JP2003505059A - 連続流マイクロ流体デバイスにおける生化学的プロトコルの集積化 - Google Patents

連続流マイクロ流体デバイスにおける生化学的プロトコルの集積化

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Abstract

(57)【要約】 サンプル流のための少なくとも1つの経路を含むマイクロ流体基板、および少なくとも２つの温度の間で循環することが可能である少なくとも1つの熱伝達部材を含むデバイスを提供する。熱伝達部材は、サンプルが前記サンプル経路の少なくとも一部に沿って連続的に流動している間に該サンプル経路の少なくとも一部を加熱するように適応される。そのようなデバイスを使用して生化学的プロトコルを行う方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術背景） マイクロ流体学は解析および反応を行うために試験管またはマイクロプレート
の代わりにマイクロチャンネルを使用することからなる。これらのマイクロチャ
ンネルまたはマイクロ回路はケイ素、石英、ガラス、セラミクスまたはプラスチ
ックにエッチングされる。これらのチャンネルのサイズはマイクロメートルのオ
ーダーである一方、反応容積はナノリットルまたはマイクロリットルのオーダー
である。マイクロ流体デバイスの原理は、試薬およびサンプルを含有する反応媒
体をプロトコルの異なる工程に対応する帯域に誘導することである。反応部、ク
ロマトグラフィーカラム、キャピラリー電気泳動システムおよび小型検出システ
ムをこれらのマイクロ流体システムに組み込むことは、それらを単一のシステム
に組み込むことによって複雑なプロトコルの自動化を可能にする。これらの「チ
ップ上の検査室」は、反応速度、生産費用および携帯可能なデバイスの開発を可
能にするミニチュアにおいて効率的な結果を得ることができる。しばしば高価な
操作を必要とする生化学的または分子生物学的プロトコルを含む複雑なプロトコ
ルは集積化され、自動化されている。これらの操作には、試薬およびサンプルの
混合、反応温度の制御、熱循環の実施、電気泳動による分離、および反応生成物
の検出が含まれる。
【０００２】 Wolleyら、(Anal. Chem. 68: 4081-4086 (1996))はPCRマイクロ反応部、キャ
ピラリー電気泳動システムおよび検出器の単一デバイスへの組込みについて開示
している。PCR反応、電気泳動によるPCR産物の分離、およびPCR産物の検出は自
動的に行われる。しかし、本デバイスには試薬の混合工程が組み込まれておらず
、本デバイスでは大規模なプロトコルを実施することができない。
【０００３】 試薬の混合および酵素反応の工程を組み込むことが可能なデバイスまたは基板
についてはHaddら、( Anal. Chem. 69,3407-3412, (1997))が記載している。本
デバイスは、ガラス基板にエッチングされたチャンネルのマイクロ回路および貯
蔵部を提供する。液体の移動および混合は動電学によって生じる。
【０００４】 プロトコルおよび解析を組み込むためのマイクロ流体システムについては、国
際特許出願WO 98/45481に記載されている。これらのデバイスを完成する際の困
難な点の1つは、液体の移動である。液体は一般に、電極の回路網を必要とする
電気浸透または動電学によって移動する。他のシステムでは、マイクロ流体基板
に組み込まれたマイクロポンプおよびマイクロバルブが使用されている。大部分
の場合、マイクロ反応部で静止していた液体がプロトコルの各工程で1つの反応
部からもう1つの反応部に異動する間に反応が行われる。電極、マイクロバルブ
またはマイクロポンプが組み込まれたこれらのシステムは非常に費用が高く、ま
た複雑であるため極めて多数のサンプルを同時に処理するために大規模に適用す
ることができない。主な困難の1つは、分配、混合および並列または直列状態に
ある極めて多数の生成物の輸送である。
【０００５】 従って、多数の液体の操作が可能であり、多数の複雑なプロトコル、特に熱処
理を含むプロトコルを低いコストで行うことが可能であるマイクロ流体基板を含
むデバイスの開発が必要である。
【０００６】 （発明の概要） 本発明は、プロトコルを構成する反応または一連の反応が行われる少なくとも
1つのマイクロチャンネルを含むマイクロ流体基板を含むデバイスを提供する。
【０００７】 本発明は、プロトコルを構成する反応または一連の反応が行われる少なくとも
1つのマイクロチャンネルを含むマイクロ流体基板を提供し、ここで、連続流に
おいて該チャンネルに供給される。
【０００８】 マイクロ流体基板と熱支持体とを組み合わせると、プロトコルの様々な工程に
対応するチャンネルの異なる帯域において反応温度を制御することが可能である
。本発明は、熱循環帯域上の連続流において熱循環を行うのに有利なデバイスお
よび方法に関する。
【０００９】 該デバイスは、静水圧による液体の分配および移動のためのシステムに基づく
。プロトコルのすべての工程は連続流において行われ、ここで、サンプルおよび
試薬を連続的に注入することによって、同一のチャンネルで交互に多数の反応を
行うことが可能である。試薬は、プロトコルの異なる段階で連続的に注入するこ
とができる。いくつかのチャンネルを並列に配置することによって、同一のチャ
ンネルで直列におよび様々なチャンネルで並列に同じプロトコルを行うことが可
能である。並列に配置されたチャンネルにおいて反応を同期化することによって
、試薬を同時に様々なチャンネルに分配させることが可能である。このような配
置は処理能力の改善および実施されるべき分配数の減少に特に有利な適用である
。
【００１０】 本発明のマイクロ流体基板は、好ましくは、半使い捨て（数百回の反応または
数十時間の使用）であり、取り外し可能な様式で熱支持体、液体供給デバイスお
よび検出手段が追加されている。温度の制御、液体の移動、試薬の注入、連続流
におけるよう液の混合および検出は完全に自動化されている。さらに、永久デバ
イスと使い捨てで比較的安価なマイクロ流体基盤とを組み合わせると、すべてが
同一のマイクロ流体デバイスに組み込まれているシステムに比べてコストを相当
軽減することが可能である。
【００１１】 本発明の1つの実施態様は、サンプル流のための少なくとも1つの経路および少
なくとも2つの温度管で循環可能な少なくとも1つの熱伝達部材を含むデバイスで
あって、前記少なくとも１つの熱伝達部材は、サンプルが前記サンプル経路の少
なくとも一部に沿って連続的に流動している間に前記サンプル経路の少なくとも
一部を前記少なくとも2つの温度にするように適応される。本実施態様のいくつ
かの態様では、デバイスは、前記サンプル流のための少なくとも1つの経路に作
動可能に連結された力供給部材をさらに含み、ここで、前記力供給部材は、前記
サンプルが前記少なくとも1つの経路に沿って移動するように前記サンプルに力
を適用する。該デバイスは、前記少なくとも1つの経路にサンプルを供給するサ
ンプル供給部を含んでもよい。該デバイスはまた、前記サンプル供給部が前記入
力容器に前記サンプルを供給し、前記サンプルが入力容器から前記少なくとも1
つの経路に移動するように前記少なくとも1つの経路の第1の末端に配置された少
なくとも1つの入力容器をさらに含んでもよい。該デバイスはまた、前記経路の
第2の末端に配置された少なくとも1つの出力容器をさらに含んでもよい。本発明
のいくつかの態様では、デバイスは前記入力容器と前記出力容器との間に配置さ
れた少なくとも1つの試薬供給部をさらに含む。本発明の他の態様では、デバイ
スは複数の前記経路を含む。該経路は並列に配置されたチャンネルを含んでもよ
い。前記力供給部材によって作り出される力は圧力であってもよい。マイクロ流
体基板は本質的にケイ素からなるもであり得る。該デバイスは前記生物学的サン
プルの物理化学特性を測定するための検出器をさらに含む。熱伝達部材は、前記
少なくとも2つの温度で水を含有する複数の水供給源と流体連絡している金属棒
を含んでもよく、前記金属棒は前記経路の少なくとも一部と熱連絡している。
【００１２】 本発明のもう1つの実施態様は、生化学的または化学的プロセスための試薬を
含むサンプルが前記少なくとも1つのサンプル流経路の少なくとも一部を通って
流動している間、少なくとも2つの温度の間で少なくとも1つのサンプル流経路の
少なくとも一部を循環させることを含む、生化学的または化学的プロセスを行う
方法である。該サンプル流経路はマイクロ流体基板に設置されてもよい。前記サ
ンプルが前記少なくとも1つのサンプル流経路の少なくとも一部を通って連続的
に流動している間、該サンプル流経路は前記少なくとも2つの温度の間で循環す
る少なくとも1つの熱伝達部材と熱連絡してもよい。前記サンプルが前記少なく
とも1つのサンプル流経路の少なくとも一部を通って連続的に流動している間、
前記熱伝達部材は少なくとも2つの温度を通して複数回循環してもよい。前記サ
ンプルが前記少なくとも1つのサンプル流経路の少なくとも一部を通って連続的
に流動している間、該熱伝達部材は少なくとも２つの温度を通して約2回〜約35
回循環してもよい。本実施態様のいくつかの態様では、複数のサンプルが前記サ
ンプル流経路を通って同時に流動している間、複数のサンプル流経路の少なくと
も一部は前記少なくとも2つの温度の間で同時に循環される。該生化学的または
化学的反応は核酸増幅手順を含んでもよい。
【００１３】 核酸増幅手順はポリメラーゼ連鎖反応を含んでもよい。該方法は、前記核酸増
幅手順の生成物中の少なくとも1つの多型性ヌクレオチドの同一性を決定するこ
とを含んでもよい。
【００１４】 本発明のもう1つの実施態様は、少なくとも1つのサンプルに対する生化学的プ
ロトコルを行うための方法であって、少なくとも1つのチャンネルに少なくも1つ
のサンプルを含有する溶液の連続流を供給する工程、試薬貯蔵部から少なくとも
1つの試薬を前記チャンネルに注入し、それによって前記サンプルと前記試薬と
を混合する工程、および少なくとも1つの熱支持体と前記少なくとも1つのチャン
ネルの少なくとも1つの温度調節部分との間で熱を伝達させる工程を含む方法で
ある。該供給工程は、前記少なくとも1つのチャンネルの供給容器と前記少なく
とも1つチャンネルの出力容器との間に圧力差をかけることを含んでもよい。該
方法は、前記少なくとも1つのチャンネルにおける前記サンプルの少なくとも1つ
の物理化学的パラメータを検出することをさらに含んでもよい。該方法のいくつ
かの態様では、前記溶液が前記少なくとも1つのチャンネルの前記少なくとも1つ
の温度調節部分を通って走行するとき、前記溶液の温度は予め決定されたレベル
に調節される。該方法は、少なくとも2つの異なる温度を通して前記少なくとも1
つの熱支持体を循環させることをさらに含んでもよい。溶液が前記少なくとも1
つのチャンネルの前記少なくとも1つの部分を通って走行している間、該循環は1
回〜35回反復されてもよい。該方法の他の態様では、セパレータによって分離さ
れた複数のサンプルは前記少なくとも1つのチャンネルに連続的に導入される。
該方法のいくつかの態様では、前記供給工程、前記注入工程、および前記伝達工
程は、並列に配置された複数のチャンネル上で同時に行われる。
【００１５】 本発明のもう１つの実施態様は、少なくとも1つのサンプルを含有する溶液に
対する少なくとも1つの温度サイクルを連続流において行うための方法であって
、少なくとも1つのチャンネルに前記溶液の連続流を供給する工程、少なくとも1
つの温度調節帯域を通して前記溶液を走行させる工程、および前記溶液が少なく
とも1つの温度調節帯域を通って1回走行するときに少なくとも1回は前記温度サ
イクルを経験するように、予め決定された時間系列で少なくとも2つの温度の温
度サイクルを通して前記少なくとも1つの温度調節帯域を連続的に循環させる工
程を含む方法である。該方法は、前記チャンネルにおける前記サンプルの少なく
とも１つの物理化学的パラメータを検出することをさらに含んでもよい。前記供
給工程は、前記少なくとも1つのチャンネルの供給容器と前記少なくとも1つチャ
ンネルの出力容器との間に圧力差をかけることを含んでもよい。前記供給工程は
、セパレータによって分離された複数のサンプルによって連続的に反復されても
よい。該方法のいくつかの態様では、前記供給工程、前記走行工程および前記循
環工程は、並列に配置された複数のチャンネル上で同時に行われる。
【００１６】 本発明のもう1つの実施態様は、核酸を増幅するための方法であって、a）前記
核酸を含む少なくとも1つのサンプルと核酸を増幅させるのに適切な試薬とを混
合して少なくとも1つの反応混合物を形成させる工程、b）少なくとも1つのチャ
ンネルに前記少なくとも1つの反応混合物の連続流を供給する工程、c）少なくと
も1つの温度調節帯域を通して前記少なくとも1つの反応混合物を走行させる工程
、ならびにd）予め決定された時間系列で少なくとも2つの温度の温度サイクルを
通して前記温度調節帯域を循環させる工程であって、ここで、少なくとも2つの
温度、温度サイクルの持続時間、および前記走行の速度は、前記少なくとも1つ
の核酸サンプルが前記少なくとも1つの温度調節帯域を介して流動する間に1回以
上の変性−ハイブリダイゼーション−伸長サイクルを経験するように予め選択さ
れる、上記工程を含む方法である。前記供給工程は、前記少なくとも1つのチャ
ンネルの供給容器と前記少なくとも1つチャンネルの出力容器との間に圧力差を
かけることを含んでもよい。該チャンネルは、マイクロ流体基板に形成されても
よい。該前記マイクロ流体基板は、本質的にケイ素からなるものであってもよい
。該方法のいくつかの態様では、前記供給工程は、セパレータによって分離され
た複数の核酸サンプルによって連続的に反復される。該方法の他の態様では、工
程a）、b）、c）およびd）は、並列に配置された複数のチャンネル上で同時に行
われる。
【００１７】 本発明のもう1つの実施態様は、少なくとも1つの標的核酸中の少なくとも1つ
のヌクレオチドを連続流において同定するための方法であって、a）チャンネル
に前記少なくとも1つの標的核酸を含む溶液の連続流を供給する工程、b）マイク
ロシークエンシング用緩衝液、少なくとも1つのマイクロシークエンシング用プ
ライマー、少なくとも1つのddNTPおよびポリメラーゼを含むマイクロシークエン
シング用試薬を前記チャンネルに注入し、それによって前記核酸溶液と前記試薬
とを混合する工程、c）前記少なくとも1つの標的核酸の変性、前記核酸と前記少
なくとも1つのマイクロシークエンシング用プライマーとのハイブリダイゼーシ
ョン、および前記プライマーの３’末端で同定しようとするヌクレオチドに相補
的なddNTPの取り込みを含む少なくとも1つのサイクルが生じるように少なくとも
1つの温度調節帯域を通して該溶液を走行させる工程、ならびにd）マイクロシー
クエンシング用プライマーの３’末端に取り込まれているヌクレオチドを同定す
る工程を含む方法である。該供給工程は、前記チャンネルの供給容器と前記チャ
ンネルの出力容器との間に圧力差をかけることを含んでもよい。該方法は、少な
くとも1つのヌクレオチドを同定する前記方法を実施する前に上記の方法を使用
して前記少なくとも1つの標的核酸を増幅することさらに含んでもよい。該ddNTP
は発蛍光団で標識してもよく、取り込まれたddNTPの蛍光を検出することができ
る。該供給工程、前記注入工程および前記走行工程は、並列に配置された複数の
チャンネルに対して同時に行われてもよい。
【００１８】 本発明のもう1つの実施態様は、少なくとも1つの標的核酸中の少なくとも1つ
のヌクレオチドを連続流において検出するための方法であって、a）少なくとも1
つの標的核酸を含有する溶液の連続流をチャンネルに供給する工程、b）検出し
ようとする少なくとも1つのヌクレオチドを担持する少なくとも1つの標的核酸の
領域を増幅するための試薬を第1の試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入する工
程、c）該核酸が1回以上の変性−ハイブリダイゼーション−伸長サイクルを経験
するような方式で少なくとも1つの温度調節帯域を通して該溶液を走行させる工
程、d）増幅産物を精製するための試薬を第2の試薬貯蔵部から前記チャンネルに
注入する工程、e）少なくとも1つの温度調節帯域を通して該溶液を走行させて精
製反応を行う工程、f）マイクロシークエンシング用緩衝液、少なくとも1つのマ
イクロシークエンシング用プライマー、少なくとも1つのddNTPおよびポリメラー
ゼを含むマイクロシークエンシング用試薬を第３の試薬貯蔵部から前記チャンネ
ルに注入する工程、g）標的核酸の変性、前記核酸と少なくとも1つのマイクロシ
ークエンシング用プライマーとのハイブリダイゼーション、および前記プライマ
ーの３’末端で検出しようとするヌクレオチドに相補的なddNTPの取り込みを含
む少なくとも1つのサイクルが生じるような方式で少なくとも1つの温度調節帯域
を通して反応混合物を走行させる工程、ならびにh）マイクロシークエンシング
用プライマーの３’末端に取り込まれる少なくとも1つのddNTPを検出する工程を
含む方法である。該供給工程は、前記チャンネルの供給容器と前記チャンネルの
出力容器との間に圧力差をかけることを含んでもよい。該方法のいくつかの態様
では、工程c）およびe）において、温度調節帯域を、少なくとも1つのサイクル
を形成する時間系列で連続的に少なくとも２つの温度に至らせる。該ddNTPは発
蛍光団で標識してもよく、工程h）において取り込まれたddNTPの蛍光を検出する
ことができる。精製のための試薬は、エキソヌクレアーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼを含んでもよい。該方法のいくつかの態様では、工程a）、b）、c）、d
）、e）、f）、g）およびh）は並列に配置された複数のチャンネル上で同時に行
われる。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、サンプル流のための少なくとも1つの経路を含むマイクロ流体基板
、および少なくとも２つの温度の間で循環することが可能である少なくとも1つ
の熱伝達部材を含むデバイスに関する。熱伝達部材は、サンプルがサンプル経路
の一部に沿って連続的に流動している間、少なくとも1つのサンプル経路の一部
を少なくとも２つの温度に過熱または冷却するように適応される。熱伝達部材は
、少なくとも1つのサンプル経路の少なくとも一部を、周囲温度を含む任意の所
望の温度に加熱または冷却することができる。いくつかの実施態様では、経路は
チャンネルであってもよい。様々な実施態様では、本発明の化学的、生化学的、
および生物学的分析デバイスは、サンプルを注入するための供給容器および前記
サンプルを回収するための出力容器を有する少なくとも1つのチャンネル、なら
びに連続流において前記チャンネルに供給するための手段を含むマイクロ流体基
板を含む。「供給容器」および「出力容器」は、チャンネルの入出力および出力
における任意のタイプの貯蔵部、接続部またはオリフィスを意味することを意図
する。本明細書で使用される「生化学的」は、少なくとも1つの基板および少な
くとも1つの酵素を用いる反応、プロセス、ならびにプロトコルを指す。例えば
、用語「生化学的」は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの核酸増幅、マイク
ロシークエンシングなどの遺伝子型決定、または核酸の配列決定に関連するがこ
れらに限定されないプロトコルを指すために使用することができる。また、用語
「生化学的」には酵素によって触媒される他の反応も含まれる。本明細書で使用
される「化学的」は、少なくとも1つの工程において酵素触媒を用いない化学的
反応、プロセス、またはプロトコルを指す。例えば、用語「化学的」は、酵素触
媒に関与しない少なくとも1つの工程を有する有機もしくは無機分子合成または
分解反応を指すために使用することができる。本明細書で使用される「生物学的
」は、生体材料を含む反応、プロセス、またはプロトコルを指す。例えば、用語
「生物学的」は、単一細胞、単一細胞の培養物、粘着細胞の集団培養物、単一細
胞もしくは複数細胞からなる生物、または組織もしくは器官の部分を含むがこれ
らに限定されないプロセスを指すために使用することができる。本明細書におい
て使用される用語「生物学的」は、単一細胞または複数細胞を含む真核細胞、お
よび細菌、またはウイルスを含む真核細胞を包含する。
【００２０】 用語「マイクロ流体基板」は、サンプル経路（チャンネルなど）、容器または
貯蔵部がマイクロ製造されている固体支持体を指す。典型的に、固体支持体はケ
イ素ガラスもしくは石英またはプラスチックを含むか、該材料から本質的になる
かまたは該材料からなることができる。固体支持体は、ポリメタクリル酸メチル
（PPMA）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（Teflon(登録商標)
）、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリジメチルシロキサン（PDMS）またはポリスル
ホンなどの高分子材料から作製することができる。本明細書で使用される用語「
マイクロ流体デバイス」は、マイクロ流体基板を含むデバイスを指す。
【００２１】 本発明の有利な実施態様によれば、マイクロ流体基板はケイ素から作製される
。さらに、マイクロ製造およびケイ素のエッチングの技術は周知であり、従って
良好に規定された寸法および形態でチャンネルを製造することができる。ケイ素
基板を適合させるためのこれらの技術は、特に化学的エッチング技術を含む。典
型的に、マイクロ流体デバイスでは、平面基板の表面に作製された一体型チャン
ネルネットワークが用いられる。第2の基板は、該基板において形成される相補
的チャンネルを有してもまた有していなくてもよいが、該基板は、チャンネルを
被覆および密封するために第1の基板の表面上を覆い、それによってチャンネル
を規定する。
【００２２】 また、ケイ素はその熱特性のために利点を有する。ケイ素は極めて良好な熱伝
導体であり、熱伝導率が150 W/mKである。熱伝導率が高いと、マイクロ流体基盤
の迅速な温度変化を可能にすることができる。これとは対照的に、プラスチック
の熱伝導率は、一般にケイ素よりも約100〜300倍低い。ガラスおよび石英は良好
な熱伝導体であるが、高い精度でエッチングするにはケイ素より困難である。従
って、ケイ素は熱源との接触時に迅速に応答するためプラスチックよりも好まし
く、また製造が容易であるためガラスおよび石英よりも好ましい。しかし、ケイ
素以外の材料を用いてもよいことも理解されるであろう。
【００２３】 ケイ素が有利な基板材料として提示される一方、基板材料は広範な適切な材料
から選択することができる。さらに、マイクロ流体基板は、１を超えるタイプの
材料がマイクロ流体基板で使用されるように１を超える帯域からなり得る。1つ
の実施態様では、マイクロ流体基板は第1の材料からなり、マイクロ流体基板の
熱帯域は第2の材料からなる。例えば、マイクロ流体基板は、熱帯域で使用され
る第2の材料（例えば、ケイ素）よりも低い熱伝導率を有する材料（例えば、プ
ラスチック）からなるものであってもよい。この方法では、温度調節帯域におい
て熱交換を増強することができ、および／または温度調節帯域間に隔離帯域を形
成することができる。
【００２４】 マイクロ流体デバイスの用途に応じて任意の所望の基準に従い基板材料を選択
することができる。一般に、基板材料の熱および物理化学的特性に従って基板材
料を選択することができる。
【００２５】 本明細書にさらに記載のように、熱伝導率は温度調節帯域のため、循環温度ま
たは一定温度帯域のために使用される材料の重要な特徴である。高い熱伝導率は
、温度間の短い転移時間を有するべきである温度調節帯域のために特に所望され
る。熱伝導率はまた、温度調節帯域に接続するために使用される材料、またはチ
ャンネルが配置されている材料であって、この場合に温度調節帯域にチャンネル
が配置されない材料（良好な熱隔離部であるべきであることが好ましい）に重要
であり、このため温度調節帯域間に必要な距離が減少する。
【００２６】 マイクロ流体基板で使用される材料は、加熱あるいは冷却時の熱膨張および／
または収縮に基づいて選択することもできる。特に異なるタイプの材料を含む２
つ以上の帯域をマイクロ流体基板に使用する場合、加熱時の膨張係数が材料に類
似するように材料を選択することができる。
【００２７】 また、材料は、熱特性に加えて、物理化学的特性に基づいて選択される。特に
、基板材料は、それらが基板の特定のアプリケーションに生体適合性であるよう
に選択される。生体適合性は、典型的に、マイクロ流体基板において行われる反
応もしくは操作を妨害するかまたはそれらに影響する材料の傾向を指す。反応ま
たは操作の妨害は、一般に試薬の吸着または反応阻害物質の溶解（生物学的反応
