JP2005253466A - 核酸増幅方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸増幅用反応物が含まれた反応物水溶液と、反応物水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を異なるインレットチャンネルを通じて反応容器内に注入させる第1段階と、反応物水溶液が流体と出合って反応容器内に流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成する第2段階と、複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応を起こす第3段階と、を備える核酸増幅方法。また、基板と、基板の内部に形成された反応容器と、基板の内部に形成され、反応容器の一端に連結されて核酸増幅用反応物が含まれた水溶液を反応容器の内部に注入するための少なくとも一つの第1インレットチャンネルと、基板の内部に形成され、反応容器の一端に連結されて、水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を反応容器の内部に注入するための第2インレットチャンネルと、基板に熱的に接触されるように設置されて基板を加熱する加熱装置と、を備える核酸増幅装置。
【選択図】図1A
Description
David J.Kempら,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.86,pp2423〜2427 E.T.Lagallyら,2001,Anal.Chem.73,pp565〜570 Martin U.Koppら,1998,Science,Vol.280,pp1046〜1048 Jill Bakerら,2003,Micro TAS,pp1335〜1338 Michihiko Nakanoら,2003,J.Biotechnology,102,pp117〜124
図1Aは、本発明の望ましい第1実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であり、図1Bは、図1Aに示された核酸増幅装置の分離斜視図である。
図2は、本発明の第2実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であり、図3及び図4は、本発明の第2実施例による核酸増幅装置及び方法を使用してPCRを行った場合、各水溶液滴から発散される蛍光シグナルについてのCCDイメージを示す図面、及びサイクル数による蛍光シグナルの強度を示すグラフである。
図5は、本発明の第3実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
図6は、本発明の第4実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
図7は、本発明の第5実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
図8は、本発明の第6実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図である。
図9A及び図9Bは、本発明の第7実施例による核酸増幅装置を概略的に示す平面図であって、図9Aは、1段階PCRを説明するための図面であり、図9Bは、2段階PCRを説明するための図面である。
前記本発明の第1実施例ないし第6実施例において、連続フローPCRを実施する場合に、反応チャンネル内には、熱伝導率が異なる反応物水溶液とオイルとが流れているので、そのそれぞれの流速と、基板の厚さ、ヒータと反応チャンネルとの間隔など設計変数の設定が必要である。
前記表1を参照すれば、PDMSと過フッ化デカリン(Perfluorodekalin(C10F18))との熱的特性が最も悪い値が示されている。
図10A及び図10Bは、2次元シミュレーション条件を説明するための概略的な増幅装置断面図である。
実験例2は、前述した2次元的な状態のシミュレーションを行った後、実際構造に近接した3次元構造についての熱的特性を解釈するためのものである。
111 上部基板
112 下部基板
120 加熱装置
121、122 ヒータ
130 反応チャンネル
131 オイル
132 水溶液滴
141、151 チャンネル
142、152 注入口
162 排出口
232 反応物水溶液滴
233 NTC水溶液滴
234 標準サンプル水溶液滴
241 第1インレットチャンネル
243 第3インレットチャンネル
249 第4インレットチャンネル
245a、245b 標準サンプルインレットチャンネル
247 蒸留水インレットチャンネル
246a、246b、248 注入口
341 第一インレットチャンネル
342、344 注入口
343 プライマーインレットチャンネル
Claims (38)
- 核酸増幅用反応物が含まれている反応物水溶液と、前記反応物水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を異なるインレットチャンネルを通じて反応容器内に注入させる第1段階と、前記反応物水溶液が前記流体と出合って、前記反応容器内に前記流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成する第2段階と、
