CN104246458B - 用于验证微环境中的温度测量结果的方法和系统 - Google Patents
用于验证微环境中的温度测量结果的方法和系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104246458B CN104246458B CN201280051489.4A CN201280051489A CN104246458B CN 104246458 B CN104246458 B CN 104246458B CN 201280051489 A CN201280051489 A CN 201280051489A CN 104246458 B CN104246458 B CN 104246458B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- temperature
- microenvironment
- liquid crystal
- illuminator
- independent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 title claims description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 103
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 claims abstract description 100
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims abstract description 51
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 57
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 31
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 26
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 13
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 29
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 33
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000520870 Phoenicurus phoenicurus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001073322 Setophaga Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012067 mathematical method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 101150009136 tlcA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071385 tlcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150018104 tlcC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01K—MEASURING TEMPERATURE; MEASURING QUANTITY OF HEAT; THERMALLY-SENSITIVE ELEMENTS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G01K11/00—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00
- G01K11/20—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00 using thermoluminescent materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01K—MEASURING TEMPERATURE; MEASURING QUANTITY OF HEAT; THERMALLY-SENSITIVE ELEMENTS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G01K11/00—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00
- G01K11/12—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00 using changes in colour, translucency or reflectance
- G01K11/16—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00 using changes in colour, translucency or reflectance of organic materials
- G01K11/165—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00 using changes in colour, translucency or reflectance of organic materials of organic liquid crystals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01K—MEASURING TEMPERATURE; MEASURING QUANTITY OF HEAT; THERMALLY-SENSITIVE ELEMENTS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G01K15/00—Testing or calibrating of thermometers
- G01K15/005—Calibration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01K—MEASURING TEMPERATURE; MEASURING QUANTITY OF HEAT; THERMALLY-SENSITIVE ELEMENTS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G01K15/00—Testing or calibrating of thermometers
- G01K15/007—Testing
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Measuring Temperature Or Quantity Of Heat (AREA)
Abstract
本发明涉及一种适合用于分析预计在微环境中建立限定温度的设备的温度控制的方法，所述方法包括第一光学温度验证步骤，该第一光学温度验证步骤包括a）在微环境中提供一种或多种热敏变色液晶，其中每种热敏变色液晶具有特定事件温度，b）在微环境中提供一种或多种温度依赖发光体，c）使在该微环境中的温度变化并利用光照射该微环境，d）当在该微环境中达到该一种或多种热敏变色液晶的事件温度时，记录该一种或多种温度依赖发光体的发光；并且其中所述方法包括第二光学温度验证步骤，该第二光学温度验证步骤包括以下：a）在微环境中提供在该第一光学温度验证中使用的一种或多种温度依赖发光体；b）改变微环境的温度并利用光照射该微环境；c）监测发出的光。相应的方法非常适合于特别是在校准过程中分析热循环仪的温度控制。
Description
技术领域
本发明涉及需要特定温度的化学、生物和生物技术过程的领域。特别是，本发明涉及用于验证或校准微环境中的温度测量结果的方法和用于验证或校准微环境中的温度测量结果的系统。
背景技术
许多过程以这种方式需要特定温度：过程的有效性或过程中的具体步骤依赖于在特定温度下执行该过程/步骤。为了使环境能够被加热或制冷以根据需要将温度保持在所期望的温度，监测过程/步骤的环境的温度是必要的。需要继续监测环境温度使得温度能够根据需要通过加热或制冷被保持在期望的水平。当对于过程中的进一步的步骤需要不同的温度时，同样的考虑也适用。
需要特定温度的过程的一个示例是涉及多个循环的聚合酶链反应(PCR)。PCR是分子生物学科学技术，其在每次循环完成时增扩多核苷酸序列。PCR技术是公知的并且在许多书中描述，包括：PCR:A Practical Approach，M.J.McPherson等，IRL Press(1991)；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications，Innis等，Academic Press(1990)以及PCR Technology:Principals and Applications for DNA Amplification，H.A.Erlich,Stockton Press(1989)。PCR还在许多美国专利中描述，包括U.S.4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；4,889,818；5,075,216；5,079,352；5,104,792；5,023,171；5,091,310；以及5,066,584。
每个PCR循环通常都包括三个实质上离散的温度阶段：变性阶段、退火阶段和延伸阶段。DNA的变性典型发生在约90℃至95℃下，对变性的DNA退火引物(primer)典型在约40℃至60℃下进行，利用聚合酶延伸退火的引物的阶段典型在约70℃至75℃下进行。因此，在PCR循环期间，反应混合物的温度必须被改变，并且在多循环PCR实验中改变多次。每个阶段的有效性强烈依赖于进行每个阶段的温度。PCR技术具有各种广泛的生物应用，包括例如DNA序列分析、探针生成、核酸序列克隆、位点定向诱变、基因突变检测、病毒感染诊断、分子“指纹图谱”和监测生物体液和其他来源中的污染微生物。PCR通常在称为热循环仪或PCR循环仪的实验室设备中进行。