を阻害する金属イオンの溶解など）に関与する。マイクロ流体基板におけるチャ
ンネルの表面対容積比が高いため、表面材料の生体適合特性は基板材料の重要な
面である。同様に、試薬濃度に関連する全表面積を考慮することもできる。例え
ば、比較的小さな全表面積を有するより低い生体適合性の材料は、（吸着現象に
よって）全試薬濃度に有意に影響することは予測されないため、マイクロ流体基
板での使用のために選択することができる。
【００２８】 さらなる実施態様では、マイクロ流体基板表面は、所望の表面生体適合性が達
成されるように処理することができる。一例において、本明細書に記載のように
マイクロ流体基板表面（例えば、チャンネル表面）はシリコーン処理される。
【００２９】 もう1つの態様では、マイクロ流体基板の選択に材料の表面濡れ特性を考慮す
ることができる。チャンネル内の水溶液を使用する場合、典型的に非極性である
生体適合性表面は、マイクロ流体基板材料としての使用に適切である。他の実施
態様では、１を超える材料からマイクロ流体デバイスを組み立てる場合、材料が
目的のアプリケーションについて機械的に耐性であり、生体的合成であり、同様
の極性を有し、従って生物学的溶液が該材料を同様に濡らすような形式で材料を
選択すべきである。
【００３０】 さらに、基板材料が非多孔性であり、従って該材料によるチャンネル内におけ
る気泡の形成および表面上における試薬の吸着の増大が回避されるように基板材
料を選択することができる。
【００３１】 本発明の特に有利な実施態様によれば、マイクロ流体基板は並列に配置された
複数のチャンネルを含み、各供給容器はそれぞれ該チャンネルによって出力容器
に接続されている。典型的には、数百のチャンネルが同一のマイクロ流体基板上
で並列に配置される。従って、各チャンネルで並列に所定のプロトコルを行うこ
とができる。各チャンネルで異なるプロトコルを行うことも可能である。しかし
、特に試薬の注入の自動化を容易にするためには、すべてのチャンネルで同じプ
ロトコルを行うことがより有利である。
【００３２】 典型的に基板は平面支持体に配置されるチャンネルであるが、基板の他の実施
態様には、例えば、薄い基板層を有する管状キャピラリーなどの薄い支持体に配
置されるキャピラリーチャンネルが含まれ、ここで、該キャピラリーは遊離また
は物理的に並列に連結されることができる。熱支持体を有するキャピラリーの使
用のための広範な形式を使用してもよい。例えば、キャピラリー中の溶液を少な
くとも２つの温度にすることが可能な熱支持体を中心に独立したキャピラリーを
配置することができる。
【００３３】 本発明のデバイスは、チャンネルを通してサンプルを移動させる力を供給する
力供給部材を含む。好ましくは、デバイスは、連続流において少なくとも1つのチ
ャンネルに供給するためのコンポーネントを含む。マイクロ流体基板において液
体を移動させる様々な方法については記載されている。電気浸透および電気泳動
などの動電学に基づく技術もマイクロ流体学において広範に使用される。本発明
の好ましい実施態様では、連続流において前記チャンネルに供給するコンポーネ
ントは、供給容器と出力容器との間の圧力差を生じることに関与する。好ましく
は、この圧力差は、いくらかの容積の液体をチャンネルに注入することによって
作製され、液体を置き換えることによって流速を正確に制御することが可能であ
る。加圧による流速は液体の組成には依存しないが、動電学的に圧送する場合、
ζ電位（例えば、塩濃度、溶液のpH、マイクロ流体デバイス表面の極めて近くの
溶液の粘度、表面に対する不純物の吸着など）に影響するすべての因子は、流速
に影響し、流速の制御を複雑にする。重要なことに、表面に対する不純物の吸着
は制御を困難にし、電動学的アプローチの制御に対する信頼度をさらに低下させ
および／またはより複雑にする。また、圧力を使用して様々な形態のチャンネル
を使用することが可能である。さらに、圧力による液体の制御は、電気泳動およ
び電気浸透とは異なり電極の複雑なシステムには基づいていない。本発明のデバ
イスでは、液体をマイクロ流体基板に注入し、液体の流速を制御するために使用
されるすべてのコンポーネントは、好ましくはマイクロ流体基板に依存せず、取
り外し可能な様式で該基板上に追加される。
【００３４】 該デバイスはまた、チャンネルにサンプルを供給するサンプル供給部を含む。
本発明の有利な実施態様では、並列に配置された複数のチャンネルの液体の流速
および注入は同期化される。このような同期化によって、プロトコルの様々な工
程の自動化および集積化が容易にされる。従って、例えば、すべてのチャンネル
に同時に試薬を注入することができる。
【００３５】 特に有利な実施態様では、チャンネルには、「セパレータ」によって相互に分
離されているサンプルが直列で供給される。２つのサンプルを分離するこのセパ
レータは緩衝液またはサンプルを含まない試薬からなることができ、好ましくは
、この「セパレータ」は非混合性不活性液体からなる。従って、複数の直列の反
応（または連続反応）をマイクロ流体基板の同一のチャンネルで「交互に」行う
ことができる。1つの例として、チャンネルに直列で注入されるサンプルの数は1
〜1000であり、より好ましくは1〜100である。従って、サンプルは並列および直
列の両方で処理されるため、本発明によるデバイスによって、大量のサンプルに
対する大規模なプロトコルを行うことが可能である。従って、核酸増幅もしくは
様々な遺伝子型決定などの生化学的反応、配列決定または酵素反応プロトコルを
含むがこれらに限定されない任意の適切なプロトコルを大規模に行うことができ
る。
【００３６】 一般に、マイクロ流体基板へのサンプルおよび試薬の注入および連続流におけ
る液体の移動は、入力部に陽圧を適用するかまたは出力部に陰圧を適用するかの
いずれか一方によって得られる。そのような圧力の適用が可能であればいずれの
デバイスを使用することができ、さらにそのようなデバイスは公知である。
【００３７】 いくつかの実施態様では、解析しようとするサンプルの供給および貯蔵部に試
薬を置くことは、マイクロピペッティングによって行うことができる。
【００３８】 本発明の特定の実施態様では、マイクロ流体基板への液体の注入は、空気圧注
入によって行われる。サンプルまたは試薬は、少なくとも1つのチャンネルに接
続された貯蔵部に置かれる。チャンネルへの注入は、気体または非圧縮性液体か
らの圧力を貯蔵部に適用することによって実施される。そのような空気圧注入シ
ステムは、すべてのチャンネルに正確な流速を課すために使用することができる
。
【００３９】 本発明のもう1つの実施態様では、並列に配置されたシリンジ駆動システムに
よって、チャンネル内の流速を調節することが可能である。これらのシリンジ駆
動部はチャンネルの入力部または出力部のいずれかに配置することができる。
【００４０】 所定の実施態様では、チャンネルの入力部および出力部の両方において圧力を
適用することが望ましい。例えば、1つのシリンジ駆動部を使用して入力末端で
押してもよく、またもう1つの駆動部を使用して、入力駆動部によって実現され
る場合と同じ流速でチャンネルの出力末端で吸引してもよい。これは、チャンネ
ル内の液体の流れを破壊し得る反応の間にチャンネルにおいて形成される気泡の
膨張を防ぐ。注入前に試薬から完全にガス抜きすることは、有意なレベルの気体
が高温で生成する熱循環に関与する反応などの生化学的反応において重要である
。
【００４１】 随意的に、液体の供給は、仏国特許出願第99 11889号（1999年9月23日出願）
に記載の注入デバイスを使用して行うことができる。適切な注入デバイスの例は
、例えば、層状または組の可撓性キャピラリーを含んでもよく、それぞれのキャ
ピラリーはチャンネルに注入しようとする液体を含有または保存することができ
る。従って、キャピラリーは一方の末端が開放されており、マイクロ流体デバイ
スのチャンネルの開口部に連結することができる。例えば、可撓性キャピラリー
によって加圧することによってキャピラリーに加圧するための手段を使用して、
キャピラリーの開放末端およびチャンネルに液体を移動させることができる。
【００４２】 いくつかの実施態様では、上記の方法を組み合わせることによってマイクロ流
体基板への液体供給を提供することができる。多数のチャンネルを有するマイク
ロ流体基板では、高解像度の分布または調合のためのロボットによって液体供給
を自動化することができる。さらに、直列での注入、または連続注入（ある溶液
から次ぎの溶液への置き換えが時間どおりに行われるとみなす）は、対応する貯
蔵部にいくらかの異なる溶液を順次導入することによって自動化することができ
る。非混合性中性緩衝液を２つの溶液の間の貯蔵部に導入することができる。
【００４３】 反応温度の正確な制御は、化学的、生化学的および生物学的プロトコルを行う
のに重要なエレメントである。
【００４４】 好ましい実施態様では、マイクロ流体基板は、チャンネルを介するサンプルの
走行が所定の温度になるように、少なくとも1つのマイクロ流体基板に接触して
いる熱交換面を有する少なくとも1つの熱支持体を含む。本発明の有利な実施態
様では、マイクロ流体基板は取り外し可能な様式で熱支持体に接触するように置
かれる。複雑なプロトコルを行う場合、予め決定された異なる温度で様々な工程
または反応を行うことはしばしば価値がある。反応温度を制御することは、特定
の温度で実施されなければならない酵素反応に特に重要である。本発明のデバイ
スは、様々な固定された温度で様々な工程を含むプロトコル、および熱循環工程
を含むプロトコルを行うことが可能である。そのような温度循環を実施する能力
は、核酸増幅反応に特に価値がある。
【００４５】 1つの態様では、熱支持体の熱交換面は、チャンネル付近のマイクロ流体基板
の面に接触している。
【００４６】 また、熱支持体に接触しているマイクロ流体基板の面の寸法は、基板および基
板材料の特性に依存して変動することができる。最も熱伝導性である基板材料で
あれば典型的にそのような改変は必要ないが、例えば、マイクロ流体基板の面は
、熱支持体によって熱交換を容易にする薄壁（例えば、チャンネル同士または貯
蔵部から分離する壁よりも薄い）を有してもよい。
【００４７】 熱支持体は、少なくとも1つの温度調節帯域を含むが、異なる温度に至るいく
らかの温度調節帯域を含むこともできる。例えば、温度調節帯域は、温度伝達部
材と熱連絡されていてもよい。熱伝導部材は、熱源、冷却源、または熱源および
冷却源の両方を含んでもよく、あるいは熱または冷却源から温度調節帯域に熱ま
たは冷えを伝達するように適応された材料を含んでもよい。熱伝達部材は、サン
プルが温度調節帯域を通って流動している間、2つ以上の温度の間を循環するこ
とができる。
【００４８】 様々な温度調節帯域は、マイクロ流体基板のチャンネルの部分と一致するよう
な形式で配置される。これらの温度調節帯域は、プロトコルの特定の工程が行わ
れる帯域を規定する。温度調節帯域は、マイクロ流体基板の温度が所望のプロト
コルを調節し得るようにマイクロ流体基板に関して任意の位置に配置してもよい
。いくつかの実施態様では、温度調節帯域は、例えば、試薬貯蔵部とチャンネル
との間の接続部の下流に設置される少なくとも１つのマイクロ流体基板と一致す
る。例えば、熱支持体の温度調節帯域とマイクロ流体基板の対応する帯域（例え
ば、各試薬貯蔵部の下流）とを組み合わせることによって、使用される各試薬の
機能および実施される反応の機能としてのチャンネルで循環する反応混合物の温
度を選択的に制御および適応することが可能である。本明細書で使用される用語
「下流」は、サンプルの供給容器から出力容器への流出方向に関連すると理解さ
れる。本発明の１つの実施態様では、熱支持体は、チャンネルを通って走行して
いるサンプルが予め決定された少なくとも２つの温度に連続的に至るように構築
された異なる温度で少なくとも2つの温度調節帯域を含む。温度は、様々な一定
温度で温度調節帯域を使用するかまたは温度調節帯域の温度を変動することによ
って調節することができる。チャンネルを通って走行する反応混合物は、連続的
に必要とされる様々な温度に至る。
【００４９】 本発明によれば、この帯域を通って走行するサンプルが予め決定された少なく
とも2つの温度に至るように、少なくとも2つの異なる温度に至る少なくとも1つ
の温度調節帯域を含むデバイスも提供される。あるいは、本発明のデバイスは、
溶液が少なくとも１つの温度調節帯域を通って１回走行するときに少なくとも１
回は前記温度サイクルを経験するように予め決定されたサイクルを形成する時間
系列に従って少なくとも２つの異なる温度に至らせる少なくとも１つの温度調節
帯域を含む。いくつかの実施態様では、サンプルが温度調節帯域を通って移動す
るようにサンプルは複数の温度サイクルを経験し得る。好ましくは、温度調節帯
域を横切る複数のチャンネルの部分は直線である。
【００５０】 熱支持体および温度調節帯域のために、様々なシステムを想定することができ
る。本発明の第1の実施態様では、熱支持体のためにペルティエ効果素子が使用
される。そのようなペルティエ効果素子は当業者に知られている。電流が横切る
異なる金属を接続することによって、小さな表面を冷却または加熱することが可
能である。ペルティエ効果素子に対する温度プローブは、電気強度（electrical
intensity）に比例する電圧を調節することが可能であり、従って温度を調節す
ることが可能である。あるいはまたはさらに、熱支持体も熱輸送液体が横切る1
つ以上のチャンネルを含む。この液体を使用して、解析支持体を局部的に加熱ま
たは冷却することができる。
【００５１】 好ましくは、加熱するための手段ならびに液体を注入および制御するための手
段は、マイクロ流体基板に組み込まれない。そのような実施態様では、マイクロ
流体基板は、取り外し可能な様式で液体を加熱および注入するためのこれらのエ
レメント上に追加される。これらの特性は、結果的に、マイクロ流体基板のコス
トを相当減少することが可能である。従って、この支持体は単数回使用または複
数回使用のタイプであり、即ち、該支持体は1回または複数回の使用の後に廃棄
することができる。「使用」は、大量のサンプルまたは試験（但し、診断用途の
ための1つの試験での単一のサンプルでも可能である）に対するマイクロ流体基
板上での直列または並列の大規模プロトコルの実行を意味することを意図する。
【００５２】 本発明の特に有利な態様では、本発明のデバイスはチャンネルを通って走行す
るサンプルの物理化学的または生物学的特性を測定するための検出手段を含む。
1つの実施態様では、これらの検出手段は、前記チャンネルの出力容器に設置す
ることができる。もう1つの実施態様では、第2のマイクロ流体デバイスの検出手
段はチャンネル内またはチャンネルの出口に直接接地される。好ましくは、検出
は連続流で行われる。
【００５３】 有利なことに、サンプルの注入、試薬の添加、溶液の混合、反応温度の調節お
よび検出は、本発明のデバイスで自動化することができる。従って、本発明のデ
バイスは、手動操作の介入が軽減される全体が集積化されたシステムである。従
って、様々なプロトコルは、本発明の連続流デバイスに全体を集積化することが
できる。
【００５４】 本発明はまた、連続流マイクロ流体デバイスに複雑なプロトコルを集積化する
ことおよび連続流のプロトコルを行うことに関する。
【００５５】 本発明の1つの実施態様によれば、少なくとも１つのサンプルに対して化学的
、生物学的または生化学的プロトコルを行うための方法が提供され、該方法は以
下の工程を含む。 a）連続流において少なくとも１つのサンプルを含有する溶液をチャンネルに供
給する。いくつかの実施態様では、サンプルは、前記チャンネルの供給容器と出
力容器との間に圧力差をかけることによって供給される工程、および b）前記サンプルと試薬とを混合するような形式で、少なくとも1つの試薬を少な
くとも1つの試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入する工程。
【００５６】 次いで、サンプルを前記チャンネルの出力容器から取り出す。
【００５７】 本発明のもう1つの実施態様では、少なくとも1つのサンプルに対して化学的、
生物学的または生化学的プロトコルを行うための方法は以下の工程を含む。 a）連続流において少なくとも１つのサンプルを含有する溶液をチャンネルに供
給する工程。いくつかの実施態様では、サンプルは、前記チャンネルの供給容器
と出力容器との間に圧力差をかけることによって供給される、 b）前記サンプルと試薬とを混合するような形式で、少なくとも1つの試薬を少な
くとも1つの試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入する工程、および c）前記サンプルの少なくとも1つの物理化学的パラメータを検出する工程。いく
つかの実施態様では、物理化学的パラメータを前記チャンネル内で検出する。
【００５８】 本発明の方法は以下のような特性を少なくとも1つ有する。 −溶液が温度調節帯域を通って走行する場合、該溶液が所定の温度に調整される
ように、該溶液を少なくとも1つの温度調節帯域を通って走行すること、 −溶液が一旦温度調節帯域を通って走行する場合、該溶液が連続的に少なくとも
2つの所定の温度に調整されるように、該溶液は連続的に少なくとも2つの所定の
温度に至る少なくとも1つの温度調節帯域を通って走行すること、 −溶液が温度調節帯域を通って1回走行するときに少なくとも１回は温度サイク
ルを経験するように、該溶液は、予め決定されたサイクルを形成する時間系列に
従って少なくとも2つの所定の温度に連続的に至る温度調節帯域を通って走行す
ること、および −溶液は、温度調節帯域を通って1回走行するときに、複数回、例えば、少なく
とも1〜50回、または好ましくは1〜35回温度サイクルを経験すること。
【００５９】 一般に、本発明のプロトコルは、広範な循環プロトコルに従って行うことがで
きる。溶液は一様な温度サイクルを経験することができ、ここで、温度サイクル
は本質的に未変化で反復されるかまたは連続温度サイクルのいくつかの特徴（サ
イクル時間、流速、温度伝達時間、温度など）が異なる非対称のサイクルである
。また、本明細書に記載の通り、温度循環は、液体の流速、または温度調節帯域
のサイクル速度を選択することによって容易に変動することができる。好ましい
実施態様では、コンピュータプログラムを使用して温度循環の特徴が選択および
制御される。
【００６０】 温度を制御し、熱循環を行うことは、多くの酵素反応および特に核酸増幅反応
に重要なエレメントである。本発明の方法は、サンプルと試薬とを混合すること
、および様々な熱処理を組み込むことが可能であり、操作を必要としない。
【００６１】 極めて大規模なプロトコルを行うために、好ましくは本発明の方法は以下の工
程のうちの1つを含む。 −不活性液体からなるセパレータによって互いに分離される複数のサンプルを連
続的に少なくとも1つのチャンネルに供給する工程、および −並列に配置された複数のチャンネルに対してプロセスの様々な工程を同時に行
う工程。
【００６２】 本発明の方法はまた、温度循環に関与するすべての反応に極めて有利でもある
。
【００６３】 1つの実施態様においてそのようなプロトコルを行う趣旨で、少なくとも1つの
サンプルを含有する溶液に対して少なくとも1つの温度サイクルを連続流で行う
ための本発明の方法が提供され、該方法は以下の工程を含む。 a）連続流において少なくとも1つのサンプルを含有する前記溶液をチャンネルに
供給する工程、および b）溶液が温度調節帯域を通って１回走行するときに少なくとも１回は温度サイ
クルを経験するように、前記溶液を予め決定されたサイクルを形成する時間系列
に従って少なくとも２つの所定の温度に連続的に至らせる少なくとも１つの温度
調節帯域を通して走行させる工程。
【００６４】 本発明のもう1つの実施態様では、少なくとも1つのサンプルを含有する溶液に
対して少なくとも1つの温度サイクルを連続流で行うための方法が提供され、該
方法は以下の工程を含む。 a）連続流において前記溶液をチャンネルに供給する工程、 b）溶液が温度調節帯域を通って１回走行するときに少なくとも１回は温度サイ
クルを経験するように、前記溶液を予め決定されたサイクルを形成する時間系列
に従って少なくとも２つの所定の温度に連続的に至らせる少なくとも１つの温度
調節帯域を通して走行させる工程、および c）前記チャンネルの下流において前記サンプルの少なくとも1つの物理化学的パ
ラメータを検出する工程。
【００６５】 好ましくは、いくつかの実施態様では、前記チャンネルの供給容器と出力容器
との間に圧力差をかけることによって、連続流においてチャンネルに供給する。
【００６６】 好ましくは、いくつかの実施態様では、溶液は、温度調節帯域を1回走行する
ときに少なくとも1〜50回、またはより好ましくは1〜35回の温度サイクルを経験
する。
【００６７】 極めて大規模な熱循環プロトコルを行うために、好ましくは本発明の方法は以
下の工程のうちの1つを含む。 −セパレータによって互いに分離される複数のサンプルを連続的にチャンネルに
供給する工程、および −並列に配置された複数のチャンネルに対してプロセスの様々な工程を同時に行
う工程。
【００６８】 本発明の方法はまた、任意の核酸増幅技術に極めて有利である。
【００６９】 本発明の1つの実施態様では、本発明の核酸を増幅するための方法は以下の工
程を含む。 a）前記核酸と核酸を増幅するのに適する試薬とを混合する工程、 b）連続流において反応混合物をチャンネルに供給する工程、 c）この反応混合物を、予め決定されたサイクルを形成する時間系列に従って予
め決定された温度に連続的に至らせる少なくとも１つの温度調節帯域を通して走
行させる工程、ならびに d）核酸が少なくとも1つの温度調節帯域を通って走行する間に変性−ハイブリダ
イゼーション−伸長サイクルを数回経験できるような形式で、温度および温度調
節帯域の温度サイクルの持続時間、ならびに混合物が温度調節帯域を通って走行
するのに要する時間を選択する工程。
【００７０】 本発明のもう1つの実施態様では、本発明の核酸を増幅するための方法は以下
の工程を含む。 a）連続流において前記核酸を含む溶液をチャンネルに供給する工程、 b）前記核酸と前記試薬とを混合するような形式で、核酸を増幅するのに適する
少なくとも1つの試薬を、前記核酸と前記試薬とを混合するような形式で、少な
くとも1つの試薬貯蔵部から前記チャンネルへ注入する工程、 c）この反応混合物を、予め決定されたサイクルを形成する時間系列に従って予
め決定された温度に連続的に至らせる少なくとも１つの温度調節帯域を通して走
行させる工程、ならびに d）核酸が少なくとも1つの温度調節帯域を通って走行する間に変性−ハイブリダ
イゼーション−伸長サイクルを数回経験できるような形式で、温度および温度調
節帯域の温度サイクルの持続時間、ならびに混合物が温度調節帯域を通って走行
するのに要する時間を選択する工程。
【００７１】 好ましくは、本発明の方法はまた、以下の特性の少なくとも1つを有する。 −前記チャンネルの供給容器と出力容器との間に圧力差をかけることによって、
連続流においてチャンネルに供給されること、 −ケイ素基板においてチャンネルが形成されること、 −前記チャンネルには、セパレータによって相互に分離された複数の核酸が連続
的に供給されること、および −工程a）、b）、c）およびd）は、並列に配置された複数のチャンネル上で同時
に行われること。
【００７２】 本発明の方法およびデバイスは、連続流において、大規模な遺伝子型決定プロ
トコル、特にマイクロシークエンシングプロトコルを集積化することが可能であ
る。
【００７３】 連続流において、少なくとも1つの標的核酸の少なくとも1つのヌクレオチドを
検出する趣旨で、以下の工程を含む方法が提供される。 a）連続流において核酸を含む溶液をチャンネルに供給する工程、 b）マイクロシークエンシング用緩衝液、マイクロシークエンシング用プライマ
ー、少なくとも1つのddNTPおよびポリメラーゼを、前記核酸と前記試薬とを混合
する形式で、前記チャンネルに注入する工程、 c）標的核酸の変性、前記核酸とマイクロシークエンシング用プライマーとのハ
イブリダイゼーション、および前記プライマーの３’末端で検出しようとするヌ
クレオチドに相補的なddNTPの取り込みを含む少なくとも1つのサイクルが生じる
ような方式で少なくとも1つの温度調節帯域を通して溶液を走行させる工程、な
らびに d）マイクロシークエンシング用プライマーの３’末端に取り込まれている少な
くとも1つのddNTPを検出する工程。
【００７４】 随意的に、本発明のマイクロシークエンシング方法は、以下の工程の少なくと
も1つを含むことができる。 −前記チャンネルの供給容器と出力容器との間に圧力差をかけることによって、
連続流においてチャンネルに供給する工程、 −少なくとも1つのサイクルを形成する時間系列に従って、温度調節帯域は連続
