CN107604056B - 一种核酸测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸测定方法，该方法通过可封闭的反应容器实施，反应容器包括管状腔室以及连通管状腔室的通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂；第n个管状腔室内设置有第n反应试剂；该方法包括：将反应容器封闭，在第一个管状腔室中进行第一组反应，第一个管状腔室中的产物通过通道传送到后一个管状腔室；前一个管状腔室的产物传送到第n个管状腔室后，在第n个管状腔室中进行第n组反应。本发明提供的核酸测定方法能够保证封闭性并且操作便捷简单。且无需使用分子探针，不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制。

Description

一种核酸测定方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸定性或定量测定的方法。
背景技术
随着生物技术的发展，现代分子生物学技术或基因工程技术正被日益广泛地用到各种生物技术产业中，特别是应用到医疗诊断中。这类技术的应用，往往涉及用分子探针进行定性、定量测定。典型的核酸定量扩增反应是聚合酶链式反应，即PCR。例如，当对RNA病毒进行检测和诊断时，首先需对病毒RNA进行纯化，再将RNA进行逆转录（RT）成cDNA，然后进行cDNA定量扩增反应 （RT-PCR）。可见RT-PCR是两步反应。多步反应还包括巢式PCR (nestedPCR) 。巢式PCR是用一对外引物完成第一步PCR后、再用一对内引物对第一步反应的产物进行第二步反应并进行定量测定。多重PCR是在一反应体系(反应管)内含有多对引物。巢式PCR的多步反应可以与多重PCR相结合、即在巢式PCR的第一步进行多重PCR、巢式PCR的第二步分别进行多个单重定量PCR。
其中，定量PCR是在DNA扩增反应中，检测每次聚合酶链反应循环后产物总量，以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
巢式PCR使用两对或两对以上的PCR引物分别进行扩增反应。第一对PCR引物称外引物(对)、第二对引物称内引物(对)。由于内引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增产物。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR具有非常有高的特异性和灵敏度。
多重PCR是在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR能够在同一PCR反应体系中对多个基因进行分析，具有高效性。
RNA单链分子可通过逆转录酶转录(RT)成为互补的DNA或称cDNA分子。cDNA可与普通DNA一样可用于PCR反应。这一过程叫做RT-PCR。
上述多种PCR反应可以单独实施，也可以多种PCR反应相互结合。现有技术常常采用多个反应器分别进行多步反应，不能满足密封的要求，特别是在产品转移的过程中，产物容易造成污染。
此外，现有技术中常用实时荧光定量核酸扩增检测对核酸进行定量检测，检测时需要用到荧光标记的分子探针。现有用探针进行定量的方法的缺点是探针需要有二至三个标记物，在设计、制作上成本高。该方法还需要使用具外切酶活性的聚合酶，对试剂的要求高。现有用探针进行定量的方法还要求靶分子有足够的长度，如五十碱基对以上。以上要求在许多应用情况不能被满足。
现有技术中也存在使用非专一性的荧光染料对核酸进行定量测定等方法。这类荧光染料可与双链的DNA结合并产生荧光，产生的信号与DNA量成正比，但与DNA的序列无关，无法测出DNA中的特定序列。
发明内容
为了解决上述的问题，本发明的目的是提供一种保证封闭性并且操作便捷简单的核酸测定方法。