除了PCR之外，如在授予Landegren和Hood的美国专利第4,988617号公开的、包括连接酶链反应的其他体外扩增程序是已知的并且有利地在现有技术中使用。更一般地，在生物技术领域中已知的几个重要的方法，诸如核酸杂交和测序，依赖于以受控制的方式改变包含试样分子的溶液的温度。常规技术依靠使用循环通过不同的温度区域的各个孔或管。例如，在现有技术中公开了若干用于DNA扩增和测序的热“循环仪”，其中温度受控制元件或“模块”容纳反应混合物，并且其中模块的温度随时间变化。这些设备的一个优点是相对大量的试样能够被同时处理，例如96孔板被普遍采用。
这种热循环仪的不同的设计是已知的。例如可获得设备用于多试样的热循环，典型用于DNA的扩增。这种设备的常用形式是包括热传导材料模块，该热传导材料模块具有多个通道或腔体用于接纳在其中执行期望的反应的容器——诸如反应管或板。温度的监测在这种设备中相对简单，这是因为温度探针可以与块相关联。
然而，这种模块设备经受各种缺点，例如它们在循环反应混合物时相对缓慢，它们对操作是相对能量密集的并且难以原位检测反应混合物。在避免这些缺点中的几个的努力中，已经开发了其他热循环仪，其中用于容纳反应混合物的多个容器被支撑在可旋转的转盘上，该可旋转的转盘被可旋转地安装在适合于被加热和制冷的腔室中。
用于使反应混合物热循环的设备也是已知的，其中反应容器被保持在转子中，使该转子在受控制的温度环境如含有转子的绝缘腔室(也称为“Rotor-Gene”)中旋转。温度循环通过加热和环境制冷进行。转盘或转子具有用于容器、瓶或管的孔口、插座或插槽。具有60或72个插座用于对应数目的瓶或管的转子是已知的。这种设备例如在国际专利申请No.PCT/AU98/00277(公开号WO98/49340)中公开。因为反应混合物在PCT/AU99/00277的设备中旋转，难以准确地测量反应混合物的温度。无论转子环境的温度被如何良好地控制，在反应混合物和环境本身之间都会存在温度差。因为对于大多数的热循环反应来说精确温度控制都是必须的，知道反应混合物，即在反应管中的液体的实际温度是重要的。然后能够在环境温度管理程序中进行补偿以在实际的反应管中得到所期望的温度。然而，在旋转系统内的大量水溶液的动态热行为不容易监测。具有电缆的传感器会引入额外的散热能力。此外，电缆将形成额外的热桥，其也可以影响温度的测量。因此，虽然通常容易监测过程的整体环境的温度，但监测过程微环境的温度并不总是容易的。
各热循环仪的操作的重要方面因此是反应容器的内容物的温度的精确控制。这等价于如何准确地控制反应容器周围的空气的温度。然而，容器内的温度可能不一定与如由Rotor-Gene温度控制设施感测的腔室温度一样，因此必须在该设施中进行补偿。
从WO03/102522A1已知用于在容器中的反应温度的光学校准的系统和方法。在校准过程中获得在可检测腔室温度和反应容器中的温度之间的关系。在校准过程中使用透明瓶，该透明瓶具有含发光体成分，该含发光体成分在热敏变色液晶成分(TLC)成分之上或之下分层。包括含发光体成分和TLC成分的系统被光源照射，由含发光体成分发出的光由检测器检测，同时记录所述环境的温度。所获得的数据被用来提供关于腔室温度对反应瓶温度的温度校准曲线。由此，它能够被控制/验证使各设备的温度控制准确工作。为此，发光体和TLC的组合被提供在微环境(反应瓶)中，并且例如PCR曲线在必须在微环境中建立不同的离散的温度的过程中运行。在TLC/发光体组合的发光中的转变被记录。基于所述组合的假设转变温度，微环境中的当前实际温度被推算/确定并与如果温度控制正常工作预计达到的温度比较。如果发现偏差，则在设备的温度控制中执行适当调节，直到微环境中由TLC/发光体组合确定的实际温度足够良好匹配预期温度。
上面提到的方法和系统的准确度留有改进空间。此外，当使用光学测量来确定温度时可能发生影响测量的光学漂移。例如在照明源的光通量随时间而变化的情况下，光检测器所检测到的强度变化。此外，照射源即光通量可能受到照射源的温度影响，并且该光学漂移会直接导致温度测量偏离。这尤其是对于不具有用于补偿光学系统中的漂移的基准通道的热循环仪造成问题。
本发明的目的是克服或改善上述现有技术的缺点中的至少一个，或提供有用的替代。
发明内容
本发明涉及允许诸如特别是热循环仪的分析设备的性能、并且特别是温度控制的准确度的方法。如上所述，这种设备在所包括的、诸如例如反应瓶的微环境中必须达到并保持特定的温度以确保在该微环境执行的例如PCR反应的温度依赖反应的准确度。因此，重要的是确保并因此验证设备的温度控制正常工作和因此在微环境中达到的实际温度对应于在其中预期达到的温度。如果发现偏差，则能够进行温度控制的适当调节直到实际温度对应于预定的温度。为例如在PCR循环期间确定在微环境中的实际温度用于验证设备的温度控制的准确度，能够使用被包含在微环境的温度依赖发光体，优选为荧光染料。优选地，它被包括在液体体积中。所发射的荧光能够与在微环境中被实现的实际温度相关联。通过将相应确定的实际温度与根据温度控制预计达到的期望温度比较，可以分析温度控制的准确度，并且如果需要，可以对温度控制进行适当调节。
本发明现在基于以下发现：如果温度依赖发光体的发光强度已在该微环境中产生的特定绝对温度下被测量并因此已被映射到所述特定绝对温度，则能够改善基于微环境中、并且特别是液体体积中的温度的确定的温度依赖发光体的准确度。此外，有利的是当设备在使用中例如以在所述微环境中执行诸如PCR反应的反应时。确定在占优势的微环境内的条件下确定发光强度。
因此，根据第一方面，提供了一种适合分析为在微环境中建立限定温度的设备的温度控制的方法，所述方法包括第一光学温度验证步骤，该第一光学温度验证步骤包括以下：
a)在微环境中提供一种或多种热敏变色液晶，其中，每种热敏变色液晶都具有特定的事件温度，
b)在微环境中提供一种或多种温度依赖发光体，
c)使该微环境的温度变化并利用光照射该微环境，
d)当在包括所述热敏变色液晶的该微环境中达到该一种或多种热敏变色液晶的事件温度时，记录该一种或多种温度依赖发光体的发光。
根据第二方面，提供了一种用于验证或校准热空气循环仪的温度控制的系统，所述系统包括转子，该转子包括用于微环境的插座，其中，所述转子包括在微环境中的：
a)两种或更多种不同的热敏变色液晶，每种热敏变色液晶具有不同的事件温度，和
b)一种或多种温度依赖发光体。
根据第三方面，本发明涉及一种温度依赖发光体在分析预计在微环境中建立限定温度的设备的温度控制时的使用或用途，其中，在温度依赖性方面不同的至少两种不同的温度依赖发光体用于补偿光学系统的光学偏移，并且在同一温度下确定该第一温度依赖发光体和该第二温度依赖发光体的荧光强度的商。该第二温度依赖发光体的温度依赖性小于该第一温度依赖发光体的温度依赖性。
根据下面的描述和所附权利要求本申请的其他目的、特征、优点和方面对于本领域的技术人员将变得明显。然而，应当理解，下面的描述、所附权利要求和具体示例尽管表示了本申请的优选实施例，但仅由说明的方式给出。对于阅读了下文的本领域技术人员来说本发明的精神和范围内的各种改变和修改将变得显而易见。
本发明的详细说明
根据第一方面，一种适合分析适合在包括在环境中的微环境中建立限定温度的设备的温度控制的方法，所述方法包括第一光学温度验证步骤，该第一光学温度验证步骤包括：
a)在微环境中提供一种或多种热敏变色液晶，其中，每种热敏变色液晶都具有特定事件温度，其中，优选地，具有特定事件温度的每种TLC都被包括在分开的微环境中，
b)在微环境中提供一种或多种温度依赖发光体，其中，优选地，在分开的微环境中提供不同的发光体，
c)使该微环境的温度变化并利用光照射该微环境，
d)当在包括相应的热敏变色液晶的该微环境中达到该一种或多种热敏变色液晶的事件温度时，记录该一种或多种温度依赖发光体的发光。
术语“环境”当在本文中使用时优选指在例如装置的腔室的设备中建立的任何温度受控制的环境。例如在所述环境中的温度能够被控制用于使过程或过程内的步骤在特定温度进行。该术语优选指可加热反应腔室，尤其是热循环仪，特别是其中反应容器包括在转子中的热循环仪，该转子在受控制温度环境中旋转。通过加热和制冷这里是绝缘腔室的环境来在相应的热循环仪中实现温度循环。根据一个实施例，它指具有用于保持反应容器的至少一个腔室的被加热的模块。该术语还包括其中根据需要通过加热或制冷环境来控制温度的环境。
术语“微环境”当在本文中使用时优选指被包括在温度受控制环境或温度受控制环境的部分中的环境。该术语因此具体指反应容器，更优选的指被包括在温度受控制环境内的反应容器的内部，所述温度受控制环境是如热循环仪的可加热反应腔室或加热模块。具体来说，术语微环境包括并指被包括在反应容器内的液体，该反应容器被包括在相应的温度受控制环境中。优选地，微环境的温度经由包括微环境的环境的温度来控制。利用本发明提出校准过程，其中光学地确定处于环境中的微环境的温度，其中该微环境优选由反应容器中的液体提供。
术语“热敏变色液晶”(TLC)当在本文中使用时具体指“清亮点”型TLC或“温度灵敏型”型TLC。利用“清亮点”型TLC，在称为转变温度的特定温度或清亮点，化合物由不透明变成清亮。因此，在转变温度，光学特性突然改变。在宽范围的转变温度上在商业上可购买这种TLC。利用“温度灵敏型”TLC，低于称为“红色开始”温度的特定温度时，TLC几乎清亮。高于作为清亮点温度的第二更高温度，TLC也几乎清亮。这两个温度之间，TLC选择性反射可见光。在红色开始温度，TLC改变到强烈反射红色光的状态。在蓝色开始温度时，在TLC改变到强烈反射蓝色光的状态。在其中保持RLC的环境的温度增加时，TLC最强烈反射的光的颜色波长减小，从红色至橙色、黄色、绿色、蓝色然后紫色。通过监测光学系统、即光检测器的输出，当照射与TLC相关联的微环境时，能够确定何时微环境和其内容物处于、高于或低于光学特性突然改变的温度。在本文中，光学特性突然改变的上述温度还称为TLC的“事件温度”。在清亮点TLC的情况下，“事件温度”的示例是TLC的转变温度。在温度灵敏型TLC的情况下，这种事件温度的示例是TLC最强烈地反射或重定向来自容器的光源的特定波长的光的温度。
术语“发光体”当在本文中使用时具体指表现发光的化合物。通常，它是化合物的负责发光的特定成分，诸如原子或原子团。发光体能够吸收特定波长的能量并在不同的特定波长下重新发射能量。能够由光检测器来检测重新发射的能量的强度。发光体能够以许多不同的形式存在，包括液体、气体和固体形式。优选地，发光体能够分别作为水溶液或有机溶液存在。在固体形式中，发光体能够被提供为微环境的内部或外部的涂覆或喷涂。术语发光体包括荧光体以及磷光体。优选地，所述术语指荧光体。荧光体的优势在于其具有相当短的衰减寿命。优选地，所述术语指荧光染料和因此的含有荧光体的任何染料。在温度依赖发光体中，光学特性依赖于发光体的温度。因此，通过分析存在于特定微环境中的温度依赖发光体的发光，能够推算出所述微环境的温度。优选地，优选是荧光染料的所述温度依赖发光体以与随后在能够在该设备中执行的反应中使用的设定匹配的设定而被提供。例如在热循环仪中，微环境通常通过诸如管、瓶或孔的反应容器提供，其包括分立的液体量，特别是水溶液量。这种设定提供微环境，该微环境预计具有离散的温度以允许正确进行反应。因此，优选的是还在以与通常用于该反应中的相同的容器和优选同一标准体积的液体中、优选在水溶液中提供优选是荧光染料的发光体，以密切反映当设备被使用时将存在于微环境中的条件。这能够显著改善校准过程。
