DE102014114748B3

DE102014114748B3 - Fluorometrische Temperatursensorik mit FRET-basierten Molecular Beacons in molekularbiologischen und diagnostischen Assays

Info

Publication number: DE102014114748B3
Application number: DE102014114748.0A
Authority: DE
Inventors: Andy Wende; Ute Resch-Genger; Zerrin Fidan
Original assignee: Qiagen GmbH; Bundesrepublik Deutschland; Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM
Current assignee: Qiagen GmbH; Bundesrepublik Deutschland; Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2015-10-08
Anticipated expiration: 2034-10-11
Also published as: EP3204743A1; WO2016055332A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der biochemischen Sensorik und befasst sich mit der Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensoren.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der biochemischen Sensorik und befasst sich mit der Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensoren.
Die Temperatur ist eine der am häufigsten gemessenen physikalischen Größen, deren präzise Bestimmung sowohl in der Forschung als auch bei vielen analytischen Verfahren, medizinisch-diagnostischen Assays, und in vielen Industrieprozessen erforderlich ist. Neben taktilen Verfahren, welche eine elektrische Kontaktierung erfordern (z.B. Thermoelemente), sind kontaktlose bzw. nicht-invasive Temperaturmessungen mit optischen Methoden verbreitet.
Ferner ist die Bestimmung der Temperatur (T) vor allem in biologischen Prozessen (z.B. zelluläre Prozesse) von großer Bedeutung, da diese die biochemischen Reaktionen in den Zellen beeinflusst. Für Temperaturmessungen in sich bewegenden, z.B. rotierenden Systemen wie bestimmten Auslesegeräten für mikrofluidische Assays und Reaktionen, in Zellen oder unter Bedingungen, wo generell keine elektrischen Sensoren eingesetzt werden können, eignen sich besonders optische T-Sonden, die eine berührungslose Temperaturmessung z.B. über die Lumineszenz im NIR- oder sichtbaren vis-Spektralbereich erlauben, bisweilen sogar intrazellulär.
In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von fluoreszierenden Temperatursonden geeignet, da diese aufgrund ihrer temperaturabhängigen Emissionseigenschaften als sogenannte „molekulare Thermometer“ eingesetzt werden können. Hierzu gehören beispielsweise Lanthanoid-basierte molekulare Thermometer (z.B. seltenen Erden dotierte Nanopartikel), aufkonvertierende lumineszierende Nanopartikel, Polymer-basierte Nanogele, fluoreszierende Gold-Nanopartikel oder lumineszierende Metall-Ligand-Komplexe oder organische Farbstoffe mit temperaturabhängigen optischen Eigenschaften.
Diese Systeme leiden allerdings unter einer geringen Flexibilität bezogen auf die Steuerung des zu detektierenden Temperaturbereichs, der für molekularbiologischen Anwendungen in Frage kommt.
Auch sind die Anforderungen für einen Einsatz von nicht-invasiven Temperatursonden in molekularbiologischen Systemen oder diagnostischen Verfahren hoch anzusiedeln, da die jeweiligen Sensoren nicht mit den Reaktanden in Interaktion treten dürfen und darüber hinaus bei den gegebenen Bedingungen chemisch stabil sein müssen, unter der Voraussetzung, dass eine konstante und ausreichende Signalsendung gewährleistet ist. Es besteht daher ein Bedarf an geeigneten nicht-invasiven Temperatursensoren, die in biomolekularen Reaktionen verwendet werden können, und wenn möglich eine kontrollierte Positionierung zulassen.
Vor diesem Hintergrund wird eine Verwendung von Molecular Beacons nach Anspruch 1, sowie eine Kombination von Molecular Beacons nach Anspruch 10 und ein Sensorarray nach Anspruch 16 vorgeschlagen.
In einer ersten Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon (MB) als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren vorgeschlagen umfassend

– einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder
– einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder
– einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor,