进一步地，本发明的目的是提供无探针的、不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制的核酸定性或定量测定方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种核酸测定方法，该方法通过可封闭的反应容器实施，反应容器包括按序排列的至少两个管状腔室以及连通至少两个管状腔室的至少一个通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂；第n个管状腔室内设置有第n反应试剂，其中n等于或大于2；该方法包括：将反应容器封闭，在第一个管状腔室中进行第一组反应，第一个管状腔室中的产物通过通道传送到后一个管状腔室；第n个管状腔室接收到前一个管状腔室的产物后，在第n个管状腔室中进行第n组反应；对所述第n个管状腔室内的产物进行检测。
本发明采用封闭式的具有至少两个管状腔室的反应容器，并通过连通管状腔室的通道将前一个管状腔室的产物传送到后一个管状腔室，该产物在后一个管状腔室中作为底物进行反应，可以实现多步PCR反应，例如巢式PCR、RT-PCR、多重PCR或者是它们的两种或以上的组合。
进一步的技术方案是，第一反应试剂包括巢式PCR的第一对引物或RT-PCR的逆转录反应引物或多重PCR的第一组引物；第n反应试剂包括巢式PCR或RT-PCR或多重PCR的第n对引物或多重PCR的第n组引物和亲和性物质。
在每一步扩增反应中，可以通过由亲和性物质与产物结合形成的可检测信号来对产物进行定性、定量测定。其中，亲和性物质可以是现有的任意一种或多种能够直接与产物结合形成可检测信号的物质。与分子探针不同，亲和性物质不依赖于外切酶的活性，使得任何适用于PCR的聚合酶均可以用于本发明的定量测定，有利于定量反应的推广，且在反应设计时不需要给分子探针预留空间，因而不受靶分子长度的影响。本发明无需使用具荧光标记的分子探针进行定性或定量测定，有效降低了成本。
第一反应试剂和第n反应试剂除了包括对应的引物以及可根据需要加入的亲和性物质，还包括本领域公知的其他反应试剂例如聚合酶、 逆转录酶、核苷酸、缓冲液等有机或无机物质。反应试剂和样品可以在反应前通过手工或自动化方法加入到相应的管状腔室中。也可以预先将反应试剂加入反应试剂，封闭后进行保存和运输，使用时在相应的管状腔室中加入样品即可。完成样品和反应试剂的加入后，再通过物理、机械或化学方式可对反应容器进行封闭，进行酶反应。
根据巢式PCR和RT-PCR原理，第一个管状腔室中可以放置有一对外引物或包括逆转录引物，第二个管状腔室中可以放置有一对内引物。如有必要，第三个管状腔室可以放入相应的引物。作定量反应时，含靶分子的样品只加入到有外引物的第一反应管中。
利用该方法进行定量测量的原理是，反应进行时, 第二个及其后的管状腔室产生信号的时间与在第一管状腔室内样品靶分子的数量成特定的比例关系。这是由于前一个管状腔室中的产物分子会有限地通过例如分子扩散、液体对流等方法传送到后一个管状腔室，并成为下一反应的分子底物，所传送的产物分子的量和速度与上一反应的产物量成正比。通过调节或控制反应管之间分子的传输机率，可以调节定量检测的灵敏度和反应的动态范围。
进一步的技术方案是，该方法还包括对任意一个管状腔室进行温度控制，温度控制包括保持任意一个管状腔室内具有恒定的温度梯度或周期性地改变任意一个管状腔室内的温度。
反应容器的温度可通过所有已知方法进行控制。反应装置的温度可以是整体均衡的、整体变化的或是不同部分之间具有温差，特别是每一反应器管可以保持有一温度梯度。温度控制方式可以是对管状腔室的特定部位恒定加热，保持管形反应器内产生恒定的温度梯度，或者是使用周期变化的温度控制，使管形反应器内产生均衡的周期性变化的温度。其效果是使得管状腔室内的分子经受不同的温度，从而满足不同的酶反应条件要求，达到实现管状腔室内核酸扩增的目的。
进一步的技术方案是，温度控制包括多个管状腔室进行同步温度控制。
在进行核酸定量测定时，同步控制多个管状腔室的温度，例如同步控制第二个及其后管状腔室的温度，保证第二个及其后管状腔室在在接收到前一个管状腔室传送的产物的任何时候都能够立即进行反应，从而保证反应条件一致，再通过信号检测进行定量分析。