的に予め決定された温度にする工程、 −ddNTPを発蛍光団で標識し、工程d）において取り込まれたddNTPの蛍光を検出
する工程、ならびに −並列に配置された複数のチャンネルに対して工程a）、b）、c）およびd）を同
時に行う工程。
【００７５】 有利なことに、マイクロシークエンシングプロトコルは、検出しようとする核
酸を含む配列を増幅するための増幅反応および、さらなるもう1つの実施態様で
は、増幅産物の精製のための反応によって進行する。本発明に従い、反応工程は
同一のマイクロ流体デバイスに組み込まれる。
【００７６】 いくつかの実施態様では、連続流において少なくとも1つの標的核酸中に少な
くとも1つのヌクレオチドを検出するための方法は、以下の工程を含む。 a）連続流において少なくとも1つの標的核酸を含有する溶液をチャンネルに供給
する工程、 b）検出しようとする少なくとも1つのヌクレオチドを担持する標的核酸の領域を
増幅するための試薬を第1の試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入する工程、 c）該核酸が複数回の変性−ハイブリダイゼーション−伸長サイクルを経験する
ような方式で少なくとも1つの温度調節帯域を通して該溶液を走行させる工程、
d）増幅産物を精製するための試薬を第2の試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入
する工程、 e）少なくとも1つの温度調節帯域を通して該溶液を走行させて精製反応を行う工
程、 f）マイクロシークエンシング用緩衝液、マイクロシークエンシング用プライマ
ー、少なくとも1つのddNTPおよびポリメラーゼを含むマイクロシークエンシング
用試薬を第３の試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入する工程、 g）標的核酸の変性、前記核酸とマイクロシークエンシング用プライマーとのハ
イブリダイゼーション、および前記プライマーの３’末端で検出しようとするヌ
クレオチドに相補的なddNTPの取り込みを含む少なくとも1つのサイクルが生じる
ような方式で少なくとも1つの温度調節帯域を通して反応混合物を走行させる工
程、ならびに h）マイクロシークエンシング用プライマーの３’末端に取り込まれる少なくと
も1つのddNTPを検出する工程。
【００７７】 本発明の方法はまた、以下の工程を含むことができる。 −前記チャンネルの供給容器と前記チャンネルの出力容器との間に圧力差をかけ
ることによって、連続流においてチャンネルに供給する工程、 −工程c）およびe）において、少なくとも1つの温度調節帯域を、少なくとも1つ
のサイクルを形成する時間系列に従って連続的に所定の温度にする工程、 −ddNTPを発蛍光団で標識し、工程h）において取り込まれたddNTPの蛍光を検出
する工程、 −精製のための試薬は、エキソヌクレアーゼおよびアルカリホスファターゼを含
む、および −工程a）、b）、c）、d）、e）、f）、g）およびh）は並列に配置された複数の
チャンネル上で同時に行われる。
【００７８】 本発明の方法はまた、化学的、生化学的、および生物学的反応を行うのに極め
て有利であり、ここで、反応溶液の温度変化は反応の開始、調節、停止、または
他の影響をもたらす手段を含む。本発明の１つの実施態様では、反応溶液に対す
る連続流において少なくとも１つの温度サイクルを行うための方法が提供され、
ここで、 a）連続流において前記溶液がチャンネルに供給され、 b) 溶液が温度調節帯域を通って1回走行するときに少なくとも１回は温度サイク
ルを経験するように、前記溶液は、予め決定されたサイクルを形成する時間系列
に従って少なくとも2つの所定の温度に連続的に至る少なくとも1つの温度調節帯
域を通って走行する。
【００７９】 本発明の特に有利な態様は、反応容積のミニチュア化である。典型的に、反応
容積は0.01μl〜10μlのオーダーである。本発明に好ましい実施態様では、反応
容積は0.1μl〜5μlのオーダーである。好ましくは、反応容積の容積は0.1〜2μ
lである。
【００８０】 好ましくは、反応溶液が所定の温度を有する温度調節帯域に入るときに、化学
的、生化学的、または生物学的反応を開始することができる。同様に有利なこと
に、反応液が所定の温度を有する温度調節帯域に入るときに、化学的または生化
学的反応を促進するか、または減速するか、または停止させることができる。さ
らなる実施態様では、反応溶液が所定の温度を有する温度調節帯域に入るとき反
応産物が変動し得るように、化学的または生化学的反応の反応産物は、反応が行
われる温度によって変動し得る。
【００８１】 同様に有利なことに、反応産物は、分離、精製、検出、同定、回収、またはさ
らなる改変を含む本発明のさらなる操作を経験する。有利なことに、単一の工程
で反応溶液のコンポーネントを混合し、もう1つの実施態様では、混合物がマイ
クロ流体デバイスを通って移動するときにコンポーネントが任意の工程または任
意の位置で追加され得るように、反応溶液のコンポーネントが連続的に追加され
る。
【００８２】 従って、様々な異なる形式で、サンプル上にさらなる任意の数の操作を行うこ
とができる。サンプルは、上記の同じマイクロ流体基板、またはもう1つのデバ
イスもしくはマイクロ流体基板で処理することができる。
【００８３】 サンプルを別のデバイスまたはマイクロ流体基板でさらに処理する場合、前記
デバイスまたは基板は、上記のマイクロ流体基板に連結していてもまたは連結し
ていなくてもよい。1つの実施態様では、サンプルが、さらなる操作のために1つ
の基板からもう1つの基板に直接流動することができる。上記のように、さらな
る操作は、例えば、分離、精製、検出、同定、回収、またはさらなる改変工程に
関与することができる。1つの好ましい実施態様では、温度循環反応の産物は、
少なくとも1つの温度調節帯域を含む流体基板において、典型的に前記酵素の活
性化または不活化について酵素精製工程に供される。本発明の他の実施態様では
、反応は電気泳動またはクロマトグラフィー分離によって精製される。
【００８４】 本発明の他の特徴および利点は、実施例として与えられ、非制限的である好ま
しい実施態様の説明にみることができよう。
【００８５】 以下の説明では、理解し易いように、図面における同一、同様、または同等の
部分には、同じ番号の符号を付してある。
【００８６】 （熱デバイス） 図1は、本発明のマイクロ流体デバイスの1つの実施態様を概略的に示す。マイ
クロ流体基板100は、マイクロ流体基板の温度調節帯域に熱を伝達する金属棒900
に取り付けられる。金属棒900は、図2を参考にして以下に記載の通り、マイクロ
流体基板の少なくとも1つの温度調節帯域を形成するためにマイクロ流体基板の
少なくとも一部に接触する。金属棒900は、管920のシステムを介してバルブ（電
気バルブ（electrovalve）または圧力バルブ（pressure valve））910のシステ
ムに連絡している。管920は、例えば、従来の配管で使用される材料などの任意
の従来の材料から作製される。バルブ910は、中央演算処理装置で制御される手
動または自動化のいずれかで駆動する。バルブ910は、管940のもう1つの組によ
って次々に複数（図1の実施態様では3つ）の貯蔵部930に連絡する。貯蔵部930は
、液体を保持することが可能な大きなタンクであってもよい。各貯蔵部930は、
例えば、周知の加熱または冷蔵手段によって、特定化されたレベルで内部の液体
の温度を維持することが可能である。各貯蔵部930の液体は、異なる温度で維持
される。本実施態様では、3つの貯蔵部は55℃、72℃および94℃に維持される。
しかし、貯蔵部の数および温度は、実施しようとするプロトコルに合わせて任意
の組み合わせであってよい。例えば、いくつかの実施態様では、55℃、72℃およ
び94℃の貯蔵部に加えて、37℃の貯蔵部が存在してもよい。1を超える温度調節
帯域を用いる実施態様では、それぞれの貯蔵部はすべての温度調節帯域または実
施しようとするプロトコルによる温度調節帯域の部分のみと液体連絡し得る。
【００８７】 本発明の好ましい実施態様では、使用される液体は水である。しかし、他の液
体または加熱されたもしくは冷却された空気などの気体を使用してもよい。しか
し、水は安価かつ容易に補給可能な供給源であるため、水が好ましい。
【００８８】 液体は、バルブ910を通り管940を通って貯蔵部930から循環する。バルブ910は
、液体をただ1つの貯蔵部930からマイクロ流体基板の温度調節帯域の位置での金
属棒900へ通過させることが可能であるように駆動される。次いで、液体は、管9
20を通って金属棒900へ通過する。液体は、図2を参考にして以下に記載の通り、
金属棒を通って通過し、次いで、バルブを通って貯蔵部に戻る。
【００８９】 図2は、図1の3つの金属棒900、901および902ならびにマイクロ流体基板100の
断面図である。金属棒900について示されるように、それぞれの金属棒は、内部
で形成されるチャンネル950を有する。それぞれの棒は、マイクロ流体基板の温
度調節帯域に熱調節（即ち、加熱または冷却）を提供する。チャンネル950は、
図1に表される管920と連絡している。液体は、1つの管920を通ってチャンネル95
0の1つの末端を通過し、チャンネル950を通って戻り管920を通過する。次いで、
戻り管920は、バルブによって液体を貯蔵部に戻す。
【００９０】 本実施態様では、十分な熱調節を提供するために、水は、1時間あたり約400リ
ットルの流速でそれぞれのチャンネルを通って流動する。この流速は、主に、ポ
ンプおよびバルブのシステムによって維持される。しかし、該速度は、貯蔵部と
電気バルブとの間にポンプを設置することによって制御してもよい。
【００９１】 図2は、円断面を有する金属棒900におけるチャンネル950を表す。円断面は、
例えば、金属棒を介して穿孔することによって形成するのに簡単である。しかし
、他の断面も他の利点を提供する。例えば、マイクロ流体基板に接触した金属棒
の面を横断するより扁平な断面は、より大きな面積の液体をマイクロ流体基板に
暴露させ、それによって熱伝達または冷却の速度を増大する。熱伝達または冷却
の増大を可能にするこれらの好ましい断面は、例えば、金属棒を成型または溶接
することによって製造することはさらに困難である。
【００９２】 温度調節帯域の温度は、該帯域に温度センサーを取り付けることによってより
正確に制御することができる。例えば、正確な温度を提供するために2つの熱電
対および白金センサーを組み合わせて使用してもよい。熱電対は極めて迅速に応
答時間を有するが正確ではなく、一方、白金プローブは緩徐に応答するが、熱電
対に比べてより正確に温度を測定する。従って、2つのタイプの読み取りは、個
別に読み取るよりも良好な温度の読み取りを提供する。温度センサーは、操作者
が帯域の温度をモニターし、必要であれば、チャンネルを介する液体の流れを調
節して温度を調節することが可能である。あるいは、温度センサーからの出力を
中央演算処理装置に通し、フィードバックループシステムを介して自動的に温度
制御してもよい。
【００９３】 液体がマイクロ流体デバイスの下に配置された熱デバイスのチャンネルを通っ
て通過する場合、熱は熱デバイス内の液体とマイクロ流体デバイス内の反応混合
物との間で伝達される。マイクロデバイスおよび基板の構造については、図3A〜
12を参考にして以下に記載されている。
【００９４】 （マイクロ流体基板） 図3Aは、本発明のマイクロ流体基板100の断面である。この図では、基板の末
端のうちの1つの付近で基板100aに貫通開口部を作製することによって本質的に
形成される入力容器102が表されている。同様に、出力容器104を第2の末端の付
近で作製する。容器102、104は基板100の第1の面106に開口する。内部チャンネ
ル108は、入力および出力容器に接続する。
【００９５】 チャンネル108は、第1の基板が溝を覆うように、第1の基板に結合する第2の基
板100bにエッチングされた溝の形態である。
【００９６】 例示された実施態様では、薄壁110のみがマイクロ流体100の第2の面112からチ
ャンネル108を分離するように、溝の深さは、実際的に第2の基板100bの厚さに等
しいことが観察される。
【００９７】 例示された実施態様では、基板100は平行6面体の一般形態であり、第1および
第2の面106、110は主要面であり、対向および並列である。図はまた、断面で試
薬貯蔵部120a、120b、120cを表しており、これらは入力または供給容器102と出
力容器104との間に配置される。デバイスは、実施しようとするプロトコルに合
わせて任意の数の貯蔵部を有することができる。貯蔵部はまた、解析支持体100
の第1の面106に開口する。接続部または通路122aはそれぞれの貯蔵部をチャンネ
ル108に接続するように提供される。
【００９８】 単純化のために、貯蔵部が図3Aの供給および出力容器とは異ならないように、
通路122aは図の平面に表されている。
【００９９】 （液体供給システム） 図3Bは、図3Aのマイクロ流体基板を表し、その貯蔵部120a、120bおよび120cは
、それぞれ液体供給コンポーネント150a、150bおよび150cと結合する。
【０１００】 これらのコンポーネントは、貯蔵部上に緊密に適用され、試薬を含有するシリ
ンジ駆動部154a、154bおよび154cに接続している供給セパレータまたはキャップ
152a、152b、152cを含む。キャップはマイクロ流体基板の表面に結合するかまた
は水密性シールを使用して表面に対して締め付けることができる。
【０１０１】 符号156a、156bおよび156cはそれぞれ、圧力および／または試薬の流速を制御
するような形式で、シリンジ駆動部152a、152b、152cに接続するキャップ管に対
して配置された圧力センサーを指す。
【０１０２】 示されていないが、同様の供給システムも供給または入力容器を具備すること
ができる。
【０１０３】 図3Aおよび3Bに示すように、入力容器および貯蔵部は大気圧または供給システ
ムによって固定される圧力に供されるが、真空ライン124は出力容器に適用され
る。図4は、より正確かつ個別に、マイクロ流体基板を形成する2つの基板100aお
よび100bを示す。
【０１０４】 マイクロ流体基板は、複数の供給容器102および複数の出力容器104を含むこと
が認められる。
【０１０５】 容器は、第1の基板100aにおいて作製される貫通開口部の形態を有する。これ
らの開口部は、漏斗を形成する隅切りされたV字型を有する。さらに、図4の例で
は、各入力容器102は、個々にチャンネル108によって出力容器104に接続する。
マイクロ流体基板は、3つの試薬貯蔵部120a、120b、120cを含む。この例では、
それぞれの貯蔵部は、各貯蔵部は、接続部122a、122bによって貯蔵部が接続する
いくらかのチャンネル108を共有する。符号122aは、第2の基板100bにおいて作製
されそれぞれチャンネルに接続される対応する支管122bに貯蔵部を接続する第1
の基板100aの穿孔をさらに特異的に指す。もちろん、貯蔵部を様々なチャンネル
について分離することもできる。
【０１０６】 支管122bおよびチャンネル108の接続点で混合する液体（サンプルおよび試薬
）の量は、チャンネル108のこれらの支管のそれぞれのサイズに依存する。
【０１０７】 （熱支持体） 上記のように、マイクロ流体基板は熱支持体を含むこともできる。図5は、支
持体100aおよび100bが相互に恒久的に結合している図4のマイクロ流体100を示す
。マイクロ流体基板は、対応する熱支持体200の上に表されている。
【０１０８】 熱支持体200は、付近にチャンネルが設置されるマイクロ流体基板100の第2の
面112に面する熱交換面212を有する。熱交換面212は、3つの温度調節帯域220a、
220b、220cを有し、それぞれの該帯域は1つ以上の熱源を具備する（示されてい
ない）。
【０１０９】 3つの温度調節帯域220a、220b、220cは、それぞれ貯蔵部120a、120b、120cま
たはより正確には試薬を供給する支管の付近で設置されるマイクロ流体基板のチ
ャンネルの部分に一致するような形式で配置される。
【０１１０】 一般に、限定されないが、チャンネルを含むマイクロ流体基板が頂部から熱を
隔離される（即ち、良好な熱伝導部とは接触しない）ならば有利である。この点
について、図6および7は、それらの上面、即ち、マイクロ流体基板の前記第2面
に対向する面を隔離することによって、チャンネルの温度の規則性を改善するこ
とが可能なデバイスの2つの実施態様の改変体を示す。図6に表される第1の溶液
は、支持体の上部100aの空洞160（開口部を伴っても伴わなくてもよい）を作製
することからなる。この空洞はチャンネル108の少なくとも一部に一致する。図7
に示される第2の溶液は、マイクロ流体基板の上部と下部100a、100bとの間の熱
絶縁材料の層100cを配置することからなる。アクセス孔は、試薬貯蔵部120a、12
0b、120cに対応する絶縁層100cで形成される。
【０１１１】 マイクロ流体基板について上記のように、熱支持体は、限定されないが、プラ
スチック、ガラスもしくは石英を含む任意の適切な材料を含むか、これらから本
質的になるか、またはなり得る。
【０１１２】 （マイクロ流体基板を製造するための方法） マイクロ流体基板の特定の実施態様では、該マイクロ流体基板は、それぞれ容
器、接続部および貯蔵部を形成する貫通開口部を有する第1の基板、ならび第1の
基板に結合する第2の基板であって、チャンネルを形成するために第1の基板に覆
われ、それぞれ貫通開口部に一致する溝を有する上記第2の基板を含むことがで
きる。この特に簡単な構造により、マイクロ流体基板を製造するためのコストを
軽減することが可能である。マイクロ流体基板の製造は、本発明により、以下の
連続工程を含む方法に従って行うことができる。 −第1の基板において、貫通開口部を形成する工程であって、前記貫通開口部は
、それぞれ供給容器または出力容器または試薬貯蔵部に対応する、工程、 −第2の基板において、第1の基板の少なくとも2つの開口部に手動で接続するこ
とが可能なパターンに対応する溝を形成する工程、および −上記のマイクロ流体基板を調製するための方法の例を与える以下の図8〜１１
に掲載の溝を覆うような形式で、第2の基板に第1の基板を結合させる工程。
【０１１３】 図8に示されるように、貫通開口部は、例えば、ケイ素から作製される第1の基
板プレート100aで作製される。これらの貫通開口部は、容器または貯蔵部102、1
04、120a、120b、120cを構成する。化学的にエッチングされる開口部は、隅切り
された形状に与えるような形式で、例えば、KOHを使用する異方性化学エッチン
グによって側面を傾斜させることによって調製される。開口部の配置は、溝のパ
ターンに一致するエッチングマスク（示さず）によって規定される。図7に掲載
の実施態様の場合、例えば、CHF3によるエッチングによって熱絶縁材料、例えば
、SiO2の層100cの穿孔を実施することができ、穿孔のサイズは、エッチングマス
クまたはマスクとして化学的に作製される孔の壁によって規定される。
【０１１４】 図9は、第2の基板100b、例えば、ケイ素においてチャンネル108を形成する溝
のエッチングを示す。エッチングは、所望のチャンネルに対応するパターンを有
するエッチングマスク（示さず）を介して実施される。それは、例えば、(KOH)
を使用する化学エッチングである。溝の深さは、厚さ250〜450μmを有する基板1
00bに対して100μmのオーダーである。それは、例えば、100μm×20μmで幅より
も深さがある溝を調製することができる乾燥エッチングも可能である。
【０１１５】 図10で表される第3の工程は、対応するチャンネル（溝）108に連絡する容器ま
たは貯蔵部102、104、120a、120b、120cを置くような形式で、第1および第2の基
板100aおよび100bを密封することを含む。密封工程は、例えば、2つの基板を直
接（分子）結合させることによって生じる。
【０１１６】 この操作の間、第2の基板100bの溝108は、チャンネルを形成するために第1の
基板100aによって覆われる。
【０１１７】 図11で表される最終工程は、チャンネル108と外部表面112との間のただ1つの
薄壁110を保存するような形式で第2の基板100bを薄くすることを含む。
【０１１８】 この壁110は、2つの温度調節帯域間で良好な熱隔離を促進するような形式で約
50μmのオーダーの厚さを有する。上記のように、随意的に、エッチングおよび
／または機械化学的研磨によって熱交換を促進するように壁110を薄くすること
ができる。
【０１１９】 本発明の複数のマイクロ流体基板は、同時に、および上記の方法に従って（第
1および第2の基板に対応する）2つのケイ素ウェーハにおいて製造することがで
きる。この場合、プロセスは、マイクロ流体基板を分離するために鋸でウェーハ
を切断することによって完了する。
【０１２０】 （熱循環による化学的、生化学的、および生物学的プロトコルを行うためのデバ
イスならびにプロセス） 本発明のデバイスおよび方法により、熱循環に関与する工程を含む化学的、生
化学的、および生物学的プロトコルを連続流において行うことが可能である。本
発明の使用について想定される化学的、生化学的、および生物学的プロトコルは
、温度の変化が化学的もしくは生物学的プロセスの開始、促進、減速、停止、急
冷、転換、またはそうでなければ影響を与えるのに有用であるプロトコルを含む
。本発明は、特に、遺伝子解析で広範に使用されるポリメラーゼ連鎖反応（また
はPCR）に関する。本発明は、遺伝子解析で使用することができ、生化学および
分子生物学の領域で多くのプロトコルについて使用することもできる。
【０１２１】 （ポリメラーゼ連鎖反応） ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は当該分野において周知である。PCRは、2つの
相補的DNA鎖が可逆的にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、一本鎖に分離
することが可能であるという事実を利用する。二本鎖または一本鎖状態は、スト
リンジェンシー（pH、塩、温度）に依存する。
【０１２２】 PCRは、細胞において、遺伝子情報の伝達を確実にするような様式で、DNAが複
製されるという事実に依存する。DNAの合成は、DNAポリメラーゼ酵素の作用に関
与する。マトリックスDNA鎖から開始すると、DNAポリメラーゼは、各ヌクレオチ
ドに対置して該ヌクレオチドに相補的なもう1つのヌクレオチドを取り込み、伸
長として既知のプロセスによってDNAの新たな鎖が作製される。
【０１２３】 in vitroでDNA合成を行うために、ポリメラーゼには、マトリックスおよびdNT
Pに加えて、高分子化を開始するプライマーを供給しなければならない。このプ
ライマーは、マトリックスDNAフラグメントの一方の末端に相補的なDNAの短いフ
ラグメント（好ましくは約20ヌクレオチド）である。二本鎖DNAを得るために、
増幅が所望される標的配列のいずれかの側に対して、2つのプライマー（それぞ
れの鎖に相補的なプライマー）が必要である。
【０１２４】 DNAの鎖を複数コピーするために、PCRは、ポリメラーゼによる伸長と組み合わ
せて所定量のDNAを変性し、ハイブリダイズすることを利用する。それぞれの工
程を実施する温度は、使用するプライマーおよび標的配列に適切なように選択す
ることができる。例えば、PCRを実施する1つの方法のための工程は、以下の通り
である。 −DNAの2つの鎖を完全に分離し、二次構造を除くために、溶液を94℃に加熱する
ことによるDNAの変性、 −温度を低下して特異的対合を可能にすることによって達成される、一本鎖に対
するプライマーのハイブリダイゼーション、および −温度を耐熱性ポリメラーゼの活性の最適値（例えば、特定の酵素について72℃
）に設定することによるDNAの鎖の伸長。
【０１２５】 「サイクル」を構成するとして本明細書において規定される3つの工程後、変
性が再度行われ、新たに合成されるDNAがマトリックスとして使用される。サイ
クルは20〜40回反復され、マトリックスの量は指数的に増加する。サイクルの数
およびサイクルの様々な工程が実施される温度は、所望される増幅に合わせて任
意の数値であってよい。
【０１２６】 本発明のマイクロ流体基板において行われているPCRによる増幅のためのプロ
トコルの例を実施例1に示す。
【０１２７】 （温度循環および遺伝子解析） 遺伝子解析では、温度循環を必要とする多くのプロトコルが存在する。PCRか
ら誘導される増幅技術は、RT-PCR、対立遺伝子特異的PCRおよびTaq Man PCR (Wh
ite, B. A., Methods Mol Biol 67: 481-486 (1997); Delidow, B. C.ら、Metho