本发明基于以下发现：如果温度依赖发光体的发光强度在所述微环境中产生的特定绝对温度下被测量并因此被映射到所述特定绝对温度，则能够改善基于微环境中的温度的光学确定的温度依赖发光体的准确度。为了实现相应的映射，在根据本发明的方法中进行第一光学温度验证步骤。这里，通过使用具有特定的事件温度的至少一种热敏变色液晶(TLC)进行绝对温度测量。所述TLC被包括在相应的微环境中，因此，将(仅)对在微环境中发生的温度变化反应。微环境的温度然后优选通过改变微环境所处的环境的温度而在步骤c)中变化。
优选在步骤c)中同时记录环境的温度。如果在该微环境中达到事件温度，则TLC将改变其光学特性，从而提供在微环境中达到对应于所使用的TLC的事件温度的温度的信号。热敏变色液晶在事件温度下所观察到的光学特性变化允许在微环境中确定绝对温度。优选同时或几乎同时确定温度依赖发光体的荧光。因此，还可以在已经发生TLC的光学特性改变之后确定温度依赖发光体的发光。然而，这里，必须保证及时确定，以保证包括发光体的微环境内的温度仍然与微环境在发生TLC的光学特性时的温度相同。由此，可以确定和记录当在微环境中达到特定绝对温度、即TLC的事件温度时产生的所使用的温度依赖发光体的特定发光强度。因此，在本发明的方法中，在微环境中的温度依赖发光体的具体发光强度与微环境内的特定绝对温度相关，其中该微环境中的所述绝对温度由TLC的光学特性的变化表示。优选地，温度依赖发光体的发光至少在两个、优选至少在三个在本文中还称为校准温度的离散绝对温度确定。所述绝对温度能够在设备的操作过程中，通过使用其事件温度近似在校准温度下的不同的TLC来确定，该校准温度优选是用作或接近当设备在使用时应在微环境中建立的反应温度的温度。优选地，在事件温度测量的温度依赖发光体的荧光强度与温度事件一起存储。具有在两个或更多个离散点处的实际绝对温度并具有温度依赖发光体的相应发光，可以实现温度依赖发光体的相对发光到绝对温度的映射。因此，根据一个实施例，该方法包括将在一个或多个热敏变色液晶的事件温度下确定的一种或多种温度依赖发光体的相对发光映射到相应的绝对温度的步骤。因此，可以预先将温度依赖发光体的荧光强度确定为温度的函数，并且所述数据能够被存储在例如表或模型中。
在还在示例中示出的优选实施例中，温度依赖发光体和热敏变色液晶被提供在分开的微环境中，例如分开的反应容器中。通过在不同的微环境中提供温度依赖发光体和热敏变色液晶，在不与用来确定微环境中的绝对温度的热敏变色液晶干涉的情形下测量温度依赖发光体的发光成为可能。温度依赖性能够被定位在被放置在热循环仪的插座中的反应容器中，热敏变色液晶能够被定位在被放置在设备的另一个不同的插座中的不同的反应容器中。如果使用一种以上的温度依赖发光体，则每种温度依赖发光体都被放置在不同的反应容器中。此外，如果使用一种以上的热敏变色液晶，还优选在不同的反应容器中提供每种热敏变色液晶。每个反应容器中然后被放置在热循环仪的分开的容器中。合适的布置在示例中示出。
已经用于第一光学温度验证步骤的至少一种温度依赖发光体随后能够用于例如通过改变在微环境中的温度并且分析在微环境中达到的实际温度是否匹配根据设备的温度控制预计达到的期望温度，来验证例如热循环仪的设备的温度控制。该验证通过使用温度依赖发光体发射的光完成。已在第一光学温度验证步骤获得的数据允许更准确地确定在包括温度依赖发光体的微环境中达到的温度。因此，当使用根据本发明的方法时，温度控制的更精确调节是可能的。由于改善的温度确定的准确性，这将对在微环境中必须进行的过程的有效性具有积极作用。即使微环境在环境中旋转，该准确性也能实现。
另外，在第一光学温度验证步骤中得到的数据能够用于例如将例如由包括在环境中的温度传感器确定的所确定的环境温度与预计达到的所期望的微环境温度和如由TLC指示的实际微环境温度进行比较。已经在第一光学温度验证步骤中获得的信息对于进行温度控制分析且因此对于验证或校准在微环境中的温度测量是有用的。特别地，温度传感器的准确度和在微环境中建立的温度的准确度能够被分析并例如被验证或校准。因此，所述方法对于验证或校准在热循环仪中的温度测量是特别有用的。例如，如果发现在实际温度和在微环境中预计达到的温度中的差异，则能够执行适当的调节。
根据优选的实施例，根据本发明的方法包括第二光学温度验证步骤，该第二光学温度验证步骤包括以下：
a)在微环境中提供在该第一光学温度验证中使用的一种或多种温度依赖发光体，
b)改变该微环境的温度并利用光照射该微环境，
c)监测所发出的光。
在所述第二光学温度验证步骤中，例如能够测试PCR循环仪的温度分布。微环境的温度能够通过改变微环境中所处的环境的温度而变化。为测试温度控制的准确度和因此在“现实情况”设定中在微环境中达到温度的准确度，重要的是以下述动态设定来测试设备的温度控制，在该动态设定中，温度按照当设备处于其正常使用中时将完成地变化。利用由温度依赖发光体发射的光，可以分析设备的温度控制是否以这种设定精确工作并允许精确实现微环境内所期望的温度。在微环境中预计实现的期望温度然后能够与在微环境中基于由温度依赖发光体发出的荧光实现的实际温度进行比较。由于在第一光学温度验证步骤得到的数据，特别是发光体的相对发光到绝对温度的映射，在第二光学温度验证步骤期间在微环境中获得的绝对温度能够被更准确地确定。
优选例如使用被包括在环境中的温度传感器同步记录环境的温度。微环境的温度通常通过包括微环境的环境的温度而变化。所获得的数据能够被再次用于将如由温度传感器确定的所确定的环境温度与由该至少一种温度依赖发光体的发光来确定的实际的微环境温度和/或所期望的微环境的温度相比较。
从所述第二光学温度验证步骤所获得的信息能够被用来在需要的情况下在设备的温度控制系统中进行适当的补偿，使得在微环境中确实达到所期望的温度。
根据本发明的方法的进一步的特征和优选实施例将在下面更详细地描述。
根据一个实施例，在第一光学温度验证步骤使用至少两种、优选至少三种不同的热敏变色液晶，其中所述热敏变色液晶中的至少一种具有的特定事件温度不同于所述热敏变色液晶中的至少另一种的事件温度。优选地，在分开的微环境中提供该不同的TLC，然而，其中微环境具有相同的特性。优选地，测量该不同的热敏变色液晶的光学特性。不同的热敏变色液晶的数目可以指示为了微环境中的反应混合物的反应而将微环境控制到的温度的数目。不同的热敏变色液晶的事件温度可以对应于所期望的校准温度。
优选地，使用三种不同的热敏变色液晶，并且热敏变色液晶中的每种的光学特性优选在确定温度依赖发光体的发光、优选地在荧光强度的同一平衡状态下测量。不同的热敏变色液晶的数目增加了“映射”的准确度，因此，增加了在第二光学温度验证步骤中基于所述温度依赖发光体的发光确定微环境中的温度的准确度。根据一个实施例，所使用的TLC的事件温度相差至少10℃，优选至少15℃。
在优选的实施例中，使用至少三种不同的热敏变色液晶，其中第一热敏变色液晶具有处于40℃至60℃、优选45℃至55℃范围的事件温度，第二热敏变色液晶具有处于65℃至90℃、优选70℃至80℃范围的事件温度，第三热敏变色液晶具有处于85℃至95℃范围的事件温度。优选地，使用分别具有约50℃、约70℃或75℃和约90℃的三种热敏变色液晶。在第一光学温度验证步骤中能够使用同一类型的一种以上的TLC。使用同一类型的一种以上的TLC可以进一步提高准确度。
当在步骤中改变温度，并在每一个步骤中获得平衡状态时，假定环境的空气和在微环境中的液体的温度为相同的值。然而，强制控制温度控制正常工作。热敏变色液晶包括至少一个事件温度，光学特性在该至少一个事件温度突然改变，并且其中，所述改变能够由光学系统来检测出。当选择具有特定事件温度的适当的热敏变色液晶时，可以确定在事件温度下在微环境内的温度依赖发光体的发光、优选地荧光强度。一个优点是，能够在相对于随后在第二光学温度验证步骤中使用的微环境的同一设定/条件(例如所使用的反应容器、用于接纳发光体的液体的类型、所使用的发光体浓度等)下确定荧光强度，在该微环境中例如运行动态温度分布(如PCR分布)。此外，同一设定优选用于确定微环境中的温度，该微环境中的温度随后将用于利用设备进行的实际测定/反应，该设备优选是热循环仪。在这方面，同一设定/条件指对光学特性具有较大影响的条件和/或参数，如反应器中、优选为水溶液的所使用的液体、所使用的体积等。因此，能够确定例如与绝对温度相关的温度依赖荧光染料的荧光强度，与绝对温度相关的温度依赖荧光染料的荧光强度能够进一步用于分析温度控制是否能够在相应的微环境中建立准确的温度，这是由于荧光强度到至少一个、优选至少两个、更优选至少三个绝对温度的“映射”。因此，微环境的实际温度即使在微环境在腔室中旋转的情况下也能够被非常准确地确定。在确定温度的准确度方面的提高被认为是10％至15％。
优选地，为在微环境中的发光体选择设定，其模拟由在相应的微环境中的设备定期处理的反应组合物的热特性。例如当进行扩增反应时，在微环境中处理通常是水溶液的液体。因此，对于相应的设备，优选还在液体中，诸如例如在水溶液中，提供发光体。液体试样包括发光体，该发光体优选是荧光体，从而具有随温度变化经历可检测的变化的特性。优选地，荧光体被用作温度依赖发光体，该温度依赖发光体随温度经历荧光的连续变化，从而允许基于液体荧光来确定液体温度。合适的示例包括诸如派洛宁Y(Pyronin-Y)的荧光染料。作为微环境，优选使用当设备在使用中时常规使用的同一反应容器或者使用具有相同的光学或热特性的反应容器。此外，优选地，包括温度依赖发光体的液体的体积被选择为等于通常在微环境中提供的反应混合物的体积。优选的是约10μl至约100μl的体积，更优选10μl至50μl的体积。对于反应混合物的不同的体积，优选进行分开的验证以提供准确的结果。
通过在环境中保持同一温度，在同一次运行中、即在实质上相同的时间确定温度依赖发光体的荧光强度和热敏变色液晶的光学特性，以获得相同的条件和高度准确的“映射”。根据一个实施例，TLC的事件温度是微环境中的混合物的反应将要进行的感兴趣的温度或该感兴趣的温度中的一个或者至少接近所述反应温度(例如，如果没有发现具有刚好在反应温度的事件温度的适当的TLC，则例如在5℃至10℃的范围内)。
优选地，在事件温度下测量的荧光强度与事件温度一起被存储用于进一步使用。如上文所述，荧光强度的存储值能够被用来计算温度依赖发光体的荧光强度对温度的函数或映射温度依赖发光体的荧光强度对温度的函数。荧光强度的测量和存储值提供参考值和将荧光强度的表现拟合到测定值的可能性。