进一步的技术方案是，通道中设置有介质。进一步的技术方案是，任意一个管状腔室中反应得到的产物在通道中通过液体对流或分子扩散的方式传送至后一个管状腔室。
通道中的介质可以是任何能够实现产物传送的介质，例如可以是液体。当第一管状腔室进行反应后，其产物分子可以通过介质传送到另一管形反应器。传输的方式可以是液体对流或分子扩散的方式，使部分产物分子从一个管状腔室传送到后一个管状腔室，传送的量、速度和时间决定于前一反应管中的样品靶分子量。以此可以作为定量测量的基础。
进一步的技术方案是，通道设置在管状腔室的上端。
通道与管状腔室的连接部位可以是管状腔室的上端、中间或是下端。最理想的连接方式是，通道在管状腔室的上端连通多个管状腔室，这种联通方式有利于抑制不同管状腔室之间的物质在不希望混合的情况下混合。
进一步的技术方案是，管状腔室是柱形或锥形，其内直经在0.1毫米至10毫米之间，管壁厚度在0.05至5毫米之间；管状腔室的深度与内直径的比例大于或等于2。
采用柱形或锥形的管状腔室，有利于保持管状腔室温度均匀或形成恒定的温度梯度。管状腔室的内直径、壁厚以及厚度与内直径的比例在以上范围内即可满足一般的反应需要并保持安全稳定，节省成本。
进一步的技术方案是，反应容器还包括位于相邻的管状腔室之间且向通道凸起的弧形连接部。
相邻的管状腔室之间通过弧形连接部连接，可以避免形成死角，使得不同的管状腔室之间产物分子在通道的介质中传送更加顺畅。
进一步的技术方案是，亲和性物质包括染料。
亲和性物质可以是现有的任何能够与核酸产物结合并形成可检测信号的物质，例如染料，特别是荧光染料，荧光染料与核酸产物结合后可以形成荧光信号。亲和性物质还可以是一些表面活性剂、金属配合物、蛋白质等能与产物结合的物质。
进一步的技术方案是，可检测信号包括光学信号或电学信号。更进一步的技术方案是，光学信号包括荧光信号、光吸收信号、红外吸收信号、拉曼散射信号或化学发光信号。
通过不同的亲和性物质与产物结合，可以产生光学信号或电学信号。对于透明的反应容器，通过光学信号进行定性或定量测定是有利的，可以进行实时定量测定。光学信号可以通过现有的光学信号检测仪器对其进行检测。
附图说明
图1是本发明测定方法实施例使用的反应容器的结构示意图。
图2是本发明测定方法实施例使用的反应容器的一种封闭方式的结构示意图。
图3是本发明测定方法实施例的反应过程示意图。
图4是本发明测定方法实施例的结果分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的核酸测定方法作进一步说明。
本实施例的核酸测试方法通过可封闭的反应容器实施。其中一种可封闭的反应容器如图1所示，反应容器1包括按序排列的至少两个管状腔室11，可以按次序依次将其命名为第一管状腔室至第n管状腔室，其中n等于2或大于2。
不同的管状腔室11可进行多步反应中不同的反应，管状腔室11的数目可以根据实际反应的需要而定。管状腔室11可以由一个或多个通道12在管状腔室11的上端、中间或下端连通，通道12可使反应产物在封闭条件下在管状腔室11之间传输，以实现多步生物酶反应。具体在本实施例中，多个管状腔室11在管状腔室11的上端由一个通道12连通，这种上端连通的方式有利于防止不同管状腔室11之间的反应物料不必要地混合。通道12可以根据需要设计成不同的形状，例如管状、渠状等。
在本实施例中，管状腔室11的内直径在0.1毫米至10毫米之间，管壁厚度在0.05至5毫米之间；管状腔室11的深度与内直径的比例大于或等于2。管状腔室11的尺寸在上述范围内，即可满足一般多步生物酶反应的需要，且安全稳定，节省成本。
反应容器1还可以包括开口13，优选地开口13位于通道12的上端。开口13可以采用现有的任何方式进行封闭。如图2所示，在本实施例中，开口13可以与盖体2封闭配合，盖体2上设有可用于加样和取样的通孔21。通孔21中可插入密封件3。每一个密封件3都包括可与通孔21配合的密封塞31，并且可以根据需要在密封塞31下端固定地或可活动地连接有可与管状腔室11的至少一部分配合的密封杆32，密封杆32还可以在反应前用于样品采集。
