KR19990067304A - 검정을 수행하기 위한 검정 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 반응 챔버내에서 유체가 통하지 않도록 하는 방식으로 승온 반응을 수행하기 위한 검정 시스템에 관한 것이며, 상기 검정 시스템은 (a) 반응 챔버를 포함하는 제 1 어셈블리, 및 (b) 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있는 온도 조절용 제 2 어셈블리를 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 (a) 변형 가능한 물질 및 (b) 반응 챔버의 온도를 빠르게 조절할 수 있는 메카니즘을 포함하는 검정 시스템에 관한 것이다.

Description

검정을 수행하기 위한 검정 시스템 및 방법

기술 분야

본 발명은 과학적인 화학 검정 분야, 특히 상기 검정을 수행하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.

배경 기술

형사상의 변론 및 의학적인 진단에서 이용되는 화학 검정은 미량의 DNA의 분석에 매우 가치가 있는 것으로 입증된 폴리머라아제 연쇄 반응("PCR")과 같은 생화학적인 과정을 점차로 포함하여 왔다. 특히, PCR 검정은 핵산의 한정된 세그멘트 또는 상기 한정된 세그멘트에 매우 상동하는 세그멘트의 존재를 검정하는 유력한 방법을 제공하였다. 이러한 방법은 관절염을 야기시키는 미코박테리움(mycobacterium), HIV 바이러스 또는 그 밖의 어떠한 병원성 미생물과 같은 특별한 병원체에 특이적인 핵산의 존재를 체액 검정하는데 사용될 수 있다. 미생물 진단 검정은 미생물의 게놈으로부터 핵산의 표적 세그멘트를 함유할 수 있는 샘플에 핵산의 표적 세그멘트에 특이적으로 결합하는(즉, "하이브리다이징하는") 두 개의 "프라이머"(즉, 비교적 짧은 핵산 세그멘트 또는 핵산 상동물)를 부가함으로써 작용한다. 제 1 프라이머는 두 가닥의 표적 핵산 세그멘트중 제 1 가닥에 결합하며, 하이브리다이징될 때, 다운스트림 방향으로 임의로 선정된 방향으로 표적 핵산 세그멘트중 제 2 가닥의 복사의 효소적 재생을 프라이밍할 수 있다. 제 2 프라이머는 제 1 프라이머 하이브리다이제이션 부위로부터 다운 스트림 위치에서 표적 핵산 세그멘트 중 제 2 가닥에 결합하며, 업스트림 방향으로 표적 핵산 세그멘트의 제 1 가닥의 복사의 효소적 재생을 프라이밍할 수 있다. (샘플이 단일 가닥의 표적 핵산으로 되어지는 경우, 제 2 프라이머는 왓슨 크릭크(Watson-Crick) 염기쌍 규칙으로 결정된 이론적인 제 2 가닥과 하이브리다이징될 것이다.) 상기 샘플에 핵산의 단량체 빌딩 블록이 부가되고, 핵산의 단일 가닥으로부터 핵산 재생을 특이적으로 촉매화하는 효소가 결합된다. 효소는 고온에 의한 파괴에 매우 높은 내성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 샘플은 DNA 용융 온도로 가열되어 샘플 핵산의 두 가닥을 분리한 후, 복제 온도로 냉각된다. 복제 온도는 프라이머가 분리된 가닥에 특이적으로 결합되게 하며 재생 효소가 조작되게 한다. 이러한 순환 후에, 반응 혼합물은 본래부터 존재하였던 각각의 표적 핵산 세그멘트에 대하여 두 세트의 두 가닥 핵산 세그멘트를 함유한다. 가열 및 복제 온도 사이클은 충분한 양의 핵산 세그멘트가 이러한 지수 재생 방법을 통해 생길 때까지 반복된다. 예를 들어, 20 사이클 후에, 세그멘트는 2²⁰배 또는 1,000,000배 만큼 증폭되었다. PCR 공정은 도 9에 도식화되어 있다.

PCR 반응을 자동화하는 것과 관련하여 수가지 문제점이 있다. 첫째, 검정에 의해 달성된 증폭의 정도는 바람직하지 않게 혼합된 샘플 또는 실험 장비에 결합된 올리고누클레오티드로부터 오염의 커다란 위험을 유발시킨다. 지금까지, 이러한 위험은 구조화하여 유지하기에 비용이 많이 드는 "클린(clean)" 시설에서 반응을 수행함으로써 상업적 또는 수동적인 과정에서 취급되었다. 자동화에 있어서, 이러한 위험은 필요로 되는 모든 시약 및 증폭용 반응 챔버가 샘플이 조절된 1회 조작시에 삽입될 수 있는 1회용 플랫폼에 포함되어야 한다는 것과 샘플 제조 단계가 최소화되고, 가능한 정도까지, 1회용 플랫폼내에서 수행되어야 함을 의미한다.

둘째, 두 가닥이 분리되도록 핵산을 용해시키는데 필요한 고온은 심지어 다양한 시약 유체의 삽입 및 제거를 허용하는 동안에도 반응 챔버가 증기 손실을 방지하도록 잘 밀봉되어야 함을 의미한다.

셋째, 반응은 비교적 작은 용적, 일반적으로는 약 100㎕ 이하의 용적에서 수행되어야 그 밖의 유형의 시험을 허용하도록 보존되어야 하며 또는 소량만으로도 유용한 값비싼 샘플 유체 또는 조직일 수 있는 비싼 시약을 보존하고 샘플의 양을 최소화할 수 있다.

본 발명은 유체의 반응 챔버내로의 삽입 또는 챔버로부터의 진공화를 조절하기 위한 효과적이면서 유체 밀폐된 밸브를 갖는 소규모의 1회용 장치를 제공함으로써 현재의 방법에 의해 제시된 어려움에 대한 해결책을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 반응 챔버내에서 유체가 통하지 않도록 하는 방식으로 승온 반응을 수행하기 위한 검정 시스템에 관한 것이며, 상기 검정 시스템은 반응 챔버를 포함하는 제 1 어셈블리, 및 온도 조절용 제 2 어셈블리를 포함하며, 여기에서 제 2 어셈블리는 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있다.

본 발명은 또한 샘플을 본 발명의 검정 시스템의 제 1 반응 챔버내로 도입하여 하나 이상의 유체 챔버로부터 PCR 반응을 수행하는데 필요한 시약을 함유하는 제 1 반응 챔버 용액에 전달하는 것을 포함하는 PCR 반응을 수행하는 방법에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 설명은 첨부 도면과 함께 이하 상세한 설명을 고려함으로써 용이하게 이해될 수 있다:

도 1a는 본 발명의 카루우젤(carousel)의 바닥 트레이의 상부도이다.

도 1b는 도 1a에 도시된 A-B 축을 따라서 도 1a의 바닥 트레이의 외부가 일부 절단된 투시도이다.

도 2a는 반응 챔버 디스크의 상부도이다.

도 2b는 도 2a의 반응 챔버 디스크의 외부가 일부 절단된 측면도이다.

도 2c 및 2d는 반응 챔버 디스크 측벽의 확대도이다.

도 3은 카루우젤의 또 다른 바닥 트레이의 상부도이다.

도 4a는 유체를 반응 챔버내로 유입시키거나 반응 챔버외부로 배출시키기 위한 장치를 도시하는 도면이다.

도 4b 및 4c는 도 4a의 장치의 작동을 나타내는 도면이다.

도 5는 세 개의 반응 챔버를 포함하는 반응 챔버 디스크를 도시하는 도면이다.

도 6a, 6b 및 6c는 반응 챔버를 빠르게 가열하거나 냉각시키기 위한 메카니즘을 도시하는 도면이다.

도 7a 및 7b는 반응 챔버를 빠르게 가열하거나 냉각시키기 위한 또 다른 메카니즘을 도시하는 도면이다.

도 8a 및 8b는 실시예 1에서 사용된 검정 카셋트를 도시하는 도면이다.

도 9는 PCR 반응의 첫 번째 2 사이클을 개략적으로 도시하는 도면이다.

도 10은 반응 챔버를 교반하는데 사용되는 자석의 예를 도시하는 도면이다.

이해를 돕기 위해, 동일한 참조 부호가, 가능하게는, 도면에 공통인 동일한 요소를 표시하는데 사용되었다.

정의

본원에서 사용되는 다음과 같은 용어는 아래 설명된 의미를 갖는다:

· 본원에서 사용되는 용어 "아닐링 온도"는 PCR 반응에서 사용된 프라이머중 하나, 및 표적 핵산 세그멘트에 대하여 가장 낮은 T_m미만의 온도로서 약 5℃를 의미한다. PCR 프로토콜은 종종 복제 온도 미만의 아닐링 온도를 사용하여 프라이머가 샘플 핵산에 결합되는(즉, 하이브리다이징되는) 속도를 촉진하며; 이러한 온도는 전형적으로는 약 45℃ 내지 약 72℃, 종종 55℃이다.

· 본원에서 사용되는 용어 "DNA 가닥 분리 온도"는 샘플에 존재할 수 있는 핵산의 상보 가닥을 분리하는데 PCR 프로토콜에서 사용된 온도를 의미하며; 이러한 온도는 전형적으로는 약 92℃ 내지 약 97℃, 바람직하게는 약 94℃이다.

· 본원에서 사용되는 용어 "승압"은 주위 대기압 보다 높은 압력을 의미한다.

· 본원에서 사용되는 용어 "제 1 어셈블리"는 하나 이상의 반응 챔버, 하나 이상의 유체 교환 채널, 및 하나 이상의 유체 교환 포트를 포함하는 어셈블리를 의미하며; 여기에서 제 1 어셈블리는 적합한 제 3 어셈블리와 유체 밀폐된 연결을 형성한다.

· 본원에서 사용되는 용어 "유체 밀폐"는 공간을 채우며, 1시간 동안 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열된 수성 유체의 질량을 보유하는 공간의 특성을 의미하며; 두 물질 사이의 밀봉은 밀봉이 가장 투과가 잘되는 물질 보다 실질적으로 물에 더 투과가 안되는 경우에 유체 밀봉된다.

· 본원에서 사용되는 용어 "핵산 용해 온도" 또는 T_m은 염기쌍 듀플렉스를 선호하는데서 두 가닥의 분리를 선호하는데로 평형 이동되는 핵산의 두 가닥 듀플렉스에 대한 전환 온도를 의미한다.

· 본원에서 사용되는 용어 "반응 카셋트"는 제 1 어셈블리 및 제 3 어셈블릴 포함하는 1회용 유닛을 의미한다.

· 본원에서 사용되는 용어 "감압"은 주위 대기압 미만의 온도를 의미한다.

· 본원에서 사용되는 용어 "복제 온도"는 핵산 재생성 효소가 프라이머가 결합된(즉, 하이브리다이징된) 핵산의 상보 가닥을 재생시키도록 PCR에서 사용된 온도를 의미하며; 이러한 온도는 태크(Taq) 폴리머라아제와 같은 열 안정성 폴리머라아제를 사용할 때, 전형적으로는 약 69℃ 내지 약 78℃, 바람직하게는 약 72℃이다.

· 본원에서 사용되는 용어 "제 2 어셈블리"는 열원 또는 냉각 싱크 또는 이 둘 모두를 포함하는 온도를 조절하기 위한 어셈블리를 의미하며; 제 2 어셈블리는 본원에서 "보조 블록"으로 또한 언급되며, 유체 임펠러를 포함할 수 있다.

· 본원에서 사용되는 표현 "실질적으로 일정한 온도"는 단지 약 +/- 0.3℃까지 변화하는 온도를 의미한다.

· 본원에서 사용되는 용어 "표적 핵산 세그멘트"는 PCR 반응에서, 존재한다면, 증폭하려는 서열과 같은, 핵산의 샘플에서 확인되거나 측정되는 핵산의 세그멘트를 의미하며; 표적 세그멘트는 전형적으로 샘플에서 발견된 매우 큰 핵산 분자의 일부이다.

· 본원에서 사용되는 용어 "제 3 어셈블리"는 하나 이상의 유체 챔버, 하나 이상의 유체 교환 채널 및 포트를 포함하는 어셈블리를 의미하며, 안정한 제 1 어셈블리와 유체 밀폐 조합을 형성할 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 반응 챔버내에서 유체가 통하지 않도록 하는 방식으로 생화학 반응을 수행하기 위한 검정 시스템에 관한 것이다. 상기 검정 시스템은 어떠한 특정 기하학 또는 이의 구성 요소의 형태에 의해 제한되지 않는데; 바람직하게는, 상기 검정 시스템은 반응 챔버("제 1 어셈블리"), 열원 또는 냉각 싱크 또는 이 둘 모두("제 2 어셈블리"), 및 다수의 유체 챔버("제 3 어셈블리")를 각각 포함하는 별도의 구성요소가 슬라이딩 또는 자리바꿈으로써 서로 이동할 수 있도록 원형, 정사각형 또는 직사각형 어셈블리, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 제 1 및 제 3 어셈블리는 각각 역으로 연결되어 접하는 모서리 또는 표면을 따라 나머지 어셈블리에 대하여 하나의 어셈블의 슬라이딩의 결과로서 어셈블리들 사이에서 유체가 교통할 수 있는 유체 상호 교환 포트를 갖는 접하는 모서리 또는 표면을 갖는다. 그러한 슬라이딩은 사용되는 어셈블리의 형태에 따라 선형 또는 원형 방식으로 일어나며; 원형이 사용되는 경우에는, 그러한 슬라이딩은 회전으로서 대안적으로 언급된다. 제 1 및 제 2 또는 제 1 및 제 3 어셈블리 또는 둘 모두는 각각 서로 접촉되게 역으로 위치하여 제 1 또는 제 3 어셈블리 또는 이둘 모두로부터 분리하거나 접촉시키는 제 2 어셈블리의 자리바꿈의 결과로서, 온도 조절, 유체 또는 반응 챔버로/로부터 유체 추진, 또는 둘 모두를 제공할 수 있는 접하는 표면(들)을 갖는다.

원형 구체예는 첨부 도면에 도시하여 나타내었다. 도 1a 및 1b에는, 18개의 유체 챔버(120A-Q)를 갖는 카루우젤(100)의 바닥 트레이(110)가 도시되어 있다. 각 챔버(120)는 유체 교환 포트(121)를 갖거나, 즉, 유체 상호 교환 채널과 교통할 수 있다. 카루우젤(100)에서, 챔버의 측벽(122)은 카루우젤(100)의 베이스(111)과 함께 주형되며, 상기 베이스(111)는 각 챔버(120A-Q)의 바닥(123)을 형성한다. 각 유체 교환 포트(121A-Q)는 카루우젤(100)에 의해 형성된 매끈한 내부 링 표면(140)에 구멍이 나있다. 바닥 트레이(110)의 상부에 고정된 카루우젤(100)의 상부 커버(130)는 도시되어 있지 않다. 커버(130)는 일반적으로 유체 챔버를 덮으며, 측벽(122)의 상부와 커버(130) 사이의 접합부는 일반적으로 유체가 통하지 않도록 밀봉될 것이다. 위치 노치(notch)(101)가 또한 도시되어 있으며, 이는 검정 시스템을 조절하는 메카니즘과 상호작용하여 카루우젤(100)의 회전 위치를 확인하는데 사용된다.