ds Mol Biol 58: 275-292 (1996))として公知である。リガーゼ連鎖反応（LCR）
技術も周知であり、LCR、ギャプLCR、非対称ギャプLCR逆転写LCR（RT-LCR）、オ
リゴヌクレチド連結アッセイ（OLA）およびPCR-OLA (Nikiforov, T., Anal Bioc
hem 225: 201-209 (1995); Marshall, R. L., PCR Methd Appl 4: 80-84 (1994)
; Nickerson, D. A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 87: 89238927 (1990))が挙げ
られる。クローンまたはPCR反応を使用するサイクル配列決定反応は公知である
。サイクルマイクロシークエンシング（単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応
を公知である(Cohen, D.、国際特許出願WO 91/02087)。さらなる例示的プロトコ
ルには、逆転写酵素および発現された配列の入れ子型PCR（RT入れ子型PCR）、そ
れに続くサイクル配列決定(Happら、Vet Immunol Immunopathol, 69: 93-100, (
1999))が含まれる。完全には判っていない場合の実際の配列を同定および増幅す
るための第1の工程としては縮重PCR技術を使用することができる(Harwoodら、J
Clin Microbiol 37: 3545-3555. (1999))。ランダム増幅されたDNA（RAPD）解析
はしばしば診査アプローチとして有用である(Speijerら、J Clin Microbiol 37:
3654-3661, (1999))。任意にプライムされたPCR（AP-PCR）は、しばしば潜在的
多型性を見出すための予備的な工程として有用である(Jonasら、J Clin Microbi
ol 38: 2284-2291, (2000))。
【０１２８】 少なくとも1つの熱サイクルを含む工程を含む化学的、生化学的、および生物
学的プロトコルを実施するための様々なデバイスが設計されているが、これらの
デバイスは重大な欠点を有する。本発明によって提供される利点は、他のデバイ
スと本発明とを比較すれば明らかである。
【０１２９】 1つのタイプの既知のデバイスでは、生物学的サンプルは、所望の熱処理を得
るために必要な温度に連続的に至る貯蔵部に置かれる。特定のデバイスは、ペル
ティエ効果による自動温度調節または熱調節のためのシステムを使用する。これ
らのデバイスの熱応答時間は、1秒間あたり3℃（3℃/s）のオーダーである。こ
れらのデバイスによって使用される方法を実施するのは簡単であるが、全プロト
コルを行うためのそれらから得られるサイクル時間は極めて長い。このアプロー
チでは、反応スループットまたは収量を増加させるのは不可能である。
【０１３０】 他の技術は、ケイ素基板においてエッチングされる貯蔵部を使用する。白金付
着物によって形成される電気抵抗によって貯蔵部の加熱が得られる。貯蔵部の冷
却は、冷プレートに対する恒久的伝導によって得られる。温度サイクル中の熱応
答時間を改善するために、貯蔵部（または反応チャンバ）は、基板の化学的エッ
チングによって生成されるケイ素梁によって懸架される。熱応答時間は1秒あた
り約10℃を超える。しかし、使用される技術は、プロトコルの「チップ上の検査
室」、即ち、原理が様々な生物学的または生化学的反応帯域間で液体を循環させ
ることであるマイクロ流体基板に組み込むことにあまり適合しない。このデバイ
スでは、連続流を達成し、高スループットスクリーニングに適応されるプロトコ
ルを集積化することは不可能である。
【０１３１】 もう1つのタイプの既知のデバイスでは、生物学的液体を循環することが可能
なマイクロチャンネルは、ケイ素、ガラスまたは高分子材料から作製される基板
上でミニチュア化される。これらのマイクロチャンネルまたはキャピラリーは、
継続的にサンプルを循環させることが可能である。液体は、必要とされる熱処理
に従って固定される温度で連続的に帯域を横切る。この溶液によって、コイルの
形態でマイクロチャンネルが生成する。図12はこのタイプのデバイスを表し、そ
れぞれ図に示されるマイクロチャンネル1が形成される基板の上方からの図を示
す。マイクロチャンネル1は、入力オリフィス2と出力オリフィス3との間でコイ
ルを形成する。符号4、5および6は、それぞれ温度T1、T2およびT3に供される帯
域を表す。コイルは、処理しようとする液体が変性−ハイブリダイゼーション−
伸長サイクルを経験する活性区間を含む。これらの区間は、変性温度である帯域
に液体を戻すために使用される温度調節に供されない区間によって変化する。
【０１３２】 この配置の主な欠点は、（大量の並列チャンネルを有するのは容易ではないと
いう意味で）操作、可撓性およびスループットには全く向かないという制限があ
ることである。事実、熱サイクルには異なる温度が存在するため、多くの加熱帯
域を有する必要がある。さらに、各加熱帯域は、等温帯域の標準化された温度を
保証するために別の加熱帯域から十分な距離で分離されるべきである。もう1つ
の障害は、コイルのループの数によるものであり、この数は所望される熱サイク
ルの回数に対応し、例えば、異なる反応を行おうとする場合、ミニチュア化、並
列での走行およびサイクル数の変更を困難にしている。さらに、チャンネルが長
いため、有意により高いチャンネル圧を使用しなければならず、潜在的に実施が
困難であることが示される。ミニチュア化はチャンネルの幅の減少に関与し、液
体に係わる問題（妨害および熱消失の危険性、ならびに吸着の潜在的な増加）が
生じる。さらに、熱帯域の長さは液体の速度によって倍増される反応時間に等し
くあるべきであり、これは熱帯域の寸法が増加しなければならないことを意味す
るため、そのようなデバイスに必要な液体の流速では、流出速度は相当である。
【０１３３】 英国特許出願第GB-2 325 464-A号(Bruken-Franzen Analytik GmbH)は、さらに
もう1つのタイプのデバイスを開示している。このデバイスでは、反応チャンバ
は、共通の入力部および出力部を有する複数の並列なマイクロチャンネルを含む
。処理しようとする液体は反応チャンバに進入し、3つの分離帯域または同一の
帯域のいずれか一方で3つの異なる温度に供される。プロセスの工程中に液体が
定常に維持されるため、該デバイスは連続流で作用するようには設計されていな
い。よくても、伸長工程の間、液体の循環を再開することができる。この溶液は
、かなり複雑であり、温度サイクルと完全に整合しなければならない液体を循環
するための連続手段に関与する。
【０１３４】 米国特許第5,736,314号は、PCRを実施することが可能であるデバイスについて
記載している。溶液は、循環加熱素子に囲まれている管を通って走行する。各素
子は、所定の温度に対して包囲する管のセグメントを加熱する。溶液が管を通っ
て流動するとき、溶液は、PCRを実施することが可能である適切な温度に供され
る。このデバイスの欠点は、該デバイスがサイクルにおいて異なる温度が存在す
るような多くの加熱帯域、およびサイクルが存在するような多くの加熱帯域を有
することが必要であることである。このため、溶液の回路は特に長くなる。さら
に、各帯域において標準化された温度をできるだけ保証するために、各加熱帯域
は隣接する帯域からできるだけ良好に隔離されなければならない。しかし、この
ことは、実用的および／または極めて経済的に達成することは困難であり、また
回路が長くなる。
【０１３５】 以下のパラメータを最適化する一方、サンプルを連続流熱プロトコルで処理す
ることを可能にする先行技術のデバイスは存在しない。 −デバイスのための最小活性表面、 −処理された物質の最大流速（単位時間あたりの反応容積）、および −チャンネルの最小内部表面のための最大チャンネル区間。
【０１３６】 本発明の目的は、溶液の回路の長さを減少し、低コストで熱循環に必要な正確
な温度を得ることが可能である熱循環デバイスを生産することである。
【０１３７】 この目的を達成する趣旨で、熱循環により化学的、生化学的、または生物学的
反応を行うための本発明のデバイスであって、溶液がチャンネルを通って1回走
行するときに溶液がこれらの温度に調節されるように、少なくとも1つのチャン
ネル、チャンネルに溶液を連続的に供給するための少なくとも1つの手段および
チャンネルに予め決定された少なくとも2つの温度を提供する少なくとも1つの手
段を含む上記デバイスが提供され、該デバイスは、溶液がチャンネルを通って走
行する間、チャンネルを1つの温度からもう1つの温度へ経時的に伝達するための
コンポーネントを含む。
【０１３８】 従って、チャンネル（またはチャンネルのセグメントを考慮して）において循
環する全溶液は、熱循環によって必要とされる温度に連続的に至る。流速を選択
することによって、チャンネル内で溶液が循環を経験する回数が決定される。溶
液の流速が低いほど、サイクル数が大きくなる。
【０１３９】 本発明は、デバイスの寸法を減少して生産コストを軽減することが可能である
。チャンネルのための単一の加熱帯域を使用すると、異なる温度で加熱帯域に隣
接するという先行技術で認められた困難が消失する。各サイクルの各温度間のす
べての熱隔離帯域が抑制され、回路のサイズがかなり減少する。本発明により、
チャンネルは、製造が容易であり、従って製造コストが比較的安価な直線状の形
状を有することが可能である。チャンネルを曲げることがなくなり、チャンネル
の長さが短くなることは極めて有利である。第1に、液体の循環が動電学的手段
で行われる場合、曲線および屈曲を有するチャンネルは、チャンネル内の液体の
プロフィールに劇的に影響する。チャンネル壁に対して本質的に垂直であるサン
プルの液体プロフィールを維持することは、チャンネルのすべての区間における
同一の流速を維持するという利点を可能にする。第2に、液体の循環が圧力に基
づく手段で行われる場合、小さな寸法ならびに曲線および屈曲を有するチャンネ
ルは、高い圧力を有し、システム全体、特に接続部に対する歪が増大する。回路
の長さが短くなるので、極めて遅い速度を使用することができる。より短くかつ
より直線なチャンネルは、特に液体が圧力によって移動する場合圧力ヘッドの消
失が極めて小さいため、多くの利点を提供する。熱循環は液体の連続流を生じる
ため、本発明は大量の溶液を処理することが可能である。
【０１４０】 本発明は、以下を含む多くのプロトコルを実施することが可能であるが、これ
らに限定されない。 −PCR、RT-PCR、対立遺伝子特異的PCR、Taq Man PCRなどのすべてのタイプのPCR
、 −LCR、ギャプLCR、非対称ギャプLCR、RT-LCR、オリゴヌクレオチド連結アッセ
イ（OLA）およびPCR-OLAなどのすべてのタイプのLCR（リガーゼ連鎖反応）、 −クローンまたはPCRからのサイクル配列決定反応、 −サイクルマイクロシークエンシング反応（単一ヌクレオチドプライマー伸長）
、 −OLAを含む遺伝子型決定プロトコル、 −熱循環を必要とする他の任意の生物学的操作、 −反応混合物を少なくとも1つの熱サイクルに暴露することによって所望の効果
が生じる他の任意の生化学的プロセス、および −反応混合物を少なくとも1つの熱サイクルに暴露することによって所望の効果
が生じる任意の化学的プロセス、 −反応混合物を少なくとも1つの熱サイクルに暴露することによって所望の効果
が生じる任意の生化学的プロセス。
【０１４１】 いくつかの実施態様では、本発明は、以下の特性のうち少なくとも1つを有す
る。 −溶液が予め決定された温度サイクルを形成する時間系列に従って所望の温度に
調節され、溶液がチャンネルを通って1回走行する場合に該溶液は少なくとも1回
はサイクルを経験するようにマイクロ流体デバイスが構築されること、 −溶液がチャンネルを通って1回走行する場合に該溶液は少なくとも2つの温度に
調節されるようにマイクロ流体デバイスが構築されること、 −マイクロ流体デバイスは、少なくとも2つの相互に連絡するチャンネルを含み
、各チャンネルに少なくとも第1および第2の予め決定された温度が提供されるこ
とを可能にし、さらに、該溶液が各チャンネルを通って走行するときに該溶液は
ただ1回所定のチャンネルの第1および第2の温度に至るように、チャンネル内の
溶液は第1の温度から第2の温度に伝達されることが可能であること、 −マイクロ流体デバイスは、予め決定された期間の間一定温度であり、複数のチ
ャンネルと連絡する少なくとも1つのチャンネルを含み、ここで、主要チャンネ
ルの温度を改変することができること、 −マイクロ流体デバイスは相互に並列に配置されたいくらかのチャンネルを含み
、該チャンネルは所定の瞬間に相互に同一の温度を有すること、 −マイクロ流体デバイスは1つ以上のチャンネルが形成される基板を含むこと、
および −基板は、シリコン、ガラス、石英および／またはプラスチックを含むか、これ
らから本質的になるか、またはこれらからなること。
【０１４２】 熱循環に関与する化学的または生化学的反応を行うための本発明の方法も提供
され、少なくとも1つのチャンネルには継続的に溶液が供給され、溶液がチャン
ネルを通って1回走行するときに溶液は所望の温度に調節されるように、溶液に
は少なくとも2つの予め決定された温度が供給され、溶液がチャンネルを通って
走行する間、チャンネルには1つの温度からもう1つの温度が経時的に伝達される
。
【０１４３】 1つの実施態様では、プロセスは少なくとも1つの以下の特性を有する。 −反応はDNAまたはDNAフラグメントを含むこと、 −反応はDNAまたはDNAのフラグメントの合成を実施すること、および −反応はポリメラーゼ連鎖反応を含むこと。
【０１４４】 本発明の方法に従って行われる化学的または生化学的反応を経験した本発明の
生成物も提供される。
【０１４５】 ここで、図13〜17を参考にして、熱循環を伴うPCRプロトコルが行われる本発
明のデバイスの5つの実施態様の原理について説明する。
【０１４６】 図13に表される第1の実施態様では、デバイス101は、基板103を含む熱循環ユ
ニット102を含む。基板については、図18〜20を参考にして以下に詳細に説明す
る。基板103は、上流末端を通って上流供給管116と連絡し、下流末端を通って下
流出力管118と連絡するチャンネル108を有する。
【０１４７】 デバイス101は、管116を通って供給され、管118を通って放出する溶液をチャ
ンネル108を通して継続的に走行させるためのコンポーネント105を含み、該溶液
は、全プロトコルの期間中、チャンネルの長さを通して単回チャンネル108を通
って走行する。溶液は、PCRを行うのに必要な試薬を含有する。
【０１４８】 ユニット102は、基板103を随意に加熱または冷却するためのコンポーネントを
含み、これらのコンポーネントは従来からあり、それ自体公知である。いくつか
の実施態様では、加熱コンポーネントは、図1および2で表されるマイクロ流体基
板に接触する金属棒と液体連絡する溶液を所望の温度で含有する貯蔵部を含む。
以下の説明では分かり易くするため、これらのコンポーネントは加熱コンポーネ
ントと呼ばれ、それらは、加熱および冷却のために使用され、基板およびチャン
ネルの温度を上昇または低下させることを可能にする。加熱コンポーネントは、
所定の瞬間でチャンネル108に与えられる温度がどのような温度であってもチャ
ンネル108のすべてのセグメントは同じ温度であるように、全体として基板103を
加熱または冷却するように構築される。
【０１４９】 ユニット102は、加熱コンポーネントがチャンネル108に経時的に異なる温度を
連続的に提供するように加熱コンポーネントを制御するためのコンポーネントを
含む。該コンポーネントにおけるこれらの温度は3種類あり、公知でありかつPCR
の間に使用される温度である。従って、チャンネル108は最初に温度T1に置かれ
、次いで温度T2に冷却され、次いで中間の温度T3に再加熱される。このような時
間系列は温度サイクルを形成する。このサイクルは、図13のグラフに示されるよ
うに経時的に多数回反復される。従って、温度T3での期間後、チャンネル108は
新たなサイクルなどの開始時に温度T1に1回以上置かれる。
【０１５０】 この循環は、溶液が供給管16からせいぜい出力管118までチャンネルを通って
走行する間に実施される。この循環におけるチャンネル108の区間および溶液の
速度は、溶液が異なる温度T1、T2およびT3に至り、チャンネルに侵入しチャンネ
ルから放出する間に、例えば、20〜30回サイクルを経験するにように選択される
。結果として、異なるPCR反応は、連続流による連続様式で同じチャンネルに次
々に生じる。上流から下流にかけて同じ所定の瞬間に同じ温度を有するチャンネ
ルの様々なセグメントは、該セグメントに様々な画分の溶液か、または溶液のこ
れらの画分が出力管に接近するときに増加するすでに多くの熱循環を経験してい
る異なるPCR反応が横切る点のみが異なる。
【０１５１】 符号の番号が100だけ加算された図14に表される第2の実施態様は、基板203に
おいて作製され並行に広がっているいくらかのチャンネル208のみにおける先の
実施態様とは異なる。本実施態様の各チャンネル208でも、第1の実施態様のチャ
ンネル108で生じるように同じ事象が生じる。特に、加熱コンポーネントは、基
板全体に対して同じ熱循環を実施する。この第2実施態様では、任意の瞬間で、
すべてのチャンネル208のすべてのセグメントは同じ相互温度を有する。チャン
ネル208はそれぞれ内部に供給および出力管を有する。従って、異なる溶液を同
じ時点で処理することができる。あるいは、例えば、同じ溶液が様々なチャンネ
ルを通って走行する場合、チャンネル208は共通の供給および出力管に結合し得
る。
【０１５２】 図15で表され、類似エレメントの符号が200だけ加算された第3の実施態様では
、デバイスはさらにいくらかのチャンネルを含む。さらに、この時点では、該デ
バイスはもはや熱循環302の1つの単一ユニット（基板、加熱コンポーネントおよ
び制御コンポーネント）を含まないが、例えば2つの番号付けをしたこのタイプ
のいくつかのユニット302a、302bを含む。上流ユニット302aのチャンネル308a、
308bは、それらの下流および末端ならびにそれぞれの伝達管309を通して下流ユ
ニット302bのチャンネル308bの上流末端と連絡するように、直列に配置される。
チャンネルの相互連絡のそれぞれの組は回路を形成する。
【０１５３】 上流ユニット302aはそれ自体第2の実施態様の上流ユニットと同一であり、温
度T1、T2およびT3に関連してすでに記載の熱循環に溶液を供する。下流ユニット
303bは、この特定の場合、パラメータが上流ユニットの熱循環のパラメータとは
異なる熱循環を実施する。従って、この下流循環は、温度T1、T2およびT3とは異
なる3つの温度T4、T5およびT6に関連する。さらに、図5の下方のグラフに表され
ている温度の期間および一連の温度は、第1の循環のものとは異なる。結果とし
て、各回路を通って走行する溶液は、まず溶液が上流ユニット302を通って走行
するときに上流ユニット302aの循環を数回経験し、次いで、伝達管309を横切り
、下流ユニット302bに到着し、ここで、溶液はこのユニット自体の循環を経験し
、これは、このユニットにおける溶液の速度が十分に遅くなるまで数回生じる。
溶液は、出力管318を通ってデバイス301から離れる。
【０１５４】 図16に表される第4の実施態様によるデバイスでは、類似エレメントの符号番
号は300だけ加算されている。デバイス401は、第2の実施態様の熱循環ユニット
に類似する熱循環ユニット402を有する。該デバイスはまた、2つのユニット410a
および410bを含み、それぞれ基板403およびこれらのユニットを横切るチャンネ
ル412において維持するための手段を含み、温度T7およびT8はそれぞれ経時的に
一定である。3つのユニット410a、402および410bは直列およびこの順序で配置さ
れ、それらのそれぞれのチャンネルは下流から上流へ連絡している。従って、供
給管416に導入される溶液は上流ユニット410aのチャンネル412を通って走行し、
ここで、溶液は、予め決定された期間、特に、ユニット402の1つのサイクルの期
間よりも長く、一定温度T7で置かれる。次に、溶液は伝達管409から離れ、次い
で溶液が熱サイクルを数回経験する熱循環ユニット402に到着する。次いで、第2
の伝達管409を通って通過し、溶液は、一定温度T8である下流ユニット410bに走
行し、ここで、該溶液は、もう1つの予め決定された期間、この温度を保持する
。次いで、該溶液は、出力管418を通ってデバイスから排出される。
【０１５５】 類似エレメントが400だけ加算された符号を有する図17には、第2の管514が供
給管516に走行する第5の実施態様が表されている。
【０１５６】 従って、処理しようとする溶液は、例えば、第2の実施態様のものと同一の熱
循環ユニット502に到着するすぐ前に試薬の混合によって形成される。従って上
流混合部が形成される。あるいは、またはさらに、誘導管と側方連絡する出力管
を設置することによって、下流セパレータを配置することができる。
【０１５７】 例えば、図15のデバイスに少なくとも1つの温度ユニットを追加することによ
って、これらの異なる実施態様を相互に組み合わせることも当然可能である。
【０１５８】 これらの様々な実施態様は中断されない連続流溶液によるプロトコルを実施す
ることに注目することが重要である。
【０１５９】 図18〜20は、示された実施態様において使用することができるいくらかのチャ
ンネル4を有する熱循環ユニット2を詳細に示す。基板3は、内部にケイ素基板16
を含むが、このプレートはもう1つの材料、例えば、ガラス、石英、高分子材料
またはプラスチックから作製され得る。チャンネル4は、基板の上面のマイクロ
溝の化学エッチング（それ自体既知の方法で）によって調製される。それぞれの
チャンネル4は直線状であり、1つの側が基板の面の平面に延在する二等辺三角形
（または「V」）の外形を有する。傾斜させた傾斜路は、チャンネルの各末端で
チャンネルの底部を基板の面に接続する。この段階で、それぞれのチャンネル4
は基板の上部において開口している。基板3は、チャンネルの末端に一致するこ
とが可能なオリフィス20を有する第2の基板18を含む。この基板は基板16上に延
在する。従って、該基板はチャンネルの上面を遮断し、それに対するアクセスを
提供する。
【０１６０】 溶液は一方のオリフィス、次いで関連するチャンネル4、次いで他方のオリフ
ィスを循環する。第2の基板18は、第1の基板16と同じタイプの材料から調製する
ことができる。2つのプレートは密封されるか、例えば、一方が他方に結合され
る。
【０１６１】 チャンネルの寸法は、デバイスについて意図される用途と互換可能な任意の寸
法であってもよい。チャンネルの寸法の例は、以下の通りである。 −チャンネルの幅：100μm（数ミクロンから数百ミクロンも想定される）、 −チャンネルの長さ：数センチメートルまで。
【０１６２】 加熱コンポーネント20は、チャンネルを有する上方面に対向するその下方面に
対するプレート16下に配置される。それらは、それ自体既知である形式、例えば
、ペルティエ効果、ジュール効果、放射または対流でのプレートの加熱および冷
却を実施する。加熱コンポーネントは、図1および2で表される構造を有する。
【０１６３】 例えば、2つのプレート16、18のうちの1つの表面で加熱抵抗部を機械加工し、
その全体を熱を排出するための冷却源に置くことによって、加熱コンポーネント
20を直接ケイ素に組み込むことが可能であることにも注目すべきである。
【０１６４】 溶液がユニット2を通過する間のサイクル数は、溶液がユニットに費やす時間
の関数である。従って、溶液の流速に対して良好な制御を有することは重要であ
る。このような制御は、シリンジの駆動または汲み上げ（例えば、圧力または電
気浸透）によって得ることができる。
【０１６５】 様々なDNAを含む溶液を例えば、同じデバイスの様々なチャンネルを使用する
ことができる。
【０１６６】 溶液の温度の制御が可能である限り、チャンネルをキャピラリー管によって形
成してもよい。
【０１６７】 温度T1〜T8は一般に室温とは異なり、好ましくは、デバイスは、各実施態様に
おいて循環を実行するように熱循環の温度を制御するための自動化された手段を
含む。
【０１６８】 （連続流デバイスにおける核酸のタイプの決定） 本発明のデバイスは、遺伝子型決定解析を行うために使用することができる。
家族または症例／コントロール群において一塩基多型などの大量のDNA多型性に
ついて遺伝子型決定を行うことにより、特定の多型性または多型性の群、および
特定の表現型の間の関連を見出すことが可能である。配列多型に加えて、多型性
