CN104854451B

CN104854451B - 用荧光监测温度

Info

Publication number: CN104854451B
Application number: CN201380064195.XA
Authority: CN
Inventors: L·N·斯坦福; C·T·威特沃
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2033-10-08
Also published as: WO2014058919A4; EP2906943A4; EP3379245A1; CA2887302C; WO2014058919A1; US20150247209A1; CN104854451A; US9850549B2; CA2887302A1; EP2906943B1; EP2906943A1

Abstract

本申请提供了系统、方法和试剂盒，其中，使用发出光信号的温度敏感性试剂来调节样本温度的识别或控制热循环。在各种示例性实施方式中，样本为PCR混合物。

Description

用荧光监测温度

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月9日提交的美国临时专利申请号61/711,631的优先权和权益，该申请整体通过引用合并于本文。

背景技术

聚合酶链反应(“PCR”)是分子生物学中广泛使用的技术。它们的名称源自关键组分之一，即通过酶促复制扩增DNA链的DNA聚合酶。通常，PCR使用耐热的聚合酶、脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)、一对引物和模板DNA。单个PCR反应(或循环)通常包括(1)提高样本的温度至足以将双链DNA分子熔解或变性成单链模板的温度，(2)冷却样本，让DNA引物结合或退火到每条模板，以及任选地(3)重新调节样本温度，以优化向每条被结合引物的末端酶促添加dNTP，形成新的DNA分子。随着PCR进行，产生的DNA(“扩增子”)自身用作模板用于进一步的复制。这启动了DNA模板以指数扩增的链式反应。使用PCR，可能在多个数量级范围内扩增单拷贝的DNA或较少拷贝的DNA，产生数百万或更多的DNA拷贝。

有效的PCR依赖于在热循环中准确且可重复地获得产物/模板的变性(或熔解)温度和引物退火温度。这反过来依赖于准确测量和控制样本和/或溶液的温度。PCR样本温度的测量和控制可手动进行或通过自动化仪器，例如热循环仪(或温度循环器)进行。许多热循环仪中的温度传感器测量含有扩增溶液的PCR管周围的金属模块或隔室的温度。使用这种“外部”温度传感器，有时可在温度保持恒定的平衡过程中获得准确的测量。然而，在温度转变过程中，溶液的温度经常滞后于仪器模块或隔室的温度，可能导致对温度监控和控制的不准确和不一致——该影响在PCR循环速度提高时变得更明显。

PCR溶液内的直接传感器接触虽然可能比外部温度测量更准确，但也存在问题。这种PCR的直接、内部测定由于产物污染、PCR抑制、传感器热质增加以及光学测量的障碍而通常不被赞成。这些担忧中的许多随着样本体积减小而愈发严峻。然而，在较大的样本中，直接的物理传感器仅测量一个位置的温度，而这可能不能准确地反映整个溶液的温度。

随着时间，PCR的温度循环变得更快。在更快的速度时，大部分循环时间花费在温度转变中，并且溶液温度很少追随所测量的仪器温度。改善对快速PCR循环中溶液温度的测定的尝试包括依赖于样本体积的预测算法，以及具有与样本相同的热响应使得它们在动力学上相匹配的传感器。然而，由于PCR中的生化反应快速，并且有许多迅速改变样本(尤其是小样本)温度的方式，限制PCR一致性(特别是在快速时)的因素似乎是准确的温度测量。

发明概述

本发明包括使用发光(luminescence)监测样本的内部状态。本文描述的本发明的一个或多个实施方式包括使用条件敏感性试剂的一个或多个内在发光特性准确地监测样本的状况。某些实施方式包括，例如使用pH敏感性试剂和/或温度敏感性试剂的内在发光在PCR热循环和/或准确度提高的仪器校准过程中监测样本温度的方法和系统。在至少一个实施方式中，温度敏感试剂的内在荧光作为温度的函数以已知和/或可预测的方式而变化。因此，某些实施方式包括使用样本荧光作为内部温度的监测物，以反映整个样本的平均温度或控制热循环。

在一个实施方式中，描述了包含至少一种条件敏感性试剂的PCR混合物。所述PCR混合物可包含进行PCR所需要的一种或多种试剂(例如，至少一个核酸模板、包括经设计退火到所述至少一个模板核酸的至少一部分上的至少一个正向引物和一个反向引物的多个核酸引物、热稳定性聚合酶、dNTP等)以及条件敏感性试剂。在一个实施方式中，所述条件敏感性试剂可包括至少一种能响应于刺激而发出依赖于温度的发光信号的温度敏感性试剂。在至少一个实施方式中，所述至少一种温度敏感性试剂发出的发光信号具有在95℃和50℃之间改变至少50％的荧光信号。例如，所述至少一种温度敏感性试剂可显示约1％/℃的温度敏感度。在至少一个实施方式中，由所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量不与样本中存在的核酸的量成正比。例如，优选所述温度敏感性试剂不是结合dsDNA的染料，所述温度敏感性试剂的发光信号不受dsDNA变性(或熔解)的影响，并且/或者所述温度敏感性试剂未结合至核酸。

在另一个实施方式中，描述了测量样本温度的方法。所述方法可包括(1)提供待测量的样本，所述样本包含已知量的响应于刺激而发出发光信号的温度敏感性试剂，其中，所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量作为温度的函数以已知且可预测的方式而变化。所述方法进一步包括(2)测量所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量；以及(3)确定作为所述温度敏感性试剂发出的发光信号的函数的样本温度。

在某些实施方式中，可通过观察已知量的温度敏感性试剂发出的发光信号的量直接测量样本温度。在其它实施方式中，可通过以下确定样本温度：(a)观察在第一温度来自温度敏感性试剂的发光信号的量，(b)观察在第二温度来自温度敏感性试剂的发光信号的量和(c)确定第一温度和第二温度之间的发光信号之比。

在另一个实施方式中，描述了校准样本加热装置的方法。所述方法可包括(1)提供包括上述温度敏感性试剂的校准样本。所述方法可进一步包括(2)测量所述样本的装置确定的温度，(3)刺激所述温度敏感性试剂以引起从其发出发光信号，(4)测量从所述温度敏感性试剂发出的发光量，和/或(5)作为所述温度敏感性试剂发出的发光信号的函数，测量校准样本的发光确定的温度。所述方法还包括(6)调节所述装置确定的温度，以反映所述发光确定的温度。示例性地，所述温度敏感性试剂为荧光染料。

另一些其它实施方式包括PCR系统，所述PCR系统经设置以使用依赖于温度的发光作为内部样本温度的指示。所述系统可包括(1)经设置以接受样本的样本容器，(2)经设置以控制样本温度的样本温度控制装置，和/或(3)经设置以使用样本温度控制装置来调节样本温度的样本温度控制机件。在至少一个实施方式中，样本温度控制机件包括样本温度升高机件和样本温度降低机件。所述系统还可包括(4)经设置以量化样本发出的温度敏感性发光的量的样本发光测量元件。在至少一个实施方式中，所述样本温度控制机件基于样本发光调节样本的温度。

因此，在一个示例的实施方式中，提供了测量样本温度的方法，所述方法包括提供包含温度敏感性试剂的样本，所述温度敏感性试剂响应于刺激而发出光信号；其中，所述温度敏感性试剂发出的光信号的量以已知的方式作为温度的函数而变化；测量所述温度敏感性试剂发出的光信号的量；并确定作为温度敏感性试剂发出的光信号的函数的样本温度。在具体的实施方式中，所述温度敏感性试剂包括荧光染料，并且所发出的光信号包括荧光。在其它具体的实施例中，所述荧光染料包括磺酰罗丹明B，并且所述样本包括PCR混合物。

在其它示例性实施方式中，提供了校准样本加热装置的方法，所述方法包括提供包含温度敏感性试剂的样本，所述温度敏感性试剂响应于刺激而发出光信号；其中，所述温度敏感性试剂发出的光信号以已知且可预测的方式作为温度的函数而变化，刺激所述温度敏感性试剂以引起从其发出光信号；基于温度敏感性试剂发出的光信号，确定所述样本的发光确定的温度；确定所述样本的装置确定的温度；以及基于所述发光确定的温度和所述装置确定的温度中至少之一，调节所述样本加热装置的温度设置。

在另一些其它实施方式中，提供了热循环系统，所述系统经配置以使用温度依赖性发光作为平均内部样本温度的指示，所述系统包括经配置接收样本的样本容器；经配置控制样本温度的样本温度控制装置；经配置使用所述样本温度控制装置调节所述样本的温度的样本温度控制机件(mechanism)；其中，所述样本温度控制机件包括样本温度升高机件和样本温度降低机件；以及经配置量化所述样本发出的温度敏感发光的量的样本发光测量元件；其中，所述样本温度控制机件基于样本发光调节所述样本的温度。

在另一些其它示例性实施方式中，提供了PCR混合物，所述PCR混合物包含响应于刺激而发出光信号的温度敏感性试剂；其中，所述温度敏感性试剂发出的光信号的量不与样本中存在的核酸的量成正比；并且其中，所述温度敏感性试剂发出在95℃和50℃之间变化的荧光信号。

在额外的示例性实施方式中，提供了PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含温度敏感性试剂，所述温度敏感性试剂响应于刺激而发出光信号；以及使用所述温度敏感性试剂确定样本的温度的可理解的说明书。

在更多示例性实施方式中，提供了使用反馈控制而控制样本的热循环谱的方法，所述方法包括在第一温度提供样本，其中，所述样本包括响应于刺激而发出光信号的条件敏感性试剂；刺激所述条件敏感性试剂，以引起从其发出光信号；以及检测所述条件敏感性试剂发出的光信号；其中，所述发光信号的预定值表示用以启动向热循环谱中的下一阶段改变的合适的时间。

在其它更多的示例性实施方式中，提供了热循环装置，所述热循环装置经配置使用反馈温度控制执行样本的热循环谱，所述热循环装置包括：样本容器，所述样本容器经配置接收具有至少一种温度敏感性试剂的样本，所述温度敏感性试剂响应于刺激而发出光信号，其中，所述温度敏感性试剂包括被动参考试剂(passive reference reagent)；样本温度控制组件，所述样本温度控制组件经配置调节样本的温度并响应于触发事件而启动向热循环谱中下一阶段改变，其中，所述触发事件包括检测所述发光信号的预定值。

本发明的实施方式的另外的特征和优点将在下面的描述中说明或者可通过实施此类实施方式而被获悉。可通过所附权利要求书中具体指出的仪器或组合的方式实现和获得这些实施方式的特征和优点。这些特征和其它特征在下面的描述和所附权利要求书中将整体上更显而易见，或者可通过如下文所示实施此类实施方式而被获悉。

附图说明

为了描述可获得本发明的上述和其它优点和特征的方式，将通过参考附图中描述的具体实施方式，对以上简要描述的发明作更具体的说明。应该理解这些附图仅描述了本发明典型的实施方式并因此不会认为是对其范围的限制，将通过使用附图对本发明进行更具体和详细地描述和解释，其中：

图1描述了根据公开的方面的热循环系统的示例性实施方式的框图。

图2描述了用于热循环系统的基于荧光的温度控制的示意图。

图3描述了保持在45℃(x线)、55℃(实线)、65℃(点划线)、75℃(虚线)、85℃(点线)和95℃(三角线)时在530nm激发的磺酰罗丹明B(单钠盐)的温度敏感谱。

图4描述了在490nm激发的磺酰罗丹明B(单钠盐)的温度敏感性和不敏感性，光谱数据显示为在波长范围内的比(在45℃的发射强度(e.i.)/在95℃的发射强度(e.i.))的对数值。

图5A～5C显示了使用基于荧光的循环控制扩增的3种指定(forensic)的单核苷酸多态性rs763869(图5A)、rs876724(图5B)和rs917118(图5C)的熔解导数图。

图6A～6B描述了利用基于荧光的温度控制使用保持时间为“0”秒的扩增。图6A描述了实时扩增曲线，而图6B描述了使用背景去除的量子方法分析的负导数熔解曲线。

图7描述了没有(实线)以及具有(虚线)油覆盖层时在上加热和冷却过程中的荧光。

图8描述了上加热过程中的荧光。

图9A～9C描述了在3个不同的仪器上于94℃(图9A)、80℃(图9B)和50℃(图9C)评估的磺酰罗丹明B的仪器平衡和热降解。

图10A～10C描述了磺酰罗丹明B在80℃于(图10A)、(图10B)和(图10C)上的荧光淬灭。

图11A描述了在9个实时PCR仪器上关联温度与荧光的校准曲线。仪器包括类别I(短划线)、类别II(实线)、类别III(点线)和类别IV(点划线)。

图11B描述了的图5A中描述的数据的线性图的斜率(y＝1890X+0.013,R2＝0.999)。

图12描述了通过荧光(“溶液”–实线)、微热电偶(“热电偶”–短划线)确定的，以及通过仪器(“仪器”–点线)显示的上的典型的PCR循环的温度追踪。

图13A～13C描述了30μL样本+20μL油以0.57℃/秒(图13A)、10μL样本+15μL油以0.29℃/秒(图13B)和5μL样本+5μL油以0.14℃/秒(图13C)时，通过荧光(“溶液”–实线)、微热电偶(“热电偶”–短划线)确定的，以及通过仪器(“仪器”–点线)显示的上PCR循环的温度追踪。

图14描述了Eco^TM仪器上在变性(+)和退火(x)保持阶段的过程中由荧光确定的溶液温度测量值。变性(94℃)和退火(55℃)目标温度显示为水平实线。

图15A～15C描述了在(图15A)、(图15B)和(图15C)上加热和冷却过程中溶液温度和设备温度之间的温度不匹配或滞后。理想的溶液—设备温度相关性显示为虚线。