Eine Temperaturbeständigkeit von dem fluoreszierenden Donor, dem nicht-emissiven Löscher, dem emissiven Akzeptor und dem nicht-emissiven Akzeptor ist bevorzugt gegeben durch molekular rigide Strukturen, in denen alle potenziellen Löschkanäle verbrückt sind und entsprechende Molekülteile nicht frei rotieren können bzw. thermisch labile Bindungen vermieden oder verbrückt werden.
Als besonders geeignete fluoreszierende Donoren und/oder emissive Akzeptoren wurden organische Fluoreszenzfarbstoffe gefunden, in denen alle Gruppen, deren Rotation zu einer strahlungslosen Desaktivierung des angeregten Zustand führen könnte, verbrückt sind. Eine Temperaturbeständigkeit insbesondere für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor gemäß der vorgeschlagenen Verwendung besteht in einer konstanten Fluoreszenz ohne signifikante Veränderung der Intensität der Fluoreszenz und/oder ohne eine signifikante Verschiebung der ausgestrahlten Wellenlänge(n). Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor darin, dass sich die Fluoreszenzintensitäten des Anfangs- und Endwertes in einer Temperaturspanne von 50 °C, bevorzugt 60 °C, weiter bevorzugt 70 °C, und noch weiter bevorzugt 100 °C um < 30%, bevorzugt < 20% und am meisten bevorzugt < 10% unterscheiden. Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor darin, dass sich die Fluoreszenzintensitäten des Anfangswertes 20 °C und Endwertes 95 °C um < 30%, bevorzugt < 20% und am meisten bevorzugt < 10% unterscheiden. Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor darin, dass sich die Fluoreszenzintensitäten des Maximalwertes und des Minimalwertes in einer Temperaturspanne von 50 °C, bevorzugt 60 °C, weiter bevorzugt 70 °C, insbesondere im Temperaturbereich von 20 °C bis 95 °C um < 30%, bevorzugt < 20% und am meisten bevorzugt < 10% unterscheiden. Diese Zusammenhänge können analog für die Absorption aufgestellt werden, da die gemessene Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Absorption ist.
Die integrale Emission ist hier definiert als der Quotient aus den jeweiligen Integralen der Emissionssignale eines Farbstoffes in Abhängigkeit der Temperatur und des Integrals des Emissionssignals eines Farbstoffes bei einer bestimmten Temperatur (hier Minimaltemperatur T_min in °C) über einen bestimmten Wellenlängenbereich (λ). Sie errechnet sich nach der folgenden Weise und Formel:
Ferner besteht eine Temperaturbeständigkeit eines Löschers gemäß der vorgeschlagenen Verwendung darin, dass sich die Wellenlänge des absorbierten Lichts nicht signifikant bei einer Temperaturveränderung bis zu 100 °C ändert. Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit eines Löschers darin, dass sich die Wellenlänge des absorbierten Lichts bei einer Temperaturveränderung von 50 °C, bevorzugt 60 °C, weiter bevorzugt 70 °C, und noch weiter bevorzugt 100 °C um < 100 nm, bevorzugt < 80 nm, noch weiter bevorzugt < 70 nm und am meisten bevorzugt < 50 nm verschiebt. Bevorzugt ist bei einem Löscher gemäß einem hierin beschriebenen Vorschlag eine Verschiebung der Wellenlänge des absorbierten Lichts von < 100 nm, bevorzugt < 80 nm, noch weiter bevorzugt < 70 nm und am meisten bevorzugt < 50 nm in einem Temperaturbereich von 20 bis 95 °C.
Des Weiteren kann die Temperaturbeständigkeit eines Löschers gemäß der vorgeschlagenen Verwendung darin bestehen, dass die Intensität der Absorption über einen bestimmten Temperaturbereich stabil ist, indem sich die Intensität kaum ändert, und somit nicht temperaturabhängig ist. In einer Ausführungsform wird die Temperaturbeständigkeit darin gesehen, wenn sich in einem Temperaturbereich wie beispielsweise von 20 bis 95 °C die Intensität der Absorption von einem Anfangswert wie beispielsweise von 20 °C bei Erwärmung zu einem Endwert wie beispielsweise 95 °C um lediglich 30%, bevorzugt 20% weiter bevorzugt 10% und am meisten bevorzugt 5% ändert.
Die oben beschriebene Temperaturbeständigkeit von fluoreszierendem Donor, nicht-emissivem Löscher, emissivem Akzeptor und nicht-emissivem Akzeptor steht im Gegensatz zu den meisten Fluoreszenzfarbstoffen, deren optische Eigenschaften, also die spektrale Lage ihrer Absorptions- und Fluoreszenzbanden, die Absorptionsintensitäten, die Fluoreszenzquantenausbeuten sowie die Fluoreszenzlebensdauern temperatursensitiv sind, und damit nicht für eine Verwendung in Kombination mit Molecular Beacons für den Einsatz in biomolekularen oder diagnostischen Verfahren geeignet sind.
Zu Molecular Beacons ist beschrieben worden, dass sie in nicht-invasiven Temperaturmessungen eingesetzt werden können. Diese Moleküle haben allerdings bisher lediglich Einsatz gefunden bei der Verbesserung von Schmelzpunktanalysen, zur Temperaturkalibrierung in mikrofluidischen Chips, in Mikrochip-basierten Biosensoren, als L-DNA basierte in vivo Nano-Thermometer sowie als pH-abhängige fluoreszierende Sonden. Eine Eignung als Temperatursensor in biomolekularen Reaktionen, die insbesondere DNA-basiert sind, ist weder beschrieben noch vorgeschlagen worden, und war überdies bis jetzt fraglich, da eine benötigte Temperaturbeständigkeit und der Ausschluss einer Interaktion der DNA-Stränge der Molecular Beacons mit DNA-Molekülen einer biomolekularen Reaktion nicht zu erwarten war.
Die Verwendung von temperaturbeständigen Molecular Beacons in molekularbiologischen Assays ermöglicht eine nicht-invasive und hochsensitive Temperaturmessung. Es wird ferner die Verwendung eines Molecular Beacons als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren vorgeschlagen, wobei das mindestens eine Molecular Beacon inert gegenüber den Reaktanden im biologischen Assay ist, insbesondere durch die auf den Assay angepasste Wahl der loop- und stem-Sequenz.
Eine solche Verwendung ist möglich, da gefunden werden konnte, dass selbst bei erhöhten Temperaturen keine Interaktion der oben beschriebenen Molecular Beacons mit DNA-basierten Reaktanden stattfindet und somit die molekularbiogische Reaktionen durch den Temperatursensor nicht verfälscht, verhindert oder verschlechtert werden. Insbesondere wurde gefunden, dass keine Wechselwirkung mit Assay-Komponenten beim direkten Einsatz als Temperatursensor stattfindet. In gleicher Weise wurde auch gefunden, dass die Assay-Komponenten wiederum auch nicht mit den Molecular Beacons in Verbindung treten und somit die Funktionsfähigkeit der Molecular Beacons beeinträchtigen oder verhindern. Dies hat ferner den Vorteil, dass eine Verwendung in biologisch relevanten Puffern, im Serum, in Zellkulturen möglich ist. Somit wird ferner die Verwendung eines Molecular Beacons als Temperatursensor in in vivo und in vitro Systemen vorgeschlagen.
Durch die Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensoren wie hierin vorgeschlagen sind Temperaturmessungen auch in sehr kleinen Volumina wie in mikrofluidischen Systemen möglich wie auch für rotierende Systeme, insbesondere auch bei rotierenden mikrofluidischen Auslesegräten. Ferner sind Temperaturmessungen ermöglicht an Membranen, auf Biochips, in Poren und in Mikrokanälen sowie in Mikrotiterplatten. Außerdem ist eine kontrollierte Positionierung des Molecular Beacons möglich.
In einer weiteren Ausführungsform werden die oben spezifizierten Molecular Beacons für biologische DNA-basierte Assays verwendet, insbesondere für eine PCR (Polymerasekettenreaktion), eine tHDA (thermophilic helicase-dependent amplification), eine Immuno-PCR oder ein Aptamer-basiertes Assay. Ferner finden die oben spezifizierten Molecular Beacons Anwendung zur Temperaturüberwachung in quantitativer Echtzeit PCR, in der Ligase Kettenreaktion (ligase chain reaction, LCR), in einer Strangverdrängungsamplifikation (strand displacement amplification, SDA), in einer multiplen Verdrängungsamplifikation (multiple displacement amplification, MDA), oder auch in sog. rolling-circle-Amplification (RCA), restriction aided RCA, Einzelprimer Isothermalamplifikation (single primer isothermal amplification, SPIA), transcription mediated-Amplifikation (TMA), Amplifikationsreaktion mit einschneidendem Enzym (nicking enzyme amplification reaction, NEAR), exponentielle Amplifikationsreaktion (exponential amplification reaction, EXPAR), loop mediated Isothermalamplifikation (loop mediated isothermal amplification, LAMP), Rekombinase Polymerase Amplifikation (recombinase polymerase amplification, RPA), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (nucleic acid sequence based amplification, NASBA), smart-Amplifikationsprozess (smart-amplification process, SMAP) und quantifizierende Nukleinsäure Echtzeit PCR (quantifying nucleic acids real-time PCR, rtPCR).
Bevorzugte Temperaturbereiche, die durch Molecular Beacons wie hierin vorgeschlagen, überwacht und bestimmt werden können, liegen für Fluoreszenzmessungen bevorzugt im Bereich von 50–75 °C, für isothermale Methoden, insbesondere isothermale Amplifikationen im Bereich von 35–65 °C und für Schmelzkurven von Sonden, Amplifikaten oder genomischer DNA im Bereich von 45–90 °C. Es ist vorteilhaft für den vorliegenden Vorschlag, dass der Einsatz der hierin vorgeschlagenen molekularen Thermometer zur hochsensitiven Temperaturmessung in bioanalytisch relevanten Puffern (z.B. PBS oder HDA-Puffer) im T-Bereich von ca. 35–98 °C erfolgt.
Die Molecular Beacons wurden nach gängigen Methoden so aufgebaut und synthetisiert, um diese für die fraglichen Temperaturbereiche mit einem entsprechenden Schmelzpunkt zu versehen. Die Berechnung der Struktur, insbesondere der Struktur und Sequenz des Stammbereichs, und der daraus resultierenden Schmelzpunkte ist dem Fachmann wohl bekannt und wird hier nicht weiter wiedergegeben. Beispielsweise kann die Berechnung der Struktur nach den Methoden der nachfolgenden Referenzen durchgeführt werden: Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577–W581; Owczarzy, R. et al., Biochemistry, 43, 3537; Owczarzy, R. et al., Biochemistry, 47, 5336. Durch die Verwendung entsprechender DNA-Sequenzen innerhalb des Stamms des Molecular Beacons kann der Schmelzpunkt vorher bestimmt werden.
Besonders geeignete Molecular Beacons sind:

(Die Schmelzpunkte wurden über die Internetseite
„http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx“ berechnet mit den voreingestellten Parametern: Temp. 25°C, Na⁺ conc. 50mM, Mg²⁺ conc. 5mM, suboptimality 50%.)
Insbesondere wird eine Verwendung für Nukleinsäureamplifikationsreaktionen in demselben Reaktionsgefäß zusammen mit den Analyten und Amplifikationsreagenzien vorgeschlagen. Durch die Verwendung von Molecular Beacons gemäß einem hierin beschriebenen Vorschlag wird Temperatursensorik auch in miniaturisierten Assays möglich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die temperaturbeständigen Molecular Beacons für biologische DNA-basierte Assays in einem „Lab-on-a-Chip“-Reaktormodul verwendet.
Es wird ferner eine Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon (MB) mit einem fluoreszierenden Donor und/oder einem emissiven Akzeptor vorgeschlagen, wobei der fluoreszierende Donor und/oder der emissive Akzeptor im vis- oder nahen infrarot (NIR-)Bereich emittiert/emittieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon vorgeschlagen, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher umfasst.
Als fluoreszierende Donatoren kommen prinzipiell molekulare Verbindungen wie kleine organische Farbstoffe, Metall-Ligand-Verbindungen wie beispielsweise Lanthanid-Chelate und -Komplexe, oder nanoskalige Reporter wie fluoreszente Partikel wie beispielsweise Fluorophor-dotierte oder markierte Polymer- oder Silika-Partikel, oder Mosaik-Viren, Halbleiter-Nanomaterialien wie beispielsweise Quantenpunkte, Upconversion Nanopartikel in Frage. Als gemeinsames Merkmal haben die aus diesen Farbstoffklassen ausgewählten Verbindungen die hierin beschriebene Temperaturbeständigkeit sowie deren Eignung an Molecular Beacons gebunden zu werden. Besonders bevorzugt sind Farbstoffe mit einem rigiden Chromophorgerüst mit sterisch fixierten funktionellen Gruppen, deren Rotation zur Fluoreszenzlöschung führen könnte. Insbesondere werden als fluoreszierende Donoren fluoreszierende Farbstoffe vorgeschlagen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus und/oder umfassend Rhodamine 101, Rhodamine 6G, 2,3,6,7-Tetrahydro-9-(trifluoromethyl)-1H,5H,11H-[1]benzopyrano(6,7,8-ij)quinolizin-11-one (Coumarin 153), 6-Carboxy-X-Rhodamine (ROX) und Atto 647 N. Die entsprechenden Strukturformeln sind in 2 widergegeben.
Als nicht-emissive Löscher kommen prinzipiell molekulare Systeme wie nicht-fluoreszente organische Farbstoffe oder nicht-emissive nanoskalige Partikel, wie Metall-Nanopartikel beispielsweise aus Gold oder Silber oder Kohlenstoffnanoröhrchen (CNTs) in Frage. Insbesondere werden als Löscher Azo-Verbindungen vorgeschlagen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus und/oder umfassend Black Hole Quencher 1^TM, Black Hole Quencher 2^TM, Black Hole Quencher 3^TM und 4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid (Dabcyl), Deep Dark Quencher (DDQ) und BlackBerry Quencher, sowie auch Iowa Black FQ und RQ, QXL Quencher, und DYC-Quencher. Einige der entsprechenden Strukturformeln sind in 3 wiedergegeben.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon vorgeschlagen, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor umfasst.
Als fluoreszierende Donatoren kommen die bereits oben erwähnten Verbindungen in Frage. Als emissiver Akzeptor kommen molekulare Verbindungen wie kleine organische Farbstoffe, Metall-Ligand-Verbindungen wie beispielsweise Lanthanid-Chelate und -Komplexe, oder nanoskalige Reporter wie fluoreszente Partikel wie beispielsweise Fluorophor-dotierte oder markierte Polymer- oder Silika-Partikel oder Mosaik-Viren und Halbleiter-Nanomaterialien wie Quantenpunkte in Frage. Als gemeinsames Merkmal haben die zuvor genannten Verbindungen die hierin beschriebene Temperaturbeständigkeit sowie deren Eignung an Molecular Beacons gebunden zu werden. Bevorzugt sind insbesondere Verbindungen der Verbindungsklassen, die auch als fluoreszente Donatoren in Frage kommen, wie z.B. Xanthen- oder Coumarin-Farbstoffe mit sterisch fixierten Gruppen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon vorgeschlagen, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor umfasst.
Als fluoreszierende Donatoren kommen die bereits oben erwähnten Verbindungen in Frage. Als nicht-emissiver Akzeptor kommen molekulare Verbindungen wie kleine organische Farbstoffe oder Metall-Ligand-Verbindungen in Frage, die stark absorbieren, aber nicht leuchten, oder nichtfluoreszente nanoskalige Systeme wie beispielsweise Farbstoffdotierte oder markierte Polymer- oder Silika-Partikel oder Mosaik-Viren und Metallpartikel beispielsweise Gold- oder Silber-Partikel, Carbonnanotubes oder Graphene. Als gemeinsames Merkmal haben die zuvor genannten Verbindungen die hierin beschriebene Temperaturbeständigkeit sowie deren Eignung an Molecular Beacons gebunden zu werden. Bevorzugt sind insbesondere Chromophore mit Substituenten, welche die Fluoreszenz löschen, wie z.B. Bromid-, Iodid- und Nitroverbindungen.
Es ist besonders bevorzugt, wenn der nicht-emissive Akzeptor die Fluoreszenz des fluoreszierenden Donors möglichst stark löscht beispielsweise durch kontaktbasierte Prozesse, Elektronentransfer, Energietransfer, einen Schweratomeffekt oder Paramagnetismus. Dabei kann es je nach Löschprozess vorkommen, dass der nicht-emissive Akzeptor die Emission des fluoreszierenden Donors absorbiert.
Es ist bevorzugt, dass bei allen Kombinationen von einem fluoreszierenden Donor und einem nicht-emissiven Löscher, einem fluoreszierenden Donor und einem emissiven Akzeptor und einem fluoreszierenden Donor und einem nicht-emissiven Akzeptor jeweils ein effektiver FRET gebildet wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn im geschlossenen Zustand des MBs unterhalb der Schmelztemperatur T_m effizienter FRET erfolgt, so dass entweder bei Anregung des Donors nur die Fluoreszenz des Akzeptors detektiert wird oder bei Verwendung eines nicht-fluoreszenten Akzeptors keine oder nur minimale Fluoreszenz auftritt.