도 2a 및 2b에는 원형 슬롯이 반응 챔버 디스크의 삽입용으로 제공되는 경우에 어떠한 시스템 기하학으로도 고정될 수 있는, 반응 챔버 디스크(200)의 상부 구조가 도시되어 있다. 예를 들어, 도 2a 및 2b에 도해된 디스크(200)는 카루우젤(100)과 함께 사용될 수 있다. 또한, 반응 챔버 디스크는 다수의 유체 챔버로 구성되어 있으며 반응 챔버 디스크 삽입용으로 적합한 원형 슬롯이 내장된 직사각형 어셈블리와 함께 사용될 수 있다. 하나 이상의 반응 챔버로 구성된 디스크(200)는 검정 시스템의 제 1 어셈블리의 한 구체예이다. 또한, 제 1 어셈블리는 제 1 어셈블리에 포함된 유체 교환 채널을 경유하여 유체 챔버로부터/로 시약 및 폐기물 처리를 제공하는 제 3 어셈블리내에 포함된 상호 교환 채널과 교통하거나 교통을 끊는 능력을 제공하는 그 밖의 어떠한 적합한 모양일 수도 있다.

디스크(200)로 구체화된 제 1 어셈블리는 구조 링(210), 사면 에지(220) 및 반응 챔버의 폭을 제한하는 스페이서 링(230)을 포함한다. 제 1 유체 상호교환 채널(231)은 디스크(200)의 서로 반대편에 위치한다. 도 2c에서, 링(210)의 측벽(211)은 제 1 및 제 2 노치(212 및 213)를 갖는다. 횡단면으로 도시된 제 1 및 제 2 록킹 링(214 및 215)은 각각 노치(212) 및 (213)내로 끼움으로써 링(210)내의 위치로 맞물린다. 막(214)은 제 1 록킹 링(214)과 제 1 노치(212) 사이에 고정되어 반응 챔버(250)용의 상부 커버(251)를 생성시킨다. 막(242)은 제 2 록킹 링(215)과 제 2 노치(213) 사이에서 유사하게 고정되어 하부 커버(252)를 형성한다. 매끄러운 외표면(216)은 카루우젤(100)의 내부 링 표면(140)과 반대로 가지런하게 고정되어 유체가 통하지 않도록 밀봉되고, 그렇게 하여 가지런한 접합부를 형성한다. "가지런한 접합부"는 유체가 통하지 않는 접합부이다. 도 2d에서, 디스크(200)는 챔버(250)의 승온으로부터 스페이서 링(230) 및 링(210)을 단열시키는데 사용되는 가스킷(260)을 추가로 포함한다.

도 3에는 트레이(110)의 또 다른 구체예가 도시되어 있다. 상기에서 동정된 특징에 추가하여, 카루우젤(100)은 제 1 개구부(126) 및 제 개구부(127)를 갖는 도관(125)을 갖는다. 도관은 본원에서 유체 교환 채널로 또한 언급된다. 제 2 개구부(127)는 기체 또는 액체 공급원과 용이하게 결합되도록 설계된다(도시되지 않음). 유체 챔버(120-H1)는 밸브가 장착된 입구(124)에 의해 카루우젤의 외부 테두리에 연결된다.

도 4a, 4b 및 4c에는 유체가 챔버(250)내로 흘려지는 상부 보조 블록(300A) 및 하부 보조 블록(300B)를 갖는 메카니즘이 도시되어 있으며, 여기에서 검정 시스템은 어떠한 적합한 기하학이라도 가질 수 있으며, 구조체(300)는 유체 임펠러의 구체예이다. 상부 블록(300A)은 상부 기체 유입구/유출구(310A), 상부 다기관(320A) 및 다수의 상부 가압된 채널(321A)을 포함하는 통로로 벌집모양으로 되어 있다. 상부 채널(321A)은 상부 막(241) 표면의 인접부에 구멍이 나있다. 대칭 하부 블록(300B)의 상응하는 구조체는 접미사 "A" 대신에 접미사 "B"를 사용하여 상응하게 번호붙여 있다. 도 4b에서는, 기체 압력은 상부 및 하부 가압된 채널(321A 및 321B)에서 빠져나오는 기체가 상부 및 하부 막(241 및 242)으로 하여금 합쳐지도록 상부 기체 유입구/유출구(310A) 및 하부 기체 유입구/유출구(310B)를 통해 적용되어, 챔버(250)로부터 유체를 나오게 하여 앞서 언급된 유체 임펠러 구체예를 설명한다. 도 4c에서, 기체 유입구/유출구 (310A) 및 (310B)에 적용된 진공에 의해 상부 및 하부 채널 (321A) 및 (321B)에서 흡입이 생성되어 상부 및 하부 막 (241) 및 (242)가 블록(300A) 및 (300B)에 각각 부착되며, 이렇게 하여 상부 및 하부 막 (241) 및 (242)를 끌어당김으로써 본 발명이 진공화된다. 챔버(250)내의 부분 진공의 도움에 의해 제 1 또는 제 2 유체 교환 채널(231) 또는 (232) 중의 하나의 채널을 통해 유체가 본 발명의 장치로 끌어당겨진다.

도 5에서, 반응 챔버 디스크(200)는 세 개의 챔버(250A-250C)를 포함하며, 이들은 제 1 유체 교환 채널(231A-231C) 및 제 2 유체 교환 채널(232A-232C)을 갖는 어떠한 적합한 형태 또는 용적일 수 있다.

도 6a에는 추가의 특징을 포함한다는 것을 제외하고는, 도 4a-4c에 도시된 보조 블록과 유사한 제 2 어셈블리의 한 구체예가 도시되어 있다. 제 2 어셈블리(300A)에는 상부 도관(330A)이 벌집형을 이루고 있다. 상부 도관(330A)는 상부 유입구(331A) 및 상부 유출구(332A)를 갖는다. 상부 블록(300A)의 상부(301A)는 단열 물질로 제작되고, 하부(302A)는 열전도 물질로 제작된다. 상부 전기 가열기(340A)는 챔버(250)에 인접하여 위치한다. 일반적으로, 도시된 상부 제 2 어셈블리(300A)의 이중 하부 제 2 어셈블리(300B)는 챔버(250) 바로 아래에 위치한다.

도 6b에는 도 6a의 하부 제 2 어셈블리(300A)에 대한 보조적인 지지 장치의 개략도가 도시되어 있다. 냉각수는 상부 및 하부 도관(330A 및 330B)을 통해 펌프 및 냉각기 콘솔(350)로부터 추진된다. 펌프 및 냉각기 콘솔(350)은 조절기(400)의 조절하에 작동하는 유체 밸브를 추가로 포함한다. 전류는 동력 공급기(360)에 의해 상부 및 하부 가열기(340A 및 340B)에 공급되며, 조절기(400)에 의해 조절된다. 조절기(400)는 상부 및 하부 열 센서(370A 및 370B)로부터의 입력을 받아들인다.

도 6c에는 상부 연장부(303A)가 상부 보조 블록(300A)의 외표면에 첨가되어 있다는 것을 제외하고는, 도 6a의 구체예와 유사한 제 2 어셈블리(300A)의 또 다른 구체예가 도시되어 있다. 상부 연장부(303A)는 일반적으로 상부 단면(302A)과 동일한 물질로 제작되어 있다. 상부(301A)는 유리하게는 상부 단면(302A)과 동일한 물질로 제작될 수 있다. 제 1 및 제 2 상부 단열기 세그멘트(322A 및 323A)는 상부(301A)와 상부 단면(302A) 사이에 삽입되어 있다. 제 1 및 제 2 상부 열 센서(304A 및 306A)는 상부 단면(302A) 및 상부 연장부(303A)에 각각 위치하며, 제 1 및 제 2 상부 리드(305A 및 307A)에 의해 조절기(400)에 각각 연결된다.

도 7a에서, 상부 제 2 어셈블리(500A)는 한 세트의 쌍을 이룬 제 1 및 제 2 상부 열전기 블록(511A 및 512A)을 포함하며, 하부 제 2 어셈블리(500B)는 한 세트의 쌍을 이룬 제 1 및 제 2 하부 열전기 블록(511A 및 512B)을 갖는다. 제 1 상부 및 하부 열전기 블록(511A 및 512B)은 p 유형의 반도체 물질로 제작되며, 제 2 하부 및 제 2 하부 열전기 블록(512A 및 512B)은 n-타입 반도체 물질로 제조된다. 블록(511 및 512)은 상부 및 하부 커넥터(513A 및 513B)에 의해 직렬로 전기적으로 연결되어 열전가 가열 펌프를 형성한다. 상부 및 하부 기체 유입구/유출구(510A 및 510B)는 상부 열전기 블록(501A)과 하부 열전기 블록(501B) 사이의 공간에 의해 형성된 상부 및 하부 다기관(520A 및 520B)에 각각 연결된다. 다기관(520A 및 520B)은 상부의 다수 통로(521A) 또는 하부의 다수 통로(521B)에 각각 연결된다. 상부 및 하부 블록(500A 및 500B)의 외부는 각각 상부 및 하부 가열 싱크(504A 및 504B)이다. 제 1 상부 공기가 통하지 않는 칼라(506A), 제 2 상부 공기가 통하지 않는 칼라(507A), 제 1 하부 공기가 통하지 않는 칼라(506B) 및 제 2 하부 공기가 통하지 않는 칼라(507B)는 다기관(502A 및 502B) 형성을 돕는다. 상부 및 하부 열 센서(570A 및 570B)는 각각 상부 및 하부 리드(571A 및 571B)에 의해 조절기 또는 모니터 장치에 연결될 수 있다. 도 7b에는 챔버(250)에 연접할 세라믹 말단 플레이트(502)의 표면이 도시되어 있다. 도 7b에는 도 7a에서는 분명하지 않은 제 2 어셈블리(500A 및 500B)의 3차원적인 양태 중 한 양태가 도시되어 있으며; 열전기 블록이, 도시된 바와 같이, 2차원 차수라기 보다 3 차원 차수로 배열되는 것이 전형적일, 도 7a에서는 분명하지 않은 제 2 어셈블리의 또 다른 특성이다.

도 9에는 폴리머라아제 연쇄 반응의 개략도가 도시되어 있다. 라인(901)은 오른쪽에서 왼쪽으로 5'에서 3' 배향을 갖는 표적 DNA의 제 1 가닥을 나타낸다. 라인(902)은 3'에서 5' 배향을 갖는 표적 DNA의 상보적인 가닥을 나타낸다. 프라이머(903)는 I 위치에서 제 1 가닥(901)에 상보적이다. 프라이머(904)는 J 위치에서 제 2 가닥(902)에 상보적이다. 온도 안정한 DNA 폴리머라아제(예를 들어, 태크(Taq) 폴리머라아제), 및 DNA를 복제하는데 폴리머라아제에 의해 사용된 누클레오티드 트리포스페이트는 혼합물의 형태로 존재한다. 제 1 단계로서, 가닥(901 및 902)을 분리하기 위한 가닥 분리 온도로 온도를 높인다. 그런 후, 제 2 단계에서, 다량의 프라이머가 I 및 J 위치에서 각각 제 1 및 제 2 가닥(901 및 902)에 각각 결합되고, 결합된 제 1 및 제 2 프라이머(903 및 904)상에 폴리머라아제가 수립되어 제 1 가닥(902) 및 제 2 가닥(901)의 복제 부분을 구성하는 복제 온도로 온도를 낮춘다. 두 번 반복한 후, I 위치와 J 위치 사이의 DNA 부분은 4배 복제되었다.

챔버(250)는 어떠한 적합한 형태라도 가질 수 있다. 원 형태에 있어, 앞서 언급된 제 3 어셈블리는 카루우젤 형태, 즉, 원형 컨베이어, 또는 시약 또는 폐기 생성물의 용착기가 바람직하다. 또 다른 형태는 직사각형 용적물이며, 여기에서 제 3 어셈블리는 반응 챔버를 포함하는 제 1 어셈블리상에서 유체 교환 포트에 대하여 미끄러질 수 있다. 제 3 어셈블리는 제한없이 광학 등급 유리, 실리콘 기재 물질 또는 플라스틱을 포함하여 다수의 물질로 구성될 수 있다. 일부 경우에, 단백질 또는 핵산과 같은 생물학적 분자에 결합되는 물질상의 부위를 최소화하기 위해 물질, 예를 들어 클로로메틸실란 또는 디클로로디메틸실란을 갖는 물질을 표면처리하는 것이 필요할 수 있다. 주로 선호되는 물질은 고온에 강한 내성을 갖는 폴리에틸렌(PE), 특히 고밀도 등급의 PE이다. 플라스틱으로 구성될 때, 제 3 어셈블리는 사출 성형에 의해 바람직하게 형성된다.

일반적으로, 제 3 어셈블리의 커버(130)는 바닥 트레이(110)와는 별도로 형성된다. 커버(130)는 예를 들어 두 개의 물질이 용융할 때까지 가열하면서 이들 부분을 함께 압착시킨 후, 용융된 접속부가 고화될 때까지 이들 두 부분을 계속해서 압착하면서 빠르게 냉각시킴으로써 트레이(110)에 부착된다. 챔버(120)의 측벽과 커버(130) 사이의 밀봉은 일반적으로 유체가 통하지 않도록 수행된다. 커버(130)는 신축적이면서 탄력적인 변형될 수 있는 중합성 물질, 또는 보다 경성인 물질(예를 들어, 유리)로 형성된다. 보다 경성인 물질이 사용되는 경우에는, 트레이(110)를 형성하는 물질의 팽창 계수와 비교되는 팽창 계수를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 카루우젤이 둘 이상의 온도 사이에서 순환되어지는 일부 검정 시스템으로부터 제거되기 때문에 열팽창의 이와 같은 유사성은 이러한 관계에 있어서는 중요하지 않다.