图16A～16F描述了在毛细管仪器(图16A～16C)上以0.2℃/秒(图16A)、1℃/秒(图16B)和5℃/秒(图16C)的坡变速率下，以及在基于板的仪器上(图16D～16F)以0.11℃/秒(图16D)、0.29℃/秒(图16E)和0.57℃/秒(图16F)的坡变速率下，加热和冷却过程中溶液—仪器的温度滞后。

图17A～17B描述了在上以0.14℃/秒(图17A)和0.01℃/秒(图17B)使用溶液(虚线)和仪器(实线)产生的熔解曲线的负导数曲线。

发明详述

I.介绍和定义

本发明包括使用发光监测样本的内部状态。文中所述的本发明的一个或多个实施方式包括使用条件敏感性试剂的内在发光性质准确地监测样本的状态。某些实施方式包括，例如使用pH敏感性试剂和/或温度敏感性试剂的内在发光在PCR热循环和/或仪器校准过程中准确地监测样本温度的方法和系统。在至少一个实施方式中，温度敏感性试剂的内在荧光以已知和/或可预测的方式作为温度的函数而变化。因此，某些实施方式包括使用样本荧光作为内部温度监测物，以反映整个样本的平均温度或者控制热循环。

如文中使用，“核酸”、“模板核酸”以及相似的术语包括“核苷酸”“寡核苷酸”和“DNA”以及RNA、核酸类似物和核酸取代物(即天然产生或合成的类似物、取代物或等价物；例如具有不是磷酸二酯骨架的那些)，而无论是单链、双链或其它构型。这样的取代物的说明性实例包括所谓的“肽核酸”(PNA)和所谓的“锁核酸”(LNA)，并且非类似的核酸取代物也包括在内。合适时，这样的术语还包括一个或多个dNTP。

如文中使用，“dNTP”以及相似的术语还包括如前所讨论的脱氧核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸三磷酸酯类似物、取代物、等价物等。适当时，“dNTP”和相似的术语还可包括其它核苷酸和/或核苷三磷酸酯(NTP)，包括前述的核糖核苷酸和/或核糖核苷酸三磷酸酯以及它们的类似物、取代物、等价物等。此外，本文还涉及核苷和核苷酸两者。

如文中使用，“碱基对”、“碱基配对”及相似的术语是指如先前限定的互补核酸的结合，并且不限于常规的Watson-Crick碱基配对或通过氢键的结合。

如文中使用，“双链”是指如前面定义的至少一对核酸的碱基配对，并且不限于任何特定长度的核酸或来自单独的核酸链的碱基对。

如文中使用，“引物”、“核酸引物”及相似的术语还可指引物组、引物集合、多个引物和/或引物套组。

虽然文中实施例中使用的需要控制温度的方法是PCR，应理解温度控制在其中很重要的任何扩增、非扩增或其它分析和/或方法都可受益于本发明。示例的扩增程序包括聚合酶链式反应(PCR)；链置换扩增(SDA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；级联的滚环扩增(CRCA)；基于靶标的解旋酶依赖性扩增(HAD)；转录介导的扩增(TMA)等。因此，当使用术语PCR时，应理解包括其它可选的扩增和非扩增的分析和/或方法。可受益于本发明的其它示例性分析方法包括需要严密的温度控制的熔解分析、高分辨熔解分析和等温扩增方法。还应理解，根据文中描述的某些实施方式的方法可使用从其它来源获得的核酸，包括天然产生或合成的核酸。

如文中使用，“样本板”、“样本容器”及相似的术语是指包括至少一个样本管或隔室的器皿，并且不必然表示其样本管中有已知或未知的样本的存在。说明性配置的非限制实例包括单管(Eppendorf)的试管、8管联排、12管联排、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板。此外，文中仅例示了多孔样本板或多管联排的使用。样本容器的其它例示性实例，包括样本试管、毛细管、弹性袋(flexible pouche)、阵列、收纳袋(carousel)等，是本领域中已知的并且也包含在本文中。

如文中使用，“样本管”、“样本隔室”、“样本孔”以及相似的术语是指器皿的至少一个部分或分隔，所述器皿经配置而提供有限制相邻部分或分隔之间的流体交通的屏障，并不意味着样本管、隔室或孔中存在已知或未知的样本。非限制性的示例性实例包括样本板或管联排的孔或管、样本袋内形成的泡、单独的毛细管或类似的隔室。

如文中使用，“条件敏感性试剂”、“条件依赖性试剂”以及相似的术语是指任何分子、成分、化学品、化合物、染料和/或其它材料，其性质作为至少一种条件和/或物理性质或其它性质的函数而变化，因而能够直接或间接地证明、提示或揭示实际的、实验的或接近的条件和/或物理性质或其它性质。

在某些实施方式中，所述环境敏感性试剂可响应于刺激而发出光信号。例如，所述环境敏感性试剂可包括响应于暴露到足以激发或者诱导从染料发出荧光信号的刺激(例如，给定波长的光)而发出荧光信号的温度敏感性荧光染料。

然而，注意到，提及荧光和/或荧光试剂仅为示例性的，并且发光的非荧光形态也包含在本发明的范围内。例如，本发明包括化学发光、生物发光、辐射发光、电致发光、电化学发光、机械致发光、结晶发光、热致发光、声致发光、磷光和其它形态的光致发光等。

此外，响应于非电磁刺激的条件敏感性试剂也包含在本发明的范围内。实际上，条件敏感性试剂可包括响应于任何合适条件和/或物理或其它性质并响应于刺激而发出一些光信号的任何试剂。因此，能够刺激此类发光响应的任何刺激包含在本发明的范围内。因此，本文涉及响应于刺激(包括电离辐射，例如β离子)而发出温度敏感性或依赖于温度的信号(或一些信号)的辐射发光试剂。

因此，虽然为了方便起见，可以指具体形式的发光和/或发光试剂和/或其相应的刺激(作为示例，例如荧光、荧光染料和电磁辐射)；但本文包括所有形式的发光、条件敏感性试剂和/或发光试剂以及相应的刺激。

还注意到，提及温度、温度依赖性、温度敏感性和/或温度依赖性试剂和/或温度敏感性试剂的使用仅为示例性。例如，文中公开的系统、组合物和方法中描述的条件敏感性试剂可对pH变化，离子或离子强度变化，以及粘性、密度、比重的变化和其它形式的物理变化和/或其它性质变化和/或相应的试剂敏感；它们全部包含在本发明的范围内。因此，虽然为了方便，可以指具体的条件、条件敏感性、条件依赖性和/或条件敏感性试剂和/或条件依赖性试剂(作为示例性，例如温度)；但本文包括所有的条件、条件敏感性、条件依赖性和/或条件敏感性试剂和/或条件依赖性试剂。

示例性地，条件敏感性试剂还可包括核酸、蛋白质、探针和/或具有一个或多个结合指示、连接指示、轭合指示和/或条件和/或物理性质或其它性质的其他连接的指示的其它分子，例如染料、分子、部分(moiety)、单元等。此外，本文还包含可作为第二种条件和/或物理或其它性质(作为示例，例如温度)的函数变化的，对第一种条件和/或物理或其它性质(作为示例，例如pH)敏感的试剂。在一个方面，条件敏感性试剂可不以显著特异性结合一条或多条核酸，和/或者在结合一条或多条核酸后可不显示发光信号和/或发射的显著变化。如文中使用，“结合”核酸还可指插入到核酸二级、三级和/或四级结构之中和/或之间或小沟结合。

如文中使用，“被动试剂(passive reagent)”、“被动参考试剂(passivereference reagent)”、“被动染料(passive dye)”、“被动参考染料(passive referencedye)”以及相似的术语是指响应于刺激而发出光信号，并且(1)未抑制和/或干扰PCR和/或PCR产物的形成的条件敏感性试剂，并且/或者(2)，其中，所述条件敏感性试剂发出的光信号的量没有指示样本中存在的核酸的量。在一个方面，构成被动染料、被动参考染料等的条件敏感性试剂可以不以显著特异性结合一个或多个核酸并且/或者当结合一个或多个核酸后可不显示发光信号和发射的显著变化。

如文中使用，“温度敏感”、“温度依赖”以及相似的术语是指任何试剂、物质、成分或其它物质以可感知的方式指示温度的变化或响应于温度的变化的性质、特性和/或趋势。

如文中使用，“PCR产物形成的定量指示物”以及相似的术语是指能够证明、提示或者揭示样本、溶液、悬浮液和/或反应混合物中实际的、实验的或近似量的PCR产物的任何分子、组分、化学品、化合物、染料、试剂和/或其它物质。一个示例性实例为结合dsDNA的染料或其它结合dsDNA的试剂。此类指示剂也可示例性地包括具有一个或多个结合指示、连接指示、轭合指示和/或PCR进程的其他相关指示的核酸、蛋白质、探针和/或其它分子，例如染料、分子、部分、单元等。

如文中使用，“装置确定的温度”、“仪器温度”和相似的术语是指通过装置、仪器、元件、部件、硬件、传感器和/或经设计执行相同任务的其它物质但是不必直接接触所测量的物质，和/或者通过测量所测量物质之外的温度(即所测量物质的外部温度)，而测量、量化、观测、确定或者测定的温度。

如文中使用，“热电偶确定的温度”、“热电偶温度”、“通过直接接触测量的温度”和相似的术语是指通过使所测量的物质与温度测量装置接触而测量、量化、观察到、确定的温度或者确定的温度。

如文中使用，“溶液温度”、“发光确定的温度”、“荧光确定的温度”和相似的术语是指通过使用条件敏感性试剂而测量、量化、观察到、确定的温度或者确定的温度。

如这里使用，“热循环谱”(“thermal cycling profile”、“thermocyclingprofile”)及相似的术语是指调节和/或操纵样本或样本温度从第一温度到至少第二温度的任何过程、步骤、方法、策略或其它行动计划。此类谱可手动或通过自动化完成，包括经配置以实现完成的软件或其它程序。在一个方面，此类谱可包括历经多个温度的多轮循环。例如，在示例性PCR或其它谱中，多个温度可包括至少一个“熔解”温度和至少一个“退火”温度，其中，所述熔解温度高于退火温度，并且所述谱可包括历经熔解温度和退火温度一次或多次的循环。在某些方面，谱可包括第三“延长”温度，例如在熔解温度和退火温度之间。此外，谱通常涉及几个阶段，包括(1)样本温度从第一温度变为至少第二温度的至少一个坡变(ramp)或坡变期，其中每个坡变或坡变期经设置具有至少一个温度在此改变的坡度或坡变速率或速度，以及(2)至少一个保持或保持期，在所述保持期中样本温度被保持或保持基本恒定或未变化，其中，所述保持或保持期大于或等于0秒。

II.PCR混合物

描述了包含至少一种条件敏感性试剂的PCR混合物。所述PCR混合物可包含进行PCR需要的一种或多种试剂(例如，至少一种核酸模板，包括经配置退火到所述至少一个模板核酸的至少一部分上的至少一个正向引物和至少一个反向引物的多个核酸引物，热稳定性聚合酶，dNTP等)以及条件敏感性试剂。

在至少一个实施方式中，所述条件敏感性试剂包括温度敏感性试剂。所述温度敏感性试剂可响应于刺激而产生可检测的信号(例如，发光信号和/或发射)，其中所述温度敏感性试剂产生的信号的量响应于所述温度敏感性试剂所处的介质温度的变化而变化。在一个实施方式中，所述温度敏感性试剂可不结合具有显著特异性的一条或多条核酸，并且/或者当结合一条或多条核酸后可不显示发光信号和/或发射的显著变化，并且/或者从所述温度敏感性试剂发出的发光信号的量不表示样本中存在的核酸的量。此外，在某些实施方式中，所述PCR混合物可包含被动参考染料。

在某些实施方式中，所述温度敏感性试剂发出的和/或来自所述温度敏感性试剂的发光信号的量可以已知和/或可预测的方式作为温度的函数改变。例如，以前已经研究、确定、总结和/或记录了从温度敏感性被动染料发出的荧光信号的量的温度依赖性变化和/或温度敏感性变化。

在至少一个实施方式中，温度敏感性试剂发出在给定温度范围内以可测量的量改变的发光信号。例如，所述温度敏感性试剂发出的光信号可在约95℃和约50℃之间改变约(或至少)50％。然而，可以理解，某些实施方式可包括温度敏感性试剂，所述温度敏感性试剂发出的发光信号改变的量为其它量，包括在约95℃和约50℃之间改变倍数小于50％。相似地，本文包括在约95℃和约50℃之间约(或至少)5％、10％、20％、40％、60％、80％或100％的信号变化。可以理解，信号变化可为提高或减小，并且如果信号变化为提高，还包括超过100％的变化。

同样，温度敏感性试剂发出的光信号的改变量在其中可测量，或在其中改变具体的或预定的倍数或百分比的温度范围可大于或小于两个或多个选择的温度点之间(例如约95℃和约50℃之间)。例如，在约50℃和约0℃之间、约75℃和约55℃之间、约95℃和约65℃之间、约95℃和45℃之间、约65℃和约32℃之间，或者与使用这样的试剂相配的任何温度范围之间，发光信号可提高约50％或更多。

在至少一个示例性实施方式中，在某些示例性波长处从所述温度敏感性试剂发出的荧光信号在相关的温度范围内变化约1％/℃。例如，温度敏感性试剂在某些示例性波长处在约95℃和约50℃之间可具有和/或显示约1％/℃的温度敏感性。此外，文中还包括小于1％/℃以及大于1％/℃的温度敏感性和/或温度依赖性信号变化。

