CN103773840A - 碱基序列分析方法和碱基序列分析装置 - Google Patents

碱基序列分析方法和碱基序列分析装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及碱基序列分析方法和碱基序列分析装置。该碱基序列分析方法包括：核酸扩增步骤，通过核酸扩增反应获得扩增产物，浑浊度测量步骤，测量核酸扩增反应的反应溶液的浑浊度，以及熔解曲线分析步骤，对位于核酸扩增反应的反应场所的探针核酸链和扩增产物执行熔解曲线分析。

Description

碱基序列分析方法和碱基序列分析装置
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年10月23日提交的日本在先专利申请2012-234227的权益，将其全部内容通过引用结合于此。
技术领域
本技术涉及碱基序列分析方法、碱基序列分析装置以及碱基序列分析程序。具体地，本技术涉及包括浑浊度测量步骤和熔解曲线分析步骤的碱基序列分析方法等。
背景技术
双链核酸链解离（熔解）成两个单链核酸的温度称为熔解温度（Tm值）。在熔解曲线分析中，通过检测由于在双链核酸链逐渐地被加热并熔解为两个单链核酸时出现熔解而改变的信号，测量与温度的变化有关的信号检测量的变化。可从通过绘制与温度的变化有关的信号检测量的变化获得的熔解曲线确定熔解温度。因为熔解温度反映两个单链核酸之间的同源关系，所以两个单链核酸之间的同源关系可基于熔解温度来确定。因此，熔解曲线分析用于分析核酸，例如，核酸扩增反应的特异性的验证和单核苷酸多态性（SNP）等的基因型确定。
荧光物质通常用于检测双链核酸链的熔解。例如，通过荧光标记能够与靶核酸链形成双链核酸链的核酸探针，基于当靶核酸链和核酸探针解离时通过荧光标记的光的发射或消失可检测核酸链的解离。此外，使用通过嵌入双链核酸来产生荧光的嵌入剂可检测从双链至单链的变化。
荧光物质不限于熔解曲线分析，其也广泛地用于扩增后核酸链的检测和定量及其他这样的核酸分析。另一方面，对于扩增后核酸链的检测，也可不使用荧光物质而采用检测样本的浑浊度的方法。在使用DNA合成酶的延伸反应中，反应溶液中的作为副产物产生的焦磷酸与镁离子结合，由此形成焦磷酸镁。如果产生的焦磷酸镁的量超过样品的可溶水平，焦磷酸镁沉淀且反应溶液变浊。通过测量浑浊度的水平，可实施对扩增后核酸链检测和量化。
因此，例如，JP-A-2012-34617公开的“核酸扩增反应装置包括：第一光源，被配置为输出用于激发荧光物质的光；第二光源，被配置为输出波长区域与由荧光物质产生的荧光的波长区域匹配的光；以及控制单元，被配置为通过在第一光源和第二光源之间切换来发射光；其中，通过使来自第一光源的光和来自第二光源的光沿着光路（通过光引导构件使两个光束在该光路上重叠）通过并照射在用作核酸扩增反应的反应场所的反应区上，可检测随着扩增反应的进行形成的浑浊物质所产生的光量和随着扩增反应的进行由光激发的荧光物质所产生的荧光的强度。”
发明内容
当通过核酸扩增反应在扩增后核酸链上执行上述熔解曲线分析时，因为熔解曲线分析在核酸已被扩增后开始，所以要在预定时间执行从核酸扩增反应到熔解曲线分析的切换。
根据本公开的实施方式，提供一种能够连续地执行核酸扩增反应和熔解曲线分析的碱基序列分析方法。
根据本公开的实施方式，提供一种碱基序列分析方法包括：通过核酸扩增反应获得扩增产物的核酸扩增步骤，测量核酸扩增反应的反应溶液的浑浊度的浑浊度测量步骤，以及对位于核酸扩增反应的反应场所执行探针核酸链和扩增产物的熔解曲线分析的溶解曲线分析步骤。
优选的是，当浑浊度达到预定值时执行熔解曲线分析步骤。
此外，优选的是，探针核酸链具有比核酸扩增反应的反应温度低的熔解温度。
此外，优选的是，探针核酸链具有比核酸扩增反应中使用的引物的熔解温度低的熔解温度，并且在探针核酸链存在下执行核酸扩增反应。
探针核酸链可具有比引物的熔解温度低5-15℃的熔解温度。
各自具有不同的碱基序列的多个探针核酸链可被用作探针核酸链。
各自具有不同的碱基序列的多个探针核酸链可各自被发射不同波长的光的荧光物质标记。在具有不同的碱基序列的多个探针核酸链中，一个探针核酸链可完全地匹配（match，一致）包含在扩增产物中的碱基序列的一部分。