荧光强度到热敏变色液晶的事件温度、即绝对温度的映射允许基于绝对温度确定所使用的发光体的温度表现。因此，能够准确地确定温度依赖发光体在特定的绝对温度、即事件温度下，在具体微环境设定中如何表现。在进一步运行中，能够进行所需要的温度分布的校准或验证。由此，能够分析设备的温度控制是否正常工作。例如使用在设备中使用的、在环境中的常规的温度传感器进行所需要的热循环/分布，用于控制微环境的温度。此外，通过使用温度依赖发光体确定在微环境中的实际达到的温度，并且结果能够显示在例如显示器上。如果在微环境中的实际温度不对应于所需要的温度(或温度范围，如果小的变化是允许的)，则能够进行适当调节。例如，通过使用在热循环/分布中的发光体来确定的实际温度可以不仅被显示还可以被用来修改由环境中的温度传感器设定的分布，以获得在微环境中的温度的最优化。第二光学温度验证步骤可以重复进行，直到所期望的精确的温度控制实现。
优选地，确定具有彼此不同的温度依赖性的两种温度依赖发光体的荧光强度，其中两种温度依赖发光体优选被填充在分开的微环境中。微环境优选具有相同的特性。两种不同的温度依赖发光体在其温度依赖性方面不同，第一温度依赖发光体与第二温度依赖发光体相比具有更高的温度灵敏度。
使用两种不同的温度依赖发光体将改善确定温度的准确度从而改善在腔室的微环境中将要进行的过程的有效性。在优选的实施例中，两种发光体中的一种对具有较大的温度梯度的温度变化灵敏，而两种发光体中的另一种对具有较小的温度梯度的温度变化较不灵敏。对温度变化更灵敏的发光体的荧光强度优选由阿伦尼乌斯方程(Arrhenius方程)建模，而对温度变化较不灵敏的发光体的荧光强度可以通过经验性函数关系建模。
因此，根据一个实施例，模型被用于确定温度依赖发光体的荧光依赖性，并且在第一温度依赖发光体的情况下，该模型是经验函数关系FI(T)＝FI(Tref)·f(T/Tref)，在第二温度依赖发光体的情况下，该模型是Arrhenius方程其中FI(T)是在以开尔文形式给出的温度T的荧光强度；FI(Tref)是在以开尔文给出的在基准温度Tref下的荧光强度，c＝Enr/R，其中Enr是非辐射过程的活化能，R是气体常数。
用于建模发光体的荧光依赖性的适当公式的使用将进一步改进该方法。
在该方法的第一步骤中使用两种或更多种发光体的情况下，优选的是处于在感兴趣的温度范围的中间区域的温度下的发光体的浓度被选择为使得对于感兴趣的温度范围的中间区域的温度，不同发光体中的每种的荧光强度实质上具有相同的值。这将通过得到高信噪比改善荧光强度的测量，从而提高温度测量的准确度。
在优选的实施例中，确定在同一温度下测量的两种不同的温度依赖发光体的荧光强度的商(高灵敏温度依赖发光体/较不灵敏温度依赖发光体)，这将在准确可重复的温度测量方面提供改进，这也独立于用于照射和检测荧光、即光源和/或光电倍增管的温度的光学系统的变化。因此，由本发明所教导的使用两种不同的温度依赖发光体允许消除检测系统的漂移。这是重要的优点，这是因为光学漂移将导致具有累积误差的温度测量。因此，优选是荧光染料的第二发光体允许通过数学方法来补偿光学系统中的漂移。当使用诸如例如不包括用于补偿光学系统中的漂移的基准通道的热循环仪的设备时，这是特别的优点。
如上文所述，优选地，进行三组TLC的同步熔点确定，其中，每种TLC具有不同的事件温度，并且监测所使用的至少两种温度灵敏荧光染料的荧光强度。在第二光学温度验证中可以开始实际的PCR分布的温度验证之前，进行如上文所述的使用热敏变色液晶的静态第一光学温度验证。具有在三个离散点处的实际绝对温度并具有染料的相应荧光，染料的相对荧光到绝对温度的映射(在最小平方意义上)可以实现。优选在65℃和80℃、优选70℃和80℃之间的温度范围的中间选择基准温度Tref，最优选基准温度Tref是大约75℃。
优选地，使用具有实质上相同的光学特性的两种不同的温度依赖发光体来提高温度确定的准确度。术语“光学特性”应被理解为具有实质上相同的发射以及吸收光谱，使得在光路中使用的具有特定的窗口的滤波器能够适当地用于两种不同的发光体两者。优选地，对于两种发光体的在发射/吸收光谱中的峰值的波长位于约50nm、优选25nm、更优选20nm、最优选15nm的范围内。因此，两种发光体的激发和发射光谱以及其在由滤波器给定的窗口内的相对位置应尽可能好的匹配。
具体来说发光体的温度系数指示出其温度灵敏度。具有的温度灵敏度比另一种发光体的温度灵敏度高的发光体的温度系数的绝对值高于另一种发光体的温度系数的绝对值。具有较高的温度灵敏度的发光体的温度系数的绝对值可能是至少2.5％/℃、至少3％/℃、至少3.5％/℃、至少4％/℃、至少4.5％/℃或至少5％/℃。具有较高的温度灵敏度的发光体的温度系数的绝对值可能在2.5％/℃、优选4.5％/℃至7.5％/℃的范围中，其中甚至更高的温度系数是合适的。具有较小的温度灵敏度的发光体优选包括等于或小于2.5％/℃、等于或小于2％/℃、等于或小于1.5％/℃或者等于或小于1％/℃的温度系数的绝对值。具有较小的温度灵敏度的发光体的温度系数的绝对值可能在0.3％/℃至2.5％/℃的范围中，其中甚至更小的值可能被使用，但是，荧光强度的变化必须在检测极限以上。更优选地，两种发光体的温度灵敏度与相应的发光体的温度系数的比率相关。根据一个实施例，具有较高的温度灵敏度的发光体和具有较小的温度灵敏度的发光体的温度系数的比率是至少1.5、更优选至少2.0、甚至更优选至少2.5，并且最优选至少3.0。
优选地，派洛宁Y用作高灵敏的温度依赖发光体。派洛宁Y具有约-5.5％/℃的温度系数。作为较不灵敏的温度依赖发光体，优选使用阿托532(Atto 532)。阿托532具有约-1.4％/℃温度系数。然而，能够使用还有其他的温度依赖发光体、优选的是温度依赖荧光染料。例如HEX、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素也能够用作较小温度依赖荧光染料。其具有小于约-0.5％/℃的温度系数。各染料如在Liu和Sullivan的Pressure andTemperature Sensitive Paints,2004(ISBN-10:3540222413)中描述。
根据一个实施例，热敏变色液晶用于在一个微环境中与发光体组合。在优选的实施例中，热敏变色液晶关于光学系统的光路至少部分地被定位在所述发光体之前或之后。使用相应的热敏变色液晶/发光体组合实质上用于以下目的：灵敏地指示出在微环境内何时达到热敏变色液晶的事件温度，这是因为然后热敏变色液晶/发光体组合的发光急剧变化。相应的热敏变色液晶/发光体的组合如在WO03/102522中描述。这种组合能够在本发明中与一种或多种温度依赖发光体组合使用。如上文所述，还用于基于(取决于温度的)发射的光确定微环境中的温度的一种或多种温度依赖发光体优选地提供在分开的微环境中，诸如在具体分开的反应容器中，如本文所述。通过使用这种布置，相同的光学元件、即特别是滤波器能够在确定温度依赖发光体的荧光强度时使用。在使用这种布置的情况下，不需要切换到光学系统的另一个通道。优选地，热敏变色液晶被包含在由发光体包覆的作为微环境的反应容器中，诸如瓶或管中。该发光体不需要与所使用的温度依赖发光体中的一种相同。所使用的发光体甚至不需要是温度依赖的。然而，为方便简单，可以使用与用于测量荧光强度的温度依赖发光体相同的温度依赖发光体。管或瓶能够从外部或内部利用发光体进行包覆。发光体还可以在典型由塑料制成的容器或瓶的制造过程中，通过注塑成形结合到瓶或管的壁中。根据进一步的实施例，透明反应容器或瓶用于TLC，透明反应容器或瓶不包括任何斯托克斯频移产生插入物。这里，优选使用例如红色发光二极管(625nm)和朝较长波长开放的滤波器，诸如滤波器610hp。相应的设定能够例如与荧光染料派洛宁Y和阿托532或具有类似的激发和发射特性的温度依赖荧光染料一起使用。
优选地，在第一光学温度验证步骤的步骤c)中，温度通过使用具有开始点和结束点的温度分布而变化，其中在该开始点和该结束点之间的用于加热的步长被设定为小于1℃，优选被设定为约0.1℃至0.2℃，并且用于每步的保持时间被设定为大于10秒。优选地，该保持时间被设定为约20秒，最优选被设定为约30秒。根据一个实施例，步骤c)中的温度变化是约0.1℃的增量。开始点和结束点优选被设定到TLC的标称熔点的约+/-2.5、优选1.5的温度。在校准过程中这种“温和”的温度分布将引起几乎稳定或平衡状态的测量，这继而改善了校准过程和温度确定。
根据一个实施例，在第二光学温度验证的步骤b)中，运行包括几个不同的温度阶段的动态温度分布，并且其中，该温度阶段中的至少一个不同于至少一个热敏变色液晶的事件温度。如上文所述，相应的动态温度分布可以对应于PCR分布。
根据一个实施例，通过将包含相同的微环境的测量结果取平均和/或忽略相对于其他所测量的荧光强度的每个超出以百分比给定的阈值的测量结果来减小荧光强度的错误测量结果的影响。
根据优选的实施例，一种或多种不同的热敏变色液晶和一种或多种不同的温度依赖发光体提供在分开的微环境中。因此，每种不同的化合物/元素都被包括在分开的微环境中。优选的是以多组提供各种温度依赖发光体以及不同的TLC。这再次增加了准确度。优选地，当布置在热设备的转子中时，TLC被分组在一起，并且以交替设定提供温度依赖发光体。
优选地，在第一光学温度验证步骤已经被执行之后，在进行第二光学温度验证步骤之前去除热敏变色液晶。如上文所述，使用温和的温度分布进行第一光学温度验证步骤。然而，在第二光学温度验证步骤中使用用于相应的设备实施的温度分布，例如PCR分布。这可能急剧降低TLC使用寿命。因此，优选仅在第一光学温度验证步骤中使用TLC来进行所使用的温度依赖发光体的发光(其中优选使用两种如上所述的发光体并产生商)到由TLC发出信号的绝对温度的映射。以后，在第二光学温度验证步骤，它们被去除并且例如由水代替。
如上所述，微环境优选是反应容器，分别对应于包括在上述反应容器中的液体。
该设备优选是热循环仪。根据上文应当理解，设备具体针对用于核酸扩增的热循环仪，其中反应容器被支撑在可旋转的圆形转盘上，该可旋转的圆形转盘可旋转地安装在腔室内。用于与装置一起使用的具体优选的热循环仪是由Qiagen GMBH公司(www.qiagen.com)制造和销售的热循环仪族Rotor-GeneTM，最优选是Rotor-Gene Q。其他类似设备在国际PCT公开No.WO 92/20778和WO98/49340中描述。然而，应当理解，其他市售的热循环仪可以被修改以进行操作，如上文所述。
已经存在于热循环仪中的光学系统能够用来准确地确定温度依赖发光体的荧光强度以及至少一种热敏变色液晶的光学特性。因此，用于执行根据本发明的方法的光学系统可以是在优选为热循环仪的设备中提供的光学系统，以基于微环境中包含的反应混合物中的指示剂的颜色感测反应状态。光学系统能够包括诸如发光二极管的照明光源和相应的用于检测反射光的诸如光电倍增器的光学检测器。