Für die Auswahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe ist es bevorzugt, dass neben einer Temperaturbeständigkeit in Form einer möglichst geringen Temperaturabhängigkeit ihrer Absorption und Fluoreszenz, ein effizienter FRET von Donor- und Akzeptor-Fluorophor, also eine möglichst gute spektrale Überlagerung der Absorptions- und Emissionsspektren, gegeben ist. Insbesondere ist es bevorzugt, dass das Maximum der Emission des einen fluoreszierenden Donors weniger als 100 nm vom Maximum der Absorption des Löschers abweicht, weiter bevorzugt weniger als 80 nm und noch weiter bevorzugt weniger als 50 nm. Ferner ist es bevorzugt, dass das Maximum der Emission des einen fluoreszierenden Donors und das Maximum der Absorption des Löschers im Bereich von 400 bis 800 nm liegen, weiter bevorzugt von 500 bis 700 nm.
Neben FRET können auch andere abstandsabhängige Löschprozesse wie Elektronentransfer, plasmonische Wechselwirkungen (abstandsabhängige Fluoreszenzlöschung durch Metall-Fluorophor-Wechselwirkungen z.B. für Gold oder Silber), Schweratomeffekt oder Paramagnetismus ausgenutzt werden. Für solche Prozesse ist es nicht erforderlich, dass sich die Absorption des Akzeptors und des Donors im besten Falle überlagern.
Gemäß einem Aspekt des vorliegenden Vorschlages für die Verwendung von Molecular Beacons liegt mindestens ein Molecular Beacon als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren immobilisiert vor.
Einer Immobilisierung liegt eine Lokalisierung der Molecular Beacons durch kovalente Anbindung z.B. an Kanalinnenwände von mikrofluidischen Chips, an Membranen, an Glas- oder Polymer-basierten Biochips, an porösen Trägermaterialien wie Cellulose, Silika-Nanopartikel etc. und an anderen Materialien, die für die Durchführung von DNA-basierten Assays eingesetzt werden, oder an optischen Fasern für die Herstellung von Temperatursensoren, an Trägermaterialien wie Glasslides, Polymere, Au-Oberflächen, optische Fasern oder Nanomaterialien wie z.B. Quantum Dots (QD), Metall-Nanopartikel oder magnetische Nanopartikel (MNP) zu Grunde. Ein weiteres Gebiet für Immobilisierungen bietet die Anbindung an Partikel, die dabei entweder als Trägermaterialien fungieren können, für den Einsatz zur Temperatursensorik in DNA-basierten Assays oder an Partikel wie z.B. Eisenoxid-Partikel oder Metall-Partikel für den Einsatz zur Temperatursensorik in therapeutischen Verfahren wie die therapeutische Hyperthermie und zur Temperaturmessung in vitro und in vivo Systemen sowie zum Monitoring.
Eine solche Immobilisierung geschieht vorzugsweise durch entsprechende Funktionalisierungen der Nukleotide in der Loop- bzw. Stamm-Sequenz („loop and stem region engineering“). So können modifizierte, nicht natürliche Nukleotide in die Loop-Sequenz eingebunden werden, um unterschiedliche Linker, wie beispielsweise PEG-, Peptid- oder Kohlenwasserstoff-Linker an die entsprechenden Nukleotide zu koppeln und somit die MBs auf die gewünschten Trägermaterialien zu immobilisieren. Eine gut untersuchte und universelle Methode, um MBs auf Oberflächen zu immobilisieren, ist der Einsatz des Biotin-Streptavidin-Systems. Hierbei wird der an der Stammsequenz biotinylierte Molecular Beacon durch die Bindung des Biotins an eine Streptavidin-beschichtete Oberfläche an das Trägermaterial gebunden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Immobilisierung eines Molecular Beacon auch durch die Anbindung über stimuli-responsive „spaltbare“ Linker vollzogen werden. Vorteilhaft ist an dieser Ausführungsform, dass die Immobilisierung gezielt wieder rückgängig gemacht werden kann, zum Beispiel durch reduktive, enzymatische, photochemische und/oder thermische Spaltung.
Eine Funktionalisierung zur Immobilisierung hat ferner den Vorteil, dass Sensorarrays aufgebaut werden können, durch die Molecular Beacons in alle Assayplattformen integriert werden können, die feste Supports oder Mikroanalyte verwenden. Dadurch ist eine örtliche Kontrolle der Positionierung ebenfalls gegeben. Ferner ist die Integration in Therapeutika für die therapeutische Hyperthermie und die lokale Temperaturmessung im Körper zur Kontrolle und zur Überwachung der Hyperthermiebehandlung gegeben. Ebenfalls erlaubt die Positionierung der Temperatursensoren auf Basis von Molecular Beacons gemäß einem hierin beschriebenen Vorschlag lokale Temperaturmessungen an verschiedenen Orten in einem mikrofluidischen Chip wie beispielsweise einem „Lab-on-a-Chip“-Reaktormodul, oder in einem biotechnologischen Reaktor oder in unterschiedlich großen Kavitäten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine hierin vorgeschlagene Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren vorgeschlagen, wobei mindestens zwei unterschiedliche Molecular Beacons verwendet werden.
Insbesondere wird vorgeschlagen, dass mindestens zwei Molecular Beacons verwendet werden, die verschiedene temperaturstabile und im Wesentlichen inerte Fluoreszenzfarbstoffe mit Emission im vis- und NIR-Bereich tragen, insbesondere mit spektral unterscheidbaren Emissionen im UV- und vis-Bereich. Weiter bevorzugt ist, dass mindestens zwei Molecular Beacons verwendet werden, die verschiedene temperaturstabile und im Wesentlichen inerte Fluoreszenzfarbstoffe mit Emission im vis- und NIR-Bereich tragen, wobei die Molecular Beacons in unterschiedlichen Farbkanälen emittieren.
Vorteil einer solchen Ausführungsform ist eine verbesserte Messdatenqualität und eine erhöhte Sensitivität der Temperaturmessung. Dadurch können ferner auch spektral unterscheidbare Molecular Beacons mit unterschiedlichen Stamm-Sequenzen verwendet werden, die unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen. Mit Hilfe einer mathematischen Auswertung kann bei Verwendung unterschiedlicher Molecular Beacons mit gegebenenfalls unterschiedlichen spektralen Eigenschaften die Genauigkeit der ermittelten Temperatur und die Temperaturauflösung erhöht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons vorgeschlagen, die jeweils umfassen

Eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor und/oder einen nicht-emissiven Löscher gemäß der vorgeschlagenen Kombination hat die gleichen Anforderungen wie unter [0009] bis [0014] beschrieben.
Durch die Verwendung von mindestens zwei Molecular Beacons als Kombination kann die Temperaturauflösung deutlich gesteigert werden durch das Vorliegen eines größeren und umfangreicheren Datensatz. Die Temperaturauflösung kann dadurch soweit erhöht werden, dass durch mathematische Auswertung eine T-Auflösung < 1 °C (bevorzugt 0,9 °C bis 0,05 °C, weiter bevorzugt 0.5 °C bis 0.1 °C) ermöglicht wird. Die Verwendung von mehr als einem Molecular Beacon ist insbesondere für niedrigere Temperaturbereiche unter 45 °C interessant, da in diesem Bereich von Natur aus die Temperaturauflösung von Molecular Beacons weniger präzise ist. Ferner ist es möglich, durch die Kombination von mindestens zwei Molecular Beacons eine präzise Steuerung einzurichten zur Erreichung oder Unterschreitung einer bestimmten Mindest-Temperatur mittels „Ja/Nein“-Entscheidungen. Eine solche Steuerung ist auch mit einem Molecular Beacon möglich. Eine Steuerung zur Erreichung oder Unterschreitung einer bestimmten Mindest-Temperatur mittels „Ja/Nein“-Entscheidungen mit einer hohen Präzision ist besonders gut geeignet für die Prozesskontrolle und kann dadurch eine Automatisierung unterstützen. Eine solche Automatisierung könnte insbesondere einem high-throughput Verfahren Anwendung finden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ferner eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons vorgeschlagen, wobei die Temperaturauflösung durch die Länge des Nukleotidstranges und/oder den Guanin-Cytosin-Gehalts auf unter 1 °C geregelt werden kann.
In einer Ausführungsform wird eine Kombination von mindestens zwei Molecular Beacons vorgeschlagen, wobei die mindestens zwei Molecular Beacons auf einem Träger immobilisiert sind. In einer solchen Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, wenn die mindestens zwei zu immobilisierenden Molecular Beacons eine chemische Funktionalisierung tragen, über die die Anbindung an einen Träger zur Immobilisierung geschieht.
Für eine hierin beschriebene Kombination kommen dieselben Verbindungen in Frage, die auch für die Verwendung von wie hierin beschriebenen Molecular Beacons eingesetzt werden. Insbesondere werden für eine hierin vorgeschlagene Kombination fluoreszierende Donoren ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Rhodamin 101, Rhodamin 6G, Coumarin 153, 6-Carboxy-X-Rhodamin und Atto 647 N.
Insbesondere werden für eine hierin vorgeschlagene Kombination der nicht-emissive Löscher ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Black Hole Quencher 2 (BHQ 2), Black Hole Quencher 3 (BHQ 3) und Dabcyl.
Insbesondere wird auch die Verwendung einer hierin vorgeschlagenen Kombination vorgeschlagen als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Sensorarray vorgeschlagen umfassend