核酸扩增反应可以是等温核酸扩增反应。等温核酸扩增反应可通过环介导等温扩增方法来执行。
根据本公开的实施方式，提供碱基序列分析装置包括：光源，被配置为将照射光输出在反应场所上，检测单元，被配置为检测由于照射光而从反位于应场所中的核酸扩增反应溶液产生的光，温度调节单元，被配置为加热或者冷却反应场所；以及控制单元，被配置为基于检测单元的信号输入来切换光源的驱动模式。控制单元被配置为将驱动模式从核酸扩增反应模式切换至熔解曲线分析模式。
优选的是，光源包括第一光源和第二光源，并且从第一光源输出的光的波长与从被包含在利用第二光源的光照射的核酸扩增反应溶液中的荧光物质产生的荧光的波长区域匹配。
控制单元可被配置为随着从核酸扩增反应模式切换到溶解曲线分析模式，将向反应场所输出照射光的光源从第一光源切换到第二光源。
进一步，碱基序列分析装置还可包括：光引导构件，该光引导构件被配置为将从第一光源输出的光和从第二光源输出的光引导至两束光可在其重叠的光路。
此外，第二光源可为一个或多个激光源和/或LED光源。检测单元可以时间分割方式检测从荧光物质产生的荧光。
碱基序列分析装置可被设置有遮光结构，该遮光结构被配置为限制从光源和/或反应场所输出的光的前进方向。遮光结构可具有与在光源与检测单元之间的多个光路上的位置对应的多个开口部（aperture portion）。
根据本公开的实施方式，提供一种碱基序列分析程序，该碱基序列分析程序使计算机执行：通过核酸扩增反应获得扩增产物的核酸扩增步骤，测量核酸扩增反应的反应溶液的浑浊度的浑浊度测量步骤，对位于核酸扩增反应的反应场所的探针核酸链和扩增产物执行熔解曲线分析的熔解曲线分析步骤。
根据本公开的一个或多个实施方式，提供一种能够在同一反应场所连续地执行核酸扩增反应和熔解曲线分析的碱基序列分析方法等。
附图说明
图1是根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置的示意图；
图2是示出了通过根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置来执行核酸分析方法的流程图；
图3是示出了通过碱基序列分析装置执行核酸分析方法的变形例的流程图；
图4是根据本技术的第二实施方式的碱基序列分析装置的示意图；
图5是示出了基于实验1中测量到的测试组1至3的浑浊度的Tt值的图；
图6是示出了实验2中测量到的测试组1至3的熔解曲线的图；以及
图7是示出了实验2中测量到的测试组1至3的熔解曲线的图。
具体实施方式
在下文中，将参考附图来详细描述本公开的优选实施方式。应注意，在此说明书和附图中，具有基本上相同的功能与结构的结构元件以相同的参考标号表示，并且省略了对这些结构性元件的重复解释。将按照以下顺序进行描述。
1.根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置的配置
（1）光源
（2）检测单元
（3）温度调节单元
（4）控制单元
（5）反应区域
2.根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置的操作
（1）核酸扩增步骤
（2）浑浊度测量步骤
（3）熔解曲线分析步骤
3.根据本技术的第二实施方式的碱基序列分析装置的配置
（1）激发滤波器
（2）遮光结构
4.根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法和碱基序列分析程序
1.根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置的配置
图1是根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置A1的示意图。碱基序列分析装置A1包括：将照射光输出到反应区域52上的光源（在图1中，第一光源11和第二光源12），该反应区域52是核酸扩增反应场所，检测由于照射光从发生在反应区域52（反应场所）中的核酸扩增反应产生的光的检测单元2，加热或者冷却反应区域52（反应场所）的温度调节单元3a，以及基于来自检测单元2的信号输入而切换光源11和光源12的驱动模式的控制单元4。此外，在根据本实施方式的碱基序列分析装置A1中，包括第一光源11和第二光源12作为光源。