根据第二方面，本发明提供了一种用于验证或校准热空气循环仪的温度控制的系统，该热空气循环仪包括转子，该转子包括用于微环境的插座，其中所述转子包括在微环境中的：
a)两种或更多种不同的热敏变色液晶，每种热敏变色液晶具有不同的事件温度，和
b)一种或多种温度依赖发光体。
相应系统的细节、特别是微环境、TLC和温度依赖发光体在上文进行了详细描述，并参考也适用于本文的相应公开内容。因而，随后只有几个特点被再次描述。优选地，用于测量在不同的绝对温度下的发光的不同的热敏变色液晶和一种或多种温度依赖发光体被提供在不同的即分开的微环境中。然而，如上文所述它们分别在一个循环中被测量。例如所使用的每种热敏变色液晶和每种不同的温度依赖发光体能够被放置在被放置在转子的分开的插座中的分开的反应容器中。实施例在示例中示出。优选地，该系统包括在其温度依赖性上不同的两种不同的温度依赖发光体。第一温度依赖发光体与第二温度依赖发光体相比具有更高的温度灵敏度。所述两种不同的温度依赖发光体关于激发和发射表现优选具有实质上相同的光学特性。优选地，包括派洛宁Y和阿托532作为发光体。不同的热敏变色液晶的事件温度优选相差至少10℃、优选至少15℃。如上文所述，优选使用三种不同的TLC。其特性如上文所述。相应的系统能够被用于根据第一方面的方法。
根据第三方面，本发明涉及一种用于分析预计在微环境中建立限定温度的设备的温度控制的光学方法，其中所述方法基于利用温度依赖荧光体，其中使用在其温度依赖性方面不同的至少两种不同的温度依赖发光体，用于补偿光学系统的光学偏移并确定在同一温度下该第一温度依赖发光体和该第二温度依赖发光体的荧光强度的商。该第一温度依赖发光体与该第二温度依赖发光体相比具有较高的温度敏感度。如上文所述，所述两种不同的温度依赖发光体关于激发和发射表现优选具有实质上相同的光学特性。用于测量在其温度依赖性方面不同的两种温度依赖发光体的细节在上文详细描述并参考也适用于本文的相应公开内容。
本发明并不受本文所公开的示例性方法和材料的限制。数字范围包括定义该范围的数字。本文所提供的标题不是本发明的各个方面或实施例的限制，本发明的各个方面或实施例能通过作为整体参考说明书被理解。根据一个实施例，本文描述的主题当在方法的情况下包括特定步骤时或当包括特定部件时指由相应的步骤和部件组成的主题。优选是选择和结合本文所描述的优选实施例并且从相应的优选实施例的组合产生的特定主题也属于本发明。
附图说明
现在将参照附图详细描述本发明的示例，其中：
图1是用于检测和可选控制微环境的温度的设备的示意图；
图2是对于温度依赖性荧光体的荧光强度对温度的示意曲线图；
图3是对于具有彼此不同的温度依赖性的两种温度依赖性荧光体的荧光强度对温度的示意曲线图；
图4是第一温度依赖发光体的荧光强度除以第二温度依赖发光体的荧光强度对温度的曲线图；
图5是包含在微环境中的热敏变色液晶的示意图，该微环境被喷涂有荧光染料以简化事件温度的检测，以及
图6为示意性示出微环境中的每个的内容物的转子布局的表。
具体实施方式
图1示意性地示出装置1，装置1用于在热循环过程期间检测并可选控制包含在瓶或管中的液体的温度。装置1可以是PCR循环仪或热循环仪或者是PCR循环仪或热循环仪的部分。
装置1包括腔室2，腔室2建立环境并且包含作为微环境3的至少一个反应腔室，微环境3中可以包含诸如反应混合物的液体4。装置1典型包括耦接到加热器6和制冷器7的、例如处理器的控制器5。加热器6典型是被布置以加热腔室2中的空气的对流加热器或相似的加热器。加热/制冷腔室2将影响微环境3的温度并因而影响液体4的温度。制冷器7可以是风扇。在腔室2中布置连接到控制器5的温度传感器8。利用温度传感器8，腔室2内部的温度能够由控制器5感测。此外，控制器5可操作地连接到加热器6和制冷器7。
在使用中，控制器5典型地执行指令以允许装置被控制。在这方面，使用者将典型地选择所期望的热循环过程，包括所期望的温度分布。这允许控制器5访问指令并控制装置1，因而使装置1执行所选择的热循环过程。
微环境3由布置在可旋转的转子9的插座中的管或瓶形成，其中转子9优选包括60或72个插座以容纳相应数目的管或瓶、即微环境3。
转子9可以包括用于实现快速简单处理被容纳在转子9的插座中的几个微环境3的更换的部分。提供马达10，转子9能够借助于马达10旋转。
控制器5能够访问、即写和/或读存储器，表存储在该存储器中，根据该表，控制器能够识别容纳在转子9的插座中的微环境3的内容物。
为研究目的，能够通过将转子9旋转到微环境3因而其中的内容物能够由布置在腔室2外部的光源11照射的位置来放置每个微环境3，光源11优选是发光二极管。从光源11发出的光经过腔室2中在光路上的滤波器12。光检测器13设置在腔室2外部，用于检测作为波长的函数的光强度。检测器13可以包括滤波器和光电倍增管。检测器13被可操作地连接到控制器5，用于接收所测量的荧光强度以及用于设定检测器13的增益。
在微环境3包含温度依赖发光体尤其是以具有预先确定浓度的水溶液形式的温度依赖发光体的情况下，当控制器5使转子9旋转到相应位置时，微环境3中的温度依赖发光体能够由光源11照射。在照射微环境3中的温度依赖发光体之后，所发射的荧光强度可由检测器13检测到。
利用温度传感器8的信号，可以获得由腔室2中的温度传感器8感测的温度，同时确定在该温度的微环境3的荧光强度。因此，能够确定微环境3的温度与腔室的2温度的相关性。
另外，作为对于特定温度依赖发光体的温度函数的荧光强度被存储在存储器中的表(或模型或函数)中，该存储器能够由控制器5访问，使得当由检测器13确定荧光强度时，可以根据可由控制器5访问的温度依赖发光体的表或模型来确定微环境3中的温度。
在图2中对于温度依赖性荧光体示出荧光强度对温度的曲线图的示例。能够看出，荧光强度明显指示出测量荧光强度时的温度。因此，通过借助于检测器13测量由发光体发出的荧光强度，能够确定温度依赖发光体的温度。
在具有彼此不同的温度依赖性的两种不同的温度依赖发光体用于两个相应的微环境3中的情况下，即在转子9中的至少两个瓶或管填充有预先确定的浓度的相应的发光体的水溶液的情况下，两种温度依赖染料中的每种的荧光强度能够被测量出。根据所利用的每个微环境3的内容物能够被识别的表，可以得到温度依赖发光体中的每个的荧光强度。
当使用不同的荧光强度时，使用具有彼此不同的温度依赖性的两种彼此不同的温度依赖发光体可以补偿光学系统中的偏移。这在图3中指示，其中对具有彼此不同的温度依赖性的两种温度依赖发光体绘制荧光强度对温度的曲线图。使用两种不同的温度依赖发光体，通过使用两种温度依赖发光体的不同的荧光强度而不是单一发光体的绝对荧光强度来确定微环境3的温度。由于不同的荧光强度，能够使用两种不同的温度依赖发光体的荧光强度的商。
然而，在实际PCR分布的温度验证可以开始之前，可能执行使用热敏变色液晶的静态光学温度验证。这将允许绝对温度测量，并且提高了温度测量的准确度。
用于光学温度验证的不同的热敏变色液晶的数量将增加荧光强度能够映射到的绝对温度的数量。在将使用三种不同的热敏变色液晶的情况下，这将允许在三个离散的温度下的绝对温度测量。
优选地热敏变色液晶被选择成使得液晶的事件温度等于或接近特定温度，该特定温度是感兴趣的过程/过程的步骤所需要的温度，并且将在微环境3中的过程/过程的步骤期间维持该特定温度。在装置1是PCR循环仪的情况下，可以使用具有在约50℃、约75℃和约90℃的熔点的至少两种不同的热敏变色液晶。
为获得实际绝对温度，观察热敏变色液晶的光学特性。同时温度依赖发光体的荧光强度被监测并映射到绝对温度。在微环境3的液体4中具有在三个离散点的实际绝对温度并具有荧光温度依赖染料的相应荧光强度，可以实现荧光依赖染料3的相对荧光强度到绝对温度的映射(在最小平方意义上)。
微环境3的液体4中的或作为液体4的温度依赖发光体的所测量的荧光强度被认为是以下参数的函数：
FI(T,cdye,cio,g(t)),
其中T是包含发光体的水溶液的微环境3内的温度；cdye是染料在水溶液中的浓度，cdye被认为是随时间不变，cio是关于微环境3的常数，并描述光耦合进和耦合出微环境3的效率如何，常数cio被认为是随时间不变；g(t)是包括光源11和检测器13的光电倍增管的采集系统的、作为时间的函数的整体“增益”(实际的增益主要受光源11的温度影响，然而，光电倍增管和光源11的实际温度不可获得)。
借助于使用两种不同的温度依赖发光体的校准过程，可以区分影响测量结果的时间依赖性(随研究时段变化)和时间依赖因子。时间依赖项应通过除法消除。因此，校准过程实现时间独立因子cdye和cio到图4示意性地示出的曲线的正确映射。图4示意性地示出高温度灵敏染料(派洛宁Y)的荧光强度除以低温度灵敏发光体(阿托532)的荧光强度的结果。
在两种温度发光体具有不同的温度依赖性情况下，必须在相同的增益设定的情形下为两种发光体中的每种完成读数获取，以允许比较为具有不同的温度依赖性的两种发光体中的每种测量的荧光强度。
由于转子9包括几个插座，优选不仅测量仅一个包含温度依赖发光体的微环境3的荧光，还测量多个以几乎相同的浓度和相同的体积包含相同的温度依赖发光体的微环境3的荧光。对以特定浓度包含特定温度依赖发光体的多个微环境3进行平均应使信噪比改善。
在利用具有72个插座并且因此具有72个瓶/管/微环境3的转子9的情况下，利用下面的转子布局：微观环境3中的30个被填充有具有彼此不同的温度依赖性的两种温度依赖发光体中的第一种，微环境3中的30个填充有具有彼此不同的温度依赖性的两种温度依赖发光体中的第二种。优选地，发光体以交替顺序填充在微环境中3。以相同的浓度具有同一发光体的30个微环境3的测量将以提高信噪比。
使用具有实质上相同的温度依赖发光体的内容物的至少两个或更多个微环境3会使得由测量产生的误差最小化，这是因为能够进行测量的荧光强度的平均。使用具有实质上相同的温度依赖发光体的内容物的至少三个或更多个微环境3将通过能够排除相对于其他测量结果的每一个的所测得的荧光强度而言超出以百分比给定的预先确定的阈值的那些测量结果，而使得误差最小化。
对于具有彼此不同的温度依赖性的两种不同的温度依赖发光体，使用派洛宁Y和阿托532。两种染料的激发和发射光谱以及其在滤波器12/或检测器13中的滤波器的窗口中的相对位置匹配非常好。能够使用具有530+/-2nm的中心波长和10+/-2nm的在半最大值处的全宽度的激励滤波器。能够使用具有557+/-2nm的中心波长和10+/-2nm的半高全宽的发射滤波器。因此，在装置1是PCR循环仪的情况下——能够使用PCR循环仪的黄色通道。
通过使用具有“匹配”的激发/发射光谱和在由光学通路中的滤波器给定的窗口中的相对位置的两种不同的温度依赖发光体，可以获得良好的信噪比，这是因为能够使用适合测量两种不同的温度依赖发光体两者的滤波器。