커버(130)가 변형될 수 있는 물질로 만들어지는 경우, 챔버(120)로부터 챔버(250)로 유체를 흐르게 하는 유체 임펠러는 유체를 유체 교환 포트를 통해 밖으로 유도하여 적합하게 정렬된 반응 챔버내로 유도하기 위하여 플런저가 챔버(120) 벽과 꼭 맞도록 실질적으로 같은 횡단면을 갖는 기계적인 플런저일 수 있다. 카루우젤(100)이 회전 가능한 경우에, 검정 시스템에서 수행되는 검정(또는 그 밖의 반응)이 챔버(250)내로 전달하려는 챔버(120)내 유체를 요할 때, 상기 플런저 밑에 챔버(120)가 위치하도록 회전될 수 있다. 유사하게, 직사각형 시스템에서, 제 1 및 제 3 어셈블리는 시약 함유 제 3 챔버를 반응 챔버에 연결시키는 유체 교환 채널을 정렬시키기 위해 서로에 대하여 슬라이딩된다. 이러한 회전 및 슬라이딩은 반응 챔버의 카루우젤 구체예에 관하여, 제 1 또는 제 2 유체 교환 채널(각각, 231 또는 232)과 통하는 유체 교환 포트를 갖는 유체 챔버와 통하는 유체 교환 포트를 정렬시키기 위해 측정된다. 일부 구체예에서, 채널(231) 또는 채널(232)가 유체 교환 포트(121)로 정렬될 때, 다른 채널(231 또는 232)은 또 다른 채널(121)로 정렬되며; 이러한 이중 정렬은 유체가 한 포트(121)를 통해서 디스크(200)내로 삽입되게 하며, 반면에 디스크(200)내에 이미 존재하는 기체 또는 유체는 다른 포트(121)를 통해 배출된다. 다른 구체예에서, 디스크(200)는 유체의 삽입이전에 진공처리되어 연속적인 유체 삽입을 용이하게 한다.

챔버(120)로부터 챔버(250)로 유체가 흐르도록 추진시키는 또 다른 수단은 변형 가능한 커버를 갖는 챔버(120)에 대하여 (도 4a의 상부 보조 블록(300A)과 같은) 보조 블록을 정렬시키는 것을 필요로 한다. 보조 블록은 커버(130)에 반하는 압력을 생성시켜 유체 챔버로부터 유체가 이동하도록 하향으로 변형시키는데 사용되는 다수의 기체 구멍을 포함한다. 블록(300A)과 챔버(120A-120Q)의 측벽(122)에 부착된 커버(130)의 비가요성 부분 사이의 공간은 유체에 적용될 수 있을 정도의 충분한 압력을 허용할 수 있을 정도로 충분히 좁아서, 포트(121)를 통해 챔버(120)로부터 이동할 것이다. 이러한 형태의 메카니즘은 도 4a에 도시되어 있다. 이러한 형태의 메카니즘은 구멍에 진공을 적용함으로써 역으로 조작될 수 있으며, 그 결과 커버(130)는 보조 블록 표면에 부착되어질 것이다. 부착된 커버(130)와 함께, 보조 블록이 챔버(120)에서 먼 방향으로 이끌리기 때문에, 부분 진공이 챔버내에서 생성되어 유체가 챔버내로 이끌리게 된다.

또 다른 구체예에서, 유체 챔버는 카루우젤의 외부 모서리에 연결된 밸브 장착된 입구(124)를 갖는다(도 3a 참조). 카루우젤(100)은 도시된 배향에 대하여 우각에서 조작될 수 있으며, 그 결과 액체가 배출되는 챔버가 챔버(250) 위에서 정렬될 수 있다. 입구(124)를 통해 기체를 유입시켜서 챔버(120)의 바닥에 위치한 교환 포트(121)를 통해 챔버로부터 유체를 배출시킬 수 있다. 기체가 챔버(250)내로 유입되지 못하도록 하는 한 방식은 챔버(120)보다 작은 용적을 갖는 챔버(250)를 설계하는 것이며, 이렇게 하게 되면 모든 기체가 챔버(120)로부터 배수되기 전에 챔버(250)가 충전된다. 수용액에서 낮은 용해도를 갖는 기체(예, 헬륨)은 이와 같은 상황에서는 일반적으로 바람직할 것이다.

입구(124)의 밸브는 챔버(120)로부터 유체의 외향 흐름을 차단만 하는 유체가 유입되게 하는 저지 밸브일 수 있다. 또한, 상기 밸브는 카루우젤의 외표면상의 접촉부에 연결된 전자기 가동 밸브일 수 있다. 이들 접촉부는 밸브가 가동되도록 동력을 제공하는 전기 접촉부로 정렬될 수 있다.

도 3에는 유체 챔버(120A1, 120B1, 이하 참조)가 원형 횡단면 모양을 갖는 다수의 다양한 크기의 챔버를 포함하는 바닥 트레이(110)의 또 다른 구체예가 도시되어 있다. 커버(130)는 챔버(120A 등)로 영구히 정렬되는 플런저에 의해 대체될 수 있다. 카루우젤(100)가 회전하도록 설계되는 경우에, 플런저는 카루우젤(100)과 함께 회전하는 상부 구조체에 고정된다. 검정 유체와 접촉하는 모든 구성요소의 일회성을 증가시키기 위해서, 플런저, 및 심저어 상부 구조체는 플라스틱과 같이 저비용으로 용이하게 성형된 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 타이트한 밀봉물의 형성을 용이하게 하기 위해서, 물질 "C"는 플런저를 구성하는데 사용되며, 물질 "D"는 유체 챔버의 벽을 구성하는데 사용되며, 여기에서 물질 C 및 D의 록웰(Rockwell) 경도값은 R50 이상이며, 상기 수치는 상기 어셈블리가 사용중에 변형되지 않을 것이라는 것을 보장하는 수치이다. 폴리에틸렌과 같은 물에 낮은 투과도를 갖는 물질을 사용하는 것도 마찬가지로 중요하다. 바람직한 구체예에서, C는 R50 폴리에틸렌이며, D는 R110 폴리카보네이트이다.

또한, 유체는 상기된 동일한 메카니즘에 의해 도 3의 챔버(120A1 등)로부터 또는 상기 챔버내로 유도될 수 있다.

한 구체예에서, 카루우젤(100)은 상부 절반상에 챔버(120) 및 바닥 절반상에 추가의 챔버(120)를 갖는다(도시되지 않음). 이러한 구체예에서, 검정 시스템은 유체가 챔버(120)로부터 방출되게 하는 두 개의 수단을 갖는데; 그 중의 한 수단은 카루우젤의 상부와 정렬되며, 나머지 한 수단은 하부 절반과 정렬된다.

검정 시스템이 디스크(200)와 같이 하나 이상의 챔버(250)를 수용하도록 설계되는 경우, 바람직하게는 제 1 어셈블리당 약 9개 이상의 챔버(120), 보다 바람직하게는 제 1 어셈블리당 약 15개 이상의 챔버(120), 더욱 바람직하게는 제 1 어셈블리당 약 20개 이상의 챔버(120)가 존재할 것이다.

유체 챔버(120)에 추가하여, 일부 구체예에서는 제 3 어셈블리와 통하는 하나 이상의 도관(125)이 존재할 것인데, 각 도관은 제 1 또는 제 2유체 교환 채널(각각, 231 또는 232)와 정렬할 수 있는 내부 링 표면(140)에서 제 1 개구부(126)를 갖는다. 상기 도관은 세척액 또는 불활성 기체와 같은, 제한없이, 기체 또는 액체의 공급원과 결합을 형성할 수 있는 제 2 개구부(127)를 가질 것이다.

전형적으로, 교환 포트(121), 도관(125) 및 입구(124)는 직경이 약 125마이크로미터(㎛) sowl dir 1250㎛, 바람직하게는 약 500㎛인 채널 또는 개구부이다. 전형적으로, 카루우젤(100)의 직경은 약 8cm 내지 약 10cm이며, 그 깊이는 약 5밀리미터(mm) 내지 약 8mm이다. 다른 형태의 제 3 어셈블리는 예를 들어 정사각형 형태에 대해서 길이가 약 7cm 내지 9cm이며, 그 깊이가 5mm 내지 약 8mm인 유사한 용적을 차지한다.

제 1 어셈블리는 하나 이상의 반응 챔버를 포함하며, 제 3 어셈블리에 대해 설명된 물질과 동일한 물질로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, 디스크(200)는 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이, 제 1 및 제 2 교환 채널(각각, 231 및 232)을 갖는 구조체 링(210)으로 제조된다. 링(210)은 카루우젤(100)의 내부 링 표면내에 꼭 맞게 끼워져 검정 시스템으로 하여금 어셈블리상에서 유체가 통하지 못하게 한다.

한 구체예에서, 챔버(250)는 도 2c 및 2d에 도시된 바와 같은 구조 링을 가로지르는 두 개의 얇고 변형 가능한 막(241 및 242)을 스트레칭함으로써 형성된다. 바람직하게는, 상기 막(241 및 242)은 폴리에틸렌, 플루오르화폴리비닐리덴 또는 폴리에틸렌/폴리에틸렌 테레프탈레이트 이중 층과 같이 신축적이고 가요성을 지닌 변형 가능한 중합성 필름으로 형성된다. 적합한 필름은 예를 들어 미니애폴리스에 소재하는 카파크 코포레이션(Kapak Corporation ), MN 또는 이.아이 듀퐁 드 네무어(E.I.duPont de Nemours) 및 컴패니, 윌밍톤(Co., Wilmington)(DE)에서 구입할 수 있다. 바람직하게는, 막(241 및 242)은 약 120℃ 정도의 높은 온도에 내성이 있어야 한다. 바람직하게는, 막(241 및 242)의 두께는 약 25 내지 약 150㎛이어야 하며, 보다 바람직하게는 약 50 내지 100㎛이어야 한다. 막의 두께는 반응 챔버와 인접 가열 또는 냉각 장치 사이에서의 빠른 열교환을 돕는다. 바람직하게는, 각 챔버(250)의 전체 용적은 약 5㎕ 내지 약 200㎕이며, 보다 바람직하게는 약 20㎕ 내지 약 100㎕이다. 바람직하게는, 챔버(250)는 약 1mm 이하의 두께(커버(251)과 (252) 사이의 거리)를 갖는다.

챔버(250)가 변형 가능한 상부 커버(251) 또는 하부 커버(262)(또는 이 둘)를 가질 때, 힘은 반응 챔버내로 또는 외부로 유체를 밀어내기 위해 챔버(120)에 대해서 상기된 방식과 동일한 방식으로 이들 커버에 적용될 수 있다. 이를 수행하는 바람직한 수단은 도 4a, 4b 및 4c에 도해되어 있다. 그러나, 도해가 유체를 반응 챔버 내외로 이동시키도록 변형되는 상부 커버(251) 및 커버(252) 둘 모두를 도시하고 있고, 이들 커버 중 하나의 커버는 비가요적이며 유체는 단지 하나의 신축적인 커버의 변형을 사용하여 상기 반응 챔버내외로 이동될 수 있다는 것을 주목해야 한다.

챔버(250)는 유체 교환 채널(231 또는 232)가 제시된 챔버(120)의 유체 교환 포트(121)와 정렬될 때 나머지 유체 교환 채널이 밀봉되도록(유체 교환 포트와 정렬되지 않도록) 설계될 수 있다. 이 위치에서, 유체는 예를 들어 도 4b에 도해된 메카니즘을 사용하여 챔버(250)로부터 정렬된 유체 챔버(120)내로 유입될 수 있다. 그런 후, 유체는 또 다른 챔버와 교환 채널(231 또는 232)를 정렬하여 챔버(120)내의 유체를 챔버(250)으로 유입시킴으로써 챔버내로 유도될 수 있다. 유체는 카루우젤(100)과 관련된 메카니즘을 통해 적용된 양성적 압력을 사용하거나, 도 4c에 도해된 메카니즘을 통해 적용된 압력과 같은 음성적 압력을 사용하여 챔버(250)내로 유도될 수 있다.

단일 검정 시스템에 수용될 수 있는 검정 변수를 증가시키기 위해, 반응 챔버 디스크(200)과 같은 제 1 어셈블리는 바람직하게는 하나 이상의 챔버(250), 바람직하게는 셋 이상의 챔버, 보다 바람직하게는 다섯 이상의 챔버를 포함한다. 세 개의 반응 챔버(250A-C)를 갖는 디스크(200)는 도 5에 도해되어 있다. 도해된 디스크(200)는 각 챔버(250)가 본래 세트의 챔버(120)와 상호작용할 수 있도록 설계되며, 상기 각 세트의 챔버(120)는 별도의 120°호의 반응 카셋트내에 놓여있다는 것을 주목해야 한다. 바람직한 구체예에서, 디스크(200)의 챔버(250)의 커버(251 또는 252)는 가요성 막(241 및 242)이다.

유체를 반응 챔버내외로 밀어내는 메카니즘과 함께 다중 반응 챔버 시스템을 사용할 때, 상기된 바와 같이 수행하기 위한 일부 메카니즘은 당업자에게는 자명할 방식으로 변경을 필요로 할 수 있다. 그러나, 전형적으로 유체가 동시에 반응 챔버 모두로부터 배출되거나 삽입될 것이기 때문에, 이들 변경을 수행하는 과업은 보다 용이해 진다. 반응 챔버의 동시발생 조작 때문에, 도 4a-4c에 도해되어 있는 반응 챔버를 비우거나 충전시키는 압력 조절 메카니즘은 아마도 반응 챔버와 통로를 보다 정렬하기 위해 유체 채널(321A 및 321B)의 분포를 변경시키는 이상으로 변화를 필요로 하지 않아야 한다.

도 5에 도해된 반응 챔버 디스크와 같이, 제 1 어셈블리가 다중 반응 챔버를 함유할 때, 예를 들어 제 1 챔버(250A)와 함께 사용하는데 적합한 유체 챔버는 외표면(216)상의 제 1 위치에서 채널(231A)을 가지며, 반면에 제 2 챔버(250B)는 외표면(216)상의 제 2 위치에서 유체 교환 채널을 갖는다. 추가의 챔버(250)는 다른 위치에서 교환 채널을 갖는다. 제시된 챔버(250)와 함께 사용하기에 적합한 각 챔버(120)는 상응하는 챔버(250)의 채널(231)과 포트(121)를 정렬시키는데 적합한 내표면(140)상의 위치에 위치한 포트(121)를 갖는다.

전형적으로, 채널(231 및 232)의 직경은 약 125㎛ 내지 1250㎛, 바람직하게는 약 500㎛이다. 전형적으로, 디스크(200)의 직경은 약 7.5cm 내지 약 10cm이고, 그 깊이는 카루우젤(100)의 깊이에 상응하며; 다른 형태의 검정 시스템의 상황에서 사용되는 제 1 어셈블리는 제 1 어셈블리에 관하여 상기에서 유사하게 기술된 바와 같은 유사한 용적을 차지한다.

카루우젤(100)의 표면 및 디스크(200)의 외표면(216)과 같이, 제 1 어셈블리와 제 3 어셈블리 사이의 밀봉의 질을 결정하는데 중요한 변수는 이들 두 표면의 평탄도 및 이들 두 표면 사이의 적합이다. 플라스틱을 사용할 때, 충분하게 평탄한 표면을 달성하는 한 방식은 사출 성형에 의해 표면을 형성하는 것이다. 유.에스. 프리시젼 렌즈(U.S. Precision Lens)(오하이오주 신시내티에 소재) 또는 매트릭스 인코포레이티드(Matrix Inc.)(프로비던스, RI)에 기술된 사출 성형 방법은 작은 어셈블리의 차수적 재현성에 특히 적합하다.