前記複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応を起こす第3段階と、を備えることを特徴とする核酸増幅方法。 - 前記流体は、シリコンオイル、鉱物性オイル、過フッ化オイル、炭化水素オイル及び植物性オイルよりなる群から選択された少なくとも一つのオイルであることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記第3段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、PCR、LCR、SDA、NASBA、TMA及びLAMPよりなる群から選択された何れか一つの方法によって行われることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記第3段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、PCR方法によって行われることを特徴とする請求項3に記載の核酸増幅方法。
- 前記第3段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸の増幅反応は、基板全体を一定の温度に加熱及び冷却を反復することによって、核酸の増幅反応がなされるようにするPCR方法によって行われることを特徴とする請求項4に記載の核酸増幅方法。
- 前記第3段階で、前記反応物水溶液滴内での核酸の増幅反応は、基板を異なる温度を有する少なくとも二つの温度領域に加熱した状態で、前記複数の反応物水溶液滴を前記温度領域に交互に反復的に通過させることによって、核酸の増幅反応がなされるようにする連続フローPCR方法によって行われることを特徴とする請求項4に記載の核酸増幅方法。
- 独立して制御される複数のヒータを使用して前記基板を変更可能な少なくとも二つの温度領域に加熱することを特徴とする請求項6に記載の核酸増幅方法。
- 前記第1段階で、定量分析のためのネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液と標準サンプル水溶液とを、前記インレットチャンネルとはさらに異なるそれぞれのインレットチャンネルを通じて前記反応容器内に注入させ、
前記第2段階で、前記ネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液と前記標準サンプル水溶液とが前記流体と出合って、前記反応容器内に前記複数の反応物水溶液滴と共に複数のコントロール水溶液滴と複数の標準サンプル水溶液滴とを形成することを特徴とする請求項4に記載の核酸増幅方法。 - 前記第1段階で、前記標準サンプル水溶液は、少なくとも2つの濃度に調節されて前記反応容器内に注入されることを特徴とする請求項8に記載の核酸増幅方法。
- 前記第1段階で、少なくとも2種類のプライマーがそれぞれ含まれている少なくとも二種類の反応物水溶液が、異なるインレットチャンネルを通じて前記反応容器内に注入されることを特徴とする請求項4に記載の核酸増幅方法。
- 前記第1段階で、核酸水溶液、重合酵素とdNTPとを含む共通成分及びプライマーをそれぞれのインレットチャンネルに注入し、これらが前記反応容器に注入される直前に混合されて前記反応物水溶液を形成するようにすることを特徴とする請求項4に記載の核酸増幅方法。
- 前記反応容器は、二つの1次反応チャンネルと、前記二つの1次反応チャンネルそれぞれの末端に連結される一つの2次反応チャンネルとからなり、前記第1段階、第2段階及び第3段階は、前記二つの1次反応チャンネルそれぞれについて行われ、
前記第3段階以後に、
前記2次反応チャンネルの開始端で前記複数の反応物水溶液滴が合わせられて前記2次反応チャンネル内に複数の合わせられた反応物水溶液滴を形成する第4段階と、
前記複数の合わせられた反応物水溶液滴内で再び核酸の増幅反応を起こす第5段階と、をさらに備えることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。 - 前記反応容器は、少なくとも一つの反応チャンバよりなり、
前記第3段階以後に、
前記反応チャンバ内の前記複数の反応物水溶液滴を合わせる第4段階と、
前記合わせられた反応物水溶液滴内で再び核酸の増幅反応を起こす第5段階と、をさらに備えることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。 - 前記第4段階で、前記複数の反応物水溶液滴は、遠心分離によって合わせられることを特徴とする請求項13に記載の核酸増幅方法。
- 基板と、
前記基板の内部に形成された反応容器と、
前記基板の内部に形成され、前記反応容器の一端に連結されて、核酸増幅用反応物が含まれた水溶液を前記反応容器の内部に注入するための少なくとも一つの第1インレットチャンネルと、
前記基板の内部に形成され、前記反応容器の一端に連結されて、前記水溶液と相分離されて増幅反応に関与しない流体を前記反応容器の内部に注入するための第2インレットチャンネルと、
前記基板に設置されて前記基板を加熱する加熱装置と、を備え、
前記反応物水溶液が前記流体と出合って前記反応容器内に前記流体によって取り囲まれた複数の反応物水溶液滴を形成し、前記複数の反応物水溶液滴内で核酸の増幅反応が起こるようにしたことを特徴とする核酸増幅装置。 - 前記流体は、シリコンオイル、鉱物性オイル、過フッ化オイル、炭化水素オイル及び植物性オイルよりなる群から選択された少なくとも一つのオイルであることを特徴とする請求項15に記載の核酸増幅装置。
- 前記基板は、疎水性の表面性質を有することを特徴とする請求項15に記載の核酸増幅装置。
- 前記基板は、PDMS、シリコン、二酸化ケイ素、プラスチック及びガラスよりなる群から選択された何れか一つの物質よりなることを特徴とする請求項17に記載の核酸増幅装置。