当使用在图5中示意性地示出的微环境3时，利用用于测量包含在被容纳在转子9中的其他微环境3中的温度依赖发光体的荧光强度的光学系统，可以准确地观察TLC 14的事件温度。在图5所示的微环境3被涂有适当的相应发光体15以实现从530nm(绿色激发)到557nm(黄色检测)的频移。通过当照射图5所示的微环境3并加热腔室2时监测检测器13的输出，能够确定包含在微环境3中的TLC 14的光学特性何时在事件温度下突然变化。
然而，透明的微环境3可以与发射具有大约625nm的波长的光的作为光源11的红色发光二极管和朝较长波长开放的滤波器(610hp)，一起使用。
包含TLC的微环境3应该与包含温度依赖发光体的微环境3分开。光学温度验证通过使用“温和的”熔融分布完成。使用具有上突(overshot)的现实PCR分布可能显著降低TLC的使用寿命。因此，TLC仅用于在开始与至少一种温度依赖发光体一起进行从来自两种温度依赖发光体、即派洛宁Y和阿托532测量的荧光强度到绝对温度的映射。映射之后，具有TLC的微环境中3可以由空微环境3/管/瓶组成的转子部分更换。然后，仅利用温度依赖发光体进行第二光学温度验证步骤。
图6是转子布局的示例，即，具有用于微环境3的72个插座的转子9的微环境3的内容物。TLC1表示在约50℃熔化的TLC，TLC2表示在约75℃熔化的TLC，TLC3表示在约90℃熔化的TLC，FD1表示第一温度依赖发光体，FD2表示第二温度依赖发光体。在插座18至69中包括温度依赖发光体FD2和FD1的微环境交替布置。
具有在三个离散点的实际绝对温度并具有温度依赖发光体的相应发光，可以实现温度依赖发光体的相对发光对绝对温度的映射。
荧光强度的温度依赖性能够通过Arrhenius方程来建模
其中FI(T)是在以开尔文给出的温度T的荧光强度；FI(Tref)是在以开尔文给出的(并且被选择为在感兴趣的温度范围的)基准温度Tref的荧光强度，c是Enr/R，其中Enr是在非辐射过程的活化能，R是气体常数；Tref是以开尔文测量的基准温度，T是以开尔文测量的温度。在PCR循环仪是装置1的示例中，Tref优选设定为75℃。Arrhenius方程最适合派洛宁Y。
或者荧光强度的温度依赖性能够通过利用以下拟合的较简单的启发式方法来建模
FI(T)＝FI(Tref)·f(T/Tref)，
其中，f是多项式、指数或其他函数。与派洛宁Y相比，阿托532的量子产率对于温度较不灵敏，所以阿托532由较简单的启发式方法来建模。
“光学漂移补偿”荧光强度、即派洛宁Y的荧光强度除以阿托532的荧光强度(图4中示意性地示出)可通过下面的方程来模拟：
其中Tref＝343.15K，a＝0.9959，b＝4,597.7，c＝-385,190，d＝1,487.8。
即使当使用不允许例如发光二极管的光源11的温度的独立测量的环境2，例如PCR循环仪时，使用具有不同的温度灵敏度的两种发光体也将允许补偿在光学/检测系统中的任何漂移。
接着，给出在PCR循环仪中、具体是由Qiagen GMBH(www.qiagen.com)生产和销售的Rotor-GeneTM族的PCR循环仪中、最优选是Rotor-Gene中的温度分布的热验证(校准)的详细操作：
1)热敏变色液晶三个标称熔点由使用者输入或者由控制器5执行的软件根据转子9的序列号(由使用者输入)解析它们。
2)使用者将包含发光体的转子9的部分放在转子9中。当使用派洛宁Y和阿托532时，能够使用Py-Y-/Atto-部分。
3)使用者将包括热敏变色液晶的转子9的部分放在转子9中。
4)提示使用者选择分布，对该分布应当监测/验证微环境3中的温度。
5)使用者开始校准过程(所测量的两种发光体的相对荧光强度到由热敏变色液晶的熔点给出的绝对温度的初始映射：
-软件在对包含派洛宁Y的微环境3/管的所选择的分布中出现的最低温度处在黄色通道上执行自动增益。以荧光强度的任意单位给出的目标荧光(所有微环境3所含派洛宁Y的平均)为90+/-5，相应的增益被存储。
-软件在标准OTV过程的中间温度下(约75℃下)进行预处理。
-软件在红色通道上进行自动增益校准“没有斯托克斯频移”(即发光二极管625nm/发射滤波器610hp)。具有约75℃的熔点的、包括TLC的微环境3的目标荧光(对应的包含TLC的微环境3的平均)以荧光强度的任意单位给出为50+/-5。相应的增益被存储。
-软件在中间温度热敏变色液晶的标称熔点(约75℃)附近(+/-1.5℃)开始熔化分布。步长为0.2℃，保持时间为30秒。熔化分布包括在黄色通道上和在红色“无斯托克斯频移”通道上的两次采集。
-软件在标准OTV过程的h最高温度下(约90℃下)进行预处理。
-软件在红色通道上进行自动增益校准“没有斯托克斯频移”(即发光二极管625nm/发射滤波器610hp)。具有约90℃的熔点的、包括TLC的微环境3的目标荧光(微环境所包含的对应TLC的平均)以荧光强度的任意单位给出为50+/-5。相应的增益被存储。
-软件在高温度热敏变色液晶的标称熔点(约90℃)附近(+/-1.5℃)开始熔化分布。步长为0.2℃，保持时间为30秒。熔化分布包括在黄色通道上和在红色“无斯托克斯频移”通道上的两次采集。
-软件在标准OTV过程的最低温度下(约50℃下)进行预处理。
-软件在红色通道上进行自动增益校准“没有斯托克斯频移”(即发光二极管625nm/发射滤波器610hp)。具有约50℃的熔点的、包括TLC微环境3的目标荧光(对应的包含TLC的微环境的平均)以荧光强度的任意单位给出为50+/-5。相应的增益被存储。
-软件在低温度热敏变色液晶的标称熔点(约50℃)附近(+/-1.3℃)开始熔化分布。步长为0.2℃，保持时间为30秒。熔化分布包括在黄色通道上和在红色“无斯托克斯频移”通道上的两次采集。
-三种TLC的熔点被确定。以具有两种发光体(派洛宁Y和阿托532)的微环境3的任意单位的对应的荧光强度与TLC的标称熔点一起用于使预先确定的模型表现符合当前设置。
6)提示使用者将转子9的包括包含TLC的微环境3的部分更换为填充水或为空的微环境3。
7)使用者确认所请求的使用者操作。
8)软件利用在黄色通道上的连续采集开始分布执行。在分布中定义的正常采集被延长持续时间(4秒)代替。
9)在黄色通道上的连续采集被映射到绝对温度。由时间信息和所测量的温度组成的序列被存储。
Claims (27)
1.一种适合用于分析预计在微环境中建立限定温度的设备的温度控制的方法，所述方法包括第一光学温度验证步骤，所述第一光学温度验证步骤包括：
a)在微环境中提供一种或多种热敏变色液晶，其中，所述一种或多种热敏变色液晶都具有特定的事件温度，
b)在微环境中提供一种或多种温度依赖发光体，
c)使在所述微环境中的温度变化并利用光照射所述微环境，
d)当在所述微环境中达到所述一种或多种热敏变色液晶的事件温度时，记录所述一种或多种温度依赖发光体的发光，
其中，在步骤d)中，在微环境中的温度依赖发光体的特定发光强度与所述微环境内的特定绝对温度相关，其中，所述微环境中的所述绝对温度由所述热敏变色液晶的光学特性的变化来指示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于测量在不同的绝对温度下的所述发光的所述一种或多种温度依赖发光体和所述一种或多种热敏变色液晶被提供在不同的微环境中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述微环境是反应容器。
4.根据权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中，所述方法包括第二光学温度验证步骤，所述第二光学温度验证步骤包括以下：
a)在微环境中提供在所述第一光学温度验证步骤中使用的一种或多种温度依赖发光体，
b)改变微环境的温度并利用光照射所述微环境，
c)监测所发出的光。
5.根据权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中，所述第一光学温度验证步骤的步骤a)具有特征(i)-(iii)中的一个或多个：
(i)所述一种或多种热敏变色液晶的事件温度对应于所期望的校准温度；
(ii)使用至少两种不同的热敏变色液晶，其中，所述热敏变色液晶中的至少一种具有不同于所述热敏变色液晶中的至少另一种的事件温度的特定的事件温度；和/或
(iii)以包括两种或多于两种相同的热敏变色液晶的组来使用各种不同的热敏变色液晶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述特征(ii)是：
使用至少三种不同的热敏变色液晶，其中第一热敏变色液晶具有处于45℃至55℃范围的事件温度，第二热敏变色液晶具有处于70℃至80℃范围的事件温度，第三热敏变色液晶具有处于85℃至95℃范围的事件温度。
7.根据权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中，在所述第一光学温度验证步骤的步骤b)中，设置在温度依赖性方面不同的两种不同的温度依赖发光体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述两种不同的温度依赖发光体中，第一温度依赖发光体具有比第二温度依赖发光体的温度灵敏度更高的温度灵敏度。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，生成所述第一温度依赖发光体的荧光强度除以所述第二温度依赖发光体的荧光强度的商，所述第一温度依赖发光体的荧光强度和所述第二温度依赖发光体的荧光强度是在同一事件温度下确定的。
10.根据权利要求7所述的方法，具有特征i-iii中的一个或多个：
i.使用实质上具有相同的光学特性的两种不同的温度依赖发光体；
ii.使用两种不同的温度依赖发光体以消除检测系统的漂移；
iii.派洛宁Y和阿托532被用作所述两种不同的温度依赖发光体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第一光学温度验证步骤的步骤c)中，通过使用具有开始点和结束点的温度分布来使温度变化，其中，用于在所述开始点和所述结束点之间的加热的步长被设定为小于1℃，并且用于每步的保持时间被设定为大于10秒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，用于在所述开始点和所述结束点之间的加热的步长被设定为约0.1℃至0.2℃。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述保持时间被设定为约30秒。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述第二光学温度验证步骤的步骤b)中运行动态温度分布，所述动态温度分布包括几个不同的温度阶段，并且其中，所述温度阶段中的至少一个不同于至少一个热敏变色液晶的事件温度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，通过对包含相同的微环境的测量结果取平均和/或忽略相对其他所测量的荧光强度的每一个超出以百分比给定的阈值的测量结果，来减小所述荧光强度的错误测量的影响。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，在一个微环境中与发光体组合地使用所述热敏变色液晶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述一种或多种热敏变色液晶关于光学系统的光路至少部分地被放置在温度依赖发光体之前或之后。