바람직한 구체예에서, 타이트한 밀봉 형성을 용이하게 하기 위해, 물질 "E"는 표면(140)을 구성하는데 사용되고 물질 "F"는 디스크(200)의 외표면(216)을 구성하는데 사용되며, 물질 E 및 F는 이전에 제시된 록웰 경도값을 갖는다. 바람직한 구체예에서, E는 R50 폴리에틸렌이고, F는 R110 폴리카보네이트이다.

카루우젤(100) 또는 디스크(200)와 같이 각각 제 3 또는 제 1 어셈블리는 일반적으로 모터가 장착된 기계적 슬라이딩 또는 회전 수단에 부착될 것이다. 상기 슬라이딩 또는 회전 장치는 공학 기술분야에 잘 공지되어 있다. 바람직하게는, 슬라이딩 또는 회전 수단은 조절기(400)가 검정 프로토콜의 제시된 부분에 적합한 그러한 배열을 선택하는 경우에 제 1 채널(231) 또는 제 2 채널(232)을 어떠한 제시된 유체 교환 포트(121)와 재현성있게 정렬할 수 있을 정도로 충분히 정밀해야 한다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 카루우젤 구체예의 노치(101)는 외부 모서리상에 균일한 세트의 기어 이를 갖는 외부 링내에 카루우젤을 정밀하게 적합시키는데 사용될 수 있다. 바꾸어 말하면, 기어는 조절기(400)의 유도하에 작동하는 스테퍼 모터와 상호작용한다.

전형적으로, 디스크(200) 또는 카루우젤 중의 하나가 모터가 장착된 회전 수단에 부착될 때, 다른 하나는 작동 중에 검정 시스템 대신에 적합될 것이다. 위치로의 이러한 맞물림은 배열 변수를 감소시켜 카루우젤(100)과 디스크(200) 사이의 배열의 재현성을 개선시킨다.

제 3 또는 제 1 어셈블리 중의 하나를 회전시커거나 슬라이딩시키는 다수의 수단, 에를 들어 카루우젤 또는 반응 챔버 디스크는 기계 기술분야에 종사하는 사람에게는 자명하게 될 것이다.

상부 또는 하부 어셈블리(300A 또는 300B)(또는, 물론, 상부 및 하부 제 3 어셈블리(500A 또는 500B))는 다수의 상부 또는 하부 가압된 유체 채널(321A 또는 321B)을 함유할 수 있다. 이들 채널내의 유체는 전형적으로 기체이다. 대기압 보다 높은 기체가 상부 또는 하부 기체 유입구/유출구(310A 또는 310B)에 적용된 가압된 기체통 또는 펌프로부터 채널(321A 또는 321B)에 적용될 수 있다. 진공, 보통은 부분 진공이 예를 들어 진공 펌프를 사용하는 채널(321A 또는 321B)에 적용될 수 있다. 가압된 유체 채널의 압력을 조절하기 위한 다수의 메카니즘은 당업자에 의해 인지될 것이다.

인접 반응 챔버(250)를 진공화시키기 위한 메카니즘의 일부로서, 블록(300A 또는 300B)는 챔버(250)와 멀리 떨어져 블록(300A 또는 300B)을 유도하기 위한 수단을 가질 수 있으며, 이렇게 되면 반응 챔버와 멀리 떨어져 부착력이 있으면서 신축성이 있는 커버(251 또는 252)가 유도된다. 보조 블록을 유도하는 상기 수단은 전형적으로 기계 또는 전기 기계 장치일 것이다. 그러한 장치는 당업자에게는 잘 공지되어 있다.

바람직한 구체예에서, (1) 하나 이상의 반응 챔버는, 도 2b에 도시된 구조체(250, 251 및 252)에서와 같이, 상부 커버 또는 하부 커버가 일반적인 투명한 외벽(또는 두 개의 외벽이 투명)을 갖거나, (2) 하나 이상의 유체 챔버는 챔버의 상부 커버 또는 바닥이 일반적인투명한 외벽(또는 두 개의 외벽이 투명)을 갖는다. 이러한 구체예에서 검정 시스템은 빛을 투명한 커버 또는 바닥에 유도할 수 있는 광원, 및 (a) (예를 들어, 도 8a 또는 8b의 250 또는 120과 같이) 조명된 챔버로부터 반사되는 빛, (b) 조명된 챔버(250 또는 120)를 통하여 투과되는 빛 또는 (c) 챔버(250 또는 120)내에서 여기된 입자로부터 발산되는 빛 발산을 측정하기 위한 검출 장치를 포함한다. 생물 분자를 검출하는데 유용한 파장에서 약 80% 이상 투명하다면 외벽은 "투명"하다.

검출 장치는 광학 섬유를 채용할 수 있다. 섬유 광학을 채용하기 되면, 검정 시스템에 인접한 검출 시스템의 크기는 최소가 된다. 이러한 크기 최소화는 (제 2 어셈블리에 채용된) 온도 조절 장치와 함께 검출 시스템 및 회전 장치를 검정 시스템에 채용하는 것을 용이하게 한다. 특히 바람직한 광원은 고체 상태 레이저이다. 이들 광원의 크기는 또한 검정 카셋트 주위에 다수의 보조 어셈블리를 채택하는 것을 용이하게 한다. PCR이 최근의 기술 고체 상태 레이저를 채택하는 검정 시스템에서 수행될 때, 증폭된 핵산을 검출하는데 사용된 방법은 하기에 기술된 바와 같이, 증폭된 핵산의 존재를 나타내도록 약 600나노미터(nm) 보다 높은 파장에서 빛을 흡수하는 염료를 사용한다. 그러한 염료의 예로는 Cy₅™ 컨쥬게이션된 시약(PA 웨스트 그루브에 소재하는 잭슨 이뮤노리서치 래브스, 인코포레이티드(Jacksom ImmunoResearch Labs, Inc.)), 알로피코시아닌(allophycocyanin) 및 알로피코시아닌 컨쥬케이션된 시약(미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co.)), 및 C-피코시아닌 및 C-피코시아닌-컨쥬게이션된 시약(미주리주 세인트 루이스 시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co.))이 있으며, 이들 중 Cy₅™ 컨쥬게이션된 시약은 600-650nm 범위에서 흡수하고 630-750nm 범위에서 형광 신호를 방출한다. 상기된 비교적 높은 파장은 올리고누클레오티드, 플라스틱 및 검정 시스템의 그 밖의 구성요소와 관련된 다량의 바탕 형광을 피한다. 바람직한 고체 상태 레이저 공급처는 레이저 맥스, 인코포레이티드(Laser Max, Inc.)(뉴욕주 록케스터에 소재)이며, 그 모델명은 Model LAS-200-635.5이다.

검출 장치로부터의 신호는 전형적으로 조절기(400)로 입력될 것이며, 여기에서 이들은 검정이 계속되어야 하는 지의 여부를 결정하거나 검정 보고서를 작성하는데 사용될 수 있다.

챔버(250)의 온도가 증가되거나 감소되는 속도는 PCR 기재 검정을 포함하여 다양한 효소 기재 검정을 최대한 활용하는데 중요하다. PCR에 중요한 온도 순환동안, 핵산 샘블이 효소학적으로 재생되는 비교적 낮은 온도, 및 핵산 샘플이 용융되어 핵산의 두 가닥을 분리하는 고온에서 조작하는 것은 중요하다. 검정 장치가 제시된 핵산 증폭에 적합하리라 믿어지는 소정의 두 온도 사이에서 순환하는 기간 동안에, 원하지 않은 다양한 화학 반응이 일어날 것으로 기대될 수 있다. 예를 들어, 온도가 저온으로부터 증가함에 따라, 지시된 저온에서 달성된 복제의 적합한 정확성을 반드시 가질 필요는 없지만, 복제 효소는 계속해서 작용하리라 기대될 수 있다. 고온의 세트 포인트에서, 이러한 원하지 않은 효소 활성이 고온에 의해 억제된다. 이와 같이, 두 작동 온도 사이에서 반응 온도를 빠르게 변화시키는 것은 중요하다.

반응 챔버내에서 온도가 빠르게 변화될 수 있는 하나의 메카니즘은 도 6a 및 6b에 도시되어 있다. 이러한 도해가 원 형태의 검정 시스템에 관하여 제공됨에도 불구하고, 동일한 열원 및 냉각 싱크 요소가 당업자라면 이해할 수 있는, 어떠한 적합한 형태의 검정 시스템의 상황에서 사용될 수 있다. 챔버(250)는 저온 "G"에서 작동하고 있다고 가정하면, 이들 조건하에서, 냉각수는 상부 및 하부 도관(330A 또는 330B)을 통해 흐르지 않는다. 온도는 챔버내의 온도가 G 마이너스 X(미분 온도)의 온도 밑으로 저하될 때 상부 및 하부 가열기(340A 및 340B)를 간헐적으로 조작함으로써 유지된다. 사전에 프로그램된 시간에, 상기 온도는 온도 H에서 온도 안정화될 온도가 도달할 때까지 가열기(340A 및 340B)를 작용함으로써 고온 "H"까지 상승된다. 도관(330A 및 330B)를 통한 물 흐름은 필요에 따라 초과 온도를 최소화하기 위해 작용될 수 있으며, 이러한 작용은 제 2 어셈블리의 냉각 침비 효율을 증가시키는 경향이 있다. 온도 H는 챔버(250)의 온도가 H 마이너스 Y(미분 온도) 온도 밑으로 저하될 때 가열기(340A 및 340B)를 간헐적으로 작동시킴으로써 유지된다. 온도 G로 다시 순환시키기 위해, 조절기는 콘솔(350)의 펌프(도시되지 않음)를 가동시켜 냉각수가 제 2 어셈블리의 도관(330A 및 330B)를 통해 흐르게 한다. 또 다른 구체예에서, 냉각 싱크 효과는 냉각될 필요가 있는 반응 챔버와 역으로 접촉되는 적합한 열교환 용량 및 이들의 충분한 질량을 갖는 적합한 물질에 의해 제공된다.

가열기(340A 및 340B)는 일반적으로 얇은 전기 절연층에 의해 블록(300A 및 300B)의 열 전도성 상부 및 하부 단면(302A 및 302B)으로부터 분리되는 전도성 물질의 얇은 층이다. 상기 블록은 본원에서 검정 시스템의 제 2 어셈블리로 언급되며, 상기 어셈블리는 열원 및 냉각 싱크를 포함한다. 또한, 또는 추가하여, 그러한 제 2 어셈블리는 변형 가능한 커버를 유체 또는 반응 챔버상에 밀거나 당기기 위한 메카니즘을 포함할 수 있다. 절연층은 예를 들어 기판상으로의 직접 증착에 의해 형성된다. 예를 들어, 질화규소는 기체상으로부터 증착되거나 산화알루미늄은 액체 운반체를 사용하여 증착될 수 있다. 가열기(340A 및 340B)를 형성하는 전도층은 예를 들어 (예를 들어, 니크롬 전도층에 대해서는) 진공화에 의해, 또는 (예를 들어, 인듐 주석 산화물 전도층에 대해서는) 증기로부터의 증착에 의해 증착된다. 또한, 사전에 형성된 가열기 시이트는 예를 들어 에폭시 접합제 또는 행상인에 의해 추천된 접착제를 사용하여 기판에 접착된다. 적합한 가열기는 엘름우드 센서스 인코포레이티드(Elmwood Sensors Inc.)(알아이 포투켓에 소재) 또는 오메가 엔지니어링 인코포레이티드(Omega Engineering Inc.)(코네티컷주 스탬포드에 소재)로부터 구입할 수 있다.

일부 구체예에서, 가열기 (340A)와 (340B) 사이 및 블록(300A)와 (300B) 사이의 열 접촉은 블록(300A 또는 300B)의 온도가 인접 챔버(250)의 온도에 거의 근사하리라 기대될 수 있을 정도로 충분할 것이다. 따라서, 온도 모니터링 수단이 블록(300A 또는 300B)에 장착될 수 있다. 그 밖의 구체예에서는, 사전에 제작된 가열기가 보조 블록상으로 장착되는 것이 전형적이며, 반응 챔버 온도를 측정하는 다른 방법이 필요로 될 수 있다. 하나의 그러한 방법은 도 6c에 도시되어 있으며, 여기에서는 블록(300A)의 외표면상에 상부 연장부(303A)를 나타낸다. 연장부(303A)는 일반적으로 상부 단면(302A)과 동일한 물질로 제작된다. 상부 제 2 열 센서(306A)는 챔버(250)내의 온도를 보다 직접적으로 증거하며, 상부 제 1 열 센서(304A)는 진단상의 온도 정보를 제공한다.

가열기와 챔버(250) 사이의 열전달을 최대화하기 위해서, 챔버(250)의 커버(251 및 252)는 상기 가요성 커버에 반하여 위치한 가열기(340A 또는 340B)의 표면에 합치시킬 수 있는 가요성 물질로 구성되는 것이 바람직하다.

블록(300A 및 300B)의 비전도성 상부 및 하부(301A 및 301B)는 나일론 또는 폴리카보네이트를 포함하지만 이에 국한되지 않는 비전도성 물질로 제조된다. 블록(300A 및 300B)의 전도성 상부 및 하부 단면(302A 및 302B)은 알루미늄 또는 구리를 포함하지만 이에 국한되지 않는 물질로 제조된다.

도 7a에는 상부 및 하부 보조 블록(500A 및 500B)내에서 교체식의 가열기 및 냉각 장치가 도시되어 있다. 도시된 블록(500A 및 500B)은 도 4a 내지 4c의 블록(300A 및 300B)에서와 같이 챔버(250)를 좁히거나 팽창시키는 작용을 한다. (511A) 및 (512B)와 같은 요소는 이들의 접속부에서 강한 열전기 효과를 제공하는데 적합한 물질로 제조된다. 가열은 적합한 극성의 전압을 제 1 및 제 2 리드(508A 및 509A), 및 하부 리드(508B 및 509B)에 적용함으로써 달성된다. 냉각은 전압의 극성을 바꿈으로써 달성된다. 이들 가열 및 냉각 장치의 조작에 있어서 중요한 변수는 온도 균일성이다. 온도 균일성을 증가시키기 위해, 상부 및 하부 제 1 말단 플레이트(502A 및 502B)는 소결된 산화베릴륨과 같이, 높은 열전도성을 갖는 물질로 구성되는 것이 바람직하다. 그 밖의 적합한 물질은 알루미늄을 함유하는 세라믹을 비제한적으로 포함한다. 바람직하게는, 말단 플레이트(502A 및 502B)의 열전도도는 약 0.2와트/cm^-1/K^-1이상, 보다 바람직하게는 약 2와트/cm^-1/K^-1이상이다. 상부 및 하부 온도 센서(570A 및 570B)는 비제한적으로 써모커플 또는 저항성 센서일 수 있다. 예를 들어, 센서(570A 570B)가 말단 플레이트(502A 및 502B)상에 박막으로서 증착될 수 있거나 말단 플레이트(502A 및 502B)의 구멍으로 삽입된 얇은 선의 형태일 수 있다.