相邻的至少两个管状腔室11之间设置有向通道12内凸起的弧形连接部14，弧形连接部14可以避免死角，有利于相邻的管状腔室11之间产物的传送。此外，为了便于放置反应试剂或样品，反应容器1中还可以设置存储腔室15。
优选地，反应容器1采用透明材料例如塑料、玻璃等制成，因此具有透明的外观，反应结果可以连续实时迅速地通过光学方法进行检测。反应容器1可以采用机械加工成型或注塑一体成型。
将上述的反应容器1应用于核酸检测时，需要在第一个管状腔室内放置样品和第一反应试剂，在第n个管状腔室内放置第n反应试剂，其中n是由2开始的一个或多个正整数。根据巢式PCR的原理，第一反应试剂除了包括本领域公知的聚合酶、核苷酸以及缓冲液等成分，还包括巢式PCR的第一对引物，即外引物。第n反应试剂除了包括本领域公知的聚合酶、核苷酸以及缓冲液等成分，还包括巢式PCR的第n对引物，即内引物，以及亲和性物质。作定量反应时，含靶分子的样品只加入到有外引物的第一反应管中。
反应试剂也可以预先存于管状腔室11内，封闭后进行保存和运输，使用时只须加入待测样品即可。也可以在使用前，再通过手工或自动化方法对管状腔室11填充反应试剂及生物样品。
亲和性物质可以是现有的任何能够与核酸产物结合并形成可检测信号的物质，例如染料，特别是荧光染料，荧光染料与核酸产物结合后可以形成荧光信号。亲和性物质还可以是一些表面活性剂、金属配合物、蛋白质等能与产物结合并产生可检测信号的物质。
通过不同的亲和性物质与产物结合，可以产生光学信号或电学信号。对于透明的反应容器，通过光学信号进行定性或定量测定是有利的，光学信号包括荧光信号、光吸收信号、红外吸收信号、拉曼散射信号或化学发光信号等，可以进行实时检测。
通道12内设置有一种或多种介质，所述介质可以是液体，一个管状腔室11中的产物通过介质传送到后一个管状腔室11。传送方式可以是液体热对流或分子扩散。
在进行核酸测定时，首先将反应容器1封闭，避免产物造成污染。然后控制各个管状腔室的温度进行巢式PCR反应。具体地，在第一个管状腔室中进行巢式PCR的第一扩增反应，第一扩增反应可以独立地进行，再将所得到的产物传送至第二个管状腔室（n=2）。如图3所示，第二个管状腔室（n=2）中进行巢式PCR的第二扩增反应，随着反应的进行，产物的量逐渐增加，产物还可以逐渐地自动地通过通道传送到第三个管状腔室（n=3）中，继续进行下一步扩增反应，以此类推，直至完成所需的多步反应。第n个管状腔室中的产物与亲和性物质结合，产生可检测信号。从第二个管状腔室至第五个管状腔室可以依次逐步地产生可检测信号，且可检测信号随时间逐渐增强。图3中时间是从第一个管状腔室中产物的传送开始算起。
生物酶反应需要进行温度控制。生物酶反应一般在15 ℃至99 ℃之间进行。可使用目前已知的方法来对管形反应器内的生物酶反应进行温度控制，例如利用红外光、热/冷风、冷/热固体或液体物质、电磁感应等。可以把封闭后的反应装置插入温度控制仪器中进行温度控制。根据反应的要求，任一管状腔室11可经受恒定温度或周期变化温度，管型腔室11内也可有均衡的温度或梯度温度。例如，与传统PCR温度控制相似地，采用周期性均温的温控方法时，温度控制仪器的温度在电脑程序的控制下进行周期性变化，如在某一温度下保持数秒钟至数分钟，且管状腔室11完全插入温度控制仪器的加热部分中，在这变温过程中管状腔室11内的液体温度基本是均衡的。又例如，在温度恒定的梯度温度控温方法中，温度控制仪器的温度在电脑程序的控制下保持不变，且管状腔室11仅有部分与温度控制仪器的加热部分接触。当底部被加热时，底部温度会高于顶部温度，此时管状腔室11内的液体会有一温度梯度。由于上部温度低的液体有相对高的密度或比重，上部与下部的液体会产生对流，其效果是带动管状腔室内的分子流动，且经受不同的溫度，从而满足不同的酶反应条件要求，达到实现管状腔室11内DNA扩增的目的。管状腔室11的管状结构给仪器设计带来更多的灵活性。
在进行核酸定量测定时，应当同步控制管状腔室的温度，保证第二个及其后管状腔室在任何时候在接收到前一个管状腔室传送的产物时都能够立即进行反应，保证反应条件一致。