此外，根据本实施方式的碱基序列分析装置A1包括光引导构件131，其将从第一光源11（第一光源）输出的光和从第二光源12（第二光源）输出的光引导至这些光束在其重叠的光路。
将参考图1依次描述在碱基序列分析装置A1中的各个结构。应注意，将要由碱基序列分析装置A1分析的核酸扩增反应溶液将被描述为被存储在微芯片B1的反应区域52中，微芯片B1被配置为相对碱基序列分析装置A1的单独的结构。此外，在图1中，设置在微芯片B1中的多个区域中的两个反应区域52和52作为代表示出。
（光源）
如图1所示，碱基序列分析装置A1包括两种类型的光源（第一光源11和第二光源12）作为将光照射在反应区域52上的光源。
第一光源11输出光L1用于测量核酸扩增反应过程期间的核酸扩增反应溶液的浑浊度。优选来自第一光源11的光L1的波长与从包含在利用来自第二光源12的光L2照射的核酸扩增反应溶液中的荧光物质产生的荧光L21的波长区域匹配。碱基序列分析装置A1包括允许由来自第二光源12的光L2激发荧光物质产生的荧光L21经过的荧光滤波器17。因此，配置成从第一光源11输出的光L1具有与来自荧光物质的荧光L21相同的波长区域从而允许光L1经过荧光滤波器17，因此，在反应区域52中产生的光L11和荧光L21可通过同一检测单元2检测。
例如，来自第一光源11的光L1可为像从普通光源（如：氘灯、钨丝灯、氙灯、汞灯、卤素灯等）输出的各种波长的混合波长的光。匹配荧光滤波器17的传输波长区域的波长区域可为诸如大于等于450nm，特别是450至780nm。
在通过核酸扩增反应产生的扩增产物的熔解曲线分析中，第二光源12将激发光L2（在图1中以光L2表示）输出到包含在核酸扩增反应溶液中的荧光物质上。激发光L2具有与期望的荧光物质的吸收光谱对应的特定波长区域。此波长区域不与由荧光物质产生的荧光L21的波长区域重叠。激发光L2到达反应区域52，并激发熔解曲线分析中使用的荧光物质。此外，从荧光物质产生的激发光L2经由荧光滤波器17到达检测单元2。
第二光源12（第二光源）的实例包括激光光源和LED光源、汞灯、钨丝灯等。这些光源可单独使用或者以其多个光源的组合使用。特别地，优选一个或多个激光源和/或LED光源。如果光源是激光源，因为这样的光源具有较窄光谱宽度和高功率输出，所以可省略过去使用的激发滤波器。此外，在第二光源12中包括导光板使得能够通过具有不同的波长的多种类型激光光源以多种颜色激发。这也允许具有不同波长的多个激发光束以时间分割方式从第二光源输出。
在根据本实施方式的碱基序列分析装置A1中，光引导构件131被设置为使分别从第一光源11和第二光源12输出的光L1和L2的光路重叠。尽管光引导构件13在根据本技术的实施方式1的碱基序列分析装置中是可选择的结构，但是使用光引导构件131允许光路上的聚光透镜15和检测单元2的数目减少，因此，能够减少整个碱基序列分析装置的大小。
光引导构件131包括光学入射端部131a。从第一光源11或者第二光源12输出的光L1和L2入射在光学入射端部131a上。使入射光L1和L2朝反应区域52的方向前进的构件（如：棱镜、反射板、凹凸部等）被设置在光引导构件131中。此外，在碱基序列分析装置A1中，优选在光引导构件131和反应区域52之间布置聚光透镜15和光阑16。
（2）检测单元
检测单元2检测从反应区域52输出的光L11或者荧光L21。不特别地限制检测单元2的配置，只要至少可检测光L11和荧光L21即可，光L11包括来自利用来自第一光源11的光L1照射的反应区域52的散射光或者通过反应区域52的透射光，荧光L21通过来自第二光源12的激发光L2从反应区域52产生。检测单元2的实例包括区域成像元件，例如，CCD或CMOS元件、PMT（光电倍增管）、光电二极管等。
此外，优选碱基序列分析装置A1包括在包含散射光或透射光的光L11和荧光L21到达检测单元2的光路上、在反应区域52和检测单元2之间的荧光滤波器17和聚光透镜15。优选荧光滤波器17使来自反应区域52的光L11（包含散射光或透射光）或荧光L21较好地通过。例如，荧光滤波器17可为多带通滤波器。特定的波长频带可为大于等于450nm，更具体地为450nm至750nm。此外，如果从上述第二光源12输出的激发光L2以时间分割的方式输出到反应区域52，优选碱基序列分析装置A1具有以时间分割方式检测从反应区域52中的荧光物质产生的荧光L21的检测单元2。