바로 전 단락에 기술된 장치를 포함하여, 이들 가열 및 냉각 장치를 사용하여, 약 -20℃ 내지 약 100℃의 챔버(250) 온도가 유지될 수 있다. 고온은 블록(504A 및 504B)에 일정 온도 바이어스를 제공하기 위해 보조 가열기를 필요로 할 수 있다. 반응 챔버내의 온도는 바람직하게는 약 10초, 보다 바람직하게는 약 5초, 더욱 바람직하게는 약 3초 안에 약 25℃로부터 약 75℃로 도약될 수 있다. 상반되는 냉각 단계는 약 10초, 보다 바람직하게는 약 5초, 더욱 바람직하게는 약 3초 이내에 달성도는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 냉각 또는 가열 단계 이후에, 반응 챔버내의 온도 변화는 약 1℃ 이하, 보다 바람직하게는 약 0.5℃ 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.1℃ 이하이어야 한다.

하나의 바람직한 구체예에서, 디스크(200)가 하나 이상의 반응 챔버(250)를 포함할 때, 각각의 그러한 챔버(250)는 반응 챔버의 측면과 정렬될 수 있는 (바로 전 단락에 기술된 가열 및 냉각 장치와 같이) 열전기 블록(501)으로 제조된 하나 이상의 가열 및 냉각 장치를 가질 것이다. 보다 바람직하게는, 각각의 챔버(250)는 두 반대편의 각각에 가열 및 냉각 장치를 가질 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 말단 플레이트(502A 또는 502B)의 횡단면은 열을 전달하도록 의도되는 챔버(250)의 가장 큰 횡단면과 실질적으로 부합한다.

블록(500A 및 500B)으로 가열되고 냉각되는 챔버(250)의 온도 순환 원리는 도 6a, 6b 및 6c의 블록(300A 및 300B)에 대해 상기에서 개략적으로 언급된 바와 동일하다.

또 다른 구체예에서, 가열되거나 냉각된 유체, 바람직하게는 기체를 하나 이상의 챔버(250) 표면에 직접 또는 반응 챔버의 하나 이상의 표면에 인접하게 위치할 수 있는 열교환 장치를 통해서 통과시킴으로써 반응 챔버가 가열되고 냉각된다. 도 6a 및 6b에 도시된 장치는 (a) 가열기(340A 및 340B)를 제거하고, (b) 유체를 가열시키기 위한 가열기를 부가함으로써 이러한 구체예에 따라 작동하도록 변경될 수 있다. 상기 시스템은, 반응 챔버에서 제시 온도를 유지시키는데 적합한 챔버(250)로 유도하는 배관내로 고온 유체 또는 냉각 유체를 주입시키는데 필요한 가치평가와 함께, 두 개의 유체 제어 시스템(그 중 하나는 고온 유체이고 또 다른 하나는 냉각 유체임)을 갖는다. 특히 가열 또는 냉각 유체가 기체인 경우에, 반응 챔버에 의해 통과된 후 곧바로 기체 온도는 반응 챔버 온도의 유용한 지시를 제공할 것이다.

챔버(250)내에서 수행된 반응의 균일성은 자기장을 회전시킴으로써 교반된 상자성 비즈로 증가될 수 있다. 그러한 상자성 비즈는 컨쥬게이션된 생분자가 결여된 비즈에 대해서는 뱅 래버러토리이즈(Bang Laboratories)(인도 카멜에 소재), 다양한 항체(예를 들어, CD2 세포 표면 수용체에 결합하는 항체)에 컨쥬게이션된 비즈에 대해서는 다이날(Dynal)(뉴욕 레이크 석세스에 소재), 및 유리 매트릭스 및 다양한 표면 결합된 유기체를 갖는 비즈에 대해서는 씨피지(CPG)(뉴저지 릴콜른 파크에 소재)를 포함하여, 수개의 공급처로부터 구입할 수 있다. 비즈가 반응 챔버내외로 세척될 것이라고 기대되는 경우에, 각 비즈의 직경은 바람직하게는 약 25㎛ 미만, 보다 바람직하게는 약 12.5㎛ 미만일 것이며, 이러한 직경은 물질이 챔버(250)내로 삽입되거나 이로부터 배출되는 채널로의 유입 및 배출을 용이하게 한다. 비즈가 챔버(250)내에 잔류할 것이라 기대되는 경우에, 한 구체예에서, 직경은 이들 채널로의 유입을 허용하지 않을 정도로 충분히 큰 것이 바람직하다. 챔버(250)내 상기 채널로의 입구는 채널의 입구 통로에 걸쳐서 고정되는 비즈에 의해 채널이 차단될 기회를 최소화시키도록 위치하거나 설계되는 것이 바람직하다. 또 다른 구체예에서, 비즈는 자기장을 사용하여 감금된다.

비즈 중에서 충분한 이동을 발생시키기 위해, 사용된 자석이 챔버(250)내에서 충분한 자기장 기울기를 발생시켜야 하는지의 여부를 결정하였다. 상기 자석은 네오디늄-철-붕소 부류의 영구 자석과 같이, 희토산화물로 형성된 것과 같은, 자성을 많이 띈 영구 자석에 뾰쪽한 에지를 형성시킴으로써 구성된다. 그러한 영구 자석은 예를 들어 에드문드 사이언티픽(Edmund Scientific)(뉴저지주 바링톤에 소재)에서 구입할 수 있다. 특별한 반응 챔버에 적합한 차수의 뾰쪽한 에지는 예를 들어 자성 물질의 연마 파쇄에 의해 형성된다. 이와 같은 모양의 자석(600)의 예는 도 10에 도시되어 있으며, 여기에서 자석의 N 폴은 지붕 모양을 갖는다. 상자기성 비즈상에서 작용하는 자기장 기울기를 최대로 하기 위해서, 자석(600)의 피크는 비즈가 위치한 반응 챔버 또는 그 밖의 구조체에 인접하여 위치시켜진다. 비즈는 N에서 S 축 주위로 자석을 회전시킴으로써 교반된다. 상자성 비즈는 비즈에 인접한 피크(601)를 이탈시킴으로써 그 자리에 보유된다. 비즈에 인접한 피크(601)로 자석을 슬라이딩시킴으로써, 상기 비즈는 자석과 함께 이동된다.

상기된 뾰쪽한 에지의 자석은 특정 위치의 상자성 비즈를 부착시키는데 효과적이며, 예를 들어, 캐필러리 또는 반응 챔버에 위치한 비즈를 특정 위치로부터 또 다른 위치로 이동시키는데 효과적이다. 이와 같이, 상기 자석은 예를 들어 챔버(250) 또는 챔버(120)내 유체가 상기 챔버로부터 제거되고 있을 때 특정의 장소에 상자성 비즈를 보유하는 것을 돕지만, 챔버내 비즈를 이탈시키는 것이 바람직하다.

다양한 세포 결합 비즈(예를 들어, 특정 서브세트의 세포에 특이적인 결합된 항체를 갖는 비즈)는 다수의 세포로부터 선택된 세포를 부착시키는데 사용될 수 있다. 상기 비즈는 예를 들어 비즈가 상자성인 경우에 자기적으로 감금될 수 있으며, 비부착 세포 및 유체는 세척된다. 이와 같이, 세포 결합 비즈는 작은 부차집단의 세포를 농축시키는데 사용될 수 있다.

PCR 반응에서, 혼합은 증폭 단계 이전의 제조 단계에서 중요할 수 있다. 그러나, 이어서 일어나는 온도 순환중에, 기계적인 혼합은 생략될 수 있다. 이와 같이, 일부 구체예에서, 비즈의 혼합 운전을 야기시키는 회전 가능한 자석은 다양한 시약이 유입된 후 곧바로 챔버(250)에 인접하여 위치할 수 있다. 그런 후, 상기 시약은 혼합되고, 자석은 회수되어 챔버(250)에 인접한 가열 및 냉각 장치와 같은 다른 메카니즘을 위치시키는 것을 용이하게 한다.

조절기(400)는 전형적으로 마이크로프로세서일 것이다. 그러나, 그것은 타이머, 스위치, 솔레노이드 등으로 구성된 보다 단순한 장치일 수 있다. 조절기(400)의 중요한 특징은 카루우젤(100) 또는 디스크(200)의 운전, 유체를 추진시키기 위한 수단, 및 하기에 개략적으로 기술된 프로토콜 중의 하나와 같은 검정 프로토콜의 작동을 유발시키는 프로그램 가능한 일정 또는 예비 세트에 따른 가열 및 냉각 장치의 가동을 유도하는 것이다. 바람직하게는, 조절기는 검정 카셋트의 반응 챔버의 온도를 나타내는 입력을 수용하여, 이러한 입력에 반응하는 조절 신호를 조정할 수 있다.

PCR 반응의 중요한 변수는 종종 검정하려는 샘플에 존재하는, 세포 화합물을 포함하여, 세포 단편을 방해하는 양이다. 이상적으로는, 고도로 정제된 핵산은 PCR 증폭을 하는 샘플로 사용된다. 그러나, 그러한 정제는 진단 검정에 유용한 소량의 조적 또는 유체로는 실시되지 않는다. 더욱이, 핵산의 주위 공급원에 의해 오염에 대한 검정의 민감도가 주어진다면, 핵산 정제 단계는 잘못된 양성 결과를 얻는 가능성을 증가시킬 수 있다. 진단 또는 법정의 PCR의 일부 영역에서, 세포 단편에 의한 간섭에 대한 이러한 관심은 PCR 반응 조건의 특성의 개선에 의해 다소 용이하게 되어 미정제 핵산 샘플은 역효과 없이 사용될 수 있었다. [참고문헌: Rolfs et al.,PCR: Clinical Diagnnostics and Research, Springer Lab, 1992 (특히 Chapter 4 이하 참조)]. (참조예: 또한, 진릴리어서(상품명: GeneReleaser)(테네시주 부어프리스보로에 소재하는 바이오벤쳐스, 인코포레이티드(BioVentures, Inc.)에서 시판), 폴 루코소브(상품명: Pall Leukosorb) 배지(뉴욕 이스트 힐스에 소재하는 폴(Pall)에서 시판) 및 딘비즈(상품명: Dynbeads) 디엔에이 디렉트(상품명: DNA Direct)(뉴욕주 레이크 석세스에 소재하는 다이날(Dynal)에서 시판)와 같은 제품에 유용한 문헌). PCR 과정상에서는, 일반적으로 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York(AUSUBEL I) 및 PCR: A Practical Approach, IRL Press, 1991 (AUSUBEL II)]이 참조가 된다. 그럼에도 불구하고, 샘플에 존재할 수 있는 세포의 세포막과 관련된 세포 단편을 최소한 제거하는 능력을 갖는 것은 바람직하다. 상기 검정 시스템과 함께 사용하기 위한 그러한 기술은 하기에 기술되어 있다. 그러한 세정 단계는 요구량의 민감도 또는 정확도를 달성하는데 필요로 될 때 적용되거나, 필요치 않다면 생략될 수 있다.

PCR을 수행할 때 대조 PCR 반응을 수행하는 것은 또한 중요하다. 한 중요한 형태의 대조군은 반응으로부터 샘플을 제거하거나 음성으로 이전에 특성화된 샘플을 사용한다. 또 다른 중요한 형태의 대조군은 증폭을 목적으로 PCR 반응이 설계되는 서열(들)을 함유하는 것으로 알려진 공지된 양의 정제된 핵산을 유입시키는다. 이들 형태의 대조군은 다중 검정 시스템 유닛 또는 카셋트상에서, 또는, 보다 바람직하게는 디스크(200)와 같은, 동일한 제 1 어셈블리상에서의 별도 반응 챔버에서 완수될 수 있다.

PCR에서 사용된 또 다른 대조 기술은 다중 핵산 세그멘트를 증폭시킬 수 있도록 PCR 반응을 설계하는 것이다. 상이한 세그멘트는 다중 반응 또는 동일한 반응 챔버에서 증폭될 수 있다. 동일한 챔버내에서 증폭되는 경우, 자기장의 경험은 다양한 프라이머 사이의 결합 경쟁이 복제 온도에서 쓰여진, 각 증폭 사이클에서, 시간을 연장시키는 것을 필요로 한다는 것을 나타낸다.

샘플로부터 세포 단편을 제거하기 위한 하나의 도구는 먼저 샘플내 세포를 세포에서 발견된 세포 표면 입자에 특이적인 항체에 결합된 비즈에 결합시키는 것을 포함한다. 백혈구에서 발견된 CD2 분자, 또는 대장균(예, 0157E 가닥)에 결합되는 비즈는 다이날(Dynal)(뉴욕 레이크 석세스)에서 시판된다. 포유류 세포, 박테리아 세포, 바이러스 및 기생충에서 발견된 항상 자라는 족의 세포 표면 분자가 특성화되었으며, 다수의 이들 분자에 반하는 항체가 개발되었다. [참고문헌: Adhesion Molecules, C.D. Wegner, ed., Academic Press, New York, 1994]. 다수의 이들 항체는 다른 형태의 세포 친화성 비즈(예를 들어,미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 컴패니에서 시판)를 제조하는데 사용하는데 유용하다. 상기 세포는 비즈에 부착되어 이들의 핵산 내용물을 방출시키도록 분해될 수 있다. 방출된 핵산과 함께 용해 유체는 추가의 처리를 하기위해 별도의 구획으로 운전되어 비즈 및 이들의 부착 세포 단편을 잔류시킨다.

샘플 세포로부터 핵산을 방출시키는데 사용된 용해 유체는 또한 PCR 반응을 방해할 수 있다. 이와 같이, 일부 프로토콜에서 용해 유체가 세척되도록 기질에 핵산을 결합시키는 것은 중요한다. 하나의 그러한 지지는 이온 및 상호작용력에 의해 DNA에 결합되는 유리 비즈와 같은, DNA에 결합되는 비즈에 의해 제공된다. 상호작용 부위의 수를 최대화하기 위해 화학적으로 처리된 표면을 갖는 적합한 비즈는 바이오라드(BioRad)(캘리포니아 허큘레스에 소재)에서 구입할 수 있다. 니트로셀룰로오스 또는 나일론 피복된 표면과 같은 다수의 DNA 결합 표면을 갖는 상자성 비즈는 본 발명을 실시하는데 유용할 것으로 기대된다. 일부 구체예에서, 자기력을 사용하여 조작될 수 있도록 비즈가 상자성을 띠는 것이 바람직하다. 상자성의 유리 비즈는 다이날(뉴욕 레이크 석세스에 소재) 또는 CPG(뉴저지 린콜른 파크에 소재)에 의해 제조된다. 핵산이 일단 비즈에 결합되면, 용해 유체는 비즈로부터 세척될 수 있다. 핵산은 존재하는 비즈로 증폭될 수 있다.