利用该方法进行定量测量的原理是，反应进行时，由于前一个管状腔室中的产物分子会有限地通过通道例如通过扩散等方式传送到后一个管状腔室，并成为后一反应的分子底物，所传送的产物分子的量和速度与前一反应的产物量成正比。通过调节或控制反应管之间分子的传输机率，可以调节定量检测的灵敏度和反应的动态范围。
如图4所示，在连续反应的多个管状腔室中，信号与时间的比值和管状腔室的位置之间呈正比，其中信号与时间的比值是指当信号达到在非饱和、即线性增长期的一理想值时信号与所用的时间的比例，该比值采用对数方式表示。当一号样品斜率大于二号样品斜率时，一号样品的靶分子数大于二号样品靶分子数。
本实施例的方法可以应用于各种不同的核酸的定性和定量测试。
例如，可以将该方法用于人类EGFR基因突变测定。具体地，包括以下步骤：
（1）在第一管状腔室中进行巢式PCR外围初步反应，利用DNA聚合酶及一对外引物扩增EGFR酪氨酸激酶域 （TKI domain）突变片段，具体地，使用外围引物对扩增覆盖多类突变序列的exon18-22序列。
在50uL反应体积的第一个管状腔室内加入DNA template，200 µM dNTPs，20 mMTris-HCl，10 mM (NH4)2SO4，10 mM KCl, 2 mM MgSO4，0.1% Triton®-X-100，1 unit DNA聚合酶，及0.3 µM 下列外引物对：
EGFR OutF1:5’-CAATG CCATC CACTT GATAG G-3’
EGFR OutR1:5’-GATCG GCCTC TTCAT GCGAA GG-3’
然后，在第一个管状腔室内先进行同管恒温热对流DNA扩增。同管恒温对流反应15分钟。
（2）通过通道传送第一轮扩增反应产物到第二个管状腔室，并且依次将前一个管状腔室中的产物传送到后一个管状腔室，各个相继的管状腔室内含有特定突变基因测试内引物对 （以T790R 和L858R突变为例）及检测亲合物：
第二个管状腔室进行T790野生型检测，第二管状腔室内含有200 µM dNTPs, 20mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton®-X-100,0.25X Cyber Green dye (AAT Bioquest， USA) 及1 unit DNA聚合酶，以及巢式PCR内引物对0.3 µM：
EGFR T790F：5’-ACCTC CACCG TGCAG CTCAT CAC-3’
EGFR 790R： 5’-GTGTT CCCGG ACATA GTCCA -3’。
第三个管状腔室进行M790突变型检测，第三个管状腔室内含有200 µM dNTPs, 20mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton®-X-100,0.25X Cyber Green dye (AAT Bioquest，USA) 及1 unit DNA聚合酶，以及巢式PCR内引物对0.3 µM：
EGFR M790F：5’-ACCTC CACCG TGCAG CTCAT CAT-3’
EGFR 790R：5’-GTGTT CCCGG ACATA GTCCA -3’。
第四个管状腔室进行L858野生型检测，第四个管状腔室内含有200 µM dNTPs, 20mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton®-X-100,0.25X Cyber Green dye (AAT Bioquest， USA) 及1 unit DNA聚合酶，以及巢式PCR内引物对0.3 µM：
EGFR L858F：5’-GTCAA GATCA CAGAT TTTGG GCT-3’
EGFR OutR1：5’-GATCG GCCTC TTCAT GCGAA GG -3’。
第五个管状腔室进行R858 突变型检测，第五个管状腔室内含有200 µM dNTPs,20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton®-X-100,0.25X Cyber Green dye (AAT Bioquest， USA) 及1 unit DNA聚合酶，巢式PCR内引物对0.3 µM：