と表現型との間の関連を見出すためにトリプレット反復などの長さ多型が研究さ
れる。多型性と表現型を連結する関連研究により、病因に関与する遺伝子、治療
用製品に対する遺伝子、および複雑な表現型に関与する遺伝子が同定される。現
在まで、関連研究に対する制限因子は、数千または数万の多型性について数百の
個体の遺伝子型を決定する必要性があることである。
【０１６９】 遺伝子型決定の法医学的用途には、サンプルが抽出される生物もしくは個体の
同定を確立すること、および家系または血統を決定することが含まれる。オープ
ンリーディングフレームにおける欠失または反復に対応する多型性を同定するこ
とは、その多型性に関連する欠損を診断するのに有用である。(Winzelerら、(Sc
ience 285: 901-906 (1999))。
【０１７０】 遺伝子型決定は、生物または個体の病態の原因である生物の株を同定するため
に使用することもできる。そのような方法では、生物または株由来の核酸を含有
するサンプルを個体から得る。核酸サンプルは、異なる生物または株の多型配列
の特徴の同定を決定するために遺伝子型決定される。
【０１７１】 （一塩基多型（SNP）） ヒトDNA多型の約80％は配列多型であり、長さ多型は僅か約20％である。配列
多型の約90％は一塩基多型（SNP）である。3つの多型ヌクレオチドを有する部位
も検出されている。SNPはヒトゲノムにおいて最も広範に分布した遺伝子マーカ
ーであるようであり、ほぼキロベースごとに認められる。SNPは最も一般的なタ
イプのDNA配列変異であるため、これらの遺伝子マーカーの変異間を区別する能
力は遺伝子調査において極めて重要なツールである。多くの遺伝型疾患は、SNP
部位の1点変異の結果である。場合によっては、タンパク質をコードする遺伝子
のヌクレオチド置換を生じる1点変異は、鎌状赤血球貧血および血友病などの疾
患を実際に引き起こすのに十分である。糖尿病、心疾患、様々な癌および特定の
精神障害を含む多くの遺伝子の影響を受ける疾患については、科学者が疾患関連
遺伝子を見出すのに役立つ遺伝子変異の詳細な地図を作成するのを助けるための
マーカーとして、SNPが研究される。
【０１７２】 SNPマーカーを使用し、病態の重症度の存在、不在、または程度に相関する1つ
以上のSNPの変異塩基を同定することによって、疾患に関与する遺伝子または任
意の検出可能な表現型に関連する遺伝子を同定することができる。DNAサンプル
は、疾患を伴うまたは伴わない個体から単離され、各集団由来の1つ以上のSNPの
多型性塩基の正体が検出される。疾患または表現型に統計的関連を有する変異が
同定される。その後、サンプルは個体から採取することができ、疾患または表現
型に関連する1つ以上のSNPの変異塩基を同定して、個体が特定の疾患もしくは表
現型を発達しやすいかどうか、または個体が特定の疾患を患うかもしくは特定の
表現型を所有するかどうかを決定することができる。染色体位置に対する疾患ま
たは表現型に関連するSNPマーカーの地図を作成することにより、SNPマーカーが
生じる遺伝子を同定するか、または疾患の発達もしくは重症度に役割を果たす付
近の遺伝子を示すことができる。科学者らは、ヒトゲノムの高密度SNPを発達さ
せることによって、疾患の由来遺伝子、個体を疾患にかかりやすくし、治療に対
する個体の応答の変異に基づく遺伝的差異を正確に指摘し、所定の遺伝子構成か
らなる個体の疾患を治療するのに最も適切な薬物を予想することが可能であると
期待している。
【０１７３】 ヒトゲノムにおける高頻度かつ広範な分布のSNPは、同定試験、ゲノム地図作
成、および医学的診断のためのバイアレリックマーカーの貴重な供給源となる。
SNPは、3×109塩基対のヒトゲノムに沿って散在する107部位を超える予想数でヒ
トゲノムに密集している。SNPは、可変性縦列重複配列数（VNTR）多型性または
制限酵素断片長多型（RFLP）などの他のクラスの多型よりも高頻度でより一様な
分布で生じるため、目的の遺伝子座の極付近にSNPマーカーが認められる可能性
がより高い。SNPは高い変異率を有するVNTRよりも安定に変異するため、SNPはマ
ーカーとして好適に選択される。さらに、VNTRおよびRFLPを使用するゲノム解析
は、多型性を検出するために使用される方法に強く依存するが、新たなSNPは、
新たなSNPを検出するためのランダム配列決定または既知のSNPを解析するための
標的刺された配列決定のいずれかの配列決定によって容易に検出することができ
る。
【０１７４】 異なる形態の特徴付けられたSNPは容易に区別され、従って、個人内および個
人間の多型に基づく遺伝子型決定ための一般検査に使用することができる。SNP
は、配列が1ヌクレオチドだけ異なり、2つのみの対立遺伝子を有する座位に対応
し、SNPを高度な並列検出および自動化された評価に適切にする。これらの特徴
により、SNP解析を使用する迅速、高スループットの遺伝子型決定の可能性が与
えられる。
【０１７５】 （本発明による遺伝子型決定のためのデバイスおよび方法） 本発明の1つの実施態様は、極めて大規模な遺伝子型決定のためのデバイスお
よび方法を提供し、ここで、遺伝子型決定プロトコルは、本発明のマイクロ流体
デバイスの連続流に組み込まれる。試薬の配分はすべて自動化することができ、
温度循環はデバイスに組み込まれる。マイクロ流体基板は閉じた系を構成し、従
って反応混合物が蒸発する危険性は取り除かれる。従って反応容積がミニチュア
化され、これに伴いサンプルおよび試薬の消費量が減少する。プロトコルは、数
百のチャンネルについて並列かつ直列で行われ、高スループットの遺伝子型決定
が可能である。さらに、半使い捨ておよび取り外し可能なマイクロ流体基板と固
定された外部エレメント（液体供給システム、熱支持体）との組み合わせにより
コストが減少する。
【０１７６】 本発明の1つの態様では、サンプルの温度循環は、温度において循環する加熱
エレメントに適切な試薬を通過させることによって実施される一方、サンプルは
所望の回数のサイクルに暴露されるように流速が調節される。温度循環は、変異
および多型を検出または型決定するために開発された多くの技術において重要で
ある。いくつかの遺伝子型決定はハイブリダイゼーションおよび連結反応に基づ
く。鎖置換および自己維持的配列複製は、本発明の以後の遺伝子型決定のための
DNAのストレッチを増幅するために使用または改変することができる等温方法で
ある。他の遺伝子型決定技術では、DNAのストレッチの配列を決定するか、また
は部位で単一のヌクレオチドの正体を決定するためのPCRに基づく伸長が利用さ
れる。Baranyら(PCR Meth Appl 1: 5-16, 1991)により記載の通り、連結反応とP
CRとを組み合わせることもできる。
【０１７７】 現在、本発明において提供されるデバイスで利用することができる様々な方法
のいずれかによって、SNPを特徴付けすることができる。これらの方法には、部
位の配列決定、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）、リガーゼ／ポリメラ
ーゼ解析、PCR-RFLPアッセイ、Taq man PCRアッセイ、分子ビーコンアッセイ（m
olecular beacon assay）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブ
によるハイブリダイゼーションアッセイ、ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸
（ddNTP）などの検出に役立つように改変されているヌクレオチドを利用するマ
イクロシークエンシングなどのプライマー伸長アッセイが含まれる。
【０１７８】 マイクロ流体デバイスに対し他のアッセイ（化学修飾もしくはタンパク質結合
、および／または標的サンプルが、E. coliメチル指向性ミスマッチ修復システ
ムを使用するミスマッチ修復検出（MRD）を含む既知の配列のプローブに暴露さ
れるヘテロ二本鎖DNAの切断およびミスマッチの化学的切断（CCM）に基づく方法
など）を全体的または部分的に適応することもできる。DNA配列決定に基づく方
法には、直接配列決定およびdUTPの存在下で増幅されたDNAからウラシル塩基を
取り出すためにウラシルN-グリコシラーゼを利用し、続いてUNGによって作製さ
れた「歩行不能症」部位の分子を切断するUNG介在T配列決定（何故なら、いずれ
かの鎖に対して「T」塩基に関与するUNGは12の可能な単一ヌクレオチドの変異の
うち10の検出を可能にするからである）を含む。(KwokおよびChen, Genetic Eng
ineering 20: 125-134 (1998))。
【０１７９】 本発明に従い遺伝子型決定に関連する様々な反応を実施した後、チャンネル流
のサンプル混合物は、多型が存在することを検出するための検出器を通過する。
従って、本発明はさらに、遺伝子型決定反応の産物を検出するための手段を提供
する。上記のように、検出帯域またはデバイスは、マイクロ流体基板から直接検
出するために設置もしくは配置することができるか、または個別のデバイスとし
てかもしくは個別のマイクロ流体基板において提供することができる。検出手段
は、一般に任意の酵素的、光学的、電気的、または放射能に基づく検出プロトコ
ルを含む広範な適切な実施態様から選択することができる。好ましい検出方法は
、蛍光強度を直接検出することによるか、蛍光の偏極を検出することによるか、
または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を検出することによって蛍光色素を検出
することを含む。
【０１８０】 選択されるプロトコルに依存して、分離工程を行ってもよい。分離工程には、
反応産物の電気泳動またはクロマトグラフィー分離が含まれる。検出工程につい
て上記のように、分離工程はマイクロ流体基板内で行っても、または分離デバイ
ス上もしくは分離マイクロ流体基板内で行ってもよい。分離は、所定の分離目的
に適切な媒体、電気泳動分離のための電極、またはクロマトグラフィー分離のた
めのポンプに適切な媒体を取り込むことによって本発明のデバイスに組み込むこ
とができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ
フィー、もしくは電気泳動のための媒体は、本発明の装置のチャンネルまたは他
の構造に取り込むことができる。サンプルが供給容器を通ってデバイスに導入さ
れる場合、分離のための試薬および媒体はすでにチャンネル内に埋包されている
。あるいは、分離のための試薬および媒体は後に導入してもよく、例えば、それ
らは、増幅または配列決定用試薬の下流で試薬貯蔵部を通ってサンプル混合物に
添加してもよい。チャンネル内の連続流中のサンプルは、前記チャンネル内の媒
体に進入することができ、選択された分離方法の原理に従って分離される。分離
されたサンプルは、染色されたバンドの可視検出または本発明のデバイスの実施
態様に付着もしくは組み込まれた蛍光検出器による蛍光バンドの検出を含む適切
な方法、あるいは、反応生成物の電気的特性の検出または放射性もしくは非放射
性標識反応生成物の検出によってチャンネル内でin situで検出することができ
る。あるいは、分離媒体により分離されたサンプルは、出力容器104に溶出され
、サンプルはもう1つの部位でさらなる解析のために回収される。
【０１８１】 （本発明によるマイクロシークエンシング） マイクロ配列決定技術により、核酸の所定の位置に存在するヌクレオチドを同
定することが可能である。初期に適用されるマイクロシークエンシング技術は、
SNP（一塩基多型）の型を決定することおよび点変異を検出することを含むが、
この技術はより複雑な多型性を検出するためにも使用することができる。この技
術はハイブリダイゼーションの特異性とポリメラーゼによるヌクレオチドの酵素
認識の特異性とを組み合わせるため、ハイブリダイゼーションに基づくSNP型決
定技術よりも特異的である。目的のヌクレオチドは、ddNTP（ヌクレオチド塩基
を遮断する）によるプライマーの伸長によって検出される。目的のヌクレオチド
の直接下流の領域に相補的なプライマーが使用される。このプライマーは、プラ
イマーの３’末端が検出しようとする特定のヌクレオチド塩基に隣接するような
形式で標的核酸と対合する。このプライマーは、ddNTPの存在下でポリメラーゼ
による相補鎖の合成を開始し、標的核酸中に存在するヌクレオチドの相補体であ
る単一のddNTPによるこのプライマーの伸長を可能にする。次いで、取り込まれ
たddNTPが検出される。好ましくは、それらの検出を容易にするためにddNTPは標
識される。
【０１８２】 例えば、ゲノムDNAなどのサンプル中の特定のヌクレオチド、またはSNPを検出
するために、このマイクロシークエンシング技術は、解析しようとする多型を担
持する領域を増幅する工程によって進行されるべきである。増幅反応（一般に、
それはPCR反応である）後、過剰のdNTPおよびPCRプライマーを除去するために、
増幅産物の精製が必要である。
【０１８３】 マイクロシークエンシング反応後、しばしば第2の精製工程を使用して、マイ
クロシークエンシング用プライマーの３’末端に取り込まれたddNTPを検出する
前に、過剰の標識ddNTPが除去される。この後者の精製は、一般にゲル分離に関
与する。しかし、この後者の精製工程を回避するために、均質相検出方法が好適
に選択される。従って、マイクロシークエンシングによって遺伝子型を決定する
ためのプロトコルは複雑である。該プロトコルは、様々な工程に関与し、各工程
は試薬を混合することおよび長い反応時間を含む。プロトコルの様々な酵素反応
は、特定の温度で実施されるべきである。PCRおよびマイクロシークエンシング
反応は熱循環によって行われる。
【０１８４】 PCR、精製、マイクロシークエンシング反応および検出がマイクロプレートの
ウェル内の溶液中で行われる均質相プロトコルが開発されている(Chenら、Proc.
Ilatl. Acad. Sci. USA, la, 94120: 10756-10761, (1997))。この均質相プロ
トコルでは、取り込まれたddNTPはエネルギー移動による蛍光によって検出され
る。従って、マイクロシークエンシング用プライマーは標識される。マイクロプ
レートにはすべての工程が組み込まれているにも係わらず、この方法ではきわめ
て大規模な遺伝子型決定はできない。特に、マイクロプレートへの試薬の連続添
加についてみると、プロトコルの各工程において配分が極めて多数になる。これ
らの配分は、配分ロボットの助けにより自動化することができるが、この配分は
極めて遅く、蒸発の危険性がかなりある。従って、反応容積はかなり大きく（10
〜100μl）、しばしば微量で利用できるべきサンプルおよびしばしば多くのコス
トがかなり消費されることになる。さらに、高度に自動化された様式でマイクロ
プレートをそのような高スループットで操作するのは、不可能である。
【０１８５】 図21は、本発明に従って行うことができる特定の例示的遺伝子型決定プロトコ
ルのための一般スキームを示す。図21は、連続流に組み込まれた遺伝子型決定の
ためのマイクロ流体基板100を示す。このプロトコルでは、型決定しようとするD
NAサンプルは、矢印で示された方向に向かって連続流でチャンネル108に供給す
る入力容器102に注入される。図に示されるように、各チャンネル1〜nは、各チ
ャンネルがDNAの単一のサンプルのみを含有するように所定のDNAの連続注入を受
ける。従って、DNA 1〜nは並列で走行する。PCR試薬は、試薬容器または貯蔵部1
22aを通して注入される。異なるPCR試薬がチャンネル内の各連続DNAサンプルに
対して注入されるが、このPCR試薬は、並列ですべてのチャンネル1〜nを横切っ
て同時に注入される。このサンプルは、PCR帯域130を横切ってPCR試薬と混合さ
れ、ここで、熱支持体はサンプルの温度を循環させてPCR反応を行う。精製試薬
（好ましくは酵素）は、試薬容器または貯蔵部122bに注入される。同じ精製試薬
がすべてのDNAに対し連続および並列の両方で注入される。次いで、精製反応混
合物は、精製帯域131を横切り、ここで、熱支持体でサンプルは精製反応のため
の第1の温度に至り、精製酵素の不活化のための第2の温度に至る。次いで、マイ
クロシークエンシング用試薬は、試薬容器または貯蔵部122cに注入される。次い
で、マイクロシークエンシング用反応混合物は、マイクロシークエンシング帯域
132を横切り、ここで、熱支持体は、マイクロシークエンシング反応を行うため
に反応溶液の温度を循環させる。PCR試薬について、異なるマイクロシークエン
シング用試薬がチャンネル内の各連続DNAサンプルに対して注入され、マイクロ
シークエンシング用試薬は、並列ですべてのチャンネル1〜nを横切って同時に注
入される。次いで、完了した反応は出力容器104を進行し、検出帯域133に続く、
ここで、マイクロシークエンシング用プライマーに取り込まれたヌクレオチド塩
基の正体は、検出デバイスによって決定される。随意的に、検出帯域は、基板10
0に設置することができる。
【０１８６】 図22は、本発明に従って遺伝子型決定が行われる特定の実施態様を示す。図22
は、連続流に組み込まれた遺伝子型決定のためのマイクロ流体基板100の切片を
示す。入力容器102および出力容器104はこの図に示されている。並列に配置され
た内部チャンネル108は、それぞれ供給容器および出力容器に接続している。供
給容器および出力容器は、基板100aで作製される貫通開口部によって本質的に形
成される。チャンネル108は、基板100bにおいてエッチングされた溝の形態であ
る。図はまた、供給容器102と出力容器104との間に構築された試薬貯蔵部122a、
122b、122cを示す。接続部は、各試薬貯蔵部をすべてのチャンネル108に接続す
ることが可能である。マイクロ流体基板は、複数のチャンネルを並列で含むこと
が認められる。典型的に、少なくとも100のチャンネルが並列で配置されている
。
【０１８７】 図には示されていないが、供給容器および貯蔵部はチャンネルにサンプルを継
続的に供給し、試薬を配分するための液体供給システムにそれぞれ関連する。
【０１８８】 マイクロ流体基板が追加される熱支持体は示されていない。この熱支持体は、
循環することができる帯域を含むいくらかの温度調節帯域を含む。これらの温度
調節帯域は、試薬貯蔵部122aと122bとの間に配置されるチャンネル108の切片に
一致し、該チャンネル108の切片は、試薬貯蔵部122cと出力容器104との間に配置
される。
【０１８９】 本発明のデバイスはまた、出力容器において検出システムを含む。検出はすべ
てのチャンネル108に対して並列および直列で行われる。あるいは、検出は、出
力容器では行われないが、最終の温度調節帯域の出力部のすぐ上流で行われる。
この場合、透明な材料（例えば、ガラス、石英またはプラスチック）のプレート
を局部的に基板100aの代わりに使用して、チャンネルを介するサンプルの走行を
直接検出することができる。
【０１９０】 特に有利なことに、サンプルおよび試薬の注入、反応温度および温度サイクル
、ならびに検出はすべて自動化される。
【０１９１】 連続流中のサンプルは供給容器102を通してチャンネル108に注入される。好ま
しくは、同じDNAが直列でチャンネル108に注入され、DNAの注入は不活物である
「セパレータ」（随意的に非混合性液体）によって相互に分離される。注入は並
列に配置されたすべてのチャンネル108について同期である。時間tで注入された
サンプルは、すべてのチャンネルに対して並列で試薬の注入および検出が同時に
行われるような形式で、チャンネルを通って同時に走行する。
【０１９２】 PCR試薬は、並列で試薬貯蔵部122aのすべてのチャンネルに注入される。同じ
試薬が同時に並列ですべてのチャンネルに注入される。一方、100多型部位に対
して同じDNAの型を決定するのを助けるために、100の異なる試薬を直列で所定の
チャンネルに注入する。マイクロ流体基板に100のチャンネルが並列で配置され
る場合、同じ基板上で100のDNAが並列で型決定される。同じチャンネルへの注入
は、「セパレータ」の注入によって相互に分離される。
【０１９３】 次いで、反応混合物は、循環することができる温度調節帯域を通って走行し、
ここで、増幅反応が実施される。チャンネルは直線状であり、反応混合物はただ
1つの加熱帯域を通って走行することに注目すべきである。本発明のこの特定の
配置の利点については、上記に記載されている。PCR反応の特徴があれば、サン
プルの画分が温度調節帯域に侵入する瞬間の該温度調節帯域のサイクル温度は、
ほとんど重要でないことも注意すべきである。最後に、この配置は、循環時間お
よびチャンネルを通って走行する溶液の流速を調節することによって実施される
熱サイクルの回数（典型的に、1回のPCRについて15〜40回）を随意に変動するこ
とが可能である。
【０１９４】 プロトコルの第2の工程であるPCR産物精製工程は、精製試薬が貯蔵部122bに注
入されることによって開始する。同じ試薬が並列および直列ですべてのチャンネ
ル108に注入される。
【０１９５】 次いで、反応混合物は精製反応のために37℃に温度調節される第1の帯域、お
よび精製酵素の不活化のために94℃に温度調節帯域を通って走行する。
【０１９６】 マイクロシークエンシング反応は、マイクロシークエンシング用試薬の注入に
よって開始する。PCR試薬について先に記載のように、それぞれの多型の型を決
定するための試薬が使用される。100多型を型決定するために、様々な試薬が直
列で同じチャンネル108に注入される。
【０１９７】 次いで、反応混合物は、循環することができる温度調節帯域を通って走行し、
ここで、増幅反応が実施される。
【０１９８】 この温度調節帯域で、マイクロシークエンシング用プライマーの３’末端で取
り込まれるddNTPの検出が並列および直列で実施される。典型的に、ddNTPは発蛍
光団で標識される。
【０１９９】 検出は、蛍光、偏極した蛍光、もしくは蛍光の時間相関を測定することによっ
て、または分光偏光分析によって実施される。さらに、これらの検出手段は既知
である。
【０２００】 実施例２では、本発明によるPCRによる増幅およびマイクロ流体基板における
マイクロシークエンシングのための集積化されたプロトコルの例が提供される。
【０２０１】 （対立遺伝子特異的連鎖反応（LCR）の方法による遺伝子型決定） 高解像の遺伝子型決定は、対立遺伝子特異的リガーゼ連鎖反応（LCR）の耐熱
性リガーゼを使用して、本発明に従い行うことができる。(Baranyら、(PCR Meth
. Appl. 1: 5-16 (1991))。対立遺伝子特異的LCRは、4種のオリゴヌクレオチド
（標的DNAの一方の鎖にハイブリダイズする2種および対向鎖にハイブリダイズす
る隣接のオリゴヌクレオチドの相補の組）を用いる。耐熱性DNAリガーゼそれぞ
れの組に共有結合する。但し、接続では完全な相補性が認められる。1ラウンド
のハイブリダイゼーションおよび連結反応から得られるオリゴヌクレオチド産物
は、次のラウンドで基質として作用し得、PCR増幅に類似のオリゴヌクレオチド
の指数増幅を可能にする。オリゴヌクレオチド接続での一塩基ミスマッチは増幅
されず、従って区別される。変異特異的オリゴヌクレオチドの第2の組は、変異
対立遺伝子を検出または確認するための個別の反応に使用される。
【０２０２】 対立遺伝子特異的連結反応の産物の検出および解析は、本発明に従って行われ
る。好ましい実施態様では、前記産物は、マイクロ流体基板内または該基板から
流動する反応産物から、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、または偏極した蛍光
を測定することによるさらなる第2の分離工程を伴うことなく直接検出される。
従って、マイクロ流体基板は検出帯域を含んでもよい。検出帯域は任意の材料（
例えば、ケイ素、ガラスまたは偏極した蛍光のためのプラスチック）からなり得
る。好ましくは、本発明の多の実施態様では、連結反応産物は、デバイスの領域
またはマイクロ流体デバイスに接続された別のデバイスに含有される分離媒体を
通して反応混合物を通過させ、連結したおよび連結していないオリゴヌクレオチ
ドの流出を検出することによって解析される。もう1つの実施態様では、反応混
合物は連続流によって、マイクロ流体デバイスに接続されたデバイスに好適に設
置された電気泳動分離のための媒体に導入され、電気泳動が実施され、生成物は
、媒体内の生成物の位置によってかまたは媒体からの生成物の溶出の順序によっ
て検出される。さらにもう1つの実施態様では、反応混合物は連続流によって回
収チャンバに移動し、そこから該反応混合物が取り出され、解析される。
【０２０３】 リガーゼ連鎖反応を使用する本発明の1つの実施態様では、サンプルは供給容
器102に導入され、チャンネル108に配分される。1つの対立遺伝子に特異的なオ