샘플내 세포로부터 핵산을 방출시키는데 사용된 용해 유체는 세제, 바람직하게는 비이온성, 및 완충액(보통은 PCR 증폭 반응에서 사용된 완충액)을 포함한다. 용해 유체의 pH는 바람직하게는 약 pH 8 내지 약 pH 8.5이다. 적합한 세제는 사코실(Sarkosyl) 및 노니데트 피-40(Nonidet P-40)을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 그 밖의 어셈블리는 MgCl₂를 포함하여 염, 킬레이트화제 및 프로티나아제 K와 같은 프로테아제를 포함할 수 있다. 프로티나아제 K는 예를 들어 약 10분 동안 약 100℃로 가열함으로써 불활성화될 수 있다. 용해 완충액의 조성에 따라, 증폭 검정을 수행하기 전에 핵산으로부터 용해 완충액을 세척하는 것은 다소 중요할 수 있다.

증폭 반응을 지지하는데 사용된 증폭 완충액은 전형적으로 네 개의 데옥시누클레오티드 트리포스페이트(NTPs)(예를 들어, 각각 약 0.2mM의 농도), 완충액(예를 들어, 트리스(Tris)-HCl, 10mM), 염화칼륨(예를 들어, 50mM) 및 염화마그네슘(예를 들어, 1 내지 10mM, 보통은 제시된 PCR 설계에 최적)을 포함할 것이다. pH는 전형적으로 약 pH 8.4일 것이다. 젤라틴(예를 들어, 0.1mg/ml)과 같은 그 밖의 성분이 첨가될 수 있다. 각각의 프라이머는 반응중에 약 0.5μM의 농도로 존재하는 것이 전형적이다. 요구되는 샘플 핵산의양은 핵산 샘플내 표적 핵산 세그멘트의 수 및 핵산의 유형에 따라 변한다. 게놈 DNA에 대해, 샘플내 각 세포가 표적 핵산당 약 2개의 복사를 갖는 경우, 약 10㎍/ml의 농도가 바람직하다.

단순하게는, 과정에서 사용된 폴리머라아제는 태크 폴리머라아제, 재조합 태크 폴리머라아제, Tfl DNA 폴리머라아제 및 Tli DNA 폴리머라아제(이들 모두 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)에서 시판)와 같은 내열성 DNA 폴리머라아제이다. 열 안정성은 반응 용기가 DNA 가닥 분리 온도가 될 때 역으로 변성되는 폴리머라아제를 대체시키도록 반응 공정 도중에 PCR 반응이 추가의 폴리머라아제 첨가에 대한 요건 없이 사이클로부터 사이클로 진행되게 한다. 바람직하게는, 사용된 DNA 폴리머라아제는 Tli DNA 폴리머라아제의 교정 활성과 같은, 3'에서 5' 엑소누클레아제 활성의 존재와 관련하여 증가된 정확도를 갖는다.

혈액은 진단 또는 유전 PCR 시험용으로 보다 편리한 샘플중의 하나를 제공한다. 최대한도의 유전 시험을 하기 위해서는, 약 10 내지 약 50㎕의 혈액이라면 특정 표적 세그멘트의 PCR 증폭을 고려할 수 있을 정도로 충분한 샘플 DNA를 제공하는데 충분하다. 그러나, 태아 세포 분석용으로, 약 400 태아 세포를 함유할 수 있는 약 20ml의 양이 필요로 될 수 있다. 이와 같이 큰 샘플 용적은 예를 들어 상기된 방법을 사용하여 농축될 필요가 있다. 미생물 질환에 대해 시험을 수행함에 있어, 샘플내 표적 핵산의 농도는 매우 낮을 수(예를 들어, 세균 게놈 당 약 2fg 내지 약 5fg 이하) 있다. 이와 같이, 상기 미생물에 대해 시험하는 검정 시스템을 사용할 때, 농축 방법이 재차 필요로 될 수 있다.

RNA를 특이적으로 증폭시키기 위해, 역전사 효소(예, 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션에서 시판하는 AMV 역전사 효소)를 사용하여 샘플내 RNA로부터 cDNA 가닥을 먼저 합성하는 것이 요구되어 진다. RNA 샘플로부터 PCR 반응을 수행하기 위한 방법은 예를 들어 AUSUBEL I 및 AUSUBEL II에 기술되어 있다. 이러한 목적으로 RNA를 제조하기 위해서, 용이한 과정은 사용하기 바로 전에 에탄올중의 1:10 디에틸피로카보네이트 용액과 혼합된, 세제(0.5% 노니데트 P-40), 완충액(예, pH 8.3) 및 적합한 염을 함유하는 용해 완충액을 사용한다. 샘플 세포가 이 용액으로 용해된 후, RNA를 함유하는 상청액이 원심분리에 의해 핵의 펠릿과 멀리 떨어져 분리된다. 후속적인 PCR 순환에서 사용된 프라이머중 하나와 일반적으로 동일한 프라이머는 예를 들어 65℃까지 가열한 후 온도를 일반적으로 약 37℃까지 감소시킴으로써 RNA로 아닐링된다. 그런 후, 역전사 효소, 누클레오티드 트리포스페이트 및 적합한 완충액(이미 존재하지 않는 경우)이 첨가되어 cDNA 합성을 개시한다. 일반적으로, 용적이 작은 cDNA 합성 용액이 PCR 증폭에 필요한 완충액, DNA 폴리머라아제, 누클레오티드 트리포스페이트 및 프라이머를 함유하는 용액에 첨가된다. 그런 후, 온도 순환 프로그램이 개시된다.

이들 장점은 또한 하이브리다이제이션 과정을 수행하는데 실질적으로 적용된다. 승온을 수용하는 검정 시스템의 밸브 능력에 의해 시스템이 하이브리다이제이션 프로토콜에 사용된다. 하이브리다이제이션 반응은 PCR 반응과 같이 오염에 민감하지 않지만, 그럼에도 불구하고, 이들 반응은 오염에 매우 민감한데, 그 위험은 1회용 시스템을 사용하게 되면 실질적으로 감소된다.

하이브리다이제이션을 수행하기 위한 과정은 당해기술분야에 잘 공지되어 있다. [참고문헌: 예를 들어, AUSUBEL I 및 Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989]. 이들 과정에서, (a) 표적 서열을 함유하는 핵산의 샘플 공급원 또는 (b) 고형 지지체에 결합되는 프로브 핵산, 및 이러한 결합후에, 지지체상에 잔류하는 결합 부위가 비활성화된다. 그런 후, 검출 가능한 리포터 분자가 결합된 다른 종의 핵산이 적합한 하이브리다이제이션 조건하에 첨가된다. 세척 후에, 고체 지지체상의 핵산에 결합된(하이브리다이징된) 리포터 분자의 양이 측정된다.

예를 들어, 하이브리다이제이션은 검정 시스템에서 반응 챔버에서 수행될 수 있으며, 여기에서 반응 챔버는 RNA가 (예를 들어, 분리겔로부터 전기영동 또는 캐필러리 블로팅, 이어서 배킹에 의해) 결합된 일편의 니트로셀룰로오스 막(또는 핵산을 결합시키는 또 다른 막)을 함유한다. 그런 후, 노던 프리하이브리다이제이션 용액이 유체 챔버 중의 하나의 챔버로부터 반응 챔버로 유입될 수 있다. (AUSUBEL I의 노던 프리하이브리다이제이션 용액(p. A1-40), 노던 하이브리다이제이션(p. A1-39), SSC (p. A1-53, 20X 방법) 및 덴하트(Denhart) 용액 (p. A1-14, 100X 방법)에 대한 방법이 검정 시스템에서 수행될 수 있는 하이브리다이제이션 방법을 보다 충분하게 예시하도록 참조로 본원에 인용되어 있으며; DNA가 비특이적 하이브리다이제이션을 감소시키기 위한 경쟁물로서 사용되는, 이들 방법중 두가지 방법이 열거된 연어 정액 DNA가 사용전에 전단되는 것이 전형적이라는 것을 주의해야 한다.) 막 및 프리하이브리다이제이션 용액은 표적 서열 및 프로브 서열 사이의 상호작용을 위한 용융 온도에 따라서, 약 37℃ 내지 약 42℃의 온도에서 밤새 인큐베이션된다. 이들 인큐베이션 온도는 프리하이브리다이제이션 및 하이브리다이제이션 용액중에 50% 포름아미드의 존재로 제시되는 범위이며; 포름아미드 없이 수행도는 하이브리다이제이션에 대해서는, 인큐베이션 온도는 약 55℃ 또는 약 70℃와 같이 높은 것이 전형적이다. 그런 후, 막은 용융된 프로브를 함유하는 노던 하이브리다이제이션 용액에 노출되고 프리하이브리다이제이션에서 사용된 동일한 온도에서 밤새 인큐베이션된다. 하이브리다이징 후에, 하이브리다이제이션 용액은 반응 챔버로부터 유출되고, 반응 챔버는 약 25℃가 되고, 제 1 세척 용액(1X SSC, 0.1% w/v 소듐 도데실 술페이트)가 유입된다. 15분 후에, 세척을 반복한다. 추가의 15분 세척 후에, 0.25X SSC, 0.1% w/v 소듐 도데실 술페이트를 사용하여 세 번째 및 최종적으로 세척하였다.

이러한 하이브리다이제이션 방법은 단지 예시적일 뿐이다. 본원에 참조로 인용된 하기 절의 AUSUBEL I에 기술된 방법을 포함하여, 그 밖의 다수 하이브리다이제이션 방법이 검정 시스템에서 수행될 수 있다: 본원에 언급된 유닛 2.9, pp. 2-24 내지 2-30 및 부록 1의 방법; 본원에 언급된 유닛 6.3, pp. 6-6 내지 6-7 및 부록 1의 방법; 및 본원에 언급된 유닛 13.12, p. 13-44 및 부록 1의 방법.

하이브리다이제이션 반응에 필요한 승온은 자동화된 장치에서 취급될 수 있다. 예를 들어, 하이브리다이제이션은 용융 온도(T_m)에 의해 정의된 온도에서 수행될 수 있다, 어떠한 하이브리다이제이션 프로브에 대해서도 T_m값은 미네소타주 플리마우스에 소재하는 네셔날 바이오사이언스, 인코포레이티드(National Biosciences, Inc.)에서 시판하는 올리고 버전 4.0(상품명: Oligo v4.0)과 같은 구입 가능한 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다.

통상적으로 당해기술분야에 공지된 면역 검정 시스템에서, 항체-항원 결합 반응은 일반적으로 실온 또는 감소된 온도(예, 약 4℃)에서 수행된다. 결합 반응 후에, 양성적 결과는 효소 알칼리성 포스파타아제에 의해 중재된 반응과 같이, 효소 반응에 의해 나타내어지는 것이 일반적인데, 상기 효소 반응은 일반적으로 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 상기 검정은 이들 검정이 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도 범위에서 빠르고 신뢰할 수 있는 온도 조절을 허용하는 시스템에서 자동 조작되어지게 한다.

전형적으로, 현재 항체 기본된 스크리닝 방법은 "항원"(적합한 형태로 적합한 동물내로 주입되는 경우에 동물이 그 항원에 특이적인 항체를 생성하는 물질임) 또는 항체가 결합되는 고형 지지체를 사용하고 있다. 또한, 항원은 박테리아 또는 진핵세포와 같은 세포의 표면에서 발견되며, 이러한 세포를 고형 지지체로 대체한다.

한가지 검정법(간접 ELISA)에서, 항원은 지지체에 결합되며, 항원에 특이적이며 제 1 동물종에 의해 생성되는 제 1 항체를 함유하는 샘플은 결합된 항원과 함께 인큐베이팅된다. 적절한 세척단계 후에, 제 2 동물종으로부터 유도되고 제 1 종의 항체에 특이적이며 검출 가능한 부분(예, 알칼리성 포스파타제)에 결합되는 제 2 항체는 지지체와 함께 인큐베이팅된다. 샘플이 제 1 항체를 함유하였다면, 제 2 항체가 결합할 수 있으며 검출 가능한 부분을 이용하여 검출될 수 있을 것이다. 예를 들어, 검출 가능한 부분이 알칼리성 포스파타제인 경우, 포스파타제 효소의 작용에 의해 푸른 물질로 전환될 수 있는 화학적인 p-니트로페닐 포스페이트를 가하여 검출을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어, 혈액을 AIDS 바이러스에 대한 항체의 존재에 대하여 실험하는 데 이용될 수 있다.

지지체와 결합된 항원을 사용하는 또 다른 검정에서, 항원을 함유하는 샘플은 지지체 및 항원에 특이적인 제한된 양의 항체와 함께 인큐베이팅되며, 상기 항체는 결합된 검출 가능한 부분을 함유한다. 용액상 항원과 지지체 결합된 항원 사이의 경쟁으로 인해서, 샘플내에 항원이 많으면 많을수록, 지지체 결합된 항원에 결합되는 항체는 더 적을 것이며, 검출가능한 부분에 의해 발생되는 신호를 더 약할 것이다.

또 다른 검정(항체 샌드위치 ELISA)는 항원에 특이적인 제 1 항체를 이용하며, 여기서, 상기 항체는 지지체에 결합된다. 항원을 함유하는 샘플은, 이어서, 지지체와 함께 인큐베이팅된다. 그 후에, 항원의 제 1 부분에 결합되며 결합된 검출 가능한 부분을 지니고 있는 제 2 항체가 지지체와 함께 인큐베이팅된다. 샘플이 항원을 함유하는 경우, 항원을 지지체에 결합될 것이며, 이어서, 검출 가능한 제 2 항체에 결합될 것이다. 이러한 과정은 항원이 임신 관련된 호르몬 융모막 성선자극 호르몬인 가정 임신 테스트에 기본이 된다.

결합된 항체와 함께 지지체를 사용하는 또 다른 검정(이중 항체 샌드위치 ELISA)에서, 제 1 종으로부터의 제 1 항체를 함유하는 샘플은 제 1 종의 항체에 특이적인 제 2 종으로부터의 제 2 항체에 결합되는 지지체와 함께 인큐베이팅된다. 제 1 항체에 대한 항원은, 이어서, 지지체와 함께 인큐베이팅된다. 최종적으로, 제 1 항체에 의해 결합되지 않은 일부의 항원에 특이적인 제 3 항체가 지지체와 함께 인큐베이팅된다. 제 3 항체는 검출 가능한 부분을 지닌다. 샘플이 제 1 항체를 함유하는 경우, 검출 가능한 제 3 항체가 지지체에 결합될 것이다.

상기 및 또 다른 면역검정법이 문헌[Units 11.1 and 11.2 of AUSUBEL I pp. 11-1 to 11-17]에 기재되어 있으며, 본원에서는 상기 문헌을 참조로 인용한다.

하기 실시예는 본 발명을 단지 예시하고자 하는 것이며, 이로써 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니라는 것을 인지할 수 있을 것이다.