EGFR R858F：5’-GTCAA GATCA CAGAT TTTGG GCG-3’
EGFR OutR1：5’-GATCG GCCTC TTCAT GCGAA GG -3’。
以上第二个管状腔室至第五个管状腔室同步进行恒温对流反应15分钟。
（3）对第二个管状腔室至第五个管状腔室信号进行连续检测，可以实现对样品的靶分子数进行定量测定。并以野生型和突变型比较来判断样品的基因型。
由上可见，本发明提供的核酸测定方法将具有多个管状腔室和通道的封闭式反应容器与巢式PCR反应相结合进行定性或定量测定，能够防止产物造成污染，且反应的灵敏度和准确性高，无需使用分子探针，不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制。
最后需要强调的是，以上仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种核酸测定方法，其特征在于：
所述方法通过可封闭的反应容器实施，所述反应容器包括按序排列的大于两个的管状腔室以及连通所述管状腔室的至少一个通道；所述通道内设置有一种或多种介质；
其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂，第n个管状腔室内设置有第n反应试剂，其中n等于或大于2且n等于或小于管状腔室的数目；
所述方法包括：将所述反应容器封闭，在所述第一个管状腔室中进行第一组PCR反应，所述第一个管状腔室中的产物通过所述通道传送到后一个管状腔室；任意的前一个管状腔室中反应得到的产物在所述通道中通过液体对流或分子扩散的方式传送至后一个管状腔室；所述第n个管状腔室接收到前一个管状腔室的产物后，在所述第n个管状腔室中进行第n组PCR反应；对所述第n个管状腔室内的产物进行检测，获得所述第n个管状腔室中信号与时间的比值，所述信号与时间的比值是指当信号达到在非饱和即线性增长期的一理想值时信号与所用的时间的比例；根据所述信号与时间的比值和所述管状腔室的位置之间的线性关系来实现核酸的定性或定量测定。
2.根据权利要求1所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
所述第一反应试剂包含巢式PCR的第一对引物或RT－PCR的逆转录反应引物或多重PCR的第一组引物；所述第n反应试剂包含巢式PCR或RT－PCR或多重PCR的第n对引物和亲和性物质；所述方法不使用分子探针。
3.根据权利要求1或2所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
所述方法还包括对所述管状腔室进行温度控制，所述温度控制包括保持所述管状腔室内恒定的温度梯度或周期性地改变所述管状腔室的整体温度。
4.根据权利要求3所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
所述温度控制包括对多个所述管状腔室进行同步温度控制。
5.根据权利要求1或2所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
所述管状腔室是柱形或锥形，其内直经在0.1毫米至10毫米之间，管壁厚度在0.05至5毫米之间；所述管状腔室的深度与内直径的比例大于或等于2。
6.根据权利要求1或2所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
所述反应容器还包括位于相邻的所述管状腔室之间且向所述通道内凸起的弧形连接部。
7.根据权利要求2所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
所述亲和性物质包括染料。
8.根据权利要求2所述的一种核酸测定方法，其特征在于：
可检测信号包括光学信号或电学信号；所述光学信号包括荧光信号、光吸收信号、拉曼散射信号或化学发光信号。
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