18.根据权利要求4所述的方法，具有特征(i)-(ix)中的一个或多个：
(i)所述方法用于验证和/或校准微环境中的温度测量结果；
(ii)包括所述微环境的所述温度受控制的环境的温度在所述第一光学温度验证步骤和/或所述第二光学温度验证步骤中被记录；
(iii)所述一种或多种不同的热敏变色液晶和所述一种或多种不同的温度依赖发光体被提供在分开的微环境中；
(iv)所述温度依赖发光体是荧光染料；
(v)关于实质上影响所述微环境的温度和/或光学特性，以与在相应的微环境中由所述设备执行的反应条件相对应的微环境设定来提供所述一种或多种温度依赖发光体；
(vi)所述一种或多种温度依赖发光体被提供在水溶液中；
(vii)所述一种或多种热敏变色液晶在执行所述第二光学温度验证步骤之前被去除；
(viii)所述微环境是反应容器，和/或
(ix)所述设备是热循环仪。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述设备是：
(i)热循环仪，所述热循环仪包括金属块，所述金属块包括用于接纳反应容器的插座，或
(ii)热循环仪，所述热循环仪包括旋转元件，所述旋转元件用于接纳位于加热环境中的所述反应容器。
20.一种用于验证或校准热空气循环仪的温度控制的系统，所述热空气循环仪包括转子，所述转子包括用于微环境的插座，其中，所述转子包括在微环境中的：
a)两种或多于两种不同的热敏变色液晶，每种热敏变色液晶都具有不同的事件温度，和
b)一种或多种温度依赖发光体，
其中，在微环境中的温度依赖发光体的特定发光强度与所述微环境内的特定绝对温度相关，其中，所述微环境中的所述绝对温度由所述热敏变色液晶的光学特性的变化来指示。
21.根据权利要求20所述的系统，其中，所述不同的热敏变色液晶和所述一种或多种温度依赖发光体都被提供在不同的微环境中。
22.根据权利要求20或21所述的系统，其中，包含所述热敏变色液晶的微环境与包含所述一种或多种温度依赖发光体的微环境分开。
23.根据权利要求20或21所述的系统，其中，所述微环境是反应容器。
24.根据权利要求23所述的系统，其中，所述微环境中的每一个被提供在所述转子的不同插座中。
25.根据权利要求20所述的系统，具有特征(i)-(vii)中的一个或多个：
(i)所述不同的热敏变色液晶和所述一种或多种温度依赖发光体被提供在不同的微环境中；
(ii)所述系统包括在温度依赖性方面不同的两种不同的温度依赖发光体；其中，在所述两种不同的温度依赖发光体中，第一温度依赖发光体比第二温度依赖发光体具有更高的温度灵敏度，使用实质上具有相同的光学特性的两种不同的温度依赖发光体；
(iii)所述温度依赖发光体是荧光染料；
(iv)关于实质上影响所述微环境的温度和/或光学特性，以与在相应的微环境中由设备执行的反应条件相对应的微环境设定来提供所述一种或多种温度依赖发光体；
(v)所述一种或多种温度依赖发光体被提供在水溶液中；
(vi)所述系统包括派洛宁Y和阿托532作为温度依赖发光体，和/或
(vii)所述不同的热敏变色液晶的事件温度相差至少10℃。
26.根据权利要求25所述的系统，其中，所述不同的热敏变色液晶的事件温度相差至少15℃。
27.根据权利要求20至26中的任何一项所述的系统在根据权利要求1至19中的任何一项所述的方法中的使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP11186023 | 2011-10-20 | ||
| EP11186023.5 | 2011-10-20 | ||
| PCT/EP2012/070856 WO2013057308A2 (en) | 2011-10-20 | 2012-10-22 | Method for verifying a temperature measurement in a micro-environment and system for verifying a temperature measurement in a micro-environment |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104246458A CN104246458A (zh) | 2014-12-24 |
| CN104246458B true CN104246458B (zh) | 2018-11-02 |
Family
ID=47076212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201280051489.4A Expired - Fee Related CN104246458B (zh) | 2011-10-20 | 2012-10-22 | 用于验证微环境中的温度测量结果的方法和系统 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9976917B2 (zh) |
| EP (1) | EP2769189A2 (zh) |
| JP (1) | JP6174591B2 (zh) |
| CN (1) | CN104246458B (zh) |
| AU (1) | AU2012324791B2 (zh) |
| WO (1) | WO2013057308A2 (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102917796B (zh) * | 2010-04-20 | 2015-04-01 | 科贝特研究私人有限公司 | 温度控制方法和设备 |
| JP6276405B2 (ja) | 2013-07-22 | 2018-02-07 | トリンゼオ ヨーロッパ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 重合反応開始剤 |
| DE102014114748B3 (de) * | 2014-10-10 | 2015-10-08 | Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie, dieses vertreten durch den Präsidenten der Bundesanstalt für Matrialforschung und -prüfung (BAM) | Fluorometrische Temperatursensorik mit FRET-basierten Molecular Beacons in molekularbiologischen und diagnostischen Assays |
| CN106595898A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-04-26 | 深圳天珑无线科技有限公司 | 一种温度提示装置及终端 |
| TWI709733B (zh) * | 2018-06-11 | 2020-11-11 | 熱映光電股份有限公司 | 高溫熱橋效應及低溫熱橋效應的量測方法及其量測系統 |
| CN110068591B (zh) * | 2019-04-04 | 2021-09-14 | 南京邮电大学 | 一种测量石墨烯在室温范围内微米尺寸区域温度的系统及其方法及可视化算法 |
| CN110207843B (zh) * | 2019-07-12 | 2021-02-19 | 南昌航空大学 | 一种变色显示检测温度的方法 |
| CN112880881B (zh) * | 2021-03-31 | 2022-02-01 | 同济大学 | 一种研究光致发光溶液发光强度对温度敏感特性的实验系统 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3142755A (en) * | 1960-12-13 | 1964-07-28 | Leroux Jean-Pierre | Method of determining temperature by means of a phosphorescent substance, and measuring apparatus for the employment of said method |
| DD270448A3 (de) * | 1986-09-16 | 1989-08-02 | Univ Halle Wittenberg | Verfahren zur kalibrierung von temperatur-messvorrichtungen |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4455741A (en) * | 1982-02-11 | 1984-06-26 | At&T Bell Laboratories | Fabrication of solid state electronic devices using fluorescent imaging of surface temperature profiles |
| US4708494A (en) * | 1982-08-06 | 1987-11-24 | Marcos Kleinerman | Methods and devices for the optical measurement of temperature with luminescent materials |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US5079352A (en) | 1986-08-22 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US4988617A (en) | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5091310A (en) | 1988-09-23 | 1992-02-25 | Cetus Corporation | Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction |
| US5075216A (en) | 1988-09-23 | 1991-12-24 | Cetus Corporation | Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase |
| US5066584A (en) | 1988-09-23 | 1991-11-19 | Cetus Corporation | Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction |
| US5023171A (en) | 1989-08-10 | 1991-06-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Method for gene splicing by overlap extension using the polymerase chain reaction |
| US5104792A (en) | 1989-12-21 | 1992-04-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method for amplifying unknown nucleic acid sequences |
| WO1992020778A1 (en) | 1991-05-24 | 1992-11-26 | Kindconi Pty Limited | Biochemical reaction control |
| DE9402646U1 (de) * | 1994-02-18 | 1994-05-26 | Kaiser & Co Gmbh W F | Springform mit Abdeckhaube |
| DE19548922A1 (de) * | 1995-12-27 | 1997-07-03 | Max Planck Gesellschaft | Optische Temperatursensoren und Optroden mit optischer Temperaturkompensation |
| AUPO652997A0 (en) | 1997-04-30 | 1997-05-29 | Kindconi Pty Limited | Temperature cycling device and method |
| AUPS267702A0 (en) * | 2002-05-30 | 2002-06-20 | Corbett Research Pty Ltd | Optical means for calibrating temperature |
| EP2487675A4 (en) * | 2009-10-07 | 2013-03-06 | Sharp Kk | LIQUID CRYSTAL DISPLAY DEVICE |
| EP2612120B1 (en) * | 2010-08-31 | 2019-04-10 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Thermal calibration |
-
2012
- 2012-10-22 EP EP12778313.2A patent/EP2769189A2/en not_active Withdrawn
- 2012-10-22 CN CN201280051489.4A patent/CN104246458B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2012-10-22 WO PCT/EP2012/070856 patent/WO2013057308A2/en active Application Filing
- 2012-10-22 US US14/352,708 patent/US9976917B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-10-22 JP JP2014536277A patent/JP6174591B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-10-22 AU AU2012324791A patent/AU2012324791B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3142755A (en) * | 1960-12-13 | 1964-07-28 | Leroux Jean-Pierre | Method of determining temperature by means of a phosphorescent substance, and measuring apparatus for the employment of said method |
| DD270448A3 (de) * | 1986-09-16 | 1989-08-02 | Univ Halle Wittenberg | Verfahren zur kalibrierung von temperatur-messvorrichtungen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104246458A (zh) | 2014-12-24 |
| AU2012324791B2 (en) | 2016-04-14 |
| US20140254622A1 (en) | 2014-09-11 |
| WO2013057308A2 (en) | 2013-04-25 |
| AU2012324791A1 (en) | 2014-04-10 |
| JP2014532854A (ja) | 2014-12-08 |
| EP2769189A2 (en) | 2014-08-27 |
| JP6174591B2 (ja) | 2017-08-02 |
| WO2013057308A3 (en) | 2014-07-10 |
| US9976917B2 (en) | 2018-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104246458B (zh) | 用于验证微环境中的温度测量结果的方法和系统 | |
| CA2887302C (en) | Monitoring temperature with fluorescence | |
| US20150165440A1 (en) | QPCR Analysis Apparatus | |
| CN102618439B (zh) | 基于封闭反应器的dna片段扩增和定量检测系统 | |
| CN102917796B (zh) | 温度控制方法和设备 | |
| CN105586403A (zh) | 在微流体装置中产生热熔化曲线的方法和设备 | |
| US20120025081A1 (en) | IR spectrometer with non-contact temperature measurement | |
| KR20110091309A (ko) | 흡광도 측정 방법 및 장치 | |
| CN104968776A (zh) | 核酸扩增装置和温度调节功能的异常检测方法 | |
| Venturini et al. | Optical temperature sensing using a new thermographic phosphor | |
| TW201843446A (zh) | 光熱反應分析儀 | |
| ES2962866T3 (es) | Sistemas y procedimientos para la normalización de señales en sistemas de medición de cultivos de sangre | |
| CN112011455A (zh) | 一种用于实时荧光定量pcr仪的温场与光路双通道检测装置 | |
| JP2012520994A (ja) | 体液測定用の試験要素と測定法 | |
| US8345215B2 (en) | Optical means for calibrating temperature | |
| Collier et al. | Temperature compensation of oxygen sensing films utilizing a dynamic dual lifetime calculation technique | |
| CN109791108A (zh) | 用于检测样品发出的荧光信号的装置 | |
| Span et al. | Measurement uncertainty in calibration and compliancy testing of PCR and qPCR thermal cyclers | |
| TWI780548B (zh) | 聚合酶連鎖反應檢測設備及其溫度檢測方法 | |
| KR101335940B1 (ko) | 생체물질 검사 장치 및 그 제어 방법 | |
| AU2003229395B2 (en) | Optical means for calibrating temperature | |
| Datta et al. | Measurement and instrumentation | |
| CN110207843A (zh) | 一种变色显示及检测温度的方法 | |
| Catini et al. | Thermoelectric Sensor for Detection of Chemical Radiation Heat | |
| IE20070696A1 (en) | A qPCR analysis apparatus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190327 Address after: German Heerden Patentee after: Qiagen GmbH Address before: Humbrechtikon, Switzerland Patentee before: Qiagen Instruments AG |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20181102 Termination date: 20201022 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |