（４）演算部により増幅反応が完了していると判断されたＰＣＲ溶液を、反応領域から排出する排出機構。
（５）排出機構により排出されたＰＣＲ溶液と交換に、標的核酸を含む新たなＰＣＲ溶液を反応領域に供給する供給機構。

前記増幅部は前記増幅工程を、前記検出部は前記検出工程を、前記演算部は前記演算工程を、前記排出部は前記排出工程を、前記供給部は前記供給工程をそれぞれ行う装置部分に該当する。

以下、本発明に係わるリアルタイムＰＣＲ方法及び装置の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

（第１の実施形態）
図１は本発明のリアルタイムＰＣＲ装置の好適な一例を示す模式図である。

図１において、
１０１は、基板、
１０２は、基板中に形成されたＰＣＲ溶液を流すための環状流路、
１０３は、増幅反応が完了したＰＣＲ溶液を排出する排出口、
１０４は、排出されたＰＣＲ溶液の領域に新しい標的核酸を含むＰＣＲ溶液を供給する供給口、
１０５は、標的核酸の増幅を検出する検出器、
１０６、１０７は、１１６および１１７はＰＣＲ溶液の供給又は排出を行う際に環状流路の流れを制御するバルブ、
１０８は、ＰＣＲ溶液を環状流路への導入又は環状流路からの排出を行うポンプ、
１０９は、ＰＣＲ溶液を環状流路１０２で循環させるポンプ、
１１０は、検出器１０５で得られてデータを基に増幅反応の完了の有無を算出する演算器（初期値を算出する機能も有する）、
１１１は、標的核酸を増幅させる温度サイクルを行う為の温度サイクル付与機構としての加熱冷却器、
となっている。

本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置における増幅部は、本実施形態のうち、ＰＣＲ溶液を流すための環状流路１０２、ＰＣＲ溶液を環状流路１０２に循環させるポンプ１０９及び温度サイクルを行う加熱冷却器１１１から構成される部分に該当する。また、検出部は検出器１０５、演算部は演算器１１０に該当する。また、排出機構は、排出口１０３、バルブ１０６、１０７、１１６及び１１７並びにポンプ１０８から構成される装置部分に該当する。同様に、供給機構は、供給口１０４、バルブ１０６及び１０７並びにポンプ１０８から構成される装置部分に該当する。

環状流路１０２、循環ポンプ１０９及び加熱冷却器１１１は、上述のように増幅部を構成する。この構成によれば、ＰＣＲ溶液を循環ポンプ１０９により環状流路１０２に流すことにより、環状流路１０２に接して配置された加熱冷却器により温度サイクルを与えることができる。この場合、環状流路中の加熱冷却器により温度サイクルが付与される部分が反応領域となる。反応領域は、環状流路中に少なくとも１つ設けられる。環状流路中に反応領域を一箇所設けた場合は、ＰＣＲ溶液が環状流路を１周するごとに１回の温度サイクル（熱変性、アニーリング、伸長）をＰＣＲ溶液に付与できる。環状流路中に反応領域を複数箇所設けた場合は、ＰＣＲ溶液が環状流路を１周するごとに複数回の温度サイクル（熱変性、アニーリング、伸長）をＰＣＲ溶液に付与できる。加熱冷却器は、ヒーターやペルチェ素子などの温度制御手段から構成することができる。ＰＣＲ溶液を、環状流路中を連続的あるいは半連続的（移動と停止を繰り返す）に流す場合は、ＰＣＲ溶液の流れ方向に、ヒーターを用いた加熱部と、ペルチェエ素子などを用いた冷却部との必要個数を、所定の温度サイクルを付与可能に配列して、反応領域を構成することができる。また、後述するように、ＰＣＲ溶液の循環を停止した状態で温度サイクルを付与する場合は、反応領域内のＰＣＲ溶液に所定の温度サイクルを付与できるように、ヒーターなどの加熱手段と、ペルチェ素子などの冷却手段を反応領域となる流路部分に配置する。すなわち、環状流路中の温度サイクルの付与が行われる部分が反応領域となる。つまり、加熱冷却器は複数の温度制御手段を有し、環状流路１０２を複数の異なる温度領域に分割することができる。この場合、ヒーターやペルチェ素子などの温度制御手段を有して加熱冷却器１１１が構成されており、図１では、基板１０１の下側に配置されている。