실시예 1 - 열원/냉각 싱크 작동

예시된 검정 시스템의 순환형태에 관련되어 사용되고, 도 6a에 도시된 히터 장치 및 냉각장치의 작동은 열 흐름 방정식에 대한 유한 원소 근사치를 이용하는 열전달 시뮬레이션 컴퓨터 프로그램으로 시뮬레이션되었다. 이러한 시뮬레이션은 하기와 같은 가정하에 수행된다:챔버(250)의 두께는 0.5mm이고, 상하 커버의 두께는 0.1mm이며, 가열기와 보조 블럭 사이의 두께는 0.025mm이다. 시뮬레이션은 적절한 시판용 물질로 25℃에서 75℃로의 상승은 3.2초 이내에 달성될 수 있고, 3.2초 후에, 반응 챔버에서의 온도는 실질적으로 일정하게 유지된다. 상호냉각 단계는 약 3초 이내에 달성되어, 반응 챔버에서의 온도를 실질적으로 일정하게 유지시킨다.

실시예 2-PCR 반응

PCR 검정을 도 8A 및 8B에 도시된 반응 카셋트를 사용하여 수행하였으며, 여기에서 반응 챔버 디스크는 동일한 부피의 제 1 내지 제 3 반응 챔버(250A-250C) 및 제 1 반응 챔버와 제 3 반응 챔버(250A 및 250C)의 합쳐진 부피보다 8% 더 큰 부피의 제 4 반응 챔버(250D)를 갖는다. 카루우젤(carousel)은 17개의 유체 챔버(120A2 내지 120R2)를 갖는다. 반응 카셋트는 챔버(250D) 내로 샘플을 도입시키기 위해 사용되는 모세관 구조(150)를 갖는다. 모세관 구조는 샘플을 모세관 시스템에 도입시키는 유입구(151)를 갖는다. 검정 시스템은 상부 및 하부 보조 블록을 가지며, 이것의 하부는 반응 챔버로부터 충분히 멀리 유인되어 회전 자석을 반응 챔버 디스크 아래에 위치시킨다. 검정 시스템은 유체를 추진시켜서 유체 챔버(120A2 내지 120R2)로부터 반응 챔버(250A 내지 250D)로 이동시키기 위한 제 1 유체 임펠러 및 반응 챔버(250A 내지 250D)를 비우기 위한 제 2 유체 임펠러를 가지면, 이러한 임펠러는 둘 모두 상부 보조 블록에서 발견된다. 하기에 기재되는 단계 1 내지 12는 반응 챔버 디스크로부터 멀리 유인된 하부 보조 블록 및 디스크 아래에 위치한 회전성 자석을 사용하여 수행된다. 반응 프로토콜은 다음과 같다 :

1. 모세관 구조(150)를 검정 카셋트의 챔버(250D)와 정렬시키고, 모세관(150) 중의 혈액 샘플을 공기압을 사용하여 챔버(250D) 내로 유인시킨다 (모세관은 모세관 구조의 유출구를 반응 챔버 디스크 상의 유체 교환 채널(231D)에 인접하여 위치한 배기구(도시되지 않음)와 정렬시키고, 모세관 구조를 유입구(151)를 통해 모세관 작용에 의해 충전시킴으로써 충전된다.). 챔버(250D)를 직경이 50 내지 100㎛인 강자성 백혈구 결합 비즈의 공급원[뉴욕, 레이크 석세스(Lake Success)의 다이날(Dynal)]으로 사전에 로딩시킨다. 자석을 회전시켜서 비즈를 휘져어서 교반을 제공한다.

2. 45분의 비즈와 혈액의 동시 배양 후에, 카셋트의 카루우젤을 제 1 유체 챔버(120A2)가 유체 교환 채널(231D)와 정렬될 때까지 회전시킨다. 샘플로부터의 과량의 유체를 비결합 세포와 함께, 챔버(120A) 내로 밀어넣는다. 비즈가 챔버(250D)로부터 배출되는 것을 자기적으로 제한한다.

3. 이 시점에서, 카루우젤을 회전시켜서, 챔버(25D)를 증폭 완충제(40 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 5 mM MgSO₄)를 포함하는 세척 용액을 함유하는 제 2 유체 챔버(120B2)와 정렬시킨다. 세척 용액을 챔버(250D) 내로 유인시킨다.

4. 카루우젤을 회전시켜서, 챔버(250D)를 챔버(250A2)와 정렬시키고, 여기에 세척 용액을 밀어넣어서, 챔버(250D) 중에 자기적으로 제한된 비즈를 다시 배출시킨다.

5. 카루우젤을 회전시켜서, 챔버(250D)를 제 3 유체 챔버(120C2)와 정렬시키고, 이로부터 용해 용액(0.5% w/v Tween 20(미주리주, 세이트 루이스의 시그마 케미컬 컴패니)이 보충된 증폭 완충제)을 유인시킨다. 용해 용액을 그대로 고정시키기 위해, 카루우젤을 회전시켜서 유체 교환 채널(231D)를 폐쇄시킨다. 제 4 챔버(250D)의 온도를 56℃로 유지시킨다. 인접 자석을 회전시켜서 세포 결합 비즈를 휘저음으로써 교반을 달성시킨다.

6. 45분 후에, 카루우젤을 회전시켜서 챔버(250D)를 제 4 유체 챔버(120D2)와 정렬시키고, 그 안에 샘플의 세포로부터 추출한 핵산을 함유하는 용해 용액을 밀어넣는다. 다시, 세포 결합 비즈를 챔버(250D) 중에 잔류시킨다. 용해 용액의 부피는 제 1 및 제 3 반응 챔버(250A 및 250C)의 합져진 부피보다 8% 더 크다 (핵산 결합 비즈에 의해 점유된 부피는 제외함).

7. 챔버(250A 및 250D)를 강자성 핵산 결합 비즈로 사전 로딩시키고, 유체를 비운다. 카루우젤을 계속 회전시켜서 제 4 유체 챔버(120D2)를 제 3 유체 교환 채널(231A)와 정렬시킨 후, 유체 교환 채널(232C)와 정렬시키고, 챔버(250A 및 250C)를 제 4 유체 챔버(120D2)로부터의 핵산 함유 용해 용액으로 충전시킨다. 챔버(250C) 중의 비즈를 포지티브 결과를 발생시키기에 충분한 양으로 증폭 서열을 포함하는 정제된 DNA로 사전 로딩시킨다. 챔버(250A)는 실험적 증폭을 위한 것이다. 챔버(250C)는 포지티브 콘트롤을 제공한다. 챔버(250B)는 단지 핵산 결합 비즈 및 사전 로딩 부피의 용해 용액을 함유하며; 이것은 네가티브 콘트롤로서 역할을 한다.

8. 카루우젤을 회전시켜서, 챔버(250A 내지 250C)를 폐쇄시킨다. 챔버(250A 내지 250C)를 비즈 상의 결합 물질과 일치되는 온도러 유지시킨다. 예를 들어, 다이날 다이나비이즈(Dynal Dynabeads) M-450 Pan T(CDL) 결합 비즈에 대해, 최적 온도는 2 내지 4^oK이다.

9. 용해 용액 중에서 DNA를 DNA 결합 비즈에 결합시키기 위한 충분한 시간인 15분 후에, 카루우젤을 회전시켜서, 챔버(250A 내지 250C)를 제 5(120E2), 제 10(120J2) 및 제 15(120P2) 유체 채널과 각각 정렬시키고, 용해 완충제를 챔버(250A 내지 250C) 밖으로 밀어낸다. DNA 결합 비즈가 배출되는 것을 자기적으로 제한시킨다.

10. 카루우젤은 회전하여 각각 6번째(120F2), 11번째(120K2) 및 16번째(120Q2) 유체 챔버를 갖는 챔버(250A-250C)를 정렬시키고, 세척 용액(상기에 설명되어 있음)은 챔버(250A-250C)로 도입시킨다. DNA 결합 비즈를 자기적으로 교반시킨다.

11. 10분 후에, 카루우젤은 회전하여 각각 5번째(120E2), 10번째(120J2) 및 15번째(120P2) 유체 챔버를 갖는 챔버 250A-250C를 정렬시키고, 세척 용액은 반응실로부터 밀어 보낸다.

12. 카루우젤은 회전하여 각각 7번째(120G2), 12번째(120L2) 및 17번째(120R2) 유체 챔버를 갖는 챔버 250A-250C를 정렬시키고, 여기에서 증폭 완충액(0.01% w/v 겔라틴, 0.1% v/v 트리톤 X-100(미주리 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미컬 코포레이션)으로 보충됨)을 함유하는 증폭 용액, 필요한 누클레오티드 트리포스페이트, 표적 서열(0.5μM)을 증폭시키기 위한 적당한 프라이머 및 Taq 폴리머라아제(위스콘신 메디슨 프로메가 코포레이션으로부터 시판됨)를 유도한다.

13. 카루우젤은 회전하여 챔버 250A-250C를 폐쇄시키고 낮은 보조 블락은 반응실 디스크하에서 위치하여 더욱 정확한 온도 조절을 제공한다. 그 후 조절기는 하기 문헌에 의해 설명된 프로토콜에 따라 모델링된 온도 프로그램을 초기화시킨다 [참고 문헌: Wu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 2752-2760 (1989)]. 프로그램은 먼저 챔버 250A-250C를 55℃까지 가열시키고 2분 동안 이 온도에서 유지시킨다. 다음 조절기는 72℃의 복제 온도(3분 동안 유지됨)와 94℃의 DNA 용융 온도(1분 동안 유지됨) 사이의 온도에서 순환시킨다. 복제 온도 배양이 25배로 수행된 후에, 챔버(250A-250C) 중의 물질은 적당한 증폭된 서열의 존재에 대해 분석된다.

8번째(120H2), 9번째(120I2), 13번째(120M2) 및 14번째(120N2) 유체 챔버는 상기 프로토콜에서 사용되지 않으며 후반응 처리에 이용될 수 있다. 카루우젤이 회전되는 서열은 핵산 함유 물질과 접촉하는 내부 고리 표면에서 네거티브 조절 반응이 수행되는 반응실용 유체 교환 채널에 의해 회전되는 부분이 전혀 없도록 디자인된다. 이러한 예방은 오염에 대한 PCR 반응의 감도면에서 바람직하다. 유체 교환 채널 231D는 어떠한 유체 교환 포트(121-A2 내지 121-R2)와 함께 정렬되는 경우, 유체 교환 채널 231A-231C 및 232C 중 어느 것도 전혀 정렬되지 않도록 놓인다. 반응실의 이러한 2 그룹 사이의 동시 정렬의 결여는 유체의 의도하지 않은 혼합을 방지한다.

실시예 3 - PCR 증폭

최근에 상자성 DNA 결합 비즈가 세포 용리 단계에서 직접 사용되어 용리된 세포(예를 들어, 뉴욕에 소재한 다이날, 레이크 석세스로부터 시판되는 디나비즈(Dynabeads, 등록상표명) DNA 디렉트^TM)로부터 방출되는 DNA를 결합시키는 것이 제시되어 왔다. 이 실시예에서, 반응실 디스크상의 각각의 반응실은 유체 챔버 분리되고 독립적인 세트를 갖고, 적당한 경우, 분리된 모세관 튜빙 구조를 갖는다. 단순하게 하기 위해, 하기에 약술된 프로토콜은 하나의 반응실 및 이것의 관련 유체 챔버와 모세관 관 구조에 초점을 두고 있다. 프로토콜은 하기와 같다:

1. 모세관 구조체(160)는 검정 카셋트의 챔버(250)와 함께 정렬되고 모세관 튜빙 150 중의 혈액 샘플은 공기압을 사용하여 4번재 챔버(250)내로 유도된다. (모세관은 반응실 디스크상에서 유체 교환 채널(231)에 인접하여 위치된 통구(도시되지 않음)를 갖는 모세관 튜빙 구조의 배출구를 정렬시키고, 유입구 151을 통해 모세관 구조를 채움으로써 혈액으로 충전된다.) 혈액 샘플은 단지 4번째 반응실의 부피의 반을 채운다. 챔버 250은 직경이 50-100㎛인 상자성, DNA 결합 비즈(뉴욕에 소재한 다이날, 레이크 석세스)의 공급으로 사전 적하되고 샘플의 부피와 동등한 용리 용액의 부피가 유도된다. 용리 용액은 1.0% v/w 트윈 20(미주리 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미컬 코포레이션)으로 보충된 증폭 완충액의 2X 용액이다. 용리 용액을 적절하게 고정시키기 위해, 카루우젤은 회전하여 채널 231을 폐쇄시킨다. 챔버 250의 온도는 56℃에서 유지시킨다.

2. 45분 후, 카루우젤은 회전하여 샘플의 세포 잔여물을 함유하는 용리 용액이 밀어 보내지는 1번째 유체 챔버(120A)를 갖는 챔버(250)를 정렬시킨다. 세포형 DNA가 결합되는 DNA 결합 비즈는 챔버(250)에 유지시킨다.

3. 카루우젤은 회전하여 제 2 유체 챔버(120B)를 갖는 챔버(250)을 정렬시키고, 증폭 완충액(40mM NaCl, 20mM 트리스-HCl, pH 8.3, 5mM MgSO₄)으로 이루어진 세척 용액을 챔버(250)내로 도입시킨다. 그 후 카루우젤은 회전하여 챔버(250)를 폐쇄시킨다. DNA 결합 비즈를 자기적으로 교반시킨다.

4. 10 분 후, 카루우젤을 챔버(120B)를 갖는 챔버(250)에 일직선으로 회전시키고, 세척 용액을 반응 챔버에서 밀어냈다.

5. 제 3 유체 챔버(120C)를 이용하여, 단계 4 및 5를 반복하였다.

6. 그 후, 제 4 유체 챔버(120D)를 갖는 챔버(250)에 일직선으로 카루우젤을 회전시키고, 상기 제 4 유체 챔버에 증폭 완충제(1.01% w/v 겔라틴, 0.1% v/v 트리톤 X-100(미저리주, 성 루이스에 소재한 시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co), 표적 서열(0.5 μM)을 증폭하는 데 필요한 누클레오티드 트리포스페이트, 적합한 프라이머 및 Taq 중합효소(위스콘주의 매디슨에 소재한 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)으로부터 구입 가능)가 추가된)를 함유하는 증폭 용액을 따른다.

7. 카루우젤을 챔버(250)에 급접하게 횐전시키고, 더 낮은 보조 블록을 반응 챔버 디스크 아래에 위치시켜, 더 정확한 온도 조정을 제공한다. 그 후, 제어 장치는 우(Wu) 등에 의한 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2752-2760(1989)]에 기재된 프로토폴에 따른 온도 프로그램을 개시하였다. 프로그램은 첫 번째 챔버(250)를 55℃의 온도로 가열시키고, 2분 동안 그 온도에서 유지시키는 것이다. 그 후, 제어 장치는 72℃의 복제 온도(3분간 유지)와 94℃의 DNA 가닥 분리 온도(1분간 유지)를 순환한다. 복제 온도 인큐베이팅을 25시간 처리한 후에, 챔버(250)중의 물질을 적합한 증폭된 서열의 존재하에 분석하였다.