リゴヌクレオチドを含有するリガーゼ連鎖反応のための試薬は、試薬貯蔵部122a
に導入され、チャンネル108を通って流動するサンプルと混合され、その後、チ
ャンネル108の遠位末端に設置される分離媒体に流動する。分離手順が実施され
、サンプルが出力容器104に溶出するときに該サンプルは回収される。本実施態
様では、次いで、第2の同一サンプルが供給容器102およびチャンネル108に導入
され、先のサンプルとは「セパレータ」によって分離される。もう1つの対立遺
伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを含有するリガーゼ連鎖反応のための試薬は
、試薬貯蔵部122aに導入され、第2のサンプルと混合され、上記の手順が実施さ
れる。以下の実施例3は、LCRによる遺伝子型決定のための本発明のデバイスの使
用について記載している。
【０２０４】 （PCRに基づく遺伝型決定方法：Taq Man(登録商標)方法） 診断アプリケーションに優先的に、ヌクレオチド塩基の正体を決定するTaq Ma
n(登録商標)方法（PE Applied Biosystems）により本発明を使用してもよい。Ta
q Man(登録商標) PCRシステムは、さらなる検出のための処理を伴うことなく、
色素標識されたDNAプローブの蛍光の増加をモニターすることによって、PCR産物
の検出を提供する。Taq Man(登録商標) PCRシステムは、均質相検出システムで
ある。
【０２０５】 本発明は、DNAポリメラーゼの5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を利用する標的
特異的プローブに基づき(Hollandら、PNAS USA 88: 7276-7280 (1991)；Lawyer
ら、J. Biol. Chem. 264: 6427-6437 (1989))、PCR中の蛍光レポーターの放出に
よるPCR産物の検出(Hollandら(1991)；Leeら、Nuc. Acid. Res. 21: 3761-3766
(1993))を可能にする。プローブは、一般にリンカーアームを通って付着した5'
レポーター色素（例えば、FAM、TET、JOE、HEX）および3'クエンサー（quencher
）色素（TAMRA）で標識したオリゴヌクレオチドからなる。プローブがインタク
ト（intact）である場合、クエンサー色素に対してレポーター色素が近接してい
るとレポーターの蛍光が抑制される。PCR中に、目的の標的が存在すれば、プロ
ーブは、プライマー部位の前方向と逆方向との間で特異的にアニールする。ポリ
メラーゼの5'−3'ヌクレオチド鎖分解活性（AmpliTaq Gold(登録商標)）は、プ
ローブが標的にハイブリダイズする場合にのみレポーターとクエンサーとの間の
プローブを切断する。ポリメラーゼは遊離のプローブを消化しない。次いで、プ
ローブは標的から置き換えられ、鎖の高分子化が継続する。このプロセスはサイ
クルごとに生じ、PCR産物の指数的蓄積を妨害しない。クエンサー色素からレポ
ーター色素を分離すると、レポーターからの蛍光発光の増加が認められ、これは
測定することができ、PCR中の標的増幅の直接的結果である。Taq Man(登録商標)
システムについては、TaqMan(登録商標)PCR試薬キットプロトコル、PE Applied
Biosystems (1996)にさらに記載されている。レポーター蛍光の検出のための任
意の適切なデバイスを使用して、レポーター蛍光の増加をモニターすることがで
きる。1つの実施態様では、ABI Prism Sequence Detection Systen (PE Applied
Biosystems)などのデバイスが使用される。他の実施態様では、検出デバイスは
本発明のマイクロ流体デバイスに組み込まれるか、または本発明のマイクロ流体
基板に作動可能に連結されたさらなるマイクロ流体基板に組み込まれる。
【０２０６】 Taq Man(登録商標) PCRシステムを使用する本発明の1つの実施態様では、サン
プルは供給容器102に導入され、チャンネル108に配分される。1つの対立遺伝子
に特異的なオリゴヌクレオチドを含有するTaq Man(登録商標) PCR反応のための
試薬は、試薬貯蔵部122aに導入され、チャンネル108を通って流動するサンプル
と混合され、その後、チャンネル108の遠位末端に設置される検出帯域に流動す
る。蛍光検出工程が実施され、サンプルが出力容器104に溶出するときに該サン
プルは回収される。あるいは、サンプルが出力容器104に流動するときに該サン
プルは回収され、もう1つのまたは好ましくは作動可能に連結された検出デバイ
スに反応収量物が流動するときに蛍光検出工程は実施される。本実施態様では、
次いで、第2の同一サンプルが供給容器102およびチャンネル108に導入され、先
のサンプルとは「セパレータ」によって分離される。もう1つの対立遺伝子に特
異的なオリゴヌクレオチドを含有するTaq Man(登録商標) PCR反応のための試薬
は、試薬貯蔵部122aに導入され、サンプルの第2のアリコートと混合され、上記
の手順が実施される。以下の実施例5は、Taq Man(登録商標) PCRによる遺伝子型
決定のための本発明のデバイスの使用について記載している。
【０２０７】 （PCRに基づく遺伝子型決定方法：分子ビーコン） 診断アプリケーションに優先的に、ヌクレオチド塩基の正体を決定する分子ビ
ーコンにより本発明を使用してもよい。
【０２０８】 分子ビーコンは均質溶液中の特定の核酸の存在を報告することができるオリゴ
ヌクレオチドプローブである(TyagiおよびKramer, Nature Biotech. 14: 303-30
8 (1996); Tyagi, S.ら、Nature Biotech. 16: 49-53 (1998))。これらのビーコ
ンは、内部消滅発蛍光団を有するヘアピン形状の分子であり、該ビーコンが標的
核酸に結合するときその蛍光は保存される。分子のループ部分が標的核酸分子に
相補的なプローブ配列であるような形式で、それらは設計される。主部はプロー
ブ配列の末端に対する相補アーム配列のアニーリングによって形成される。蛍光
レポーター色素（例えば、FAM、TET、JOE、HEX）は一方のアームの末端（5'また
は3'）に付着し、クエンサー色素（TAMRA、DABCYL）は他方のアームの末端に付
着する。主部が2つの色素を極めて近接に保つ場合、クエンサー色素に対してレ
ポーター色素が近接しているとレポーターの蛍光が抑制される。プローブが標的
分子に遭遇すると、プローブは主部より長くかつより安定なハイブリッドを形成
し、その長さおよび剛性によって主部ハイブリッドの同時存在が防止される。分
子ビーコンが、主部を引き離すこのようなコンホメーション変化を経験する場合
、レポーター色素およびクエンサー色素は相互に離れて蛍光は保存される。複数
の標的ヌクレオチドを検出するために、広範な発蛍光団を使用することができる
。さらに、多くの異なる発蛍光団に対して普遍的クエンサーとしてDABCYL、非蛍
光発色団を使用することができる。分子ビーコン方法については分子ビーコンの
ためのTyagiらのプロトコルにさらに記載されており、均質溶液において核酸を
検出するためのハイブリダイゼーションプローブについてはDepartment of Mole
cular Genetics, New York University (1997)に記載されている。
【０２０９】 分子ビーコンは、（a）プローブのヌクレオチド配列が標的配列または標的ヌ
クレオチドを含有する配列に相補的である、（b）それらのアーム配列の長さは
主部がPCR反応のアニーリング温度で形成されることを可能にする、および（c）
ループ配列の長さはループ−標的ハイブリッドがアニーリング温度で安定である
ことを可能にするように形成される。これは、熱変性プロフィールを得ることに
よって決定することができる。ビーコンは、PCR反応中、PCRプライマーによって
含まれる。ビーコンは変性工程中およびアニーリング温度時の両方で蛍光を発す
るが、変性工程からアニーリング温度へ温度を低下させる間は蛍光を発せず、ま
たビーコンはプライマー伸長温度ではテンプレートから解離するためプライマー
伸長工程では蛍光を発しない。
【０２１０】 2つの対立遺伝子特異的分子ビーコンは、それぞれが異なる発蛍光団で標識さ
れており、遺伝子型決定反応に含まれる。このため1つはホモ接合体とヘテロ接
合体とを区別することが可能である。例えば、野生型対立遺伝子に特異的な分子
ビーコンは発蛍光団（例えば、テトラクロロフルオレセイン（TET））で標識さ
れ、変異対立遺伝子に特異的な分子ビーコンはもう1つの発蛍光団6-カルボキシ
フルオレセイン（FAM）で標識される。DABCYLは、両方の分子ビーコンに対して
クエンサーとして使用される。各PCRにおいて2つの異なる分子ビーコンを使用す
ることによって、2つの配列変異体の3つの可能な対立遺伝子の組み合わせ（遺伝
子型）を検出される蛍光のタイプ（TET蛍光であれが野生型対立遺伝子に対する
ホモ接合体を示唆し、FAM蛍光であれば変異対立遺伝子に対するホモ接合体を示
唆し、TETおよびFAM蛍光の両方であればヘテロ接合体を示唆する）によって同時
に区別することができる。
【０２１１】 PCR反応後、チャンネルからサンプルを回収するときに蛍光を測定することが
できる。特定の実施態様では、実時間で、好ましくはアニーリング温度で蛍光を
モニターすることができる。報告される蛍光を検出するための任意の適切なデバ
イスを使用して、レポーター蛍光をモニターすることができる。1つの実施態様
では、ABl Prism Sequence Detection Systen (PE Applied Biosystems)などの
デバイスが使用される。他の実施態様では、検出デバイスは本発明のマイクロ流
体デバイスに組み込まれるか、または本発明のマイクロ流体基板に作動可能に連
結されたさらなるマイクロ流体基板に組み込まれる。以下の実施例６は、分子ビ
ーコンを使用して遺伝子型決定をするための本発明のデバイスの使用を示す。
【０２１２】 （PCR−配列特異的プライマー（SSP）） 遺伝子型決定は、対立遺伝子特異的PCR（AS-PCR）とも呼ばれる配列特異的プ
ライマー（PCR-SSP）(Metcalfeら、Vox Sang 77: 40-43 (1999))を使用して本発
明に従って行うことができ、競合的多重PCR方法は、３’末端が対立遺伝子に正
確に一致するプライマーを使用することによってのみPCR増幅を連続的に実施す
ることができる並列反応を使用する。Sohda (J. Clin. Lab Anal. 13: 205-208
(1999))。
【０２１３】 （体細胞遺伝子型決定のためのサンプル調製：RT-PCR） 本発明は、発現された配列の逆転写酵素および入れ子型PCR（RT−入れ子型PCR
）を使用し、続いて完全には判っていない場合の実際の配列を同定および増幅す
るための第1の工程として使用することができる縮重PCR技術を提供するサイクル
配列決定(Happら、Vet. Immunol. Immunopathol. 69: 93-100 (1999))を使用し
てサンプルの遺伝子型決定をするためのデバイスおよびサイクルを提供する。Ha
rwoodら、U. Clin. Microbiol. 37: 3545-3555 (1999))。1つの実施態様では、
増幅テンプレートは、全RNAに対して逆転写酵素PCR（RT-PCR）を実施することに
よって生成される。1つの実施態様では、RT-PCR反応はデバイスのチャンネル内
で実施され、以後の反応のための試薬はデバイスの混合物に直接添加される。あ
るいは、RT-PCRは、デバイスの外部で実施され、アリコートが本発明のデバイス
に導入される。
【０２１４】 （任意にプライムされたPCR（AP-PCR）を使用する多型部位の同定 本発明は、しばしば潜在的多型性を見出すための予備的工程として有用である
任意にプライムされたPCR（AP-PCR）を実施するためのデバイスおよび方法を提
供する。Jonasら(J. Clin. Microbiol. 38: 2284- 2291 (2000))。この方法では
、プライマーは低いストリンジェンシー、例えば、36℃で60秒のサイクルの条件
下でゲノムDNAにアニールされる。伸長および増幅サイクル後、PCR産物は、多型
を検出するために配列決定される。実施例4では、AP-PCRを使用して多型を同定
するための本発明のデバイスの使用について説明する。
【０２１５】 （AFLPおよびfAFLPの方法による遺伝子型決定） さらにもう1つの実施態様では、本発明は、AFLP（増幅された断片長多型）フ
ィンガープリントを使用して本発明に従って実施される遺伝子型決定のためのデ
バイスおよび方法を提供する。AFLPは、全ゲノム由来の制限断片の選択的PCR増
幅によって独特なDNAフィンガープリントを生成する。AFLPフィンガープリント
は、2つの異なるDNA制限エンドヌクレアーゼで染色体DNAを消化し、アダプター
を粘着末端に連結し、アダプターに相補的なプライマーでフラグメントを増幅す
ることによって作製される。本発明はまた、fAFLP（蛍光増幅された断片長多型
）として知られる改変物でもあり、以下の実施例に詳細に記載されている(Hooke
yら、J. Microbiol. Meth. 37: 7-15 (1999)；Gouldingら、J. Clin. Microbiol
. 38: 1121-1126 (2000))。
【０２１６】 本発明に従ってfAFLPを実践するために、サンプルは供給容器102に導入され、
該サンプルはそこから複数のチャンネル108に流動する。消化のための制限酵素
および他の試薬が貯蔵部122aに導入され、サンプルと混合される。あるいは、予
め消化されたDNAを供給容器102に導入する。消化されたDNAをアダプターに連結
するための試薬が貯蔵部122bに導入される。蛍光色素5/6-FAMを含む増幅工程の
ための試薬が試薬貯蔵部122cに導入され、予め消化され、アダプターに連結され
ているサンプルと混合される。増幅工程後、サンプルは出力容器104で回収され
、解析のために取り出すことができる。あるいは、電気泳動分離が可能な第2デ
バイスを本発明のマイクロ流体基板に接続することができる。
【０２１７】 （普遍的ヘテロ二本鎖発生器（UHG）を使用する遺伝子型決定） 本発明は、PCR産物のためのハイブリダイゼーションプローブとして普遍的へ
テロ二本鎖発生器（UHG）と呼ばれる合成分子を使用する遺伝子型決定のための
デバイスおよび方法を提供する。UHGは、変異点の極付近にストラテジー配列改
変物を含有する標的配列の増幅可能なコピーである。UHGは、混合され、変性さ
れ、標的配列を含有するアンプリコンと再アニールされる。2つの異なる対立遺
伝子の相補領域間で形成される同じ対立遺伝子およびヘテロ二本鎖の相補鎖によ
って形成されるホモ二本鎖を分離および同定するために、ホモ二本鎖およびヘテ
ロ二本鎖のクロマトグラフィーまたは電気泳動分離を使用される(Bollaら、J. L
ipid Res. 40: 2340-2345 (2000))。UHGは合成、融合および以後の増幅によって
構築され、該増幅は、4重複ヌクレオチドについて有意の回数のサイクルで、例
えば、94℃を1分間、57℃を1分間、72℃を1分間のサイクルが30サイクル行われ
る。UHGでプローブすべきゲノムDNAも同様にPCR方法で増幅される。UHGは、本発
明のデバイスおよび方法に従って作製することができ、ここで、チャンネル108
を介する連続流中のサンプル混合物は、該サンプル混合物が熱循環を経験する温
度調節帯域を通って通過する。あるいは、UHGは、予め構築され、試薬貯蔵部122
aまたは122bまたは122cを通してチャンネル108中の増幅されたDNAサンプルに添
加してもよい。
【０２１８】 （本発明による他の化学的、生化学的および生物学的プロセス） 本発明は、生化学的および生物学的解析のための新規の方法を有利に実践する
ためのデバイスおよび方法を提供する。本発明の有利な態様には、温度調節帯域
の正確な温度制御の態様、少なくとも2つの異なる温度を含む本発明の熱循環態
様、本発明の連続流態様、サンプルがデバイスを通って流動するときにサンプル
に反応物を添加する能力、サンプルがデバイスを通って流動するときにサンプル
からアリコートを取り出す能力、ならびに反応、分離、および検出を本発明のデ
バイスのチャンネル108に組み込む能力が含まれるが、これらに制限されない。
【０２１９】 本発明は、プロテオミクス、多糖の解析、精製化学品の合成、高分子合成およ
び薬物のスクリーニングの分野のアプリケーションに有利に一般的に使用され得
る。効果または稀なサンプルを扱うそのようなアプリケーションは、小さなサン
プル容積を提供し、サンプルの蒸発を防止する閉じた系、および高スループット
を提供することができる本発明のシステムにおいて有利に行われる。
【０２２０】 （プロテオミクス） 最近まで、組織、細胞および生物学的液体のタンパク質の配列解析は、数年間
の間に迅速化され、自動化されたプロセスとなっている遺伝子（ゲノム学）の配
列および発現解析とは極めて対照的に労力が掛かる。プロテオミクスは、タンパ
ク質をより小さな高スループット、自動化された様式で解析することが可能な能
力を有し、薬学的研究および開発に重要な意味を持つ。
【０２２１】 プロテオミクスがヒトゲノムを理解し、組織化し、そしてヒト由来の医学的に
重要なタンパク質および遺伝子の発見を加速するかについて如何に重要であるか
は、現在迅速に知られてきている。疾患のサンプルとコントロールのサンプルと
を比較することによって、「疾患特異的タンパク質」を同定することが可能であ
る。これらは、薬物の開発のための標的および疾患の分子マーカーとしての能力
を有し得る。
【０２２２】 ほとんどの疾患のプロセスは遺伝子レベルではなく、タンパク質レベルで明白
にされており、異なる遺伝子の活性のレベルと比較的豊富にある対応タンパク質
との間には相関関係が乏しい。また、タンパク質および翻訳後修飾は同じ遺伝子
によってコードされておらず、従って、個々のタンパク質の完全な構造は、遺伝
子のみを参考にして決定することはできない。従って、プロテオミクスの分野に
おいて、特に高スループットまたは大量解析でのタンパク質の解析および操作が
必要である。
【０２２３】 プロテオミクスは、生物学的サンプルに存在するタンパク質の分離、同定およ
び特徴付けに関与する。1つのアプリケーションでは、糖タンパク質、好ましく
は稀な糖タンパク質をマイクロ流体基板においてトリプシン消化に供することに
よってタンパク質の特徴を得ることができ、マイクロ流体デバイスまたは電気泳
動もしくはクロマトグラフィーデバイスなどの個別の解析デバイスでペプチドを
解析することができる。随意的に、ペプチドは、マイクロ流体デバイス内で以後
の検出工程のための検出可能な部分で誘導される。もう1つのアプリケーション
では、チャンネル内の糖タンパク質からオリゴ糖が切断され、マイクロ流体基板
の解析帯域またはもう1つのデバイスの流動のいずれかにおいて解析される。
【０２２４】 （タンパク質の翻訳後修飾の特徴付け） 例えば、本発明の方法およびデバイスに従えば、タンパク質に対するオリゴ糖
の構造的および位置的（タンパク質上の位置）特徴付けの組み合わせを解明する
ことによって翻訳後修飾を特徴付けることが可能である。例えば、細胞由来のタ
ンパク質は2D-ゲル電気泳動によって分離される。所定の糖タンパク質はゲルか
ら溶液に移され、マイクロ流体基板のチャンネルに誘導される。基板は並列でチ
ャンネルを有するため、多くの異なるタンパク質を並列および／または直列で注
入することができる。糖タンパク質からオリゴ糖を切断する酵素は、試薬容器ま
たは貯蔵部を通してチャンネルに誘導される。第1糖のタンパク質サンプルは、
第1の温度調節帯域（37℃）に移動し、オリゴ糖が糖タンパク質から放出される
期間の所定の時間に、前記温度調節帯域を通って流動する。さらに、前記第1の
温度調節帯域では、この温度調節帯域の温度は、37℃（酵素活性の至適温度）か
ら例えば94℃（10分間）へ迅速な転移で変化し、酵素が不活化される。第1の糖
タンパク質サンプルは第1の温度調節帯域から出て、この第1の温度調節帯域の温
度は迅速に37℃に変化し、第2の糖タンパク質サンプルが第1の温度調節帯域に侵
入する。従って、第1の温度調節帯域は、多糖またはタンパク質の酵素切断が生
じる37℃、および酵素の不活化が生じる94℃の間を循環する。多糖が糖タンパク
質から放出された後、蛍光色素（例えば、アミノピレン三スルホン酸（APTS）20
mM）およびNaCNBH3（0.4 M）の混合物の1μlがサンプルに添加される。混合物
は、94℃で平衡化されている第2の温度調節帯域に侵入する。サンプルは、1時間
の期間、第2の温度調節帯域を通って移動する。糖タンパク質由来のオリゴ糖は
、第2の温度調節帯域において蛍光色素で標識される。最後に、サンプルは、レ
ーザー励起蛍光検出およびMALDI/TOF質量分析を有するキャピラリー電気泳動に
よってオフラインで回収および解析されるか、または該サンプルは温度処理のた
めに使用されるマイクロ流体デバイスが組み込まれている電気泳動マイクロ流体
デバイスに注入され、オンラインで解析される。
【０２２５】 （トリプシン消化） もう1つの例では、細胞由来のタンパク質は、2D-ゲル電気泳動によって分離さ
れる。所定の糖タンパク質はゲルから溶液に移され、マイクロ流体基板のチャン
ネルに導入される。この基板は並列でチャンネルを有するため、多くの異なるタ
ンパク質を並列、および直列で注入することができる。酵素（例えば、ペプシン
、トリプシン）は、第1の試薬供給容器または貯蔵部を通してチャンネルに誘導
される。第1のサンプルは第1の温度帯域（37℃）に進入し、タンパク質が切断さ
れ、ペプチド分子が形成される期間の所定の時間に、該サンプルはこの第1の温
度調節帯域を流動する。さらに、前記第1の温度調節帯域では、この温度調節帯
域の温度は、37℃（酵素活性の至適温度）から例えば94℃（10分間）へ迅速に転
移し、酵素が不活化される。第1のサンプルが第1の温度調節帯域から出るとき、
この第1の温度調節帯域の温度は迅速に37℃に変化し、第2のサンプルが第1の温
度調節帯域に侵入する。従って、第1の温度調節帯域は、多糖またはタンパク質
の酵素切断が生じる37℃、および酵素の不活化が生じる94℃の間を循環する。随
意的に、化学的または酵素的切断の1を超える手段が異なるオリゴ糖（例えば、O
結合型およびN結合型オリゴ糖）に使用され、異なる切断手段の最適化を可能に
するためにさらなる温度処理工程がサイクルに含まれ得る。ペプチド鎖は、第2
の温度調節帯域においてアミノ感受性蛍光色素（Molecular Probes）で蛍光標識
される。最後に、サンプルは、レーザー励起蛍光検出を有するキャピラリー電気
泳動によってオフラインで回収および解析されるか、または温度処理のために使
用されるマイクロ流体デバイスまたは基板が組み込まれている電気泳動マイクロ
流体デバイスに注入され、オンラインで解析される。ペプチドは、第1の温度調
節帯域から出た直後に金属プレート上にスポットされ、質量分析（例えば、MALD
I/TOF）によってオフラインで解析され得るか、または該ペプチドは質量分析器
に直接エレクトロスプレーされ得る。
【０２２６】 （複雑な多糖混合物（例えば、ヒアルロン酸）の構造的特徴付け） 本発明のマイクロ流体デバイスはまた、複雑な多糖の構造的特徴付けのために
使用してもよい。多糖は極めて多様かつ複雑な混合物であり、分子量の分布、偏
極の程度、配列、分岐および単糖単位のタイプ、およびそれらの結合を伴う(Yal
pani, M. Polysaccharides: Synthesis, Modifications and Structurel Proper
ty Relations; Elsevier, Amsterdam, 1988)。生物学的プロセスおよび産業アプ
リケーションにおいて異なる多糖の重要性について認識が高くなってきているた
め、これらの高分子の物理特性をそれらの構造属性に関連付ける必要がある。そ
のような物質の全体的測定はしばしば特徴付けの手段として不適切であると現在
では一般に認められている。多糖の特徴付けに適用される現代の分離技術は増え
てきており、例えば、小角散乱を伴うサイズ排除クロマトグラフィー(Jengら、J
. Appl. Polym. Sci. 49: 1359-1374 (1993))、パルス電流検出を伴うイオン交
換クロマトグラフィー(Koizumiら、J. Chromatogr. 464: 365-373 (1989))、ま
たはレーザー励起蛍光検出を有するキャピラリー電気泳動(StefanssonおよびNov
otny, Anal. Chem.66: 1134-1140 (1994))；SudorおよびNovotny, Anal. Chem.