– einen festen Träger, und
– eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons wie hierin vorgeschlagen.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sensorarray vorgeschlagen, wobei der Träger ausgesucht ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus 2D- und 3D-Supports wie beispielsweise Membrane, Filme, Glasträger, Polymerträger, mesoporöse Partikel und Gele, optischen Fasern, Mikrokanälen und Mikrotiterplatten-Kavitäten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Sensorarray vorgeschlagen, wobei die 2D und 3D-Supports aus Membranen, Filmen und / oder Mikroskopieslides aus Glas, Polymeren oder aus mesoporösen Partikeln bestehen können.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sensorarray vorgeschlagen umfassend

– einen festen Träger, und
– eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons, wobei die

Ein solcher Aufbau ermöglicht das Design von verschieden farbig emittierenden Sensorarrays.
Insbesondere wird auch die Verwendung eines hierin vorgeschlagenen Sensorarrays vorgeschlagen als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren.
Die beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen eine beispielhafte Ausführungsform und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung. Die Elemente der Zeichnungen sind relativ zueinander und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu.
1 zeigt schematisch eine fluoreszente Nukleotid-Sonde in Form eines Molecular Beacon (MB), die aus einer DNA-Sequenz, einem Donor-Fluorophor und einem nicht-emissiven oder emissiven Akzeptor-Farbstoff besteht, die ein FRET-System bilden (Donor: Fluorophor, Akzeptor: nicht-fluoreszenter Akzeptor = Löscher). Der Abstand von Donor und Akzeptor wird temperaturabhängig variiert, was eine temperaturabhängige Fluoreszenz des MB bedingt.
2 zeigt eine Auswahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe.
3 zeigt eine Auswahl geeigneter Löschermoleküle.
4 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Absorption von ROX, (A) vor und nach dem Erwärmen bei 25 °C und (B) bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
5 zeigt in (A) einen Vergleich der Absorption und Emission von ROX und in (B) die Temperaturabhängigkeit der Emission von ROX bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
6 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Absorption von Atto 647 N, (A) vor und nach dem Erwärmen bei 25 °C und (B) bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
7 zeigt in (A) einen Vergleich der Absorption und Emission von Atto 647 N und in (B) die Temperaturabhängigkeit der Emission von Atto 647 N bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
8 zeigt in (A) das Absorptionsverhalten von BHQ2 und BHQ3 bei 25 °C und in (B) das Absorptionsverhalten von BHQ3 bei 25 °C vor und nach Erwärmen und bei 90 °C.
9 zeigt die Temperaturbeständigkeit der Emission von Atto647 N und ROX durch Vergleich der normierten Emission in (A) bei 20 °C, 60 °C und 80 °C für Atto 647 N und in (B) bei 20 °C, 60 °C und 95 °C für ROX.
10 zeigt im Vergleich zu 9 den Abfall der Emissionsintensität bei dem temperaturunbeständigen Fluoreszenzfarbstoff TAMRA im Bereich von 20 °C bis 95 °C.
11 zeigt in (A) die normierte Absorption von BHQ3 zusammen mit der normierten Emission von Atto 647 N und in (B) die normierte Absorption von BHQ2 zusammen mit der normierten Emission von ROX.
12 zeigt in (A) die Änderung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Temperatur im Bereich von 35 °C bis 80 °C für den Molecular Beacon ROX-MB56-BHQ2 und in (B) die Entwicklung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Temperatur im Bereich von 35 °C bis 80 °C für den Molecular Beacon ROX-MB64-BHQ2.
13 zeigt in (A) die Änderung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Temperatur im Bereich von 35 °C bis 80 °C für die Kombination der Molecular Beacons aus ROX-MB56-BHQ2 und ROX-MB64-BHQ2 im Verhältnis 1:1 und in (B) Änderung der Fluoreszenzintensität bei den Temperaturen 35 °C, 50 °C, 65 °C und 80 °C für dieselbe Kombination.
14 zeigt in (A) die Temperaturabhängigkeit der normierten Fluoreszenz in einem Temperaturbereich von 20–95 °C für den Molecular Beacon 5‘-ROX-MB64-BHQ2-3’ und in (B) die Temperaturabhängigkeit der normierten Fluoreszenz in einem Temperaturbereich von 20–95 °C für den Molecular Beacon 5‘-FAM-MB59-TAMRA-3’ mit der Sequenz 5‘-FAMTTGCACTTTTTTTTTTGTGCAT-TAMRA-3‘.
15 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenz des in einer tHDA eingesetzten Molecular Beacons 5‘-ROX-MB70-BHQ2-3’ bei den unterschiedlichen Konzentrationen 60 nM und 100 nM im orangenen Kanal.
16 zeigt die Schmelzpunktbestimmung des in einer tHDA eingesetzten Molecular Beacons 5‘-ROX-MB70-BHQ2-3’ bei den unterschiedlichen Konzentrationen 60 nM und 100 nM in erster Ableitung der Fluoreszenz im Temperaturbereich von 55 °C bis 95 °C.
Die Figuren wurden in der obigen Figurenbeschreibung bereits näher dargelegt, weitere Details werden zusätzlich dazu weiter unten verdeutlicht.