また、他の構成として、複数のＰＣＲ溶液が環状流路１０２内の反応領域内に到達した段階で循環ポンプ１０９を停止して、反応領域内に滞留するＰＣＲ溶液に少なくとも１回の温度サイクルを付与する構成を挙げることができる。この場合、まず、環状流路１０２に循環ポンプ１０９を用いて複数のＰＣＲ溶液を導入する。全てのＰＣＲ溶液が反応領域内に達したところで、循環ポンプを停止し、加熱冷却器１１１により少なくとも１回の温度サイクルを与え増幅反応を行う。増幅反応後、温度サイクルを付与したＰＣＲ溶液を検出部へ移動させて、演算のための増幅標的核酸の検出を行う。増幅が完了していたＰＣＲ溶液については新たなＰＣＲ溶液と交換する。増幅が完了していないＰＣＲ溶液及び新たなＰＣＲ溶液については、反応領域に循環ポンプで供給し、温度サイクルを付与する。この構成における環状流路１０２中の反応領域の個数は１つでもよく、複数でもよい。反応領域を複数設けた場合は、各反応領域中にＰＣＲ溶液が滞留できるように、ＰＣＲ溶液の量（体積）に応じて複数の反応領域の間隔を適宜設定する。

ここで、流路１０２には、前述のように、複数のＰＣＲ溶液を導入することができる。この場合、各ＰＣＲ溶液の間にバッファ溶液を充填する。バッファ溶液としては、ＰＣＲ溶液と比較的混じりにくく、流路に付着したＰＣＲ溶液の洗浄を行い、各ＰＣＲ溶液間のコンタミを防止することできる溶液が好ましい。例えば、バッファ溶液としては、シリコンオイルなどを用いることができる。

検出器１０５及び演算器１１０では、検出器１０５で得られたＰＣＲ溶液に関するデータを基に、各ＰＣＲ溶液について増幅反応が完了しているか否かを判断する。例えば、前記増幅部で温度サイクルが与えられたＰＣＲ溶液から発せられる蛍光強度を検出器１０５で測定し、演算器１１０で標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応の進行具合を調べる。循環ポンプ１０９を駆動させつつ検出することで、複数のＰＣＲ溶液について迅速かつ容易に増幅反応の進行具合について検査することができる。検出器１０５としては、例えば蛍光検出器が挙げられる。

本実施形態に示した排出機構部及び供給機構は、ポンプ１０８、排出口１０３、供給口１０４、バルブ１０６、１０７、１１６及び１１７を用いた機構である。ポンプ１０８によって流路１０２から増幅反応が完了したＰＣＲ溶液は排出口１０３へと排出され、新たな標的核酸を含むＰＣＲ溶液が供給口１０４から流路１０２へと供給される。ＰＣＲ溶液の供給及び排出を行う際に、バルブ１０６およびバルブ１０７を用いることで流路１０２からの流れの影響を遮断することができる。この場合におけるさらに好ましい実施形態について、図４を用いて説明する。
（ａ）流路１０２には、複数のＰＣＲ溶液と各ＰＣＲ溶液を分離するバッファ溶液が交互に充填されている。
（ｂ）供給口１０４と排出口１０３の周りを四つのバルブ１０６，１０７、１１６および１１７で囲み、増幅反応の完了が確認されたＰＣＲ溶液が流れてきた直後に、流路１０２をバルブ１０６，１０７によって閉じ、バルブ１１６、１１７を開く。
（ｃ）導入口１０３と排出口１０４に備え付けてあるポンプ１０８（不図示）を駆動してバッファ液で挟まれた増幅反応が完了したＰＣＲ溶液を排出し、そして、これから増幅を行う標的核酸を含むバッファ液で挟まれたＰＣＲ溶液の供給する。
（ｄ）バルブ１０６及び１０７を開き、バルブ１１６および１１７を閉じることで、新たなＰＣＲ溶液を流路１０２に流す。

なお、流路１０２、排出口１０３及び供給口１０４は、基板１０１中に、フォトリソグラフィや成型などの公知技術を用いることにより形成することができる。基板の材料は、特に限定されるものではないが、例えば、シリコンウェハ、石英ガラス又はプラスチックなどを用いることができる。さらに、後述のように、ポンプ１０９に進行波型マイクロポンプを用いる場合は、基板の材料はシリコンゴムを用いることが好ましい。また、図１では、流路１０２は、流路内に流すことでＰＣＲ溶液に温度サイクルを与えることができるように加熱冷却器１１１の上に形成されている。また、流路１０２は、流路抵抗の観点から環状であることが好ましい。

ＰＣＲ溶液を流路内に循環させるポンプ１０９としては、特に限定されるものではないが、例えば、進行波型マイクロポンプを用いることが好ましい。進行波型マイクロポンプは、流路１０２の壁面に微小な振動を励起して流体を搬送するため、小さな力で流体を輸送できる。また、ぜん動運動を利用しているため、比較的高い流量を得ることができる。進行波型マイクロポンプは、例えば非特許文献１に記載されているものを用いることができる。

図３に進行波型マイクロポンプの動作原理を示す。所定タイミングで順次変化する駆動信号を所定位相ずらして各駆動電極に与えることによって進行波型マイクロポンプ１０９が蠕動運動を誘起する。

ここで、図３を用いて、ポンプ１０９に進行波型マイクロポンプを適用した場合について説明を行う。進行波型マイクロポンプ１０９で標的核酸含むＰＣＲ溶液を環状の流路１０２内を移動させる。環状の流路１０２に進行波型マイクロポンプ１０９を設置し、進行波上に微小運動を繰り返し行い、標的核酸を含むＰＣＲ溶液を進行波の進行方向に輸送を行うことができる。また、進行波型マイクロポンプを用いる場合、基板１０１としては、シリコンやプラスチックなどを使用することが好ましく、流路も同様である。
圧電アクチュエータを用いた進行波型バルブレスマイクロポンプの開発、日本ＡＴＭ学会誌１３（２００５）３１０−３１５

本実施形態の特徴の一つとなるのが、図１で示す流路１０２と検出器１０５と加熱冷却器１１１とポンプ１０９とを組み合わせたことにある。流路１０２に複数のＰＣＲ溶液を導入して循環させることで、複数のＰＣＲ溶液について温度サイクルを与え増幅反応を行うことができ、さらに、増幅反応後の各ＰＣＲ溶液についてそのＰＣＲ反応の完了時を容易に把握することができるからである。つまり、複数のＰＣＲ溶液は加熱冷却器１１１による温度変化領域と検出器１０５を共通で使うことが可能であり、ＰＣＲ溶液の駆動もポンプ１０９のみであり、安価かつ単純な構造で済ませることが出来る。

そして、この実施形態が、前工程および後工程とのつながりを設けたい場合、供給口１０４を前工程とつなげ、排出口１０３を後工程とつなげることができる。これから増幅を行う標的核酸を含むＰＣＲ溶液は導入口１０４から流路１０２に入り、増幅および検出を行い、増幅が完了したものから排出口１０３より排出され後工程へと移るように構成することができる。

次に、図５のフローチャートを用いて、本実施形態の動作説明およびリアルタイムＰＣＲ方法についての説明を行う。以下の説明は、増幅部として、流路１０２に循環ポンプ１０９を用いて複数のＰＣＲ溶液を導入した後、循環ポンプを停止し、加熱冷却器１１１により少なくとも１回の温度サイクルを与え増幅反応を行う構成としたものである。

ステップＳ１として、増幅反応を行う領域（流路１０２）に標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液をバッファ溶液を介して導入する。

ステップＳ２として、増幅を行う領域にあるＰＣＲ溶液の増幅を行う。その際に、加熱冷却器１１１によってＰＣＲ溶液の温度変化を行い、標的核酸の熱変性、アニーリング、伸長反応を行う。

ステップＳ３として、増幅を行う領域にある各ＰＣＲ溶液の増幅量を検出器１０５及び演算器１１０で測定する。この際、標的核酸の増幅量は、例えば、標的核酸に付随している蛍光標識が放つ蛍光を測定することなどにより測定することができる。

ステップＳ４として、各ＰＣＲ溶液の増幅量の変化から初期数が算出できる標的核酸を含むＰＣＲ溶液が存在するかどうか判断する。存在しない場合は、ステップＳ２に戻り、各ＰＣＲ溶液について増幅反応を行う。存在する場合は、ステップＳ５に進む。

ステップＳ５として、増幅を行う領域から、初期数が算出された標的核酸を含むＰＣＲ溶液を排出する。

ステップＳ６として、増幅を行う領域以外に増幅を行っていない標的核酸を含むＰＣＲ溶液が存在するかどうかみる。存在しない場合はステップＳ８に進む。ステップＳ８に関しては後で説明する。存在する場合は、ステップＳ７に進む。

ステップＳ７として、増幅を行う領域以外から増幅を行う領域に新規な標的核酸を含むＰＣＲ溶液を増幅を行う領域に導入する。そして、ステップ２に戻り、ＰＣＲ溶液について増幅反応を継続して行う。

ステップＳ８は、ステップＳ６の判断で、他に増幅させるべき標的核酸が存在しない場合である。ステップＳ８として、排出したＰＣＲ溶液の代わりにバッファ液を導入し、ステップ９に進む。

ステップＳ９として、増幅を行う領域に標的核酸を含むＰＣＲ溶液が存在するかどうかみて、存在する場合は、ステップＳ２に戻り、ＰＣＲ溶液について増幅反応を再び行う。存在しない場合は、全体を終了する。

また、第１の実施形態において、図５における増幅を行う領域とは流路１０２のことであり、増幅を行う領域以外とは導入口１０４である。

（第２の実施形態）
本発明を適用できる構造として第２の実施形態を示す。図６は本発明のリアルタイムＰＣＲ装置の他の実施例を示す模式図である。

図６において、
６０１は、ＰＣＲ溶液が入った容器６０２を保持するホルダー、
６０２は、ＰＣＲ溶液を入れるための容器、
６０３は、増幅反応にかける前のＰＣＲ溶液が入った容器を保管する処理前ケース、
６０４は、増幅反応が完了したＰＣＲ溶液が入った容器を保管する処理後ケース、
６０５は、標的核酸の増幅を検出するための検出器、
６０７は、標的核酸を含むＰＣＲ溶液を保持した容器６０２の移動を行うための供給機構及び排出機構を兼ねる容器搬送部、
６１０は、検出器６０５で得られてデータを基に増幅反応の完了の有無を算出する演算器（標的核酸の初期値を算出する機能も有する）、
６１１は、標的核酸を増幅させるために温度変化を行う反応領域を構成する加熱冷却器、
となっている。

動作説明および方法に関しては、第１の実施形態で説明を行った図５とほぼ同一であるが、第１の実施形態に比べ、第２の実施形態では以下のような異なる点がある。

まず、第１の実施形態は、流路１０２内に複数のＰＣＲ溶液を導入して増幅および検出を行っている。それに対して、第２の実施形態は、ＰＣＲ溶液毎に容器６０２の中に入れて、その容器６０２を増幅及び検出を行うホルダー６０１内に入れることで、ＰＣＲ溶液について増幅反応および増幅した標的核酸の検出を行っている。

また、第１の実施形態では、ＰＣＲ溶液について増幅反応を行う領域への供給及び排出はポンプ１０８を使っている。それに対して、第２の実施形態では、容器搬送部６０７を使っている。

また、増幅反応において、第１の実施形態では、加熱冷却器に複数の温度制御部を設け、ＰＣＲ溶液を流路内で移動させることによって、ＰＣＲ溶液に温度サイクルを与え、増幅反応を行う構成とすることもできる。それに対し、第２の実施形態では、加熱冷却器全体を一つの温度制御部とし、その温度制御部で温度サイクルを容器６０２中のＰＣＲ溶液に与えることによって、複数のＰＣＲ溶液について増幅反応を行っている。

また、第２の実施形態において、図５における増幅を行う領域とはホルダー６０１であり、増幅を行う領域以外とは処理前ケース６０３である。

（第３の実施形態）
本発明を適用できる構造として第３の実施形態を示す。図７は本発明のリアルタイムＰＣＲ装置の他の実施形態を示す模式図である。

図７において、
７０１は、基板、
７０２は、ＰＣＲ溶液について増幅反応を行うための反応領域を構成するチャンバー、
７０３は、増幅反応が完了したＰＣＲ溶液を排出するための排出口、
７０４は、チャンバー７０２にＰＣＲ溶液を供給するための供給口、
７０５は、標的核酸の増幅を検出するための検出器、
７０６および７０７は、複数のチャンバー７０２からＰＣＲ溶液毎に使用するチャンバー７０２を選択するバルブ、
７０８および７０９は、ＰＣＲ溶液の移動を行うためのポンプ、
７１０は、検出器７０５で得られてデータを基に増幅反応の完了の有無を算出する演算器（標的核酸の初期数を算出する機能も有する）、
７１１は、チャンバー７０２に入ったＰＣＲ溶液に温度サイクルを与えるための加熱冷却器、
７１２は、ＰＣＲ溶液が移動する流路、
である。本実施形態における供給機構は、供給口７０４、バルブ７０６、流路７１２及びポンプ７０８を有して構成されている。また、本実施形態における排出機構は、排出口７０３、バルブ７０７、流路７１２及びポンプ７０９を有して構成されている。

動作説明および方法に関しては、第１の実施形態で説明を行った図５とほぼ同一であるが、第１の実施形態に比べ、第３の実施形態では以下のような異なる点がある。

まず、第一の実施形態は、共通の流路１０２内で標的核酸の増幅および検出を行っている。それに対して、第３の実施形態は、ＰＣＲ溶液毎にバルブ７０６，７０７を用いて各チャンバー７０２を割り当て、各チャンバー７０２内で標的核酸の増幅および検出を行っている。

また、増幅反応において、第１の実施形態では、加熱冷却器に複数の温度制御部を設け、ＰＣＲ溶液を流路内で移動させることによって、ＰＣＲ溶液に温度サイクルを与え、増幅反応を行う構成とすることもできる。それに対して、第３の実施形態では、加熱冷却器７１１の全体で加熱と冷却を交互に行うことによって複数のＰＣＲ溶液について増幅反応を行っている。

また、第３の実施形態において、図５における増幅を行う領域とはチャンバー７０２であり、増幅を行う領域以外とは導入口７０４である。

本発明の方法を行うのに好適な装置を示す模式図である。 リアルタイムＰＣＲの概要を示す模式図である。 本発明の液移動を示す模式図である。 本発明のＰＣＲ溶液の排出および供給を示す模式図である。 本発明のシステムの流れを示すフロー図である。 本発明の他の実施形態の一例を示す模式図である。 本発明の他の実施形態の一例を示す模式図である。

符号の説明

１０１、７０１ 基盤
１０２ 流路
１０３、７０３ 排出口
１０４、７０４ 導入口
１０５、６０５、７０５ 検出器
１０６、７０６ バルブ
１０７、７０７ バルブ
１０８、７０８ ポンプ
１０９、７０９ ポンプ
１１０、６１０、７１０ 演算器
１１１、６１１、７１１ 加熱冷却器
６０１ ホルダー
６０２ 容器
６０３ 処理前ケース
６０４ 処理後ケース
６０７ 容器搬送部
７０２ チャンバー
７１２ 流路
１１６ バルブ
１１７ バルブ

Claims (7)

1. 複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行う方法であって、
   反応領域に収納した前記標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液のそれぞれに温度サイクルを与えることにより前記標的核酸を増幅させる増幅工程と、
   前記増幅工程により増幅された標的核酸を検出する検出工程と、
   前記検出工程により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを個々のＰＣＲ溶液毎に判断する演算工程と、
   前記演算工程により増幅反応が完了していると判断されたＰＣＲ溶液を前記反応領域から排出する排出工程と、
   前記排出工程により排出されたＰＣＲ溶液と、前記増幅工程に供するための標的核酸を含む新たなＰＣＲ溶液とを、交換して前記反応領域に供給する供給工程と、
   を有することを特徴とするリアルタイムＰＣＲ方法。
2. 前記増幅工程が、前記反応領域を設けた流路中に前記複数のＰＣＲ溶液を循環させ、各ＰＣＲ溶液が前記流路を１周する間に少なくとも１回の温度サイクルを与えて増幅反応を行うことを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ方法。
3. 前記検出工程が、前記温度サイクルを与えた直後のＰＣＲ溶液における標的核酸を検出することを特徴とする請求項１又は２に記載のリアルタイムＰＣＲ方法。
4. 複数の標的核酸についてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行うための装置であって、
   前記標的核酸を含む複数のＰＣＲ溶液を収納し得る反応領域と、該反応領域に収納した各ＰＣＲ溶液に、標的核酸の増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与機構と、を有する増幅部と、
   前記増幅部により増幅された標的核酸を検出する検出部と、
   前記検出部により得られたデータから前記標的核酸の増幅量を算出し、増幅反応が完了しているか否かを判断する演算部と、
   前記演算部により増幅反応が完了していると判断されたＰＣＲ溶液を前記反応領域から排出する排出機構と、
   前記排出機構により排出されたＰＣＲ溶液と、標的核酸を含む新たなＰＣＲ溶液とを交換して前記反応領域に供給する供給部と、
   から構成されていることを特徴とするリアルタイムＰＣＲ装置。
5. 前記検出部が、前記温度サイクルを与えた直後のＰＣＲ溶液における標的核酸を検出するように配置されたことを特徴とする請求項４に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
6. 前記増幅部が、
   前記反応領域を設けた流路と、
   前記流路中に流れるＰＣＲ溶液に、前記反応領域において温度サイクルを与えることができるように、前記流路に沿って複数の温度制御手段を配置した加熱冷却器と、
   前記ＰＣＲ溶液を前記流路中に循環させるための循環ポンプと、
   からなることを特徴とする請求項４又は５に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
7. 前記排出機構と供給機構が、
   前記流路を閉じる少なくとも二つのバルブと、
   前記バルブによって前記流路から遮断された増幅反応が完了したＰＣＲ溶液を、まだ増幅反応を行っていない新たなＰＣＲ溶液に入れ替えるために使用するポンプと、
   前記新たなＰＣＲ溶液を保持させておく供給口と、
   前記増幅反応が完了したＰＣＲ溶液を排出する排出口と、
   からなることを特徴とする請求項５又は６に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。

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