본 발명은 바람직한 구체예에 중점을 두어 설명되었지만, 다양한 바람직한 조성물 및 방법이 이용될 수 있으며, 본 발명은 본원에 특정하게 설명된 것과 다른 방식으로 수행될 수 있음을 보통의 당업자는 명백히 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구 범위에 의해 정의된 본 발명의 사상과 범위내에서 포함된 모든 변형을 포함한다.

본 발명은 PCR 분석(여기에 제한된 것은 아님)과 같은 다양한 법의학 및 진단상의 생물학적 분석 수행에 이용되기에 적합한 효과적인 밸브를 갖는 경제적이고 증가된 온도 미세반응기를 제공한다. 또한, 미세반응기는 높은 증기 압력이 특정하게 관계되지 않을 경우에도, 자동 분석 유도에 적응시키에 적합하다.

또한 본 발명은 하기 어셈블리를 포함하는 반응 챔버내에 유체 밀폐 방식으로 증가된 온도 반응을 유도하기 위한 시스템이다: (a) 반응 챔버를 포함하는 제 1 어셈블리, 및 (b) 온도 조정을 위한 제 2 어셈블리, 여기서 제 2 어셈블리는 반응챔버에 근접하게 위치시킨다. 제 1 어셈블리는 유체 교환 채널을 각각 갖는 다수의 반응 챔버를 포함하며, 바람직하게는 3개 이상의 이러한 반응 챔버를 포함한다. 제 2 어셈블리는 열 공급원, 냉각 싱크, 또는 이들 둘 모두 및 바람직하게는 유체 임펠러를 포함한다.

상기 시스템은 또한 제 1 어셈블리와 미끄러지게 위치하여 접촉될 수 있는 제 3 어셈블리를 함유하며, 유체 교환구를 각각 갖는 다수의 유체 챔버 및 유체를 제 1 유체 교환기 채널과 일직선에 맞출 수 있는 유체 교환구를 갖는 유체 챔버로부터 제 1 유체 교환 채널에 일직선인 반응 챔버로 흐르게하기 위한 유체 임펠링용 제 1 유체 임펠러; 및 일부 구체예어서는, 반응 챔버를 빠져나오기 위한 유체 임펠링용 제 2 일펠러를 가지며, 상기 유체 교환구는 제 1 어셈블리와 상대적으로 제 3 어셈블리를 미끄러지게 위치시킴으로써 제 1 유체 교환 채널에 일직선으로 맞추어진다.

제 1 어셈블리는 유체 밀폐기와 결합된 제 3 어셈블리내에 맞추어지며, 제 1 유체 교환 채널이 제 3 어셈블리중의 유체 교환 채널에 일직선이 되지 않을 경우, 유체가 제 1 유체 교환 채널을 통하여 흐르지 않을 정도로, 제 1 및 제 3 어셈블리는 서로에 대해 미끄러질 수 있다. 또한, 제 1 어셈블리와 제 3 어셈블리 사이의 유체 밀폐는 유체의 온도가 약 90℃ 내지 100℃일 경우 반응 챔버중에 유체를 존속시키는 데 효과적이다.

또 다른 구체예는 외부 투명 벽을 갖는 하나 이상의 반응기 또는 유체 챔버를 포함한다. 또한, 본 발명은 빛을 반응 또는 유체 챔버의 외부 투명 벽으로 이동시킬 수 있는 광원을 포함한다. 이러한 구체예는 (a) 외부 투명 벽을 갖는 비추어진 반응기 또는 유체 챔버로부터 반사된 빛, (b) 외부 투명 벽을 갖는 비추어진 반응기 또는 유체 챔버를 통해 투과된 빛, (c) 외부 투명 벽을 갖는 반응기 또는 유체 챔버중의 여기 분자로부터 발산된 빛 방사를 탐지할 수 있는 빛 탐지 장치를 포함한다.

또 다른 구체예에는 제 3 어셈블리 또는 제 1 어셈블리를 슬라이딩하기 위한 슬라이더 및 (a) 제 3 어셈블리 또는 제 1 어셈블리의 슬라이딩 및 (b) 유체를 유체 챔버에서 반응 챔버에 흐르도록 추진하는 제 1 유체 임펠러를 조절하는 프로세서를 포함한다. 슬라이더는 제 1 어셈블리와 제 3 어셈블리 사이의 직선 또는 환상 이동에 영향을 미친다.

본 발명은 또한 반응 챔버의 온도를 측정하는 온도 측정 장치를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서는 온도 측정 장치로부터 신호를 수용하고 열원을 조절하는 프로세서를 포함한다. 본 발명의 내용에서 사용되는 냉각 홈은 또한 프로세서의 제어하에 존재할 수 있다. 냉각 홈은 순환 유체를 포함하는 도관을 포함한다.

또 다른 구체예에는 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있는 영구 자석, 영구 자석을 회전시키는 로테이터(rotator), 제 1 또는 제 3 어셈블리를 슬라이딩시키는 슬라이더, 및 (a) 제 3 어셈블리 또는 제 1 어셈블리의 슬라이딩, (b) 유체를 유체 챔버에서 반응 챔버에 흐르도록 추진하는 제 1 유체 임펠러, (c) 열원 및 (d) 자석의 회전을 조절하는 프로세서를 포함한다.

또 다른 구체예는 샘플을 본원에서 기재된 검정 시스템의 제 1 반응 챔버로 도입시키는 단계 및 하나 이상의 유체 챔버로부터 PCR 반응을 유도하는 데 요구되는 시제를 포함하는 제 1 반응 챔버 용액에 전사시키는 단계를 포함하여 PCR 반응을 유도하는 방법에 관련된다. 바람직하게는 검정 시스템의 제 2 어셈블리는 약 5초내에 약 25℃에서 약 75℃로 온도를 상승시키고, 제 2 어셈블리는 또한 바람직하게는 약 5초내에 약 75℃에서 약 50℃로 온도를 낮춘다.

본 발명은 반응 챔버의 온도를 빠르게 조절하는 메카니즘을 포함하며, 검정 시스템은 (i) 제 1 및 제 2 커버와 제 1 및 제 2 커버 사이의 거리에 의해 한정되는 두께를 가지는 반응 챔버 및 포함하는 제 1 어셈블리, (ii) 열원, 냉각 홈 및 제 2 어셈블리의 표면상에서 개방되는 다수의 가압된 유체 채널을 포함하는 제 2 어셈블리, 및 (iii) 가압된 유체 채널내에서 유체 압력을 조절하는 압력 조절기를 포함하며, 여기서 제 2 어셈블리는 가압된 유체 채널이 반응 챔버의 커버와 접촉하도록 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있다. 제 2 어셈블리에 포함되는 열원은 바람직하게는 제 2 어셈블리에 부착되는 하나 이상의 전기 가열기를 포함한다. 제 2 어셈블리에 포함된 냉각 홈은 바람직하게는 제 2 어셈블리에 일체화된 물 또는 기타 유체에 대한 도관 및 유체가 도관을 통해 흐르도록 하는 유체 임펠러를 포함한다.

바람직하게는 제 1 및 제 3 어셈블리는 제 2 어셈블리와 결합하여 사용되며, (i) 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있는 제 1 말단 플레이트 및 제 2 말단 플레이트 및 (ii) 제 1 및 제 2 말단 플레이트 사이에 위치하고, 전기적으로 연속적으로 접속되어 열전기 가열 펌프를 형성하는 다수개의 쌍을 이룬 p-형 및 n-형 반도체 블록을 포함한다. 가열 펌프는 제 1 극성을 갖는 전압이 연속적으로 접속된 반도체 블록에 가해지는 경우에 제 1 말단 플레이트에서 제 2 말단 플레이트로, 그리고 제 1 극성의 반대 극성의 전압이 연속적으로 접속된 반도체 블록에 가해지는 경우 제 2 말단 플레이트에서 제 1 말단 플레이트로 열을 펌핑한다. 바람직하게는 반응 챔버 두께는 약 1㎜이하이다.

바람직한 구체예에서는 가압된 유체 채널내 유체가 승압을 가지며, 제 2 어셈블리가 반응 챔버에 인접하여 위치하고, 압력이 반응 챔버의 인접 표면에 가해지는 경우에 사용된다. 이러한 사용은 바람직하게는 제 1 커버가 변형성 물질을 형성하고, 여기서, 제 2 어셈블리가 제 1 커버에 인접하여 위치하는 경우 다수개의 인접 경로를 경유하여 제 1 커버에 대해 가해지는 기체 압력이 반응 챔버의 폭을 좁게 하도록 제 1 커버를 변형시키는 데 효과적인 경우에 용이하게 된다. 따라서, 제 2 어셈블리가 제 1 커버에 인접하여 위치하는 경우와 제 2 어셈블리의 가압된 유체 채널내 유체가 감압을 가지는 경우에, 제 1 커버는 제 2 어셈블리에 부착된다. 본 발명은 또한 바람직하게는 제 1 어셈블리로부터 떨어져 제 2 어셈블리를 이동시키기 위한 트랜슬로케이터(translocator)를 포함하며, 여기서 제 1 커버가 제 2 어셈블리에 부착되는 경우 제 2 어셈블리는 제 1 어셈블리로부터 떨어져 제 2 어셈블리를 이동시키므로써 제 1 어셈블리로부터 멀리 이동될 수 있다.

바람직한 어셈블리는 (a) 변형성 재료로 형성된 커버를 가지는 반응 챔버 및 (b) (i) 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있는 제 1 말단 플레이트 및 제 2 말단 플레이트 및 (ii) 제 1 및 제 2 말단 플레이트 사이에 위치하고, 전기적으로 연속적으로 접속되어, 제 1 극성을 갖는 전류가 연속적으로 접속된 반도체 블록에 가해지는 경우에 제 1 말단 플레이트에서 제 2 단 플레이트로, 그리고 제 1 극성의 반대 극성의 전류가 연속적으로 접속된 반도체 블록에 가해지는 경우 제 2 말단 플레이트에서 제 1 말단 플레이트로 열을 펌핑하는 열전기 가열 펌프를 형성하는 다수의 쌍을 이룬 p-타입 및 n-타입 반도체 블록을 포함하는, 반응 챔버의 온도를 빠르게 조절하는 메카니즘을 포함한다.

Claims (11)

1. (a) 반응 챔버를 포함하는 제 1 어셈블리, 및 (b) 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있는 온도 조절용 제 2 어셈블리를 포함하는, 반응 챔버내에서 유체가 통하지 않도록 하는 방식으로 승온 반응을 수행하기 위한 검정 시스템.
2. 제 1항에 있어서, 제 1 어셈블리에 접촉하여 미끄러질 수 있게 위치할 수 있으며 다수의 유체 챔버를 함유하는 제 3 어셈블리로서, 각각의 유체 챔버가 유체 교환 포트를 가지며, 다수의 유체 교환 포트가 제 1 어셈블리에 대하여 제 3 어셈블리를 미끄러질 수 있게 위치시킴으로써 제 1 유체 교환 채널과 정렬될 수 있음을 특징으로 하는 시스템.
3. 제 2항에 있어서, 정렬된 제 1 유체 교환 채널의 반응 챔버내로 제 1 유체 교환 채널과 정렬될 수 있는 유체 교환 포트를 갖는 유체 챔버로부터 유체 흐름을 추진시키기 위한 제 1 유체 임펠러를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시스템.
4. 제 3항에 있어서, 유체가 반응 챔버를 이탈하도록 하는 제 2 유체 임펠러를 추가로 포함하며, 여기에서 제 1 어셈블리는 제 1 유체 교환 채널이 제 3 어셈블리내의 유체 교환 채널과 정렬되지 않을 때 유체가 제 1 유체 교환 채널을 통해 흐르지 않도록 유체가 통하지 않는 미끄럼 가능한 방식으로 제 3 어셈블리내에 맞춰짐을 특징으로 하는 시스템.
5. 제 2항에 있어서, 제 3 어셈블리 또는 제 1 어셈블리를 슬라이딩 시키기 위한 슬라이더, 및 (a) 제 3 어셈블리 또는 제 1 어셈블리의 슬라이딩 및 (b) 유체를 유체 챔버로부터 반응 챔버로 흐르게 하기 위한 제 1 유체 임펠러를 조절하기 위한 프로세서를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시스템.
6. 샘플을 제 1항의 검정 시스템의 제 1 반응 챔버내로 도입시키는 단계 및 샘플을 하나 이상의 유체 챔버로부터 PCR 반응을 수행하는데 필요한 시약을 함유하는 제 1 반응 챔버 용액으로 전달하는 단계를 포함하는 PCR 반응을 수행하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 제 2 어셈블리의 온도가 약 5 초 내에 약 25℃로부터 약 75℃의 온도로 상승함을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6항에 있어서, 제 2 어셈블리의 온도가 약 5 초 내에 약 75℃로부터 약50℃로 저하됨을 특징으로 하는 방법.
9. (a) 제 1 및 제 2 커버, 및 제 1 및 제 2 커버 사이의 거리에 의해 규정된 두께를 갖는 반응 챔버를 포함하는 제 1 어셈블리,

   (b) 열원, 냉각 싱크, 및 제 2 성분의 표면상에서 개방되는 다수의 가압된 유체 채널을 포함하는 제 2 어셈블리, 및

   (c) 가압된 유체 채널내에서 유체 압력을 조절하기 위한 압력 조절기를 포함하며, 제 2 어셈블리는 가압된 유체 채널이 반응 챔버의 커버와 접촉하도록 반응 챔버에 인접하여 위치할 수 있는, 반응 챔버의 온도를 빠르게 조절하기 위한 메카니즘을 갖는 검정 시스템.
10. 제 9항에 있어서, 열원이 제 2 어셈블리에 부착된 하나 이상의 전기 가열기를 포함하고, 냉각 싱크가 제 2 어셈블리에 통합되는 물 또는 그 밖의 유체에 대한 도관 및 유체가 도관을 통해 흐르도록 하기 위한 유체 임펠러를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
11. (a) 변형 가능한 물질로 형성된 커버를 갖는 반응 챔버 및 (b) 반응 챔버의 온도를 빠르게 조절하기 위한 메카니즘을 포함하는 검정 시스템으로서,

    메카니즘이 (i) 반응 챔버 커버와 접촉하여 위치할 수 있는 제 1 말단 플레이트, 및 제 2 말단 플레이트; 및 제 1 및 제 2 말단 플레이트 사이에 위치하고 전기적으로 직렬로 연결되어 열전기 가열 펌프를 형성하는 다수의 쌍을 이룬 p-타입 및 n-타입 반도체 블록을 포함하며;

    제 1 극성을 갖는 전류가 직렬로 연결된 반도체 블록을 가로질러 가해질 때 가열 펌프가 열을 제 1 말단 플레이트로부터 제 2 말단 플레이트포 펌핑하며, 제 1 극성과 반대 극성을 갖는 전류가 직렬로 연결된 반도체 블록을 가로질러 가해질 때 제 2 말단 플레이트로부터 제 2 말단 플레이트로 펌핑함을 특징으로 하는 시스템.