Insbesondere verdeutlicht 1, dass unterhalb der Schmelztemperatur T_m effizienter FRET erfolgt, so dass entweder idealerweise bei Anregung des Donors nur die Fluoreszenz des Akzeptors detektiert wird oder bei Verwendung eines nicht-fluoreszenten Akzeptors keine bzw. minimale Fluoreszenz. Beim Erreichen einer bestimmten Temperatur im Bereich des Schmelzpunktes, der über die Stamm-Sequenz gezielt eingestellt und variiert werden kann, erfolgt die Dehybridisierung des Nukleotidstranges (Stamm), wobei sich der Abstand von Fluorophor und Löscher bzw. der Donor- und Akzeptor-Fluorophore zunehmend ändert. Im Falle von Fluorophor-Löscher-MB bedingt dies einen starken Anstieg der Fluoreszenz des zuvor gelöschten Donor-Fluorophors.
Insbesondere verdeutlicht 4A, dass die Absorption von ROX trotz zwischenzeitlichen Erwärmens auf 95 °C sich nicht ändert. Damit wird die Temperaturbeständigkeit von ROX gezeigt. Selbiges wird in 4B verdeutlicht, der zu entnehmen ist, dass die Absorption von ROX bei 25 °C, 60 °C und 80 °C annähernd gleich ist.
Insbesondere verdeutlicht 5B, dass sich auch die Emission von ROX bei verschiedenen Temperaturen 25 °C, 60 °C und 95 °C nicht signifikant unterscheidet und dass die Emission auch nach Erwärmung auf 95 °C bei 25 °C stabil bleibt.
Insbesondere verdeutlicht 6A, dass die Absorption von Atto 647 N trotz zwischenzeitlichen Erwärmens auf 80 °C sich nicht ändert und konstant ist. Damit wird die Temperaturbeständigkeit von Atto 647 N gezeigt. Selbiges wird in 6B verdeutlicht, der zu entnehmen ist, dass die Absorption von Atto 647 N bei 25 °C, 60 °C und 80 °C annähernd gleich ist.
Insbesondere verdeutlicht 7B, dass sich auch die Fluoreszenz von Atto 647 N bei verschiedenen Temperaturen 25 °C, 60 °C und 80 °C nicht signifikant unterscheidet und dass die Fluoreszenz auch nach Erwärmung auf 80 °C bei 25 °C stabil bleibt.
Insbesondere verdeutlicht 8B, dass sich auch die Absorption von BHQ3 bei verschiedenen Temperaturen 25 °C und 90 °C nicht signifikant unterscheidet und nur eine geringe bathochrome Verschiebung der Absorptionsbande stattfindet. Ferner zeigt 8B, dass die Absorption auch nach Erwärmung auf 90 °C bei 25 °C stabil bleibt.
Insbesondere verdeutlichen 9A und B, dass hinsichtlich der relativen integralen Emission eine Temperaturerhöhung für die Fluoreszenzfarbstoffe ROX und Atto 647 N keine nennenswerte Veränderung auftritt bei einer Temperaturerhöhung von 20 °C auf 90 °C (Atto 647 N) bzw. 95 °C (ROX).
Insbesondere verdeutlicht 10, dass im Vergleich zu ROX und Atto 647 N der Fluoreszenzfarbstoff TAMRA einen erheblichen Abfall der Emissionsintensität im Bereich von 20 °C bis 95 °C erleidet. TAMRA ist im Gegensatz zu ROX und Atto 647 N ein Beispiel für einen temperaturunbeständigen Fluoreszenzfarbstoff.
Insbesondere verdeutlichen 11A und 11B, dass Atto 647 N und BHQ3, sowie 6-ROX und BHQ2 gute FRET-Paare bilden.
Insbesondere verdeutlichen 12A und 12B die Eignung der Molecular Beacons 56 und 64 für die jeweiligen Temperaturbereich um 56 °C und 64 °C.
Insbesondere verdeutlicht 13B, dass die Molecular Beacons ROX-MB56-BHQ2 und ROX-MB64-BHQ2 temperaturbeständig in einem Temperaturbereich von 35 °C bis 80 °C emittieren ohne nennenswerte Verschiebung der emittierten Wellenlänge. Es wurde für die Kombination MB56 + 64 ROX-BHQ2 eine Kalibrierebene von 56–68°C erhalten, für die die Unsicherheit +/–0.7 °C beträgt.
Insbesondere verdeutlicht 14A die Eignung des Molecular Beacon ROX-MB64-BHQ2 als Temperatursensor in einem Temperaturbereich von 55°C bis 95 °C. Im Vergleich dazu verdeutlicht 14B, dass ein nicht temperaturbeständiger Fluoreszenzfarbstoff wie TAMRA (Fluoreszenzbereich um 580 nm) die Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensor in biomolekularen Systemen nicht zulässt, da die Fluoreszenzintensität im Temperaturbereich zwischen 25 °C und 95 °C nicht konstant bleibt und signifikant abnimmt.
Insbesondere verdeutlichen 15 und 16, dass die Molecular Beacons die in einer tHDA eingesetzt wurden, keinen Schaden während der Reaktion genommen haben und weiterhin einen stabilen Schmelzpunkt aufweisen und bei Temperaturerhöhung einen sauberen Anstieg der Fluoreszenz aufweisen.
Wenngleich hierin spezifische Ausführungsformen dargestellt und beschrieben worden sind, liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die gezeigten Ausführungsformen geeignet zu modifizieren, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die weiter unten nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren.
Beispiele
Die Fluoreszenzmessungen in Abhängigkeit der Temperatur wurden mit dem Fluoreszenzspektrometer FSP920 Edinburgh Instruments durchgeführt. Die Absorptionsmessungen wurden mit dem Absorptionsspektrometer CARY 5000 Varian durchgeführt.
Das Temperaturverhalten der Molecular Beacons wurde in 10 × 2 mm Küvetten von Hellma Analytics in PBS-Puffer (pH 7.4) gemessen (Konzentrationen um die 1µM). Die Temperaturversuche wurden in den jeweiligen Spektrometern mittels temperierbarem Probenhalter durchgeführt.
Die farbstoffgebundenen Molecular Beacons 5‘-ROX-MB56-BHQ2-3‘,5‘-ROX-MB64-BHQ2-3‘ und 5‘-ROX-MB70-BHQ2-3’wurden von der Firma metabion international AG (Planegg, Deutschland) synthetisiert und von dort erworben.
Die hier verwendeten Molecular Beacons haben die folgenden Strukturen:
tHDA mit Molecular Beacons als Temperatursensor

Um die Eignung von Molecular Beacons als Temperatursensor in biomolekularen Systemen zu zeigen, wurde eine tHDA in Gegenwart von 5‘-ROX-MB70-BHQ2-3’durchgeführt. Dazu wurden drei Primerlösungen angefertigt umfassend einen Vorwärtsprimer, einen Rückwärtsprimer, ein doppelt gelabeltes Sondenmolekül in RNA-freiem Wasser mit unterschiedlicher Menge an 5‘-ROX-MB70-BHQ2-3’: Primerset 1:

Komponente	Stock	Endkonzentration	Volumen/Reaktion
Vorwärtsprimer	10 µM	80 nM	0,12
Rückwärtsprimer	10 µM	240 nM	0,36
Sondenmolekül	10 µM	80 nM	0,12
Molecular Beacon	10 µM	60 nM	0,09
RNA-freies Wasser			1,31

Primerset 2:

Komponente	Stock	Endkonzentration	Volumen/Reaktion
Vorwärtsprimer	10 µM	80 nM	0,12
Rückwärtsprimer	10 µM	240 nM	0,36
Sondenmolekül	10 µM	80 nM	0,12
Molecular Beacon	10 µM	100 nM	0,15
RNA-freies Wasser			1,25

Primerset 3:

Komponente	Stock	Endkonzentration	Volumen/Reaktion
Vorwärtsprimer	10 µM	80 nM	0,12
Rückwärtsprimer	10 µM	240 nM	0,36
Sondenmolekül	10 µM	80 nM	0,12
Molecular Beacon	-	-	-
RNA-freies Wasser			1,4

Die verschiedenen Primersets wurden im Anschluss mit gängiger Pufferlösung, einem Enzymmix enthaltend Helicase und einem gängigen Helicasepuffer aus TRIS, NaCl, DTT, EDTA und Glycerol, einer 5 mM MgSO₄-Lösung und Wasser umgesetzt nach den folgenden Mengenangaben:

Komponente Volumen für 1 Reaktion Volumen für 4 Reaktionen

2,5 × Puffer 6 24

Primerset 2 8

Enzymmix 1 4

10x MgSO₄ 1,5 6

Wasser 3,5 14

Summe 14
Die Inkubation erfolgte in einem RotorGene Q (QIAGEN, Hilden, Deutschland) PCR-Cycler bei 65 °C. 15 µl der Reaktionsmischung wurden in den vorbereiteten RGQ-Cycler überführt und die Messung gestartet. 40 Zyklen mit je einer Minute Länge wurden vorgenommen, wobei in dieser 1 Minute auch die Fluoreszenzauslesezeit inbegriffen ist.

Aus den tHDA-Reaktionsansätzen wurden für alle drei Primersets die Zeiten bis zum Auftreten messbarer Nukleinsäureamplifikation bestimmt, jeweils in dreifacher Redundanz:

Molecular Beacon	C_t[min]	Durchschnitt C_t[min]	∆C_t[min]
60 nM	22,07
60 nM	20,83	21,25	–0,17
60 nM	20,84
100 nM	19,83
100 nM	19,82	19,62	–1,79
100 nM	19,21
-	20,9
-	21,57	21,41
-	21,77

Aus den obigen Daten geht hervor, dass die tHDA nicht durch die Anwesenheit des Molecular Beacons beeinflusst wird. Der Zeitpunkt des Eintritts der messbaren Amplifikation liegt bei allen drei Messlösungen jeweils in allen drei Versuchen im selben Bereich.
Ferner wurde zur Überprüfung des Einflusses der tHDA auf die Molecular Beacons eine Schmelzpunktanalyse im Anschluss an die tHDA mit den eingesetzten Molecular Beacons durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 15 und 16 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass auch die Molecular Beacons, die in der tHDA als Temperatursensoren eingesetzt wurden, keinen Schaden in diesem biomolekularen System genommen haben und auch nach dieser Anwendung funktionieren und verlässliche Schmelzpunkte aufweisen, und weiterhin als Temperatursonden in biomolekularen Systemen eingesetzt werden können.
Es konnte somit gezeigt werden, dass nicht nur die tHDA durch die Anwesenheit der Molecular Beacons (mit entsprechend Assay-adaptiert ausgewählter Sequenz) nicht beeinträchtigt wird, sondern auch, dass die Molecular Beacons durch deren Anwendung in der tHDA nicht in irgendeiner Weise reagieren und somit keinen Schaden nehmen.
Literaturverzeichnis:

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Claims

Verwendung von mindestens zwei unterschiedlichen Molecular Beacons (MB) umfassend jeweils – einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder – einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder – einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor, wobei der fluoreszierende Donor, der nicht-emissive Löscher, der emissive Akzeptor und der nicht-emissive Akzeptor temperaturbeständig sind, als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mindestens zwei unterschiedlichen Molecular Beacons inert gegenüber den Reaktanden im biologischen Assay sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 in in vivo oder in vitro Systemen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biologische Assay DNA-basiert ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das biologische Assay eine PCR (Polymerasekettenreaktion), eine tHDA (thermophilic Helicase-dependent Amplification), eine Immuno-PCR oder ein Aptamer-basiertes Assay ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der fluoreszierende Donor und/oder der emissive Akzeptor im vis- oder nahen infrarot (NIR-)Bereich emittiert/emittieren.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens zwei unterschiedlichen Molecular Beacons jeweils einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher umfassen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Molecular Beacon immobilisiert ist.
Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons, die jeweils umfassen – einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder – einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder – einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor, wobei der fluoreszierende Donor, der nicht-emissive Löscher, der emissive Akzeptor und der nicht-emissive Akzeptor temperaturbeständig sind.
Kombination nach Anspruch 9, wobei die Temperaturauflösung durch die Länge des Nukleotidstranges und/oder den Guanin-Cytosin-Gehalts auf unter 1 °C geregelt ist.
Kombination nach Anspruch 9 oder 10, wobei die mindestens zwei Molecular Beacons auf einem Träger immobilisiert sind.
Kombination nach Anspruch 11, wobei die mindestens zwei zu immobilisierenden Molecular Beacons eine chemische Funktionalisierung tragen, über die eine Anbindung an einen Träger zur Immobilisierung geschieht.
Kombination nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der fluoreszierende Donor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Rhodamine 101, Rhodamine 6G, Coumarin 153, 6-Carboxy-X-Rhodamine und Atto 647 N.
Kombination nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Kombination mindestens einen Molecular Beacon umfasst mit einem nicht-emissiven Löscher, und der nicht-emissive Löscher ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Black Hole Quencher 2 (BHQ 2), Black Hole Quencher 3 (BHQ 3) und Dabcyl.
Sensorarray umfassend – einen festen Träger, und – eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.
Sensorarray nach Anspruch 15, wobei der Träger ausgesucht ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus 2D- und 3D-Support, optische Fasern, Mikrokanälen und Mikrotiterplatten-Kavitäten.
Sensorarray nach Anspruch 16, wobei der 2D-Support aus Membranen, Filmen und/oder Mikroskopieslides aus Glas oder einem Polymer oder aus mesoporösen Partikeln bestehen kann.