注意到，信号变化可包括信号提高、信号降低或者试剂的特征性其它信号变化。示例性地，虽然不同的试剂或染料随温度变化可具有不同反应，但是多数荧光染料的荧光随温度的上升而降低。

在某些实施方式中，温度敏感性试剂发出的光信号以相对于(或依赖于)样本温度的基本线性式样或方式变化。在其它示例性实施方式中，指数曲线拟合、S型(sigmoidal)曲线拟合、对数曲线拟合、logistic曲线拟合和其它数学上定义的曲线拟合(包括导数或其它运算或修饰)可基本上定义试剂发光和/或发光信号发射在相关温度范围内的温度敏感性变化和/或温度依赖性变化。示例性地，观察发光信号变化的线性可能需要或进行针对发光信号检测元件或装置的初始“预热”期。

在某些实施方式中，所述温度敏感性试剂在约80℃可呈现小于或等于每小时约2.2％的热降解，并且/或者在约94℃呈现每小时约5.4％的热降解。然而，可理解，一些示例性的温度敏感性试剂可呈现更高的热降解程度，而没有背离本发明的范围。示例性的试剂还可以在约50℃呈现长达1小时或更久的显著热稳定性(即在相关的误差界限内无显著热降解)。然而，可理解，热稳定性可为温度特异和试剂特异的，并且试剂间热稳定性的变化可能不必然造成任何具体试剂不能被接受或者不被认可。示例性地，如果使用快速循环，并且不使染料在较高的温度保持任何显著的时间，那么可接受在较高的温度下显示热降解的染料。

同样地，示例性的温度敏感性试剂在相关的时间范围内在相关温度下可呈现可忽略的、可测量的或者甚至显著的发光淬灭，而没有脱离本发明的范围。例如，在至少一个实施方式中，所述温度敏感性试剂在约50℃在约一个小时的期间可显示没有显著的、可感知的和/或明显的荧光淬灭。此外，在某些实施方式中，可呈现缺少显著的荧光淬灭，而与样本是否连续被照射或者仅周期性地被照射无关。然而，可以理解，发光淬灭可为时间特异性的、温度特异性的和/或试剂特异性的，并且试剂间荧光淬灭性质的变化不必使得任何具体的试剂不被接受或者不被认可。

在具体的示例性实例中，包含在PCR混合物中的温度敏感性试剂可包括磺酰罗丹明B。磺酰罗丹明B在温度循环条件下相对稳定，并产生作为温度的函数的已知的和可预测的荧光变化。此外，磺酰罗丹明B在这种程度上可被归类为被动参考染料，原因是(1)其未抑制和/或干扰PCR和/或PCR产物的形成和/或(2)由其发出的发光信号的量未表明样本中存在的核酸的量。

当在514nm激发时，磺酰罗丹明B的荧光信号(示例性地，在约514nm测量)对于每1℃的升高减小约1.55％。虽然对于磺酰罗丹明B最有效的激发在560nm，但是470～483nm的通用激发波长可用在某些示例性实施方式中(例如，用于比较仪器)。在这些条件下，可观察到1.19％/℃的温度敏感性。可以理解，在这些波长的较低激发效率可通过较高浓度的磺酰罗丹明B补偿，而非可通常用于保持信号和限制噪音。

然而，引用磺酰罗丹明B仅为示例性的，而非意味着限制文中公开的试剂的范围。在某些实施方式中，具有应用范围所必需的质量的任何合适的条件敏感性试剂可能是充分的。因此，当需要显示(1)在约95℃和约50℃之间具有约50％的荧光的显著线性提高(大约1％/℃)，和/或(2)在约80℃每小时约2.2％的热降解平均值，以及在约94℃时每小时5.4％的热降解平均值，和/或者(3)在约50℃、1个小时内无可感知的荧光淬灭的温度敏感性被动染料时，显示这类性质的诸如磺酰罗丹明B的试剂可能是有利的。同样地，如果期望在约95℃和约50℃之间荧光或发光信号提高约60％，则可使用呈现这样的性质的试剂，例如荧光素。其它荧光染料的非限制性实例包括曙红B、乙基曙红和snarf-1。然而，可以理解，可使用各种其它条件敏感性试剂和/或温度敏感性被动染料。

本发明的一些实施方式还可包括至少一种模板核酸。此外，在一些实施方式中，模板核酸分子可包括任何数目的足以用作PCR模板的核苷酸，而不必是任何最小或最大长度。

根据本发明的至少一个实施方式的PCR混合物还可包括多个核酸引物(例如，至少一条正向引物和至少一条反向引物)。例如，某些示例性PCR混合物可包括一对(即两种、两类、两组和/或单独的序列限定的)核酸引物。在一些实施方式中，如本领域中已知，每种引物可经配置退火到模板核酸的单独链，并可以相同或不同的浓度提供。本发明的某些实施方式还可包含一种或多种dNTP。

本发明的一些实施方式还可包括核酸聚合酶，所述核酸聚合酶经配置以将一种或多种dNTP引入到核酸引物和/或初始核酸或链的末端。然而，可以理解，某些实施方式可包括RNA聚合酶、转录酶、逆转录酶、连接酶或经设置以执行预定的分子功能或其它功能的其它酶。例如，一些示例性实施方式可包括对照酶或取代酶，所述酶不被设置用以将dNTP或其它分子引入到引物和/或初始核酸或链上。

某些示例性实施方式可进一步包括PCR产物形成的定量指示物。此类指示物可包括结合dsDNA的染料或其它试剂。在至少一个实施方式中，PCR产物形成的定量指示物的光发射可不完全与温度敏感性试剂的发光重叠。例如，在某些示例性实施方式中，来自被动染料的信号可在光谱上与用于监测PCR进程的荧光通道分开，从而允许通过荧光监测目标的产生和温度。

此外，某些实施方式可包括一种或多种经设置用于标准化仪器光学的额外的试剂。例如，额外的荧光参考染料可包含在某些示例性实施方式中。在某些实施方式中，所述额外的试剂还可(或者备选地)直接和/或间接地指示混合物的量或混合物中添加的试剂。

在一些实施方式中，文中描述的PCR混合物、样本和/或一种或多种试剂可以提供在溶解在溶剂中的溶液中或者作为溶解在溶剂中的溶液而提供，和/或以其他液体形式而提供。在至少一种实施方式中，反应混合物、样本和/或一种或多种试剂以冷冻干燥、冻干、凝胶或以固态或半固态形式提供。实际上，此类物质可以任何形态或与其相容的物理状态提供。此外，试剂可以以任何组合提供，并且在某些实施方式中作为试剂盒提供，所述试剂盒包含用户必须的一些或全部物质、成分和/或试剂，然后加入一种或多种的反应特异性物质、成分和/或试剂，从而形成对成功PCR而言必需和/或充分的组成、配方或试剂列表。

一些实施方式还可包括使用所述条件敏感性试剂的说明书和/或其它说明。在某些实施方式中，所述说明可描述、详述、概述，或者提供测量、计算或者确定样本的温度、状态和/或物理或其它性质的方法，校准样本加热、热循环的方法，或者其它装置或系统，和/或用于所述条件敏感性试剂的其它相容的方法。

注意到，根据本发明的实施方式的PCR混合物可包括、引入或者包含在本文中公开的其它系统、方法和/或混合物中的性质、试剂、步骤、成分、部件和/或元件。

III.PCR系统

本发明的某些实施方式还可涉及或包括PCR系统，所述PCR系统经配置以使用或利用温度敏感性试剂的温度敏感发光作为(内部)样本温度的指标或指示物。

参照图1，显示了根据公开的示例性方面的示例性系统700的框图，其包括控制元件702、热循环元件708和光学系统710。

在至少一个实施方式中，所述系统可包括至少一个样本管714。在某些实施方式中，样本管可包括一个或多个样本712。示例性的样本712可包括PCR混合物，其经配置以允许和/或产生模板核酸的扩增。某些示例性实施方式还可包括至少一个样本模块或隔室716，其经配置以接收至少一个样本管714。样本管714可包括单独的、联排的、板式的或其它形式的一种或多种单独的样本容器，并且示例性地，可作为样本模块或隔室716提供，或者被样本模块或隔室716接收。

一个或多个实施方式还可包括样本温度控制装置718、720，其经配置以调控和/或调节样本的温度。此种样本温度控制装置可经配置以提高、降低和/或保持样本的温度。在一个实施例中，样本控制装置718包括加热系统，样本控制装置720包括冷却系统。示例性的样本温度控制装置包括(但不限于)加热和/或冷却模块、元件、交换器、线圈、加热器、冷藏室、细丝(filament)、感应加热器、辐射加热(包括IR加热)、Peltier装置、压力鼓风机(forced air blower)、处理器、通风孔、分布器、压缩器、冷凝器、水浴、冰浴、火焰和/或其它热量的燃烧或易燃形态、热敷、冷敷、干冰、干冰浴、液氮、微波和/或其它波发射装置、用于冷却的手段(means)、用于加热的手段、其它调控样本的温度的机件，以及/或者经配置以提高、降低和/或保持样本的温度的任何其它合适的装置。可以理解，在一些实施方式中，单个温度控制装置可同时用作加热系统和冷却系统。

PCR系统的某些实施方式还可包括光学系统710，其经设置检测样本712(或其一部分或试剂)发出的发光量和/或温度敏感性发光的量。此种光学系统710可包括光学部件，其经配置以查询样本712的发光。示例性的光学系统包括单通道荧光计和多通道荧光计。

至少一个实施方式进一步包括CPU 706，其部分地发挥样本温度控制或控制机件的功能。在某些实施方式中，样本温度控制或控制机件可通过连接730、732调节温度控制装置718、720，以基于样本发光和/或由其计算的任何值调节样本712的温度。例如，所述机件可响应于光学系统710和/或其光学部件或元件711检测到的具体的和/或预定量或水平的样本荧光而产生温度变化。所述机件还可(或可选地)调节温度控制装置718、720，以基于不同于发光的可测量和/或可确定的因素调节样本712的温度，所述因素包括样本温度、样本pH等，其可(至少)由样本发光计算和/或确定。此种机件可包括在检测和/或量化预定量或水平的发光(例如温度敏感性荧光)和/或其它可测量和/或可确定的因素后，使用一个或多个样本温度控制装置718、720。

在PCR系统700的至少一个实施方式中，CPU 706可执行指令，或者可经编程或经设置以基于样本发光或由其计算的值或参数操作、控制、执行或推进至少样本温度控制机件，或者运行或者执行经设计执行相同任务的软件。本文还包括经设置以运行和/或影响样本温度控制机件的人工、机械、电学和/或其它方法和/或装置。例如，本发明的范围包括机械或电触发，所述机械或电触发经设置响应于由光学系统710和/或光学元件711(或由其计算的参数)对预定量的样本发光的检测和/或量化，从而改变样本管或样本容器714在温度控制装置718和样本温度控制装置720之间的位置，所述温度控制装置718经设置提高样本712的温度，所述样本温度控制装置720经设置降低样本712的温度。CPU 706可从用户界面或终端704接受输入，或者提供输出到用户界面或终端704。

PCR系统的某些示例性的实施方式可进一步包括至少一种样本温度测量装置728或734。此种装置可包括温度计、热敏电阻、热电偶或其它能够测量样本温度的装置。样本温度测量装置728、734可经配置以直接测量样本内部温度(通过与样本712直接接触)或测量样本712的外部温度(未直接接触样本712)，并可通过连接726、732提供数据给CPU 706。此种间接接触可包括测量样本管或容器714，加热和/或冷却源例如温度控制装置718、720，样本管或容器接收部件或器皿，和/或样本温度的任何其它指示物的温度。在一些实施方式中，可从相关部件和/或元件的温度，例如加热或冷却模块或隔室，如样本模块或隔室716，推断样本的温度。还可以理解，在一些实施方式中，样本温度控制装置718、720可接受直接来自一个或多个温度测量装置728或734或光学系统710的输入，并可基于装置确定温度、热电偶确定温度或溶液温度中的一个或多个自动运行，而可经由或不经由CPU 706。

本领域中已知并且/或者通过引用合并于本文的美国专利申请号13/834,056中描述了示例性的PCR系统和/或热循环仪的示例性特征、组件、部件或元件的其它实例。

注意到，根据本发明的实施方式的PCR系统可包括、引入或者包含本文中公开的其它系统、方法和/或混合物中描述的性质、试剂、步骤、部件、组件和元件。

IV.测量温度的方法

本发明的某些实施方式可包括测量、计算或者确定样本的温度、状况或者物理或其它性质的方法。在至少一个实施方式中，所述方法可包括提供包含至少一种条件敏感性试剂的样本，所述条件敏感性试剂响应于至少一种刺激而发出光信号。在一些实施方式中，温度敏感性试剂发出的光信号的量可用于测量、计算或者确定样本的发光确定的温度。例如，所述温度敏感性试剂可包括磺酰罗丹明B、荧光素和/或响应于暴露于给定波长的光而发出温度敏感性荧光信号的任何其它荧光染料。

在至少一个实施方式中，可监测包含荧光温度敏感性染料的专门样本，以控制PCR过程中的循环。其它实施方式可包括直接加入荧光染料到PCR混合物，使得针对每个样本或区域同时单独进行实时扩增和用于循环控制的温度监控。这是有吸引力的，因为可在逐个循环的基础上进行孔与孔之间的变化和温度确认。在直接加入用于温度监控的荧光染料到PCR混合物中的情形下，由于光谱重叠，可能需要颜色补偿，这在通过引用合并于本文的美国专利号6,140,054中有进一步讨论。

可理解，提到单个样本、试剂或状况时仅为示例性的。某些实施方式可包括提供多个基本相同或不相同的样本。此类样本可包括样本重复、阳性和/或阴性对照样本、和/或独立的样本变异。相似地，根据某些示例性实施方式的样本可包括多种温度敏感性试剂。至少一种此类试剂可包括和/或代表对照试剂。此外，示例性地，样本可包括PCR混合物。

在至少一个实施方式中，所述方法可进一步包括充分刺激温度敏感性试剂以诱导发光信号。例如，实施方式可包括用具有足以诱导发射荧光信号的给定波长的电磁辐射或光刺激荧光染料。

在某些实施方式中，温度敏感性试剂发出的光信号的量以已知和/或可预测的方式作为温度和/或另一种条件或性质的函数而变化。某些实施方式还可(或可选地)包括确定此种温度敏感性变化。

某些实施方式还可包括测量温度敏感性试剂发出的发光信号的量。这种测量可包括检测和/或量化发出的光信号，使得可由其确定、计算和/或推导出样本和/或溶液的温度。因此，某些示例性实施方式还可包括至少作为所述条件敏感性试剂发出的光信号的函数而确定样本温度。

在某些示例性实施方式中，作为发光信号的函数确定样本温度可包括比较所测定的由样本和/或试剂发出的光信号的量与该试剂在各温度发出的光信号量的标准，以确定已知试剂发出测定量的发光信号时的温度。然而，可以理解，作为发光信号的函数对样本温度的确定可包括比较所测定的由试剂发出的发光信号的量与作为一些其它物理性质或其它性质(例如pH)(可作为温度的函数变化)的函数的试剂发出的发光信号的量的标准，以确定已知试剂发出测定量的发光信号的温度。

在至少一个实施方式中，可通过直接观察或者检测样本中存在的已知量的温度敏感性试剂发出的发光信号的量，测量样本的温度。在另一个实施方式中，可通过计算两种不同的荧光信号的比而确定样本的温度，其中，一种信号通常对温度敏感，第二种信号通常对温度不敏感。在一个这样的实施方式中，通过至少(a)观察或检测温度敏感性试剂在第一波长发出的光信号的量，其中来自所述温度敏感性试剂的信号在第一波长是温度敏感的，(b)观察或检测温度敏感性试剂在第二波长发出的发光信号的量，其中来自所述温度敏感性试剂的信号在第二波长对温度较不敏感，以及(c)确定发光信号在第一波长和第二波长的比，而计算温度。在另一个此类实施方式中，通过至少(a)观察或检测温度敏感性试剂发出的光信号的量、(b)观察或检测通常温度敏感的第二试剂发出的光信号的量，以及(c)确定两种试剂的发光信号的比，而计算温度。与观察或检测绝对荧光不同，因为是对来自至少两种信号的荧光比进行比较，所以在某些实施方式中样本中的温度敏感性试剂的量不必已知。

一些实施方式可包括通过至少一种其它方法测量样本的温度。例如，实施方式可包括测量样本的装置确定的温度和/或热电偶确定的温度。在某些实施方式中，试剂发光确定的温度和装置确定的温度或热电偶确定的温度之间的差异或变化为(或者已知为)小于或等于约1℃。例如，从诸如磺酰罗丹明B的温度敏感性试剂发出的荧光的量可用于计算或确定在样本的热电偶测量温度的1℃以范围内的PCR混合物的发光确定的温度。在某些实施方式中，发光确定的温度准确地和/或基本地反映了样本的(平均)内部温度。本文还包括具有大于或小于1℃的变动的温度确定。

在某些示例性实施方式中，原始的所测量的发光确定的温度可在被采用前进行处理或者用作样本的温度。此外，作为至少由所述试剂发出的发光信号的函数确定样本的温度还可包括用至少一个其它因子和/或所确定的温度对发光确定的温度进行平均化、因素化(factoring)、计算和/或其他处理。例如，以与试剂发出的光信号一致的方式确定样本的温度可包括确定原始(或经加工)的发光确定的溶液温度与热电偶确定的温度之间的平均值，或者引入发光确定的溶液温度与热电偶确定的温度两者，以获得计算的样本温度。

在本发明的至少一个实施方式中，可提供产生第二发光信号的第二试剂。在某些示例性实施方式中，所述第二发光信号可指示样本、试剂或混合物(例如来自荧光或发光信号均一化试剂)的数量或量。在一些实施方式中，所述第二发光信号可指示样本中存在的核酸的量。例如，第二试剂可包括PCR产物形成的定量指示物和/或其它DNA结合试剂。然而，可以理解，第二试剂还可(或可选地)包括阳性或阴性对照试剂或另一种条件敏感性试剂。

在某些实施方式中，所提供的样本可为PCR样本和/或混合物或PCR之后的样本和/或混合物。然而，可以理解，样本可为任何类型的生化、工业、商业、科学或其它实验或反应。简略地参照图1，CPU 706可向用户界面704输出来自第二试剂的信号的图，该图是针对使用温度敏感性试剂确定的温度绘制的。

在至少一个实施方式中，测量样本温度的方法可进一步包括刺激温度敏感性试剂以引起发光信号，测量样本发出的光，确定作为至少所述试剂发出的发光信号的函数的样本的温度，在多个时间点和/或温度通过至少一种其它方法和/或本文中描述的任何方法的任何其它步骤或部分测量样本的温度。例如，所述方法可包括在PCR循环或PCR过程中或之后的熔解的过程中在多个时间点测量由被激活(或刺激)的样本发出的荧光的步骤。然而，可以理解，本文还包括测量由未受刺激的样本发出的光。

在另一些其它实施方式中，来自温度敏感性试剂的发光信号被用于调整由生物或其它物质产生的熔解曲线。例如，PCR后可产生PCR扩增子的熔解曲线，并且在PCR扩增子的熔解过程中可基于温度敏感性试剂产生的发光信号调整针对熔解曲线所显示的温度。

示例性方法的多种实施方式都可用于关联荧光发射与溶液温度。在一个实施方式(称为单染料/单色)中，在特定的波长激发单个染料，并在单个光谱带中监测发射强度的变化，这在下面的通过引用整体合并于本文的文献中有进一步讨论：(1)J.Sakakibara,K.Hishida,M.Maeda,Vortex structure and heat transfer in the stagnation regionof an impinging plane jet(simultaneous measurements of velocity andtemperature fields by digital particle image velocimetry and laser-inducedfluorescence),Int.J.Heat Mass Transfer 40(1997)3163–3176；(2)F.Lemoine,M.Wolff,M.Lebouche,Simultaneous concentration and velocity measurements usingcombined laser-induced fluorescence and laser Doppler velocimetry:Applicationto turbulent transport,Exp.Fluids 20(1996)319–327；(3)F.Lemoine,Y.Antoine,M.Wolff,M.Lebouche,Simultaneous temperature and 2D velocity measurements in aturbulent heated jet using combined laser-induced fluorescence and LDA,Exp.Fluids 26(1999)315–323；和(4)P.Lavieille,F.Lemoine,G.Lavergne,F.Virepinte,M.Lebouché,Temperature measurements on droplets in monodisperse stream usinglaser-induced fluorescence,Exp.Fluids 29(2000)429–437。

其它实施方式在测量在两个(单染料/双色)或者甚至三个(单染料/三色)光谱带上的荧光时可使用比率，这在下面的通过引用整体合并于本文的文献中有进一步讨论：(1)P.Lavieille,F.Lemoine,G.Lavergne,M.Lebouché,Evaporating and combustingdroplet temperature measurements using two-colorlaser-induced fluorescence,Exp.Fluids 21(2001)45–55；(2)M.Bruchhausen,F.Guillard,F.Lemoine,Instantaneousmeasurement of two-dimensional temperature distributions by means of two-color planar laser induced fluorescence (PLIF),Exp.Fluids 38(2005)123–131；(3)P.Lavieille,A.Delconte,D.Blondel,M.Lebouché,F.Lemoine,Non-intrusivetemperature measurements using three-color laser-induced fluorescence,Exp.Fluids 36(2004)706–716；和(4)M.Bruchhausen,A.Delconte,Temperaturemeasurements in polydisperse sprays by means of laser-induced fluorescence(LIF)on three spectral bands,Atomization and Sprays 16(2006)599–614。

在一些实施方式中，通过在对温度不敏感的第二光谱带上测量的强度而对来自对温度敏感的光谱带的测量的荧光强度进行均一化，目的是提高温度准确性。其它操作在两个不同的激发波长(双激发单染料/单色)激发单个染料(通常是对pH的变化敏感的一种染料)。然后，如在通过引用整体合并于本文的J.Han,K.Burgess,Fluorescent Indicatorsfor Intracellular pH,Chem Rev.110(2010)2709–2728中进一步讨论的，使用在相同光谱带上测量的发射强度计算比率。

注意到，根据本发明的实施方式测量样本的温度、状况或物理或其它性质的方法可包括、引入或者包含在本文中所公开的其它系统、方法和/或混合物中所述的性质、试剂、步骤、部件、组件和/或元件。

V.校准装置的方法

本发明的某些实施方式还可涉及校准样本加热、热循环或其它装置或系统的方法。此类方法可包括提供包含至少一种条件敏感性试剂的校准样本，所述条件敏感性试剂响应于刺激而发出光信号。所示校准样本可作为以下而提供：悬浮液、溶液和/或与本文中公开和描述的方法相容的样本的其它形态或物理状态。

一些实施方式还可包括刺激条件敏感性试剂，以引起从其发出条件依赖性或条件敏感性发光信号。在某些实施方式中可能需要合适的定性和定量试剂刺激。例如，对于诸如磺酰罗丹明B的示例性的荧光试剂，电磁辐射可为适合定性的刺激形式，而一定量的具体波长(例如575nm)或范围(例如470～480nm)和/或长度的暴露于这种电磁辐射可能是对于有效的试剂刺激的合适的定量因子或参数。

某些实施方式还可包括测量从条件敏感性试剂发出的光(或发光信号)的量。再次参照图1，这样的测量步骤可涉及光学系统710、光学元件711或其它发光测量或检测部件、元件或装置，其经配置以测量发光信号的发射。

在至少一个实施方式中，校准装置的方法还可包括作为(至少)条件敏感性试剂发出的光信号的函数而测量和/或确定发光确定的温度。

某些示例性实施方式还可包括测量装置确定的温度。在某些实施方式中，通过根据外部来源或间接来源的推导来计算样本的装置确定的温度。在某些示例性实施方式中，可以对其中放置了样本712和/或样本管或容器714的样本模块或隔室716的温度进行测量，任选地针对已知或疑似变量或差异进行调整，并被采用作为样本的装置确定的温度。

在某些实施方式中，所述方法还包括调整装置和/或装置确定的温度，以(至少)反映发光确定的温度。这种步骤在某些示例性实施方式中可称为校准步骤。在至少一个实施方式中，调整装置和/或装置确定的温度还包括采用原始的或经处理的发光确定的温度。然而，可以理解，调整装置和/或装置确定的温度以反映发光确定的温度还可以(或者可选地)包括对一个或多个发光确定的温度和/或一个或多个由其他测定或确定的温度(例如，内部；通过与样本直接接触)进行平均化或他因子化。本领域中已知或如通过引用整体合并于本文的美国专利申请公开No.2013-0157376中描述了由多个值和/或数据点测量、确定、因子分析和/或计算温度的其他方法。

应注意，根据不同于发光确定的温度的因素和/或除了发光确定的温度之外的因素校准和/或调整装置确定的温度仍可构成对装置确定的温度的调整，以反映或表示发光确定的温度，并且/或者以与发光确定的温度一致的方式。因此，全部此类(或相似)方法或方法的步骤可包括以与发光确定的温度一致的方式调整装置确定的温度。

在某些示例性实施方式中，所述调整步骤可包括调整温度控制装置718、720的输出，以提供更多的加热和/或冷却。该调整步骤可包括对一个或多个温度控制装置的单个调整，或者可包括对该装置(示例性地，例如热电Peltier)的一个或多个元件的多个调整。所述调整步骤可包括手动进行的步骤和/或在CPU 706、计算机或其它硬件和/或软件的帮助下自动进行的步骤。

注意到，根据本发明的实施方式校准样本加热或其它装置的方法可包括、引入或者包含本文公开的其它系统、方法和/或混合物中描述的试剂、步骤、组件、部件和/或元件。

VI.荧光反馈的方法

本发明的某些实施方式还可涉及使用发光信号调整PCR前或PCR过程中样本加热用、热循环用或其它的装置或系统的方法。这类方法可包括提供包含至少一种条件敏感性试剂的PCR样本，所述条件敏感性试剂响应于刺激而发出光信号。所提供的反馈样本可为悬浮液、水溶液或者与本文公开或描述的方法相容的样本的其它形式或物理状态。

在一个实施方式中，热循环不在装置确定的温度或热电偶确定的温度之间发生，而是热循环发生在发光确定的温度之间，并且发光信号用于确定所编程的“保持”期的开始或结束，和/或者触发变温到热循环的下一个温度。

通过改良LightCycler 24构建另一个示例性实施例。LightCycler 24为快循环实时PCR仪器，其使用空气用于温度控制。LightCycler 24经改良以允许直接比较两种循环控制方法：(1)通过动力学匹配的外部热电偶的控制；(2)通过荧光的控制。虽然单染料/双色方法和额外的多染料和多通道方法也包括在本公开内，但是通过单染料/单色方法获得了荧光对温度的控制。荧光对温度的控制提供了相当的或改善的热循环控制。虽然LightCycler 24用作最初的仪器，预期所述方法可用于任何实时热循环仪。

在示例性实例中，基于荧光的温度(或由其计算的荧光值)被转变为电压当量(voltage equivalent)，以取代用于热循环控制的标准的热电偶电压输入。换句话说，使用样本荧光(或荧光确定的温度)而非所测量的温度(即，热电偶和/或仪器确定的温度)来控制热循环。示例性地，以荧光信号的函数确定样本温度。重要地，将样本发出的荧光信号的测定量的电压当量与该试剂在不同温度发出的荧光信号量的校准标准进行比较和/或协调。因此，使用校准标准来提供温度点，已知试剂在此温度点发出测定量的荧光信号，从而使荧光信号与样本温度相关联。可理解，基于荧光的温度还可直接使用，或被转变成电压当量，以取代针对热循环控制的标准仪器温度相关的电压输入。

图2显示了基于荧光的温度循环控制的示例性实施例的示意图。在某些实施方式中，示例性地，在模块818中的样本容器(未显示)中荧光染料808被来自示例的发光二极管(LED)812或其它合适的光源的光810激发。光810激发来自分别包含在样本808和808a中的荧光染料的发射814、814a。可通过示例性光电倍增器(管)(PMT)816或其它荧光检测仪器分别检测来自样本808和808a中包含的荧光染料的发射814、814a的强度。在一些实施方式中，激发810和/或发射814路径可被过滤通过模块818。

该方法的某些示例性实施方式包括初始校准，以确定参考样本808的参考温度826，其在后续循环过程中可用于计算样本808a的基于荧光的温度828。在初始校准的过程中，可记录来自样本808的参考荧光强度值820和温度测量值824(通过热电偶822)，并用于计算基于荧光或荧光确定的参考温度826，所述参考温度826可与由之计算和/或推导(例如以创建标准)其的荧光强度820相关联。然后，这些计算的参考温度或值826(或关联荧光强度与它们各自的温度的标准)可被用于控制模块818的温度，示例性地通过在样本808a的PCR过程中触发下一个热循环阶段。例如，在PCR过程中对应于已知的参考温度826的示例性荧光发射814a(来自样本808a)可以通过PMT 816检测并且用于：(1)确定样本的(基于荧光)的温度828；(2)确定温度循环中的循环点；和/或(3)触发或引起向热循环谱的另一个阶段的变化。

然而，可以理解，在循环中还可使用热电偶确定的温度或温度读数。改进的LightCycler 24可接受来自标准热电偶和基于荧光的等价物两者的电压输入。因此，在某些实施方式中，标准热电偶可放在相邻的样本、孔或毛细管中，用于比较或者用于确定参考温度值。

示例性地，可通过缓的坡变(例如以0.05℃/秒～0.1℃/秒的目标速率)转变或步骤以及保持转变而连续获得校准曲线。在一个实施方式中，在设定的温度增量(0.1℃～1℃)于每个保持期(1～10秒)的终点记录一个点。示例性的仪器可能能够在设定温度保持达10秒，以确定参考值和在循环中的延长。

示例性仪器还可能能够在三种设定的温度(变性、退火和延长)之间循环足以完成反应的循环数。在一些实施方式中，示例性地，当使用2个触发温度(变性和退火/延长)时，35个循环的PCR反应可在约3分45秒内完成。光学配置可允许至少两种染料的激发和检测(一种用于实时监测，一种用于温度控制)。可在一个、两个、三个或更多个波长监测用于温度控制的染料，以提供改善信噪比的比率。在一些示例性实施方式中，激发可为连续的或间歇的。例如，在一个实施方式中，激发光在激发实时监测染料的激发波长以及激发温度控制染料的激发波长之间间歇性闪光。可以理解，两种波长之间的激发频率应足够高，使得可实现温度控制，而没有显著误差。例如，如果转变的速度为10℃/秒，那么在100Hz激发温度控制染料的波长的闪光应获得约0.1℃的分辨率。

为确定本文中所述的方法是否导致温度控制改善，可比较通过以下方法控制的热循环：

方法A)外部热电偶

方法B)荧光—单染料/单色方法，其中，单染料在特定的波长被激发，并且在单光谱带中监测发射强度的变化。

方法C)荧光—单染料/双色方法，其中，通过在对温度不敏感的第二光谱带上测量的强度对来自对温度敏感光谱带的测定的荧光强度进行均一化。

应注意方法B和方法C仅为示例性，还包括使用荧光控制温度的其它方法，包括在两种不同的激发波长(双激发单染料/单色)激发单个染料(通常是对pH的变化敏感的一种染料)的操作。然后，可使用在相同的光谱带上测量的发射强度计算比率。其它方法用两种染料(双染料/双色)配置实现了均一化，其中使用来自具有相似或相反的温度敏感性的另一种染料的信号对温度敏感性染料均一化。

Cq值可用作温度准确性(尤其是在退火时)的良好的指示。如果退火温度太低，那么引物可非特异地杂交。在这样的情形下，Cq值可显著地低，但是可能已经扩增了错误的产物。可选地，如果退火温度太高，引物与DNA杂交、降低效率以及推进Cq到后面的循环中可能存在困难。如果增强了温度准确性，与方法A或方法B相比，方法C可产生最小的平均Cq值，方法C产生了正确的产物。

还可通过根据实时曲线的Cq值再现性而确定温度的准确性。针对通过方法A、B和C控制的循环，可计算Cq值的标准偏差。考虑到潜在的移液不确定性，Cq值可具有不超过0.5个循环的标准偏差。

步骤3中由方法A、B和C扩增的样本可熔解，以确定产物的纯度。预测的熔解曲线可用于比较。这些比较(熔解温度、形状和峰的数目)可证实较小的Cq值产生自循环过程中增强的溶液温度准确性，而非非特异性扩增的结果。

在某些实施方式中，当与方法A或方法B比较时，来自方法C的基于荧光的溶液温度可与物理插入的热电偶做出的记录进行更紧密地对齐(align)。作为定量测量，针对循环1、10、20、30，在各自的三个过渡期(变性至退火、退火至延长以及延长至变性)的过程中，比较平均溶液-热电偶温度差异(以及标准偏差)。可计算每种方法的值，并且方法C可证明针对全部循环的全部温度转变的最小的平均值和标准偏差。

VII.使用针对加入的对照的比率

存在有许多染料和激发/检测配置，用于基于荧光变化确定溶液温度。这些方法落入不同的类别。每种均可用在本发明的范围内，并且下面简要讨论了每一种的示例性例子。

单染料/单波带方法

单染料/单波带方法可使用温度敏感染料在设定波长的激发。可监测跨越温度在具体波长带(wavelength band)上检测到的发射强度的变化。由于在受激态寿命过程中发生的更显著的碰撞淬灭可减小量子产率，所以当温度升高时，染料的荧光强度可减小。为获得荧光—温度关联性，可在平衡温度(T)和相应的强度(I)产生校准曲线。这些数据以及参考温度(T_参考)和强度(I_参考)测量将实现校准常数C的确定。C值等于通过对与作图而形成的直线的斜率。

当校准常数与参考测量及实时荧光读数结合时，可使用下面的公式计算平均溶液温度：

[公式1]

应理解，因为测量基于绝对强度，所以单染料/单波带方法在准确性方面受限。在诸如激发强度、染料浓度和样本体积的变量不能保持足够恒定的情况下，它们的影响可大幅地降低溶液温度测量的准确度。尤其是在激光诱导的荧光的情况下，入射激光强度的波动可产生不准确的温度测量。这已经产生了使用比率的替代方法。使用比率可自归一化，并可大部分可能解释了可能发生的激发强度的变化和样本体积和染料浓度的改变。

单染料/双波带(two band)方法

使用比率可以使实验变化减缓，从而提高基于荧光的溶液温度测量的准确度。单染料/双波带方法可使用单个荧光染料的两种不同的光谱带：一种可对温度敏感，另一种可通常对温度不敏感。通过获得在两个光谱带记录的强度之比而实现自归一化。在该情形下，计算两个校准常数：针对每个光谱带各一个。可减去单个常数，以确定最终的校准常数C_F。与单波带方法相同，可如公式2所示使用参考温度和强度测量。

[公式2]

其中，

R(T)为在测量温度时的比

R(T_参考)为在参考温度的比

T_参考为参考温度，

C_F为最终的校准常数。

单染料/三波带方法

为了改善在较长的光路长度和/或在高染料浓度下的温度准确度(其中，荧光的重吸收可能是显著的)，已经开发出了单染料/三色方法，并可被使用，其中，使用来自3个光谱带的数据进行多个比率计算。

比率式(ratiometric)pH指示物

荧光pH敏感性染料可用作单染料/双波带或其它方法的扩展。通过单激发/双发射或双激发/单发射配置的至少任一种，这些染料可被相似地自归一化。

PCR混合物可包括缓冲液，以有助于灵敏度(通过优化聚合酶的活性)和特异性(通过增强引物/DNA杂交)。通常使用的示例性的缓冲液为Tris，因为它很好地匹配了针对Taq聚合物的最佳pH范围(在80℃下为7～8的pH单位)。Tris缓冲液的pH还可依赖于温度，从而允许保持用于PCR的最优pH范围，同时使温度的变化与观察到的pH的变化相关联。

由于溶液的pH跨越温度变化，所以pH敏感的荧光染料获得了不同的分子形式(由于进行性解离)。分子的不同形式可呈现不同的发射光谱，最显著为在给定波长下强度的变化。在显著特征(例如在设定波长下的光谱峰)的强度之比允许染料的自归一化。然后，当加入pH敏感性荧光染料到反应混合物中时，可监测温度的变化。

VI.实施例

除了以上讨论的示例性实施方式，下面的示例性实施例和结果可用于使本领域普通技术人员能够制造和/或使用本发明。重要地，下面的实施例和结果仅为示例性，而非旨在限制本发明的范围。此外，当实施本发明的某些实施方式时可观察到不同的结果。因此，下面的结果不旨在限制本发明的范围。

实时PCR仪器

根据可得性以及样本的形式，使用了几种实时PCR仪器。这些仪器中有四种为基于收纳袋的仪器：(Idaho Technology)、 (RocheApplied Science)、(Roche Applied Science)和(Qiagen)。此外，该研究还使用了5种基于板的仪器：(Roche AppliedScience)、Eco^TM(Illumina)、iCycler(Bio-Rad)、CFX96^TM(Bio-Rad)和StepOnePlus^TM(LifeTechnologies)。

不同仪器在温度循环期间收集荧光的能力有显著不同。仪器自然地分成四类中的一类。类别I的仪器最灵活，并在加热、冷却和温度保持期间可持续获得荧光。类别II～IV的仪器更受限。在温度循环期间，类别II和类别III的仪器仅允许在每个温度保持采集荧光一次，而类别IV的仪器每个循环仅获取一次。在温度变换期间，类别II的仪器可收集加热或冷却曲线，而类别III和类别IV不仅限于熔解曲线。

研究了4种类别I的仪器、3种类别II的仪器以及类别III和类别IV的仪器各一种。除了iCycler(卤钨灯)和(氙灯)外，全部的仪器均使用LED激发。典型的激发范围为470～480nm，例外为Bio-Rad仪器在大约575nm激发用于磺酰罗丹明B的更有效的激发。检测的形式包括CCD相机(iCycler、和Eco^TM)、PMT以及光电二极管(全部其它)。检测的范围通常在600～650nm。然而，Eco^TM(505～545nm)上唯一的熔解通道与磺酰罗丹明B不相容，因此荧光素用作温度敏感性染料。虽然在上研究了大的体积范围(5～70μL)，但是在大多数的仪器上使用5μL或10μL的样本。毛细管使用2μL的油覆盖层，和基于板的仪器上的0-20μL/孔。PCR循环时间在基于收纳袋的LightCyclers(18～27秒/循环)比在其它仪器(66～120秒/循环)快得多。表1(下面)列出了针对实时仪器的最相关的特征和实验条件。

表1

^a可能的最快连续获取速率为0.57℃/秒(针对单个颜色编程为1次获取/℃)。

^b每个温度增量或步骤获取荧光一次。

^c荧光获取可为连续的或“步骤和保持”。

试剂

在示例性的“模拟”PCR溶液中测量荧光，所述“模拟”PCR溶液不含聚合酶但包含(Sigma-Aldrich)50mM Tris(pH 8.3)、2mM MgCl₂、0.2mM的每种脱氧核苷酸三磷酸(Roche)、500μg/ml的牛血清白蛋白(Sigma)和0.08％(v/v)的甘油。对于除Eco^TM外的仪器，使用0.6mM的磺酰罗丹明B。对于Eco^TM仪器，使用4μM的荧光素(Matheson,Coleman andBell)代替磺酰罗丹明B，用于专用熔解通道的光学相容性。然而，可理解，如文中公开或本领域中已知的，根据本发明的对照和/或“模拟”PCR溶液，以及PCR混合物和/或其它样本混合物可在某些试剂组成和浓度方面变化。

聚合酶链反应

示例性地，在某些实例中使用rs1799963范围内的F2基因的3’-非翻译区的74bp产物，以检测PCR的磺酰罗丹明B抑制。反应包含上述模拟PCR溶液，并加入0.4U/10μl的KlenTaq聚合酶(AB Peptides)、50ng/10μl的人基因组DNA、0.5μM的引物GGTTCCCAATAAAAGTGACTCTAG(Seq.ID No.1)和CTGAGCCCAGAGAGCTGC(Seq.ID No.2)和3mMMgCl₂。在(LS-32)热循环仪(BioFire Diagnostics)中以10μL的体积在玻璃毛细管中进行PCR。起始变性在95℃进行30秒，然后35个循环的95℃0秒、60℃0秒和74℃2秒。

在其它实例中，使用下面的引物扩增三种指定的单核苷酸多态性(SNP)–rs876724、rs917118和rs763869：rs876724CCACTGCACTGAAGTATAAGT(Seq.ID No.3)和TTAGCAGAGTGTGACAAAAAA(Seq.ID No.4)、rs917118AAGATGGAGTCAACATTTTACAAG(Seq.IDNo.5)和GATGACTGAGGTCAACGAG(Seq.ID No.6)和rs763869AGGATGTTTGTTTATATTATTTCTAACTCA(Seq.ID No.7)和CTACTCCCTCATAATGTAATGC(Seq.ID No.8)。每10μL的反应物包含50mM的Tris-HCl pH 8.3、2.0mM Mg²⁺、200μM的每种dNTP、1×LCGreen Plus(BioFireDiagnostics)、具有64ng的抗Taq抗体(eEnzyme)的0.4U的KlenTaq1(Ab Peptides)、0.5μg的BSA、0.5μM的引物和50ng的基因组DNA。在95℃初始变性1分钟后，在改进的LightCycler上的扩增条件为85℃10秒和60℃10秒，35个循环。为证明使用更快的方案使用的基于荧光的温度控制的效用，用“0”秒的保持时间扩增rs917118靶标。通过提高引物的浓度5倍(终浓度2.5μM)而有助于使用“0”秒保持时间。在95℃初始变性1分钟后，进行35个循环的83℃“0”秒和61℃“0”秒。在全部示例性的实例中，通过基于荧光的温度测量控制热循环。

荧光染料温度敏感性

在具有氙激发、光栅上的光谱色散(405～590nm)以及聚焦到光纤上的自定义多色荧光计上(delta RAM,Photon Technology International)检测22种荧光染料的温度敏感性。光纤照亮了置于加热单元(HR-1,BioFire Diagnostics)内的玻璃毛细管的末端(LightCycler,Roche Applied Science)。荧光发射被相对毛细管呈正确角度的另一种光纤收集，传递光到CCD分光仪上(DV420-OE,Andor Technology)，收集400～850nm之间1024bins。J-型微热电偶(5SRTC,Omega)被插入到样本毛细管中，用于物理温度测量。

在上述“模拟”(无聚合酶)PCR溶液中测试荧光染料。表2中列出了每种染料的终浓度以及激发波长。25μL的样本体积被从45℃加热至95℃(以不连续的10℃增量，每个步骤平均100个点)。加热过程中步骤间的坡变速率为大约0.4℃/秒。然后，记录整个发射光谱，并计算荧光的变化倍数(45～95℃)。

表2

¹染料含量为75％。²染料含量为95％。

³在特定波长随温度升高时的荧光动态以粗体(荧光提高)、斜体(荧光减小)或常规字体(可变化的)表示。呈现最大荧光变化处的波长加下划线。

⁴列出的浓度不解释染料的百分比含量。当染料含量特定时，这些浓度将较小。

⁵发射峰波长为针对每种染料的所有检测的激发波长/浓度组合的平均。

⁶从45℃至95℃荧光最大的变化倍数(在加下划线的激发波长)。显示了在45℃和95℃测量之间增加(粗体)或减小(斜体)的荧光。

在多个激发波长和温度记录22种染料的光谱的轮廓(数据未显示)。对于每种染料，表2显示了在从45～95℃的加热过程中荧光变化的倍数，以及在加热过程中发生的荧光的总趋势(即提高的(黑体)或减小的(斜体)强度水平)。全部染料的荧光的平均变化倍数为0.74(±0.45)。虽然曙红B在85℃和95℃的荧光水平的差异有限，但是在530nm激发的曙红B呈现荧光的最大变化倍数(荧光减小了12.48倍)。图3显示了在530nm激发的磺酰罗丹明B(单钠盐)的示例性实例。

图3描述了以10℃的间隔保持在范围从45℃(x线)至95℃(三角线)的温度下的25μL样本体积中的(2,400μM)磺酰罗丹明B(单钠盐)的温度敏感性谱图。具体地，样本保持在45℃(x线)、55℃(实线)、65℃(点划线)、75℃(短划线)、85℃(点线)和95℃(三角线)。可清楚地辨别高温度敏感性的区域(接近580nm)与低温度敏感性的区域(接近525nm)。

选择呈现至少2倍的荧光变化的染料用于更深入的研究。将升高温度时荧光呈现可变趋势或者在高温(85℃至95℃)时荧光强度具有最小差异(5％)的染料排除在进一步考虑之外，虽然理解此类染料可用于某些实施方式中。进一步研究乙基曙红、部花青540(merocyanine 540)、罗丹明B、snarf-1、磺酰罗丹明B(酸式)和磺酰罗丹明B(单钠盐)。

为确定发射光谱的温度敏感和温度不敏感区域，光谱数据显示为波长范围内对数尺度上的比(在45℃的发射强度/在95℃的发射强度)(参见图4)。例如，图4描述了在490nm激发的磺酰罗丹明B(单钠盐)在45℃和95℃之间的温度敏感性，示例性地，光谱数据显示为范围为400nm至700nm的波长范围内在对数尺度上的比(在45℃的发射强度(e.i.)/在95℃的发射强度(e.i.))。应理解，低的温度-敏感性的区域具有接近于0的比，而高的温度-敏感性区域具有最远离0的值。鉴别了每种染料的具有最大温度-敏感性和不敏感性的带并在表3中列出。

表3

¹样本从45℃加热至95℃，然后冷却至45℃。在发射峰波长计算数值。第二测量的荧光除以第一测量的荧光。因此，1的数值表示没有发生降解。

荧光染料降解

还使用上述用于评价温度敏感性的自定义多色仪器评价在单个加热和冷却循环后染料降解的量。在样本温度达到95℃后，冷却样本至45℃(使用被动冷却)，并进行另外的光谱测量。

对于大多数染料，甚至在单个加热和冷却循环后，染料降解引起荧光的降低(参见表3)。示例性地，在470nm激发的磺酰罗丹明B的数值为1，表示未发生降解。乙基曙红(在455nm激发)和部花青540(在470nm激发)的值分别为0.76和0.41，显示这两种染料的更多降解。

在熔解过程中基于荧光的温度和热电偶温度的比较

进一步研究针对温度呈现最大的敏感性的6种染料(参加表4)。表4中详细说明了染料浓度和激发波长。根据以10℃的增量从45℃至95℃获得的温度和荧光数据，计算每种染料的校准常数。使用具有30μL终体积的第二样本(25μL样本，具有5μL的油覆盖层)，利用在50℃的初始保持期间确定参考温度和强度值。然后，以大约0.05℃/秒的速率加热样本到95℃。使用磺酰罗丹明B(酸式)针对单染料/单色和单染料/双色两种均计算基于荧光的溶液温度。如通过引用全文合并于此的P.Lavieille,F.Lemoine,G.Lavergne,M.Lebouché,Evaporating and combusting droplet temperature measurements using two-colorlaser-induced fluorescence,Exp.Fluids 21(2001)45–55中的描述，计算使用单染料/双色方法的溶液温度。比较基于荧光的温度与热电偶的读数。因为磺酰罗丹明B(单钠盐)在加热和冷却后呈现最强的温度敏感性以及最可重复的荧光，所以其用于热循环控制，并测试除了Eco^TM以外的全部仪器。

表4

¹基于荧光的温度和热电偶温度之间的绝对温度差异。

²从基于荧光的温度减去热电偶温度。

使温度与被动染料荧光关联

为了关联荧光强度与温度，通过缓慢加热在每种仪器上产生校准曲线。为了限制染料的降解，50～95℃的范围在少于45分钟内完成。使用0.018～0.1℃/秒的速率。由于快的热平衡、单个样本获取和高的数据密度(44～122个点/℃)，在收纳袋仪器上使用最快的速率(0.1℃/秒)。相似速率(0.05℃/秒和0.091℃/秒)，但具有降低的数据密度(11点/℃和10点/℃)分别是和Eco^TM。全部其它仪器落入1.8～2.5点/℃的较慢数据获取所需的较低速率的第三范围(0.018～0.031℃/秒)。

在、2.0和480上检查可能的三个偏差来源：仪器偏移、热降解和荧光淬灭。为检查仪器偏移(drift)和染料的热降解，温度保持在50℃、80℃和94℃一个小时。每分钟一次地照亮样本并获得荧光。为检测荧光淬灭，在连续或间歇(每分钟一次)照明期间温度保持在80℃并收集数据1小时。

由荧光计算溶液的温度

先前已经模式化荧光发射，关联荧光强度与浓度或温度(取决于哪个变量保持恒定)。染料的荧光随温度上升而减小是由于激发状态的淬灭以及降低的量子产率。温度可通过校准常数与荧光关联：

在温度T(凯氏度数)测量荧光强度I，并关联到温度敏感性试剂在参考温度(Tref)的参考荧光强度(Iref)。在实验上，ln(I/I_ref)相对于(1/T-1/T_ref)作图形成直线，斜率为C，截距为0。校准常数取决于荧光分子在具体溶剂中的物理特性。用于校准常数确定和熔解曲线分析的参考温度为50℃，用于每个仪器上的PCR循环实验为55℃。使用C、参考温度和参考荧光，根据荧光确定溶液温度：

根据每种仪器的性能获得荧光：连续地，在温度保持时，或在转变(加热和/或冷却)期间。仪器特异的校准常数用于将荧光转变成溶液温度，用于比较仪器显示的温度。校准常数可用于提供判断试剂/染料和/或光学的总的温度敏感性的定量方法。较高值的校准常数可关联于较高的温度敏感性和系统准确度。除非另外规定，循环期间在每个仪器上使用最快的转变速率。然而，可以理解文中讨论的等式、变量和运算仅为示例性的，并且多种参考温度、参考荧光强度和/或其它变量、等式和/或运算均可用于由荧光发射计算和/或确定温度。

微型热电偶测量

当允许物理仪器配置时，还用具有调节、数字化和显示(USB-TC01,NationalInstruments)的J-型微热电偶(5SRTC,Omega)监测样本的温度，以与溶液和仪器的温度关联。本领域中已知其它热电偶并且包含在本文中。

熔解曲线分析

使用仪器和溶液温度两者在LC480上获得熔解曲线。2μg/ml的噬菌体λDNA(NewEngland BioLabs)和1XPlus(BioFire Diagnostics)包含在模拟的PCR溶液中。在从60～95℃加热样本期间通过荧光同时监测DNA熔解(LCGreen Plus，在450nm激发，在500nm发射)和温度(磺酰罗丹明B，在558nm激发，在610nm发射)。以2次获取/℃(0.14℃/秒)或以40次获取/℃(0.01℃/秒)收集数据。磺酰罗丹明B荧光转变为温度，并且使用溶液温度或仪器温度显示负导数熔解图。

基于荧光的温度循环控制

使用上述改良的LightCycler 24证明了使用荧光确定的温度控制循环的温度或热循环。如图5A-5C)中例示，在使用具有10秒的保持时间的基于荧光的热循环控制的扩增后(定量循环(Cq)值是24)，对三种指定的单核苷酸多态性(SNP)rs876724(图5A)、rs917118(图5B)和rs763869(图5C)进行基因分型。在95℃持续1分钟的初始变性后，扩增条件为85℃10秒和60℃10秒共35个循环，产生15分钟46秒的操作时间。使用背景去除的量子方法的熔解分析(参见通过引用以整体合并于本文的美国专利申请No.61/872,173)鉴别全部的基因型，其中针对全部靶标均可清楚区分全部3种基因型(野生型(点线))、变异(短划线)和杂合子(实线)(参见图5A～5C)。

rs917118靶还用于证明在“0”秒的保持时间下的成功扩增，仅需要3分钟45秒来完成35个循环(参见图6A～6B)。虽然Cq提高到28(参见图6A)，但产生了能够清楚地鉴别全部3种基因型的有力结果(参见图6B)。图6B描述了使用背景去除的量子方法分析的负导数熔解曲线。示例性地，全部3种基因型(野生型(点线))、变异(短划线)和杂合子(实线)可清楚的区分。

示例性结果

应注意文中公开的结果仅为示例性，并且当实施本发明的某些实施方式时可观察到不同的结果。因此，下面的结果不旨在限制本发明的范围。

在某些示例性实施方式中，为了使绝对荧光用作温度监测物，仪器和试剂/染料应随时间基本稳定。虽然许多实时PCR仪器使用加热的盖子而非油覆盖层来限制蒸发和浓缩，使用油可获得比不使用油更一致的荧光读数(参见图7～8)。油覆盖层可在多个循环范围内稳定荧光，尤其是在保持时间的过程中和在温度极限下(参见图7)。

在示例性实例中，70μL的反应体积与具有20μL的油覆盖层的50μL的体积相比较。图7中例示的数据包括0.05℃/秒的初始加热和冷却曲线，之后是坡变速率为0.57℃/秒、0.11℃/秒和0.29℃/秒的55℃至95℃之间的三个循环。实线和短划线分别表示了缺失和存在油覆盖层。点线仅用于垂直对齐。没有油时，荧光每小时减小约8％，并存在短期的异常，这些是可影响通过荧光测量溶液温度的作用。

在通常用于熔解曲线分析的温度坡变过程中还可注意到认为产物的荧光。例如，图8描述了在仪器上加热的过程中的(磺酰罗丹明B)荧光，具有0.05℃/秒的示例性坡变速率。短划线表示10μL的样本体积，无油覆盖层，点线表示8μL的样本体积，具有2μL的油覆盖层，实线表示5μL的样本体积，具有5μL的油覆盖层。当在导数图上显示时，对于具有太少油覆盖层或不具有油覆盖层，观察到了可能误认为是PCR产物的波状曲线。只有具有合适的油覆盖层的那些样本显示了荧光随时间和温度平稳减小。示例性地，油覆盖层可改善任何和/或全部仪器上的结果，虽然变化在毛细管仪器上可能最小。然而，应理解，油覆盖层仅为示例性的，并且其它技术可用于稳定荧光。

除了蒸发和/或浓缩，影响荧光的其它潜在的假象可包括仪器偏移(有时指仪器的“变热”)、染料的热降解和荧光淬灭(现在依次解决其中的每一个)。

对于一些仪器，虽然可观察到一些初始的仪器偏移，但是这可通过“升温”仪器(示例性地，20分钟)而大幅地减小。例如，在某些示例性实施方式中，当在50℃、80℃或94℃温育样本时，在三种不同的仪器上，在前20分钟观察到达+/-4％的小的仪器偏移(参见图9A～9C和图10A～10C)。20分钟后，荧光随时间的任何变化可变得相对线性。

此外，在至少一个实施方式中，在某些(较低)的温度下不可观察到温度敏感性试剂的大幅热降解，而在其它(较高)温度可观察到可测量的量的热降解。例如，图9A～9C显示了在某些示例性实施方式中，对于 (实心圆)、(实心的正方形)和(实心的三角)的一种或多种，在仪器平衡后，平均的磺酰罗丹明B荧光在50℃可基本稳定(图9C)，在80℃可减小约2.2％/小时(图9B)，和/或在94℃减小约5.4％/小时(图9A)。示例性地，由于仪器平衡，在前20分钟(虚线)荧光是变化的。20分钟后，荧光以依赖于温度的速率减小。在每次实验之间关闭仪器1个小时。在全部仪器范围内，荧光的平均变化在50℃小于约1％/小时，在80℃为2.2％/小时，在94℃为5.4％/小时。因此，在某些条件下可发生染料的微小热降解，并且可同时为温度依赖性和时间依赖性的。

在某些实施方式中，可通过快速的循环使该依赖于温度的降解减少，以使变性和总的循环时间最小化(示例性实施方式，其中温度的荧光监测非常有用)。用于温度的荧光评估的另一个选项为使用荧光比率，使得对于绝对荧光稳定性的要求没有如此严格。

在某些示例性实施方式中，可能没有观察到实质的荧光淬灭(示例性地，对于磺酰罗丹明B)。例如，图10A～10C显示了在(图10A)、(图10B)和(图10C)上80℃超过1个小时内没有可感知的磺酰罗丹明B的荧光淬灭。在一些实施方式中，在仪器平衡后，荧光以约2.2％/小时减小，而无论样本是否被连续照亮(实线)或每分钟仅照亮一次(实心的三角)。该减小与单独的热降解一致(参见图9A～9C)，无明显的和/或是显著的促进荧光淬灭。在典型的循环中，磺酰罗丹明B荧光在示例性的毛细管仪器上在延长时(运行时间17分钟)减小0.1％的延长，与之相比在示例性板仪器上减小0.7％(运行时间60分钟)。在一个示例性实例中，在上由于与连续获取数据有关的编程限制，在1小时的保持期间编程了在79℃和80℃之间循环的多个阶段(参见图10C)。

在示例性的实施方式中，为检测磺酰罗丹明B对PCR的潜在抑制，检查了实时定量PCR的结果、凝胶分析和高分辨率熔解曲线。包含磺酰罗丹明B的样本所具有的定量循环与不包含磺酰罗丹明B的标准样本比较时差异约0.10。凝胶分析证实了包含磺酰罗丹明B的样本中产物的纯度和大小。最终，比较标准样本和具有磺酰罗丹明B的样本的高分辨率熔解曲线在强度和峰温度方面相似。

图11A显示了9个示例性仪器的校准曲线。仪器包括类别I(点划线)、类别II(实线)、类别III(点线)和类别IV(点划线)。在示例性的实例中，使用缓慢的加热速率(0.018～0.1℃/秒)平衡溶液和仪器温度。9个仪器中的8个成功地监测了磺酰罗丹明B荧光，即使许多实时仪器的激发波长对于磺酰罗丹明B不是最佳的。在某些示例性实施方式中，磺酰罗丹明B的荧光随温度从95℃降低到50℃而大约加倍(参见，例如类别II(实线)仪器)。对于一个示例性实例(Eco^TM仪器)，因为可用的光学器件而使用荧光素(即，荧光素与可用的固定的熔解发射波长相兼容)，导致与磺酰罗丹明B曲线不同形状的校准曲线。在某些实施方式中，荧光素荧光随温度从95℃减小到50℃而增加约60％。校准常数源自所述数据的线性图的斜率(如图11B中针对的显示(y＝1890X+0.013,R2＝0.999))。仅通过示例的方式，对于荧光素，校准常数为1097，对于磺酰罗丹明B，校准常数为1787至2831(参见下表5)。未受理论限制，磺酰罗丹明B在仪器之间不同的校准常数可能源自不同的光学特征和效率。

表5.在变性、退火和延长阶段的过程中的溶液温度

^a校准常数是一个无单位的常数，定义为通过对(1/T(K)-1/Tref(K))和ln(I/Iref)作图而形成的直线的斜率。参见图11B和已经通过引用合并的美国专利申请No.61/872,173。全部的校准常数针对磺酰罗丹明B，除了Eco仪器(荧光素)。

^b使用制造商建议的保持时间，即对于除了毛细管LightCyclers之外的全部仪器均为每个阶段10秒钟，完成94℃、55℃、74℃循环需要的时间，其中，0秒用于变性和退火。通过监测在LightCycler仪器上的单个样本而获得循环时间。

^c在每个阶段的保持时间，除了毛细管LightCycler在变性和退火时使用0秒保持时间。

^d温度范围表示在监测保持时间时的最小溶液温度和最大溶液温度。对于在毛细管LightCycler上的0秒保持的变性和退火，仅给出了在峰处的单个值。

^e样本体积为10μl，覆盖15μl的油。

在某些示例性实施方式中，在PCR过程中使用荧光作为温度监测物可能依赖于数据获取，而数据获取可随装置不同而具有很大差异，范围从每个循环的一个数据点至连续获取。相似地，输出的数据可从仅循环数目和荧光至综合性包括时间、程序、循环、阶段、荧光和温度在内的电子表格。软件和可用的光学部件也可限制可使用的激发和发射波长。即使具有这些限制，仍可通过荧光在许多不同仪器(包括文中公开的全部仪器)上监测样本温度，即使对于一些仪器存在比其它更大的困难。

不同的仪器在温度循环期间的荧光收集能力可能有大的差别。在示例性实例中，在整个温度循环和熔解中的连续获得仅在类型I的设备上有可能。此外，虽然一次仅可测量一个样本，但是在毛细管类型I设备上获得了最大的数据密度和循环速度。可在快速循环PCR过程中监测单个样本，所述快速循环PCR的循环时间根据仪器的模型而在18～25秒之间变化。在3个类型I的毛细管仪器上，将溶液温度(源自荧光)(实线)与仪器(点线)和热电偶(短划线)读数比较，并且图12显示了在一个模型(示例性的，)上的结果。

仅通过实例的方式，针对最大转变速率(20℃/秒)对仪器编程，但是在加热过程中获得3.7～7.0℃/秒的速率以及冷却期间1.9～8.0℃/秒的速率。延长的目标温度为在74℃保持10秒，使用变性(94℃)和退火(55℃)的温度峰值(保持“0”秒)。循环时间为27秒。在某些实施方式中，在快速转变过程中加重了温度之间的差异，而在保持期间最小化。在快速转变过程中，热电偶追踪与溶液温度最好地对齐，它们都落后于仪器的温度。因此，在某些实施方式中，溶液温度和热电偶温度可聚集到一起，并且可落后于仪器温度追踪。

至少一个加热模块仪器(示例地，)也可归类为类别1的仪器，因为可在整个温度循环期间监测荧光。在某些实施方式中，可同时监测达96或384个样本，并且激发波长和发射波长都是灵活的。然而，当连续获得荧光时，坡变速率可被限于0.57℃/秒或更小—比典型的PCR循环慢。

在一个示例性的实例中，研究样本体积和坡变速率的三种不同的组合，以测试PCR循环过程中仪器(点线)、热电偶(短划线)和溶液(实线)温度的不匹配(参见图13A～13C)。变性的目标温度为94℃，退火的目标温度为55℃，延伸的目标温度为74℃，全部保持10秒。体积和转变速率为(图13A)30μL的样本+20μL的油以0.57℃/秒、10μL的样本+15μL的油以0.29℃/秒(图13B)以及5μL的样本+5μL的油以0.14℃/秒(图13C)。循环时间分别为4.5、6.1和9.3分钟—比毛细管仪器慢10～20倍。在每种条件下均确定校准常数，分别为1977、2042和2055。对于毛细管LightCycler，溶液和热电偶温度追踪聚集到一起，并落后于仪器的读数，尤其是在温度转变过程中。

在某些示例性实施方式中，可一起追踪溶液温度和热电偶温度，并可进行平均而作为样本温度的最佳估计值，然后与显示的仪器温度定量比较。作为示例性实例，表6(下面)列出了在毛细管和类型I的96孔仪器上的变换过程中样本温度与仪器温度之间的平均差异。示例性地，样本温度始终落后于仪器读数，并且在96孔板上具有较快的转变速率和较大的样本体积时差异最大，在50μL体积和0.57℃/秒的转变速率时，在冷却过程中最大差异达到约5.1℃，在加热过程中达约4.5℃。即使毛细管的转变速率可比96孔板上的速率快10～20倍，温度差异可较小，示例性地，在冷却过程中平均约3.8℃，在加热过程中为约0.4℃(接近延长)和约1.4℃(接近变性)。

量化温度不匹配的另一个示例性方式为样本温度达到仪器温度所需的时间(参见表6)。在表6显示的示例性实例中，毛细管形式在全部转变中的平均落后或延迟为0.47秒，与之相比96孔板为5.0秒。在96孔板上的最大时间延迟为8.3秒，在50uL样本以0.57℃/秒的转变速率接近变性的过程中出现。

表6.样本温度和仪器温度差异以及温度转变期间的时间延迟

在某些仪器上不可能在整个循环期间连续监测荧光(例如，示例性的为类型II-IV的仪器)。然而，在某些实施方式中，在保持阶段过程中的单个荧光获取可能足以确定溶液温度。因此，在一些实施方式中，可通过获取在多轮上的不同时间点而重构温度追踪。获取前的最小时间可在仪器间而变化，从约1至10秒(或更多)。在至少一个实施方式中，可分析达50秒(或更多)的保持时间(参见表5)。

考虑到全部的仪器，在退火保持过程中获得第一仪器温度读数可高大约1.1～4.5℃。另外，应注意，在2个不同的仪器上变性1秒后，在一个示例性实施方式中的最大温度误差为过冷8.4℃和8.6℃。

图14显示了在类型IV的仪器上示例性的变性(+)和退火(x)保持过程中确定溶液温度的实施方式。溶液温度的测量可通过在Eco^TM仪器上变性(94℃的目标温度)和退火(55℃的目标温度)阶段保持过程中的(荧光素)荧光而确定。在至少一个实施方式中，在退火1秒后，溶液温度可热3.1℃。相似地，在变性1秒后，溶液温度可冷8.4℃。因此，所编程的保持时间可能需要达5～10秒(或更长)，用于溶液平衡到接近目标温度。

因此，在某些实施方式中，持续追踪来源于荧光的溶液温度可说明在典型的PCR循环期间热电偶和溶液温度集中，并且两者落后于仪器温度。因此，仪器可在样本实际达到目标温度前显示和/或表明已经达到目标温度。样本和仪器温度之间的差异可取决于仪器，并且在冷却过程中可比加热转变过程中更大。此外，在更快的循环速度可出现更大的误差。转变期间仪器误差的数量级可为约1～5℃和/或在某些条件下可超过5℃。

证明类别I-II的仪器上溶液温度和仪器温度之间的差异的另一个方式是通过加热和冷却阶段的不匹配或滞后。通过实例的方式，可通过对加热和冷却过程中相对于彼此的测量作图而显示温度滞后(溶液温度相比于仪器温度的滞后)(参见图15A～15C)。图15A～15C示例了在(图15A)、(图15B)和(图15C)上加热和冷却过程中溶液温度和仪器温度之间的温度不匹配或滞后。理想的溶液-仪器温度关联显示为虚线。在类型I仪器上(图15A和15B)，通过其间无停顿地连接加热和冷却阶段(显示了3个循环)而实现多个循环。在类型II仪器上(图15C)，虽然可连接加热和冷却阶段，但是荧光获取在用于平衡的强制停顿其间被中断(显示了一个加热阶段和一个冷却阶段)。对于坡变速率为5℃/秒，上的坡变速率为0.57℃/秒(慢9倍)，在Rotorgene Q上的坡变速率为0.1℃/秒(再慢5.7倍)。在上溶液温度与仪器温度差异最大达到4.5℃，在上达到8.1℃，在Rotorgene Q上达到7.5℃。

图16A～16F描述了在毛细管和基于板的仪器上加热和冷却过程中溶液-仪器温度滞后。以0.2℃/秒(图16A)、1℃/秒(图16B)和5℃/秒(图16C)的坡变速度在毛细管仪器上比较仪器温度和溶液温度。在每个图上通过点线标注了理想的溶液-温度相关性。在一些实施方式中，对于加热和/或冷却两者，以0.2℃/秒的坡变速率产生的数据可与理想数据紧密对齐。然而，以5℃/秒时，仪器温度和溶液温度的差异可达到4.5℃。

还可以0.11℃/秒(图16D)、0.29℃/秒(图16E)和0.57℃/秒(图16F)的坡变速率，全部使用30μL的样本和20μL的油，在基于板的仪器上检测仪器温度和溶液温度的差异。在某些实施方式中，仪器温度和溶液温度之间的最大差异可达到8.1℃或更大。在至少一个实施方式中，甚至以最慢的变温速率(0.11℃/秒)时，滞后水平可与在毛细管仪器上以1℃/秒的速率时的相当，这表明样本形式以及热传递的方法可能是重要的。

示例性地，研究的全部仪器均显示滞后环，表明了在加热和冷却过程中溶液和仪器温度之间的不匹配。在某些实施方式中，在较快的坡变速率时可增大温度的不匹配(参见图15A～15C和图16A～16F)，虽然一些仪器相比于其它仪器可能内在地被更好的匹配。例如，以5℃/秒运行的毛细管仪器可显示比以0.57℃/秒运行的96孔仪器小的滞后，和/或与以0.1℃/秒运行的另一种96孔仪器大约相同的滞后(参见图15A～15C和图16A～16F)。

因此，在较快坡变速率时观察到的大的温度差异还可通过相连的加热/冷却转变的温度滞后而证实，其中显示了反映温度误差的大小的区域的环(参见图15A～15C和图16A～16F)。结果，样本在转变过程中达到所示仪器温度需要的时间延迟对于空气/毛细管系统可达0.3～0.6秒或更多，对于典型的96孔形式的仪器可达1.4～8.3秒或更多。

在至少一个示例性实施方式中，可通过对比溶液温度和仪器温度而辨别熔解曲线分析的准确性(参见图17A～17B)。例如，可使用溶液温度(短划线)和仪器温度(实线)以(图17A)0.14℃/秒和(图17B)0.01℃/秒在上产生熔解曲线的负导数图。示例性的类型I的96孔仪器可使得能够在单独的荧光槽中同时收集DNA螺旋度和溶液温度。在一些实施方式中，可通过DNA染料使Lambda DNA螺旋可视化，并且可通过磺酰罗丹明B荧光确定溶液的温度。相似地，可根据制造商的建议使用无油覆盖层的20μL的体积。在某些示例性实施方式中，在0.14℃/秒的速率，来源于仪器温度的熔解曲线可比来自溶液温度的曲线高1.1℃。在0.01℃/秒时，该滞后可减小约5倍至0.2℃。因此，可以说溶液温度在0.14℃/秒时落后仪器温度1.1℃，在0.01℃/秒时落后0.2℃。

考虑到在加热和冷却过程中观察到的温度的滞后，商业循环仪在热循环过程中通常需要保持时间，使得样本温度有足够的时间达到退火、变性和延长的目标温度，这不足为奇。作为该限制的反映，在某些实施方式中，允许0秒“保持”时间的仅有的商业循环仪是最响应的、循环空气/毛细管热循环仪。在其它仪器上的最小允许保持时间可为1～10秒，即便在达到目标温度时保持时间是不必要的。然而，即使这些需要的保持时间，仍然很少获得目标温度。例如，在所需的退火保持之后的溶液温度可比目标温度高1～5℃。在所需的变性保持后，某些仪器上的溶液温度可比目标低超过8℃。在某些示例性实施方式中，虽然使用最小的可编程保持时间不可达到目标温度，但是溶液温度可最终稳定至目标温度(参见图14)。

这种时间延迟可提高熔解曲线的表观温度至某个程度，该程度似乎依赖于加热的速率。在典型的熔解速率时，在普通的仪器上该误差可超过1℃(参见图17A～17B)。表观熔解温度随熔解速率提高的提高可准确地反映DNA熔解的动力学。该表观关联的另一个解释为样本温度和仪器温度之间无意的不匹配造成的人为产物。因此，目前的实时仪器在循环过程中不足以准确控制和/或记录溶液的温度，并且随着循环时间变短，误差可增加。温度校准通常在平衡温度下进行，而不是在温度正在变化(如在PCR过程中)时进行。因此，简单的再校准通常将不改善本文揭示的动态温度误差。这可能有助于解释PCR方案在仪器品牌间不能够转换的共识。更好的溶液温度可在循环过程中通过匹配传感器对样本的热响应，或通过文中描述的方法获得。

再次使用自定义多色荧光计，针对磺酰罗丹明B(酸式)，检测了使用一条或两条发射带的方法。用两条光谱带获得了提高的温度准确性。热电偶和双色分析之间最大的温度差异为0.3℃，相比之下单色为0.6℃。荧光比例的实施将误差降低约2倍。

在改进的LightCycler 24上使用磺酰罗丹明B用基于荧光的温度控制成功地扩增了单个核苷酸变体。20秒的低的定量循环(C_q)值提示了高效扩增，即便在使用10秒的保持时间，或者甚至在使用最小的“0”秒的保持时间。注意到，0秒的保持时间可受益于更高的引物浓度，以加速退火过程，如在通过引用合并于此的C.T.Wittwer,K.Ririe,R.Rasmussen,in:F.Ferre(Ed.),Gene Quantification,Birkhauser,New York,1998.pp.129-144中的进一步说明。由于可减少或完全消除平衡保持时间(实施以让溶液温度“赶上”仪表读数)，准确的温度循环可以使循环时间最小化。

在基于荧光的温度循环控制和基于电热偶的温度循环控制的35个循环的比较中，温度测量之间的平均差异为0.5±0.4℃。这些结果表明基于荧光的温度控制在全部35个循环中产生了可重复的结果。当考虑退火和变性时的差异时，这些差异分别为0.3±0.2℃和0.9±0.3℃。因此，基于荧光的温度很好地追踪了热电偶的测量，尤其是在较低的温度。变性时的较大(并且一致的)差异提示了在较高温度出现的误差的系统性来源。内在地，磺酰罗丹明B(单钠盐)每℃的荧光变化量在较高温时较小。

当在变性和退火时比较测量温度和设定点温度之间的绝对差别时，基于荧光的温度比仪器确定的温度更好地满足目标温度。平均的基于荧光和设定点温度的差异在退火和变性时分别为0.4±0.2℃和0.4±0.3℃。当比较热电偶温度和设定点温度时，这些值对于退火和变性分别提高到0.6±0.3℃和1.1±0.5℃。

使用荧光作为温度监测物提供了评估实际的平均熔解温度的非侵入性方法，该方法甚至在最快速的循环速度下仍然强大。示例性地，用于评估样本温度的被动参考染料的荧光监测能够改善PCR和熔解分析。通过直接监测溶液温度，可记录变性和退火时的误差，并通过(1)记录加热或冷却过程中的任何异常；(2)观察效率、产率和/或特异性方面的意外结果；和(3)关联意外的结果与异常而与效率、产率和特异性相关联。此外，循环时间能够被最小化，并基于逐个循环或逐个样本验证仪器的性能。对提高实时定量PCR和熔解分析的准确度的需要要求越来越高的温度准确性。例如，用于基因分型和变异扫描的高分辨率熔解分析的成功可取决于<1℃的温度准确性。通过荧光测定溶液的温度是用于解决PCR和高分辨率熔解分析过程中的温度测量问题的可靠的非侵入性的方法。

应当注意到，根据本发明的某些实施方式的产品、过程、装置、系统、混合物和方法可包括、并入或者包含其它实施方式中描述的性质、特征、组件(组分)、部件和/或元件，包括系统、方法、产品、装置和/或与文中公开相同的实施方式。因此，提及与一个实施方式有关的具体特征不应被解释为限于仅在所述实施方式内应用。

虽然本文已经公开了多个方面和实施方式，但是本发明还包括其它方面和实施方式。本文公开的多个方面和实施方式用于示例的目的，而非旨在限制。此外，文中(包括权利要求书)使用的词语“包含”、“具有”、“涉及”及其变化(例如“包括”、“有”、“含有”)应为开放式，并且具有与词语“包括”或其变化相同的意思。

本发明还以其它具体的形式实施，而未背离其精神或本质特征。针对所有方面所描述的实施方式均应被认为是示例性而非限制性。因此，本发明的范围由所附权利要求而非上述说明所表示。虽然出于示例本发明的目的而在本文以及所附的本发明公开中包含了某些实施方式和细节，但是对本领域技术人员显然的是，可对文中公开的方法和仪器做出各种改变，而不背离所附权利要求中定义的本发明的范围。在权利要求书的意义和等同范围内的全部变化都包含在权利要求的范围内。

Claims

1.测量样本温度的方法，所述方法包括：

提供包含温度敏感性荧光染料的水样本；

其中，所述温度敏感性荧光染料发射的荧光信号的量以已知的方式作为温度的函数而变化，并且其不与所述样本中存在的核酸的量成正比，或不表示所述样本中存在的核酸的量，或基本不依赖于所述样本中存在的核酸的量，并且

其中，所述温度敏感性荧光染料不是dsDNA结合染料，所述温度敏感性荧光染料不结合至核酸，并且所述温度敏感性荧光染料的荧光信号不受dsDNA变性的影响；

激发所述温度敏感性荧光染料以诱导发射荧光信号；

测量所述水样本中所述温度敏感性荧光染料发射的荧光信号的量；以及

确定所述水样本的由荧光确定的温度，所述温度是由所述水样本中所述温度敏感性荧光染料发射的荧光信号的量的函数。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光染料包括磺酰罗丹明B。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本包括水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本包括悬浮液。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本包括PCR混合物。

6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括在PCR循环过程中的一个或多个时间点测量由所述样本发射的荧光。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本进一步包括产生第二发光信号的第二试剂，其中，所述第二发光信号表示所述样本中存在的核酸的量。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，通过所述温度敏感性荧光染料发射的荧光信号的函数确定的样本的温度与通过直接接触包含所述温度敏感性荧光染料的样本而测量的温度之间的差异小于或等于1摄氏度。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述样本进一步包括核酸的两条链以及产生显示所述样本中存在的双链核酸的量的信号的试剂，

所述确定步骤在熔解所述核酸以及测量显示存在的双链核酸的量的信号的同时发生，并且

进一步包括产生熔解曲线的步骤，所述熔解曲线基于由所述光信号确定的温度而调整。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，使用下面的公式产生所述熔解曲线：

其中，I是所述温度敏感性荧光染料在温度T时所测量的荧光强度，I_ref是在参考温度T_ref的荧光强度，并且C是等于的校准常数。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述熔解曲线显示为导数熔解图。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述确定步骤包括产生所述荧光信号与通常对温度不敏感的样本的信号之比。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述荧光信号为在第一波长来自所述温度敏感性荧光染料的信号，并且通常对温度不敏感的信号为在第二波长来自所述温度敏感性荧光染料的信号。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述荧光信号为来自所述温度敏感性荧光染料的信号，并且通常对温度不敏感的所述信号为来自通常对温度不敏感的第二发光试剂的信号。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述第二发光试剂包括PCR产物形成的定量指示物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述PCR产物形成的定量指示物包括双链DNA结合试剂。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本在样本加热装置中提供，所述方法进一步包括：

测量所述样本的装置确定的温度；和

基于所述荧光确定的温度或装置确定的温度中至少一种，调整所述样本加热装置的温度设定；

由此校准所述样本加热装置。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述样本的装置确定的温度是不直接接触所述样本而测量的。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述样本的装置确定的温度是通过直接接触所述样本而测量的。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述温度敏感性荧光染料不抑制PCR或不干扰PCR产物的形成。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，由被激发的所述温度敏感性荧光染料发射的荧光信号在95℃和50℃之间变化。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，由被激发的所述温度敏感性荧光染料发射的荧光信号在95℃和50℃之间提高约50％。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，由所述温度敏感性荧光染料显示在95℃和50℃之间约1％/℃的温度敏感性。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本进一步包括核酸聚合酶。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述样本进一步包括一种或多种dNTP。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述样本进一步包括模板核酸。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述样本进一步包括多个核酸引物，所述核酸引物经设置退火到所述模板核酸的一部分上。

28.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

提供用热循环谱编程的热循环装置，所述热循环装置包括：

样本管，所述样本管经设置接收样本；

样本温度控制组件，所述样本温度控制组件经设置调节所述样本的温度，并响应于触发事件而启动向所述热循环谱的下一阶段的变化；

样本发光刺激元件，所述样本发光刺激元件经设置提供所述刺激；和

样本发光测量元件，所述样本发光测量元件经设置检测所述荧光信号；和

将所述样本置于样本管中；

其中，所述触发事件包括检测所述荧光信号的预定值，所述荧光信号的预定值表示启动向所述热循环谱中的下一阶段改变的合适的时间。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述预定值选自由所述光信号的强度、由所述光信号计算的温度以及由所述光信号计算的值或参数组成的组。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述下一阶段选自由以下组成的组：用于所述样本的所编程的温度保持期的开始、用于所述样本的所编程的温度保持期的结束、向第二温度的坡变以及向第一温度的坡变。

31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述热循环装置进一步包括用于测量所述样本温度的样本温度测量元件，并且其中，所述触发事件进一步包括通过所述样本温度测量元件检测所述样本的预定温度。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述触发事件进一步包括所述光信号的值和所述样本温度两个因素。