（3）温度调节单元
温度调节单元3a是用于加热或冷却的结构，以便反应区域52具有期望的温度。不特别地限制温度调节单元3a，只要其能改变反应区域52的温度即可。例如，温度调节单元3a可为透明导电膜，例如，可透光的ITO加热器。温度调节单元优选设置在接近反应区域52的位置。
（4）控制单元
控制单元4控制上述的第一光源11、第二光源12及温度调节单元3a的驱动。下文将描述通过控制单元4控制第一光源11等。可从包括CPU、存储器、硬盘等的通用计算机中配置控制单元4。OS、以下描述的碱基序列分析程序等存储在硬盘上。
（5）反应区域
反应区域52是用于下文描述的核酸扩增反应和熔解曲线分析的反应场所。不特别地限制反应区域52的配置，只要通过碱基序列分析装置A1可测量从反应区域52产生的光L11和L21即可。可通过市场上可买到的核酸扩增反应用塑料管配置反应区域52用。可替换地，如图1中所示，例如，反应区域52可为形成在微芯片B1中的沟槽。
微芯片B1由多个基板51和51层压成。在根据本实施方式的碱基序列分析装置A1中，因为封装在反应区域52中的样品经受光学分析，对于基板51和51，优先选择可透光的并且由于具有很少固有荧光与少量的波长色散而具有很少光学误差的材料。基板51和51可由诸如玻璃和各种塑料（聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、聚二甲硅氧烷等）的材料形成。此外，在核酸扩增反应和熔解曲线分析中使用的试剂的一部分可预先包含在反应区域52中。
2.根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置的操作
接下来，将参考图2中示出的流程图描述根据本技术第一实施方式的碱基序列分析装置A1的操作。如此流程图（图2）所示，根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法包括：核酸扩增步骤（S1）、浑浊度测量步骤（S2）和熔解曲线分析步骤（S3）。
（1）核酸扩增步骤
在图2中，参考符号S1表示通过核酸扩增反应获得扩增产物的核酸扩增步骤。在此步骤S1中，将包含核酸链（即：扩增靶）的样品（核酸扩增反应溶液）引入反应区域52（参考图1），实施核酸扩增反应，并且获得用于熔解曲线分析的包含靶序列的扩增后核酸链。
使用根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置A1执行的“核酸扩增反应”包括：采用热循环的常规PCR（聚合酶链式反应）以及不涉及热循环的各种等温扩增方法。等温扩增方法的实例包括诸如LAMP（环介导等温扩增）、SMAP（智能扩增方法）、NASBA（基于核酸序列的扩增）、
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（核酸的等温嵌合引物启动的扩增）、TRC（转录逆转录协调）、SDA（链置换扩增）、TMA（转录介导扩增）、RCA（滚环扩增）等的方法。此外，该“核酸扩增反应”广泛地包括针对核酸扩增在变化温度或恒温下实施的核酸扩增反应。
如果核酸扩增反应包括温度循环或加热操作，可通过温度调节单元3a执行对反应区域52中的样品的加热。此外，碱基序列分析装置A1可被配置成使得通过温度调节单元3a执行的加热或冷却由控制单元4控制。
优选的是，使用碱基序列分析装置A1执行的核酸扩增反应是不涉及温度循环的等温核酸扩增反应。特别地优选基于环介导等温扩增（LAMP）方法实施的核酸扩增反应。在LAMP方法中，由于存在大量的扩增产物导致核酸扩增中涉及大量的碱基，所以容易进行下述的浑浊度测量。
反应区域52中的样品（核酸扩增反应溶液）包括作为核酸扩增反应中的扩增靶的核酸链以及用于核酸扩增反应的试剂。具体地，这些试剂可为寡核苷酸引物（在下文中也简称为“引物”）、核酸单体（dNTP）、酶、包含在反应缓冲液中的成分等，该引物与作为扩增靶的核酸链的至少部分碱基序列互补。此外，优选用于下述熔解曲线分析的探针核酸链也被包括作为试剂。在根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法中，通过在用于熔解曲线分析的探针核酸链存在下进行核酸扩增步骤S1的核酸扩增反应，熔解曲线分析可在通过核酸扩增反应获得扩增核酸链的步骤之后立即开始。