- 前記基板は、下部基板及び上部基板よりなり、前記下部基板と上部基板との間に前記反応容器、第1インレットチャンネル及び第2インレットチャンネルが形成されることを特徴とする請求項15に記載の核酸増幅装置。
- 前記水溶液滴内での核酸増幅反応は、PCR、LCR、SDA、NASBA、TMA及びLAMPよりなる群から選択された何れか一つの方法によって行われることを特徴とする請求項15に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応物水溶液滴内での核酸増幅反応は、PCR方法によって行われることを特徴とする請求項20に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応容器は、蛇行曲線型の反応チャンネルであり、前記反応チャンネルの開始端に前記第1インレットチャンネルと第2インレットチャンネルとが連結され、前記反応チャンネルの末端に前記流体と増幅産物とを排出させるための排出口が設けられたことを特徴とする請求項21に記載の核酸増幅装置。
- 前記加熱装置は、前記基板の下部に配置されて前記基板を異なる温度を有する少なくとも二つの温度領域に加熱する少なくとも二つのヒータを有することを特徴とする請求項22に記載の核酸増幅装置。
- 前記加熱装置は、前記基板を変更可能な少なくとも二つの温度領域に加熱できるように、前記基板の下部に互いに平行に配置され、独立して制御される複数のヒータを有することを特徴とする請求項22に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応チャンネルは、前記温度領域を交互に反復的に通過するように形成されることを特徴とする請求項23に記載の核酸増幅装置。
- 前記第2インレットチャンネルは、前記反応チャンネルの開始端から直線状に延びるように形成され、前記第1インレットチャンネルは、前記第2インレットチャンネルに対して直交するように形成されることを特徴とする請求項22に記載の核酸増幅装置。
- 前記基板の内部に形成され、前記反応チャンネルの一端に連結されて、定量分析のためのネガティブコントロール及びポジティブコントロールのうち少なくとも一つの水溶液を前記反応チャンネルの内部に注入するための第3インレットチャンネルと、
前記基板の内部に形成され、前記反応チャンネルの一端に連結されて、定量分析のための標準サンプル水溶液を前記反応チャンネルの内部に注入するための第4インレットチャンネルと、をさらに備えることを特徴とする請求項22に記載の核酸増幅装置。 - 前記第4インレットチャンネルには、標準サンプルがそれぞれ注入される少なくとも二つの標準サンプルインレットチャンネルと、前記標準サンプルを所定濃度に希釈するための蒸溜水が注入される蒸溜水インレットチャンネルが連結されたことを特徴とする請求項27に記載の核酸増幅装置。
- 前記第4インレットチャンネルは、蛇行曲線を特徴とする請求項28に記載の核酸増幅装置。
- 前記第1インレットチャンネルは、少なくとも二つが形成され、前記少なくとも二つの第1インレットチャンネルに異なる種類のプライマーを注入するための少なくとも二つのプライマーインレットチャンネルが前記少なくとも二つの第1インレットチャンネルにそれぞれ連結されたことを特徴とする請求項22に記載の核酸増幅装置。
- 前記少なくとも二つの第1インレットチャンネルそれぞれは、蛇行曲線を特徴とする請求項30に記載の核酸増幅装置。
- 前記第1インレットチャンネルには、前記第1インレットチャンネルにプライマーを注入するためのプライマーインレットチャンネルと、前記第1インレットチャンネルに重合酵素とdNTPとを含む共通成分を注入するための共通成分インレットチャンネルが連結されることを特徴とする請求項22に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応チャンネルの開始端の近くの一部分は、蛇行曲線を特徴とする請求項32に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応容器は、蛇行曲線型の二つの1次反応チャンネルと、前記二つの1次反応チャンネルそれぞれの末端に共に連結されて蛇行曲線型の一つの2次反応チャンネルとからなり、前記第1インレットチャンネルと第2インレットチャンネルとは、前記二つの1次反応チャンネルの開始端に連結されることを特徴とする請求項15に記載の核酸増幅装置。
- 前記加熱装置は、前記二つの1次反応チャンネル及び一つの2次反応チャンネルそれぞれに二つの温度領域を提供できるように、前記基板の底面に配置され、独立して制御される複数のヒータを有することを特徴とする請求項34に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応容器は、反応チャンバであり、前記反応チャンバの一端に前記第1インレットチャンネルと第2インレットチャンネルとが連結され、前記反応チャンバの他端に前記流体と増幅産物とを排出させるためのアウトレットチャンネルが連結されたことを特徴とする請求項15に記載の核酸増幅装置。
- 前記反応チャンバ、前記第1インレットチャンネル、前記第2インレットチャンネル及び前記アウトレットチャンネルは、それぞれ複数個が形成されたことを特徴とする請求項36に記載の核酸増幅装置。
- 前記加熱装置は、前記基板の下部に配置されて前記基板全体を所定温度に加熱する一つのヒータを有することを特徴とする請求項36に記載の核酸増幅装置。
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