67,4205-4209 (1995))の組み合わせがある。特定のアプリケーション（例えば、
稀な糖タンパク質から切断されたオリゴ糖を特徴付ける場合；Mechrefら、Glyco
biology 9: 227-234 (1999)）では、使用するサンプルの量を最小にする必要が
ある。従って、サンプル調製物のための化学的反応を実施するための手段ならび
にサンプルの特徴付けおよび検出のための以後の手段を提供するミニチュア化さ
れ、組み込まれたデバイスは、多糖またはオリゴ糖の特徴付けに有利である。
【０２２７】 （ヒアルロン酸構造の解明） ヒアルロン酸（HA）は、多くの結合組織においてプロテオグリカンの凝集を助
ける特定の機能を有する線状の多糖である。HAは細胞の調節(Alho and Underhil
l, J. Cell Biol. 108: 1557-1565 (1989))および細胞保護(UnderhillおよびToo
le, J. Cell. Physiol. 110: 123-128 (1982))にも重要な役割を果たす。HAにつ
いては、眼科学、臨床診断、薬物送達および化粧品調製物においても産業および
医学アプリケーションが認められている。
【０２２８】 ヒアルロン酸（10 mg/ml）およびヒアルロニダーゼ（3 mg/ml）の緩衝化され
た溶液を、並列および直列の本発明のマイクロ流体デバイスのチャンネルに導入
する。各反応物の容積は約1μlである。第1のサンプルまたは反応物は、37℃で
平衡化された第1の温度調節帯域に移動する。多糖の酵素切断の程度は、第1のサ
ンプルが第1の温度調節帯域を通って流動する期間を選択することによって特定
される。第1の温度調節帯域を通過した後、第1のサンプルは、ヒアルロニダーゼ
が不活化される第2の温度調節帯域（94℃）に進入する。あるいは、第1のサンプ
ルは、37℃で第1の温度調節帯域を流動し、さらに前記第1の温度調節帯域では、
この温度調節帯域の温度は、37℃（酵素活性が至適である温度）から例えば94℃
（10分間）へ迅速に転移し、酵素が不活化される。第1のサンプルが第1の温度調
節帯域から出て、この帯域の温度は迅速に37℃に転移し、第2のサンプルが第1の
温度調節帯域に侵入する。随意的に、第1の温度調節帯域が第2または以後のサン
プルのために37℃に保たれる時間は、第1のサンプルのための時間とは異なる。
酵素の速度論についてオンラインで研究する可能性を与えるばあいは時間が変動
する（注意：この状況は、タンパク質を消化し、ペプチドマップを得る場合と同
じであろう）。従って、第1の温度調節帯域は、37℃（多糖またはタンパク質の
酵素切断）および94℃（酵素の不活化）の間を循環する。第1の温度調節帯域で
ヒアルロン酸が酵素切断された後、蛍光色素（例えば、アミノピレン三スルホン
酸（APTS）20 mM）およびNaCNBH3（0.4 M）の混合物の1μlがサンプルに添加さ
れる。混合物は、94℃で平衡化されている第2（または第3）の温度調節帯域に侵
入する。サンプルは、1時間の期間、第2の温度調節帯域を通って移動する。ヒア
ルロン酸のオリゴ糖は、第2の温度調節帯域において蛍光色素で標識される。最
後に、サンプルは、レーザー励起蛍光検出を有するキャピラリー電気泳動および
光散乱検出を有するサイズ排除クロマトグラフィーによってオフラインで回収お
よび解析されるか、または熱チップが組み込まれている電気泳動チップに注入さ
れ、オンラインで解析される。
【０２２９】 他の態様では、一般に糖タンパク質、またはペプチドを誘導するために、本発
明のマイクロ流体デバイスを使用してもよい。例えば、標識試薬を注入し、サン
プルおよび標識試薬を温度調節帯域で予め決定された温度に供して、標識がペプ
チドまたはオリゴ糖に結合することを可能にすることによって、ペプチドまたは
オリゴ糖の標識を行うことができる。
【０２３０】 本発明は、酵素の連続的な活性化および不活化が所望されるプロトコルで使用
してもよい。例えば、酵素のリボヌクレアーゼが加熱時に活性を失い、冷却時に
速やかに活性を回復することは周知であり、これは、ほぐされたリボヌクレアー
ゼポリペプチドが、冷却時に天然のコンホメーションにすぐに回復することを示
唆する。(Stryer, Biochemistry, pg. 197 (1975))。リボヌクレアーゼを含有す
る反応の熱循環は、活性状態および不活性状態の酵素の間の制御された転移を可
能にする。この態様は、基質の拡散を増大するかまたはフィードバック阻害を防
止するために利用してもよい。あるいは、この態様は、さらなるまたは新規の基
質を添加することを可能にするために利用してもよい。1つの実施態様では、サ
ンプルは供給容器102を通して複数のチャンネル108に導入され、リボヌクレアー
ゼを含む試薬は試薬貯蔵部122bを通して添加される。サンプルは、チャンネル10
8を通してリボヌクレアーゼが解かれ、不活性であるより高い温度の帯域に移動
する。この時点で、さらなる基質、または新規の基質が試薬貯蔵部122bを通して
添加される。あるいは、リボヌクレアーゼ活性の一時的消失はエンドポイントを
決定する手段を提供するため、反応混合物のアリコートを、貯蔵部122bを通して
取り出してもよい。サンプルがチャンネル108を通ってより低い温度の帯域に移
動するとき、リボヌクレアーゼは活性な形状を回復し、添加された基質を使用し
て反応を開始する。反応産物は、出力容器に回収され、解析される。
【０２３１】 本発明は、化学的または生化学的反応の速度、特徴、もしくは方向を調節する
ことが所望されるプロトコルで使用してもよい。本発明の実施態様は、同じ酵素
または無機触媒によって触媒される異なる反応は、異なる温度至適条件を含む異
なる熱力学的質を有し得るという事実を利用する。Kishoreら(Biophys. Chem. 7
3: 265-280 (1998))。同様に、単一の化学的または生化学的反応の前方および後
方反応は異なる温度至適条件を有し得る。本発明は、異なる反応が異なる生成物
を生成する速度、または連続流中のサンプルを少なくとも2つの温度に暴露する
ことによって前方および後方反応が進行する速度を制御するためのデバイスおよ
び方法を提供する。
【０２３２】 本発明による化学反応の熱「同調」を使用して、所定の方向へ反応を駆動する
ことができる。Sigbesmaら(Science 278: 1601-1604 (1997))は2-ウレイド-4-ピ
リミドンの高分子化の様々な態様について開示している。ここで、結合寿命およ
び結合の強さの熱的および環境制御により、粘度、鎖長および組成などの多くの
特性が、従来のポリマーでは達成されない形式で同調可能になる。1つの実施態
様では、2-ウレイド-4-ピリミドンの二官能性誘導体のCHCl3中0.04 M溶液は、供
給容器102を通して少なくとも1つのチャンネル108に導入される。サンプルは温
度調節帯域を通って移動し、試薬貯蔵部122aを通して少量のチェーンストッパ化
合物が添加される。次いで、サンプルは異なる温度を有する温度調節帯域に移動
する。次いで、試薬貯蔵部122bを通して十分なチェーンストッパ化合物が添加さ
れ、さらなる任意の高分子化を停止する。サンプルが出力容器104に溶出すると
き、次いでサンプルを解析して、それぞれの温度で達成される高分子化の程度を
決定する。もう1つの実施態様では、2-ウレイド-4-ピリミドンの二官能性メチル
誘導体および2-ウレイド-4-ピリミドンの二官能性メチルフェニル誘導体のCHCl3 中混合物であって、2つの化合物は30℃での粘度の差が1000倍である上記混合物
を供給容器102を通って導入する。チャンネル108中のサンプルは温度調節帯域に
移動し、混合物のアリコートは、粘度および高分子の形成を測定するために、貯
蔵部122aに対する開口部を通して取り出される。サンプルは、異なる温度を有す
る複数の温度調節帯域に移動し、アリコートは、各温度での混合物の粘度および
高分子化を測定するために、貯蔵部122b、122cなどに対する開口部を通して取り
出される。次いで、サンプルは、出力容器104を通して回収され、さらに解析さ
れる。
【０２３３】 さらに、マイクロ流体デバイスは、一般に、化学品、特に精製化学品（即ち、
小容積および／または特に高品質で生産される）の合成のためにも使用すること
ができる。さらに、精製化学品の合成などのオンラインスクリーニング（例えば
、薬物のスクリーニング）との組み合わせで1を超えるプロトコルを含む本発明
のマイクロ流体基板またはデバイスが提供される。化学合成は、本発明の温度調
節帯域で行うことができる特定の反応を行うための少なくとも1つの温度変化に
関与する。反応物は、主要入力容器および／または必要であれば1つ以上の試薬
容器もしくは貯蔵部を通してチャンネルに導入される。本発明のマイクロ流体基
板の形式（基板材料の選択を含むがこれに限定されない）は、それらが、合成で
使用される反応温度および溶媒（例えば、水、有機溶媒）などの実施しようとす
る反応の特徴に互換であるように選択される。最も好ましくは、反応は、−5℃
〜150℃で行われる。
【０２３４】 1つの例では、温度変化はタンパク質のリン酸化状態の変化を誘導することが
できることが知られている。加熱処理は、網膜芽腫遺伝子産物（pRb）の可逆的
脱リン酸化を誘導し、これは、pRbがSV40誘導性DNA合成を阻害し、T抗原に結合
する能力に影響する。Khandjian (Oncogene 359-367 (1995))。42.5℃に暴露す
ると、pRBのリン酸化形態が徐々に消え、このpRbの脱リン酸化は、SV40誘導性DN
A合成の阻害に相関する。1つの実施態様では、1μgのpRbを含有するサンプルが
供給容器102を通して複数のチャンネル108に導入され、42.5℃の温度調節帯域に
侵入する。1つの組のチャンネルでは、リン酸化のための試薬が試薬貯蔵部122a
を通して添加される。同じ初期のサンプルを含有し、第1と並列で流動する個別
の組のチャンネルでは、個別の試薬貯蔵部122a'を通してATPを除くすべてのリン
酸化試薬が添加される。すべてのサンプルは並列で25℃の温度調節帯域に5分間
移動する。次いで、サンプルがそれぞれのチャンネル108から回収され、リン酸
化状態のpRbが決定される。pRbのリン酸化状態に対する熱効果は可逆性であるた
め、本発明は、pRb含有サンプルを熱サイクルに暴露することによってpRb介在プ
ロセスを調節することができるデバイスおよび方法を提供する。
【０２３５】 本発明はまた、巨大分子構造の会合を調節することが所望されるプロトコルで
使用してもよい。例えば、リポソームの会合が温度依存性であり、この温度依存
性は温度感受性高分子を添加することによって改変することができる。Hayashi
ら、(Bioconjugate Chem. 9: 382-389 (1998))。本発明は、サンプル中のリポソ
ームの会合状態を熱循環によって調節することができるデバイスおよび方法を提
供する。リポソームおよび高分子を含有するサンプルのアリコートを、試薬貯蔵
部122a、122b、122cなどの開口部を通して各チャンネル108から取り、続いて温
度サイクルの様々な工程によってリポソームの会合に対する感熱応答性高分子の
効果を測定してもよい。もう1つの実施態様では、本発明のデバイスで熱循環を
経験しているリポソームサンプルに、後の段階で熱高分子（thermopolymer）を
添加することによって、感熱応答性高分子の効果を研究することができるように
、供給容器102を通して複数のチャンネル108に導入されるリポソームを含有する
サンプルが、および後に試薬貯蔵部122aを通して感熱応答性高分子が添加される
。
【０２３６】 本発明は、少なくとも1つの熱サイクルおよび連続サンプル流を利用する生物
学的プロセスを行うためのデバイスおよび方法をさらに提供する。細菌培養物、
酵母培養物、または懸濁された植物、昆虫、哺乳動物もしくは他の培養された細
胞の培養物は、供給容器を通してデバイスの少なくとも1つのチャンネル108に導
入することができる。チャンネル108の生物学的サンプルは、少なくとも1つの熱
サイクルに供することができ、熱サイクルに対する応答は測定することができる
。測定することができる応答としては、熱ショックタンパク質の産生、各細胞シ
ステムのストレスを示すタンパク質の産生、分裂の開始または阻害、出芽または
細胞分裂、生成物の培地への排出、膜脂質組成の変化、細胞壁組成の変化が挙げ
られるが、これらに限定されない。生物学的サンプルは、該生物学的サンプルが
連続流によりデバイスを通して移動するときに1つの熱サイクルに供することが
できるか、または多数の熱サイクルに供することができる。生物学的サンプルを
熱的に「脈動する」方法を行うことができる。例えば、細胞の熱条件がより高い
温度に対する耐性を誘導することができるかどうかを試験するために、生体細胞
を含むサンプルを40熱サイクルに暴露させ、これはサイクルの後半で通常細胞に
対して致死性の温度を短期間暴露させることを含むようにプログラムされる。同
様に、熱サイクルを使用して、温度と環境条件に対する生物学的サンプルの耐性
を決定するイオン強度および細胞外媒体の組成などの他の環境変数との間の相互
作用を研究することができる。
【０２３７】 1つの代表的実施態様では、E.coliの生体培養物を、供給容器102を通して複数
のチャンネル108に導入する。チャンネル108を移動するサンプルを20℃で5分間
、続いて40℃で30秒間、続いて25℃で15分間の10サイクルに暴露する。10サイク
ル後、試薬貯蔵部122aに対する開口部を通してサンプルを取り出す。アリコート
を取り出した後、溶液の塩濃度は、試薬貯蔵部122aを通して添加されたNaCl溶液
によって増加する。次いで、サンプルを先に記載のようなさらなる10サイクルに
暴露する。次いで、出力容器104を通してサンプルを回収し、生理学的および高
塩濃度で熱ショックさせた細菌細胞のタンパク質プロフィールを比較する。
【０２３８】 （実施例） （実施例1） （マイクロ流体デバイスの連続流におけるPCR反応） 実施例1：マイクロ流体デバイスの連続流におけるPCR反応 PCR反応が実施されるチャンネルを通して、PCR反応混合物を走行させた。
【０２３９】 マイクロ流体基板は、シリコーンに化学的にエッチングされた並列の10個のチ
ャンネルを含んだ。チャンネルは、反応帯域に約600μmのオーダーの直径を有す
る直線状であった。チャンネルの区間の表面積は約0.25 mm2のオーダーであった
。
【０２４０】 PCRを並列の3つのチャンネルで行った。1つのPCRの容積は1.2μlであったが、
PCRサンプルの解析後、デバイスの外部で10回の同一のPCR反応（12μl（10×1.2
μl））を実施した（定量およびサイズ分析）。
【０２４１】 マイクロ流体基板は、該基板を使用する直前にシリコーン処理した。PCR反応
前、すべてのチャンネルに予め脱気および濾過した水を満たした。25μl／分の
オーダーの高流速を15分間適用し、回路内に存在するすべての気泡を除去した。
次いで、10 mM Tris-HClおよび50 mM KCl、pH 8.3の予め脱気および濾過した溶
液を5μl／分の流速で15分間、気泡が形成しないように注意しながら注入した。
【０２４２】 各DNAサンプルを予め脱気および濾過した1 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH8.3
緩衝液中で希釈し、10μlの2 ng/μl DNAの最終溶液を得た。各PCR反応では、こ
の溶液の0.6μlを使用した。この溶液を、サンプルを並列および直列に注入する
ためのデバイスに置いた。
【０２４３】 PCRプライマーの1つの対を使用して、合計で30μlの溶液を調製し、使用前に
脱気調整した： 0.6μMの各未精製PCRプライマー（Genset）、20 mM Tris-HClお
よび100 mM KCl、pH 8.3、4 mM MgCl2、0.2 mMの各dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dT
TP）ならびに4UのTaq Gold。各PCR反応では、この溶液の0.6μlを使用した。こ
れらの溶液を、サンプルを直列に注入するためのデバイスに置き、4℃で保存し
た。
【０２４４】 基板内の流速は8.2μl／時であり、2 cmのPCR温度調節される循環帯域上で約3
5サイクルを達成することが可能であった。
【０２４５】 PCR反応混合物は、ポリメラーゼを活性するために、94℃で10分間、温度調節
される循環帯を通してPCR循環の直前に通過させた。次いで、94℃で20秒間、次
いで、55℃で20秒間、および72℃で20秒間からなる温度循環帯域を通して、35サ
イクルに相当する期間、該混合物を走行させた。
【０２４６】 PCRが完了した後、所定のチャンネル由来の10の同一PCR反応物を相互に混合し
、オフラインで蛍光定量および電気泳動によって解析した（1.2μlのPCR反応は
標準的な方法で解析することはできない）。PCRの蛍光定量（ピコグリーン（Mol
ecular Probes）挿入色素を伴う）は、市販のサーマルサイクラー（MJ Research
）上のマイクロタイタープレートで実施されるよう性コントロールと比較して、
75％を示した。アガローススラブゲル電気泳動の結果からマイクロ流体基板で実
施されたPCR反応の特異性を確認した（増幅されたフラグメントのサイズは予想
通り500 bpであった）。
【０２４７】 （実施例２） （遺伝子型決定プロトコルの連続流マイクロ流体デバイスへの集積化） 1つの実施態様では、反応混合物は、遺伝子型決定プロトコルに必要なすべて
の工程（PCR、精製、マイクロシークエンシング反応および検出）が実施される
チャンネルを通って走行する。
【０２４８】 マイクロ流体基板は、並列で100個のチャンネルを含む。これらのチャンネル
は直線状であり、反応帯域で600μmのオーダーの直径を有する。チャンネルの区
間の表面積は、0.25 mm2のオーダーである。
【０２４９】 遺伝子決定プロトコルは、100個のチャンネルで並列で行われる。100個のサン
プルを並列でチャンネルに注入し、溶液の100のそのような注入は、各チャンネ
ルが100回注入分の同じサンプルを含有するように、連続的に行われる。従って
、マイクロ流体基板は、100種の多型性に対する100個のサンプルの交差配分によ
って、マイクロ流体基板上で10,000の遺伝子型反応を行うことが可能である。
【０２５０】 試薬の注入を、チャンネルの異なる点で実施する。注入は、反応が、直列、並
列、および連続流で行うことができるような形式で同期化される。
【０２５１】 任意の混入を回避するために、所定のチャンネルに直列で同じDNAを供給する
。しかし、このDNAは、100種の異なる多型性について解析される。
【０２５２】 マイクロ流体基板は、Schoffnerら(Nucleic Acid Research, Vol. 24, No. 2,
p. 375-379 (1996))による記載のプロトコルに従ってシリコーン処理される。
シリコーン処理された基板は、数ヶ月間保存することができる。基板のシリコー
ン処理工程は、基板の製造中に行うことができる。基板を使用する前に、すべて
のチャンネルを予め脱気し濾過した水で満たす。25μl／分のオーダーの高流速
を15分間適用し、回路内に存在するすべての気泡を除去する。次いで、10 mM Tr
is-HClおよび50 mM KCl、pH 8.3の予め脱気および濾過した溶液を5μl／分の流
速で15分間、気泡が形成しないように注意しながら注入する。好ましくは、この
操作は、いくらかの基板を並列で処理することが可能な外部装置上で行われる。
【０２５３】 各DNAサンプルを予め脱気および濾過した1 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH8.3
緩衝液中で希釈し、30μlの2 ng/μl DNAの最終溶液を得た。チャンネルあたり1
つのDNA調製物を必要とする。それぞれの遺伝子型決定反応は、この溶液の0.25
μlを使用する。30μlは、同じ個体に対して100連続遺伝子型決定を行うのに必
要な量＋注入デバイスの死空間に対応する。この溶液は、並列注入のための注入
デバイスに置かれる。
【０２５４】 すべての多型性部位について、PCR反応が調製され、使用前に脱気されなけれ
ばならない（100の異なるPCR反応混合物）。各PCR反応混合物について、30μlの
溶液を調製しなければならない：0.6μMの各PCRプライマー（Genset）、20 mM T
ris-HClおよび100 mM KCl、pH 8.3、4 mM MgCl2、0.2 mMの各dNTP（dATP、dCTP
、dGTP、dTTP）ならびに2UのTaq Gold。各遺伝子型決定では、0.5μlの最終反応
溶液に対しこの溶液の0.25μlを使用する。30μlは、100個の異なるチャンネル
に対して並列で100回遺伝子型決定を行うのに必要な量＋注入デバイスの死空間
に対応する。これらの溶液は、PCRプライマーを直列で注入するためのデバイス
に置かれ、4℃で保存される。
【０２５５】 PCR精製反応は、すべての遺伝子型決定反応に共通である。溶液の5500μlの容
積：20 mM Tris-HCl、pH 8.0、10 mM MgCl2（予め脱気および濾過しておく）、5
50 Uのエビアルカリホスファターゼ（SAP）および550 UのエキソヌクレアーゼI
を調製しPCR精製反応混合物のために4℃で注入デバイスに保存する。各遺伝子型
決定では、1μlの最終反応溶液に対しこの溶液の0.5μlを使用する。5500μlは
、並列で10,000回遺伝子型決定を行うのに必要な量＋注入デバイスの死空間に対
応する。
【０２５６】 遺伝子型決定しようとする部位あたり1つの調製物が必要である（100種の異な
るマイクロシークエンシング用溶液）。各マイクロシークエンシング用オリゴヌ
クレオチドについて、120μlのマイクロシークエンシング用溶液溶液を調製し、
使用前に脱気しなければならない：1μMの粗マイクロシークエンシング用オリゴ
ヌクレオチド（Genset）、40 mM Tris-HCl、pH 9.5、8 mM MgCl2、10 nMのddNTP
-Tamraおよび10 nMのddNTP-Fam、部位の1つの対立遺伝子に対応する各ddNTP、な
らびに6Uのサーモシークエナーゼ（thermosequenase）。各遺伝子型決定では、2
μlの最終反応容積に対しこの溶液の1μlを使用する。120μlは、100個の異なる
チャンネルに対して並列で100回遺伝子型決定を行うのに必要な量および連続注
入デバイスの死空間に対応する。これらのマイクロシークエンシング用溶液は、
マイクロシークエンシング用プライマーを直列で注入するためのデバイスに置か
れ、4℃で保存される。
【０２５７】 基板出力部での流速は40μl／時である。2μlのセパレータで分離された2μl
の反応容積のために、チャンネルあたりの全体の反応収量は、10反応／時間であ
る。分離しているセパレータは、例えば、液体パラフィンゼリーなどの反応媒体
に非混合性である液体からなる。それらは、チャンネルを介する反応コースに沿
って物理的に反応をすべて相互に分離する。
【０２５８】 DNAサンプルは、遺伝子型決定反応あたり0.25μlの容積で配分される。該サン
プルは、5μl／時の流速で注入され、3分間の時間および1mmの長さで表される。
各サンプルの注入は、0.25μlの非混合性セパレータによって分離される。
【０２５９】 0.25μlのPCR試薬は、5μl／時の流速で注入され、DNAサンプルと混合される
。各PCR試薬の注入は、0.25μlの非混合性セパレータの注入によって分離される
。従って、PCR反応は、0.5μlの容積および2 mmのチャンネルの長さを示し、10
μl／時の流速で移動する。
【０２６０】 反応混合物は、94℃で20秒間、次いで、55℃で20秒間、および72℃で20秒間の
工程からなるサイクルが可能な帯域を通して、35サイクルに相当する期間走行す
る。
【０２６１】 PCR後、0.5μlのPCR精製試薬は、10μl／時の流速で注入される。各試薬の注
入は、0.5μlのセパレータの注入によって分離される。従って、PCR精製反応は
、1μlの容積および4 mmのチャンネルの長さを示し、20μl／時の流速で移動す
る。
【０２６２】 次いで、この反応混合物は、精製反応の間、20分間、37℃で、温度調節帯域を
通って走行し、次いで、精製酵素（SAPおよびEXO I）の不活化のために10分間、
94℃で温度調節帯域を通って走行する。
【０２６３】 次に、1μlのマイクロシークエンシング用試薬は、20μl／時の流速で注入さ
れる。各マイクロシークエンシング用試薬の注入は、1μlの非混合性セパレータ
の注入によって分離される。従って、マイクロシークエンシング反応は、2μlの
容積および8 mmのチャンネルの長さを示し、40μl／時の流速で移動する。マイ
クロシークエンシング用試薬は、正しくPCR増幅されたフラグメントで注入され
なければならず、従って注入間で良好な同期化が必要である。
【０２６４】 このマイクロシークエンシング反応混合物（2μl）は、94℃で10秒間、次いで
、55℃で10秒間、および72℃で10秒間の工程からなるサイクルが可能な帯域を通
って、25サイクルに相当する期間走行する。
【０２６５】 検出は、マイクロシークエンシング帯域後、オンラインおよび継続的に行われ
る。
【０２６６】 検出は、発蛍光団FamおよびTamraのために偏極した蛍光を測定することに追っ
て行われる。励起波長は代表的に488 nmおよび555 nmであり、発光波長は代表的
に520 nmおよび575 nmである。2つの蛍光測定が同時に行われ、一方は励起ビー
ムの偏極の面にあり、他方はこの面に対して垂直な面である。これらの2つの測
定値の割合から、2〜5倍のより遊離な標識（蛍光ddNTP）から標識されたオリゴ
ヌクレオチド（反応中に長くなるマイクロシークエンシングオリゴヌクレオチド
）の存在を区別することが可能である。
【０２６７】 （実施例３） （対立遺伝子特異的リガーゼ連鎖反応（LCR）の方法による遺伝子型決定） 対立遺伝子特異的LCRはBaranyら(PCR Meth. Appl. 1: 5-16 (1991))らにより
開示されており、4種のオリゴヌクレオチド（標的DNAの一方の鎖にハイブリダイ
ズする2種および対向鎖にハイブリダイズする隣接のオリゴヌクレオチドの相補
の組）を用いる。耐熱性DNAリガーゼそれぞれの組に共有結合する。但し、接続
では完全な相補性が認められる。オリゴヌクレオチド接続での一塩基ミスマッチ
は増幅されず、従って区別される。変異特異的オリゴヌクレオチドの第2の組は
、変異対立遺伝子を検出または確認するための個別の反応に使用される。
【０２６８】 10μlの開始混合物を各チャンネルに導入することによって、本発明に従って
、対立遺伝子特異的LCRのための均質相プロトコルを行うことができ、該開始混
合物は、：解析すべき標的配列を有するDNA、それぞれが40フェトムモルである4
種の相補オリゴヌクレオチドプライマー、Thermus thermophilus由来などの15ニ
ック−クロージング単位の耐熱性リガーゼ、少なくとも1μMの各dATP、dCTP、dG
TP、dTTP、4μgの担体サケ精子DNAを20 mM Tri-HCl、100 mM KCl、10 mM MgCl2
、10 mM DTT、10 mM NAD+、1mM EDTA、pH 7.6の緩衝溶液中に含む。サイクルの
第1工程では、DNAが94℃で1分間、加熱変性される。65℃で4分間行われる次の工
程では、4種のヌクレオチドが、それらの融点付近の温度で標的DNAにアニールし
、耐熱性リガーゼは完全性を有するそれらの折後ヌクレオチドに連結する。反応
サイクルは、反応混合物が連続流を使用して20〜30回行われ、94℃〜65℃の間で
循環するようにプログラムされている温度調節帯域のチャンネルを通って移動す
るように行われる。同じ標的DNA、酵素、緩衝液、およびヌクレオチドがそれぞ
れのチャンネルに導入され、異なる組の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが
同時に個々のチャンネルに導入されるように、異なる対立遺伝子に特異的なオリ
ゴヌクレオチドの個別の組を利用する並列反応が並列で行われる。あるいは、対
立遺伝子特異的反応は、相互の反応を区別する「セパレータ」を使用して、同じ
チャンネル内で同時に行われ得る。
【０２６９】 （実施例4） （任意のプライムされたPCR（AP-PCR）を使用する新規多型性の同定 任意にプライムされたPCRの方法は、しばしば、潜在的な多型性を見出すため
の予備的工程として有用である。Jonasら(J. Clin. Microbiol. 38: 2284-2291
(2000))。AP-PCRは以下のように行うことができる：0.1μlの細胞溶解物、10 mM
HCl、3 mM MgCl2、50 mM KCl、0.2 mM dNTP、1単位Taq DNAポリメラーゼを含み
、Cyで蛍光標識されたM13プライマーを伴うpH 9.0の2.5μlの反応容積。1つの実
施態様では、反応混合物は該混合物が本発明のチャンネルに導入される前に作製
される。もう1つの実施態様では、反応混合物のコンポーネントは、デバイスに
直接導入される。反応混合物は温度調節帯域を通って連続的に流動し、95℃で60
秒間、36℃で60秒間、および72℃で120秒間の45サイクルに暴露される。反応産
物は、上記のデバイスにおいてin situで多型性を同定するか、または代替的に
解析のために取り出される。
【０２７０】 （実施例5） （TaqMan(登録商標)PCR方法による遺伝子型決定） TaqMan(登録商標)PCR方法のための均質相プロトコルは、実施例2に記載のよう
に、本質的にマイクロ流体基板を使用して本発明に従って行われる。
【０２７１】 TaqMan(登録商標)はいくらかの（例えば、3つの）チャンネルにおいて並列で
行われる。1つのPCR反応の容積は、0.6μlである。あるいは、単一PCR反応の生
成物が検出される。
【０２７２】 マイクロ流体基板は、基板が使用されるすぐ前に同期化される。基板を使用す
る前、すべてのチャンネルには、予め脱気され濾過された水が満たされる。25μ
l／分のオーダーの高流速を15分間適用し、回路内に存在するすべての気泡を除
去する。次いで、10 mM Tris-HClおよび50 mM KCl、pH 8.3の予め脱気および濾
過した溶液を5μl／分の流速で15分間、気泡が形成しないように注意しながら注
入する。
【０２７３】 各DNAサンプルを予め脱気および濾過した1 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH8.3
緩衝液中で希釈し、30μlの2 ng/μl DNA（同じサンプルで50種の異なる分子ビ
ーコン遺伝子型決定反応を実施するのに十分である）の最終溶液を得る。3つの
すべてのチャンネルに1つの DNA調製物を使用する。それぞれのPCR反応は、この
溶液の0.6μlを使用する。この溶液は、並列および直列でサンプルを注入するの
ためのデバイスに置かれる。
【０２７４】 PCRプライマーの1つの対ならびにレポーターおよびクエンサー色素で標識され
た2つの対立遺伝子特異的分子プローブ（標的ヌクレオチドのそれぞれの対立遺
伝子に対する1つ）を含むTaqMan(登録商標) PCR試薬混合物を使用し、合計で6μ
lの溶液を調製する： 0.6μMの各未精製PCRプライマー、20 mM Tris-HClおよび1
00 mM KCl、pH 8.3（またはTaqMan緩衝液A、PE Applied Biosystems）（予め脱
気および濾過した）、4 mM MgCl2、0.2 mMの依託による標識プローブおよび各dN
TP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）ならびに0.5UのAmpliTaq Gold。各PCRでは、この
溶液の0.6μlを使用した。これらの溶液を、PCRプライマーを直列に注入するた
めのデバイスに置き、4℃で保存した。PCRプライマープローブおよびTaqManプロ
ーブを変更することによって、50種の異なる多型性部位に対応する50種までの異
なる反応混合物を調製することができる。異なるすべての反応について同じ循環
温度を保つために、PCR産物が等価なサイズを有し、TaqManプローブが類似のTms
を有するように留意する。異なる反応混合物を交互にデバイスに注入するが、注
入時に該混合物はすべてのチャンネルに並列に注入される。
【０２７５】 2 cmのPCR温度調節される循環帯域上で約35サイクルが行われるように、基板
内の流速は8.2μl／時である。
【０２７６】 この反応混合物は、ポリメラーゼを活性するのに必要であれば、デバイスへの
注入前に94℃で10分間処理することができる。94℃で20秒間、次いで、55℃で20
秒間、および72℃で20秒間の工程からなるサイクルが行われる帯域を通して、35
サイクルに相当する期間、該混合物を走行させる。
【０２７７】 一旦、PCR反応がPCR温度調節帯域から流動し、PCRが完了したら、次いで、反
応はTaqManプローブの波長に適応する蛍光光度計および連続流検出器からなるサ
ーモスタット帯域を通過することができる。他の実施態様では、PCR反応は、出
力容器から回収し、製造者らの指示に従いABI Prism 7700 Sequence Detection
System上で解析することができる。
【０２７８】 （実施例6） （分子ビーコンを使用する遺伝子型決定） 分子ビーコンを使用する均質相プロトコルは、実施例2に記載のように、本質
的にマイクロ流体基板を使用して本発明に従って行われる。
【０２７９】 アッセイはいくらかの（例えば、3つの）チャンネルにおいて直列で行われる
。1つのPCR反応の容積は、1.2μlである。あるいは、単一PCR反応の生成物が検
出される。
【０２８０】 マイクロ流体基板は、基板が使用されるすぐ前に同期化される。基板を使用す
る前、すべてのチャンネルには、予め脱気され濾過された水が満たされる。25μ
l／分のオーダーの高流速を15分間適用し、回路内に存在するすべての気泡を除
去する。次いで、10 mM Tris-HClおよび50 mM KCl、pH 8.3の予め脱気および濾
過した溶液を5μl／分の流速で15分間、気泡が形成しないように注意しながら注
入する。
【０２８１】 各DNAサンプルを予め脱気および濾過した1 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH8.3
緩衝液中で希釈し、30μlの2 ng/μl DNA（同じサンプルで50種の異なる分子ビ
ーコン遺伝子型決定反応を実施するのに十分である）の最終溶液を得る。3つの
すべてのチャンネルに1つの DNA調製物を使用する。それぞれのPCR反応は、この
溶液の0.6μlを使用する。この溶液は、並列および直列でサンプルを注入するの
ためのデバイスに置かれる。
【０２８２】 PCRプライマーの1つの対ならびにレポーター（FAM）およびクエンサー（TAMRA
）色素で標識された2つの対立遺伝子特異的分子プローブ（標的ヌクレオチドの
それぞれの対立遺伝子に対する1つ）を含むPCR試薬混合物を使用し、合計で6μl
の溶液を調製する： 0.6μMの各未精製PCRプライマー、20 mM Tris-HClおよび10
0 mM KCl、pH 8.3（予め脱気および濾過した）、4 mM MgCl2、0.2 mMの分子ビー
コンプローブおよび各dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）ならびに0.5UのAmpliTaq
Gold。各PCRでは、この溶液の0.6μlを使用した。これらの溶液を、PCRプライ
マーを直列に注入するためのデバイスに置き、4℃で保存した。PCRプライマープ
ローブおよび分子ビーコンプローブを変更することによって、50種の異なる多型
性部位に対応する50種までの異なる反応混合物を調製することができる。異なる
すべての反応について同じ循環温度を保つために、PCR産物が等価なサイズを有
し、分子ビーコンプローブが類似のTmsを有することが好ましい。異なる反応混
合物を交互にデバイスに注入するが、注入時に該混合物はすべてのチャンネルに
並列に注入される。
【０２８３】 2 cmのPCR PCR温度調節される循環帯域上で約35サイクルが行われるように、
基板内の流速は8.2μl／時である。
【０２８４】 この反応混合物は、ポリメラーゼを活性するのに必要であれば、デバイスへの
注入前に94℃で10分間処理することができる。94℃で20秒間、次いで、55℃で20
秒間、および72℃で20秒間の工程からなるサイクルが行われる帯域を通して、35
サイクルに相当する期間、該混合物を走行させる。
【０２８５】 一旦、PCR反応がPCR温度調節帯域から流動し、PCRが完了したら、次いで、反
応は分子ビーコンの波長に適応する蛍光光度計および連続流検出器からなるサー
モスタット帯域を通過することができる。他の実施態様では、PCR反応は、出力
容器から回収し、製造者らの指示に従いABI Prism 7700 Sequence Detection Sy
stem上で解析することができる。
【０２８６】 本発明は特定の好ましい実施態様について記載されているが、他の実施態様も
本明細書に記載の開示内容を考慮することによって、本発明の請求の範囲内にあ
ることは当業者に明らかであろう。従って、本発明の範囲は、添付の請求の範囲
のみを参考にすることによって規定されることが意図される。本明細書に引用さ
れているすべての書面は、参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の1つの実施態様を表す略図である。
【図２】 図１の基板−熱支持体の組立体を線II−IIに沿って切った断面図
である。
【図３】 図３Ａは、本発明のマイクロ流体基板の実施態様の断面図である
。図３Ｂは、本発明のマイクロ流体基板の実施態様の断面図である。
【図４】 本発明のマイクロ流体基板の組立分解図である。
【図５】 本発明のマイクロ流体基板および熱支持体の組立分解図である。
【図６】 マイクロ流体基板および熱支持体システムのもう1つの実施態様
の断面図である。
【図７】 マイクロ流体基板および熱支持体システムのさらなるもう1つの
実施態様の断面図である。
【図８】 組立体の所定の相におけるマイクロ流体基板の断面図である。
【図９】 組立体の所定の相におけるマイクロ流体基板の断面図である。
【図１０】 組立体の所定の相におけるマイクロ流体基板の断面図である。
【図１１】 組立体の所定の相におけるマイクロ流体基板の断面図である。
【図１２】 先行技術におけるマイクロ流体システムの略図である。
【図１３】 1つの実施態様によるデバイスの略図である。
【図１４】 1つの実施態様によるデバイスの略図である。
【図１５】 1つの実施態様によるデバイスの略図である。
【図１６】 1つの実施態様によるデバイスの略図である。
【図１７】 1つの実施態様によるデバイスの略図である。
【図１８】 上記５つの実施態様に使用することができる基板の平面図であ
る。
【図１９】 図１８を面VII−VIIに沿って切った横断面図である。
【図２０】 図１８を面VIII−VIIIに沿って切った横断面図である。
【図２１】 マイクロ流体基板上で行われる遺伝子型決定プロトコルの概観
を表す。
【図２２】 マイクロ流体基板の組立分解の斜視図である。
【符号の説明】
１ マイクロチャンネル ２ 入力オリフィス ３ 出力オリフィス ４ 温度Ｔ１に供される帯域 ５ 温度Ｔ２に供される帯域 ６ 温度Ｔ２に供される帯域 １６ 供給管 １８ 出力管 ２０ オリフィス １００ 基板 １００ａ〜１００ｃ 熱絶層 １０３ 基板 １０４ 出力容器 １０５ コンポーネント １０６ 面 １１６ 上流供給管 １２０ａ〜１２０ｃ 試薬貯蔵部 １２２ａ〜１２２ｃ 貯蔵部 １３０ ＰＣＲ帯域 １３１ 精製帯域 １３２ マイクロシークエンシング帯域 １３３ 検出帯域 １２０ａ〜１２０ｃ 容器 １２２ａ 接続部 １５０ａ〜１５０ｃ 液体供給コンポーネント １５２ａ〜１５２ｃ キャップ １６０ 空洞 ２０３ 基板 ２０８ チャンネル ３０１ デバイス ３０３ｂ 下流ユニット ３１８ 出力管 ４０１ デバイス ４０２ 熱循環ユニット ４０３ 基板 ４０９ 伝達管 ４１０ｂ 下流ユニット ４１８ 出力管 ５０２ 熱循環ユニット ５１４ 管 ５１６ 供給管 ９００〜９０２ 金属棒 ９１０ システム ９２０ 管 ９３０ 貯蔵部 ９４０ 管 ９５０ チャンネル
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (31)優先権主張番号 ９９／１２３１７ (32)優先日 平成11年10月１日(1999．10．1) (33)優先権主張国 フランス（ＦＲ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ボーシー， クロード フランス国 エフ−38120 サン−テグレ ーブ，インパンス ラータイゲー，２ (72)発明者 クラー，ヤーン−フリードリヒ フランス国 エフ−38120 サン−テグレ ーブ，ラ フォンタニリ−コーニヨ，ル デュ モン ペルテュイ，８ (72)発明者 ペポネット，クレティアン フランス国 エフ−91250 ティゲリー， スクワー デ サーレルス，５ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC07 FA15 4B063 QA01 QA08 QQ42 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル流のための少なくとも１つの経路を含むマイクロ流
    体基板と、 少なくとも２つの温度の間で循環することが可能である少なくとも１つの熱伝
    達部材とを含むデバイスであって、前記少なくとも１つの熱伝達部材は、サンプ
    ルが前記サンプル経路の少なくとも一部に沿って連続的に流動している間、前記
    サンプル経路の少なくとも一部を前記少なくとも２つの温度に至らせるように適
    応している、上記デバイス。
  2. 【請求項２】 前記サンプル流のための少なくとも１つの経路に作動可能に
    連結された力供給部材をさらに含み、ここで、前記力供給部材は、前記サンプル
    が前記少なくとも１つの経路に沿って移動するように前記サンプルに力を加える
    ものである、請求項１に記載のデバイス。
  3. 【請求項３】 前記少なくとも１つの経路にサンプルを供給するサンプル供
    給部をさらに含む、請求項２に記載のデバイス。
  4. 【請求項４】 前記サンプル供給部が入力容器に前記サンプルを供給し、前
    記サンプルが前記入力容器から前記少なくとも１つの経路に移動するように、前
    記少なくとも１つの経路の第１の末端に配置された少なくとも１つの入力容器を
    さらに含む、請求項３に記載のデバイス。
  5. 【請求項５】 前記経路の第２の末端に配置された少なくとも１つの出力容
    器をさらに含む、請求項４に記載のデバイス。
  6. 【請求項６】 前記入力容器と前記出力容器との間に配置された少なくとも
    １つの試薬供給部をさらに含む、請求項５に記載のデバイス。
  7. 【請求項７】 前記デバイスは複数の前記経路を含む、請求項６に記載のデ
    バイス。
  8. 【請求項８】 前記経路は並列に配置されたチャンネルを含む、請求項７に
    記載のデバイス。
  9. 【請求項９】 前記力供給部材によって作り出される力は圧力である、請求
    項８に記載のデバイス。
  10. 【請求項１０】 前記マイクロ流体基板は本質的にケイ素からなる、請求項
    １に記載のデバイス。
  11. 【請求項１１】 前記生物学的サンプルの物理化学的特性を測定するための
    検出器をさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
  12. 【請求項１２】 前記熱伝達部材は、前記少なくとも２つの温度で水を含有
    する複数の水供給源と流体連絡している金属棒を含み、前記金属棒は前記サンプ
    ル経路の前記少なくとも一部と熱連絡している、請求項１に記載のデバイス。
  13. 【請求項１３】 生化学的または化学的プロセスための試薬を含むサンプル
    が少なくとも１つのサンプル流経路の少なくとも一部を通って流動している間、
    少なくとも２つの温度の間で前記少なくとも１つのサンプル流経路の前記少なく
    とも一部を循環させる工程を含む、生化学的または化学的プロセスを行う方法。
  14. 【請求項１４】 前記サンプル流経路はマイクロ流体基板上に設置される、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記サンプルが前記少なくとも１つのサンプル流経路の前
    記少なくとも一部を通って連続的に流動している間、前記サンプル流経路は前記
    少なくとも２つの温度の間で循環する少なくとも１つの熱伝達部材と熱連絡して
    いる、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記サンプルが前記少なくとも１つのサンプル流経路の前
    記少なくとも一部を通って連続的に流動している間、前記熱伝達部材は前記少な
    くとも２つの温度を通して複数回循環する、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記サンプルが前記少なくとも１つのサンプル流経路の前
    記少なくとも一部を通って連続的に流動している間、前記熱伝達部材は前記少な
    くとも２つの温度を通して約２回〜約３５回循環する、請求項１６に記載の方法
    。
  18. 【請求項１８】 複数のサンプルが前記サンプル流経路を通って同時に流動
    している間、複数のサンプル流経路の少なくとも一部は前記少なくとも２つの温
    度の間で同時に循環される、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記生化学的または化学的反応は核酸増幅手順を含む、請
    求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記核酸増幅手順はポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項
    １９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記核酸増幅手順の産物中の少なくとも１つの多形性ヌク
    レオチドの正体を決定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 少なくとも１つのサンプルに対する生化学的プロトコルを
    行うための方法であって、 少なくとも１つのチャンネルに少なくとも１つのサンプルを含有する溶液の連
    続流を供給する工程と、 試薬貯蔵部から少なくとも１つの試薬を前記チャンネルに注入し、それによっ
    て前記サンプルと前記試薬とを混合する工程と、 少なくとも１つの熱支持体と前記少なくとも１つのチャンネルの少なくとも１
    つの温度調節部分との間で熱を伝達させる工程とを含む、上記方法。
  23. 【請求項２３】 前記供給工程は前記少なくとも１つのチャンネルの供給容
    器と前記少なくとも１つチャンネルの出力容器との間に圧力差をかけることを含
    む、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記少なくとも１つのチャンネルにおける前記サンプルの
    少なくとも１つの物理化学的パラメータを検出することをさらに含む、請求項２
    ２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記溶液が前記少なくとも１つのチャンネルの前記少なく
    とも１つの温度調節部分を通って走行するとき、前記溶液の温度は予め決定され
    たレベルに調節される、請求項２２に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 少なくとも２つの異なる温度を通して前記少なくとも１つ
    の熱支持体を循環させることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 溶液が前記少なくとも１つのチャンネルの前記少なくとも
    １つの部分を通って走行している間、前記循環を１回〜３５回繰り返す、請求項
    ２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 セパレータによって分離された複数のサンプルを前記少な
    くとも１つのチャンネルに連続的に導入する、請求項２２に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記供給工程、前記注入工程、および前記伝達工程は、並
    列に配置された複数のチャンネル上で同時に行われる、請求項２２に記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 少なくとも１つのサンプルを含有する溶液に対する少なく
    とも１つの温度サイクルを連続流において行うための方法であって、 少なくとも１つのチャンネルに前記溶液の連続流を供給する工程と、 少なくとも１つの温度調節帯域を通して前記溶液を走行させる工程と、 前記溶液が少なくとも１つの温度調節帯域を通って１回走行するときに少なく
    とも１回は前記温度サイクルを経験するように、予め決定された時間系列で少な
    くとも２つの温度の温度サイクルを通して前記少なくとも１つの温度調節帯域を
    連続的に循環させる工程とを含む、上記方法。
  31. 【請求項３１】 前記チャンネルにおける前記サンプルの少なくとも１つの
    物理化学的パラメータを検出することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記供給工程は前記少なくとも１つのチャンネルの供給容
    器と前記少なくとも１つチャンネルの出力容器との間に圧力差をかけることを含
    む、請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記供給工程はセパレータによって分離された複数のサン
    プルによって連続的に反復される、請求項３０に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記供給工程、前記走行工程および前記循環工程は、並列
    に配置された複数のチャンネル上で同時に行われる、請求項３０に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 核酸を増幅するための方法であって、 ａ）前記核酸を含む少なくとも１つのサンプルと核酸を増幅させるのに適切な
    試薬とを混合して少なくとも１つの反応混合物を形成させる工程と、 ｂ）少なくとも１つのチャンネルに前記少なくとも１つの反応混合物の連続流
    を供給する工程と、 ｃ）少なくとも１つの温度調節帯域を通して前記少なくとも１つの反応混合物
    を走行させる工程と、 ｄ）予め決定された時間系列で少なくとも２つの温度の温度サイクルを通して
    前記温度調節帯域を循環させる工程であって、ここで、少なくとも２つの温度、
    温度サイクルの持続時間、および前記走行の速度は、前記少なくとも１つの核酸
    サンプルが前記少なくとも１つの温度調節帯域を通って流動する間に１回以上の
    変性−ハイブリダイゼーション−伸長サイクルを経験するように予め選択される
    工程とを含む、上記方法。
  36. 【請求項３６】 前記供給工程は前記少なくとも１つのチャンネルの供給容
    器と前記少なくとも１つチャンネルの出力容器との間に圧力差をかけることを含
    む、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記チャンネルはマイクロ流体基板に形成される、請求項
    ３５に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記マイクロ流体基板は本質的にケイ素からなる、請求項
    ３５に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記供給工程はセパレータによって分離された複数の核酸
    サンプルによって連続的に反復される、請求項３５に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は並列に配置された複数
    のチャンネルに上で同時に行われる、請求項３５に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 少なくとも１つの標的核酸中の少なくとも１つのヌクレオ
    チドを連続流において同定するための方法であって、 ａ）チャンネルに前記少なくとも１つの標的核酸を含む溶液の連続流を供給す
    る工程と、 ｂ）マイクロシークエンシング用緩衝液、少なくとも１つのマイクロシークエ
    ンシング用プライマー、少なくとも１つのｄｄＮＴＰおよびポリメラーゼを含む
    マイクロシークエンシング用試薬を前記チャンネルに注入し、それによって前記
    核酸溶液と前記試薬とを混合する工程と、 ｃ）前記少なくとも１つの標的核酸の変性、前記核酸と前記少なくとも１つの
    マイクロシークエンシング用プライマーとのハイブリダイゼーション、および前
    記プライマーの３’末端で同定しようとするヌクレオチドに相補的なｄｄＮＴＰ
    の取り込みを含む少なくとも１つのサイクルが生じるような方式で少なくとも１
    つの温度調節帯域を通して前記溶液を走行させる工程と、 ｄ）マイクロシークエンシング用プライマーの３’末端に取り込まれているヌ
    クレオチドを同定する工程とを含む、上記方法。
  42. 【請求項４２】 前記供給工程は前記チャンネルの供給容器と前記チャンネ
    ルの出力容器との間に圧力差をかけることを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 少なくとも１つのヌクレオチドを同定する前記方法を実施
    する前に請求項３５に記載の方法を使用して前記少なくとも１つの標的核酸を増
    幅することさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記ｄｄＮＴＰは発蛍光団で標識され、取り込まれたｄｄ
    ＮＴＰの蛍光が検出される、請求項４１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記供給工程、前記注入工程および前記走行工程は、並列
    に配置された複数のチャンネル上で同時に行われる、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 少なくとも１つの標的核酸中の少なくとも１つのヌクレオ
    チドを連続流において検出するための方法であって、 ａ）少なくとも１つの標的核酸を含有する溶液の連続流をチャンネルに供給す
    る工程と、 ｂ）検出しようとする少なくとも１つのヌクレオチドを担持する少なくとも１
    つの標的核酸の領域を増幅するための試薬を第１の試薬貯蔵部から前記チャンネ
    ルに注入する工程と、 ｃ）前記核酸が１回以上の変性−ハイブリダイゼーション−伸長サイクルを経
    験するような方式で少なくとも１つの温度調節帯域を通して該溶液を走行させる
    工程と、 ｄ）増幅産物を精製するための試薬を第２の試薬貯蔵部から前記チャンネルに
    注入する工程と、 ｅ）少なくとも１つの温度調節帯域を通して前記溶液を走行させて精製反応を
    行う工程と、 ｆ）マイクロシークエンシング用緩衝液、少なくとも１つのマイクロシークエ
    ンシング用プライマー、少なくとも１つのｄｄＮＴＰおよびポリメラーゼを含む
    マイクロシークエンシング用試薬を第３の試薬貯蔵部から前記チャンネルに注入
    する工程と、 ｇ）標的核酸の変性、前記核酸と少なくとも１つのマイクロシークエンシング
    用プライマーとのハイブリダイゼーション、および前記プライマーの３’末端で
    検出しようとするヌクレオチドに相補的なｄｄＮＴＰの取り込みを含む少なくと
    も１つのサイクルが生じるような方式で少なくとも１つの温度調節帯域を通して
    反応混合物を走行させる工程と、 ｈ）マイクロシークエンシング用プライマーの３’末端に取り込まれる少なく
    とも１つのｄｄＮＴＰを検出する工程とを含む、上記方法。
  47. 【請求項４７】 前記供給工程は前記チャンネルの供給容器と前記チャンネ
    ルの出力容器との間に圧力差をかけることを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 工程ｃ）およびｅ）において、温度調節帯域を、少なくと
    も１つのサイクルを形成する時間系列で連続的に少なくとも２つの温度に至らせ
    る、請求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記ｄｄＮＴＰは発蛍光団で標識され、工程ｈ）において
    取り込まれたｄｄＮＴＰの蛍光が検出される、請求項４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 精製のための試薬はエキソヌクレアーゼおよびアルカリホ
    スファターゼを含む、請求項４６に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ
    ）は並列に配置された複数のチャンネル上で同時に行われる、請求項４６に記載
    の方法。
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