优选探针核酸链的熔解温度（Tm）低于核酸扩增反应的反应温度。更优选熔解温度低于用于核酸扩增反应的引物的熔解温度以使得在核酸扩增反应过程中不会阻碍扩增核酸链和双链核酸的扩增。特别优选的是，探针核酸链的熔解温度比引物的熔解温度低5-15℃。探针核酸链的熔解温度可通过在实际执行核酸扩增反应的条件下实施熔解曲线分析来实际测量。此外，可通过恰当地选择已知的方法（例如，最近毗邻法、华莱士法（Wallace method）、GC%方法等）计算熔解温度。
在步骤S1中，碱基序列分析装置A1的控制单元4选择“核酸扩增反应模式”作为驱动模式。该“核酸扩增反应模式”是其中碱基序列分析装置A1中的每一结构被控制在适于包含在反应区域52中的核酸扩增反应溶液中的核酸的扩增的状态的模式。具体地，在像碱基序列分析装置A1的具有两种类型的光源（第一光源11和第二光源12）的装置中，驱动以下将描述的浑浊度测量步骤S2中使用的第一光源11。此外，如果核酸扩增反应采用包括温度循环的方法，控制单元4在“核酸扩增反应模式”中通过驱动温度调节单元3a执行期望的温度。
（2）浑浊度测量步骤
在图2中，参考符号S2表示测量核酸扩增反应溶液的浑浊度的浑浊度测量步骤。在此步骤中，通过测量反应区域52中的核酸反应溶液的浑浊度完成核酸是否已扩增的确定，其中，核酸扩增反应已在核酸扩增步骤S1中实施。
在核酸扩增反应中产生的碱基的实例包括从焦磷酸和能够与其结合的金属离产生的碱基。如果产生的这些碱基的量高于可溶解入核酸扩增反应溶液的量，碱基沉淀并形成浑浊物质。在根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法中，不特别地限制作为浑浊度测量对象的浑浊物质，只要浑浊物质是通过核酸扩增反应产生并可被光学测量的即可。
浑浊度测量步骤S2可在核酸扩增步骤S1开始时同时开始，或者可在从核酸扩增步骤S1启动时起推移预定时期之后开始。如果像在称为实时PCR中哪样，在核酸链扩增过程中执行浑浊度测量，优选在核酸扩增步骤S1启动的同时或之后立刻开始浑浊度测量步骤S2。另一方面，在确定扩增后核酸链是否包含在核酸扩增反应溶液的情况下，可在从核酸扩增步骤S1启动时起推移预定时期之后开始浑浊度测量步骤S2。
在浑浊度测量步骤S2中，控制单元4在预定时刻（timing）输出来自第一光源11的用于浑浊度测量的光L1。从第一光源11输出的光L1经由光引导构件131和聚光透镜15照射在反应区域52上。通过用光L1照射，在反应区域52产生包括由在核酸扩增反应过程中产生的浑浊物质产生的散射光或者通过反应区域52的透射光的光L11。光L11通过荧光滤波器17从而由检测单元2检测。应注意，在浑浊度测量步骤S2中，可检测在反应区域52中产生的散射光，或者可检测来自反应区域52的透射光，或者其可检测这二者。在根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法中，不特别地限制测量浑浊度的方法。
如图2中所示，例如，由控制单元4控制的第一光源11的光L1的输出可以预设间隔重复进行直至核酸扩增反应溶液的浑浊度超过预先设置的浑浊度的预定值。在核酸扩增反应溶液的浑浊度超过此预定值的时间点，控制单元4开始下文描述的熔解曲线分析步骤S3。
另一方面，如图3中所示，控制单元4也可通过在核酸扩增反应开始后推移预定时期后输出来自第一光源11的光L1测量核酸扩增反应溶液的浑浊度。在核酸扩增反应溶液的浑浊度超过预定值时，控制单元4开始下文描述的熔解曲线分析步骤S3。如果核酸扩增反应溶液的浑浊度没有超过预定值，控制单元4确定没有获得将用于熔解曲线分析的扩增的核酸，因此结束碱基序列分析方法。
（3熔解曲线分析步骤
在图2中，参考符号S3表示熔解曲线分析步骤，其用于对位于核酸扩增反应的反应场所的探针核酸链和扩增产物（扩增后核酸链）执行熔解曲线分析。优选在核酸扩增反应溶液的浑浊度已经达到预定值时执行此步骤S3。在步骤S3中，通过将激发光L2照射在反应区域52上以及测量从包含在核酸扩增反应溶液中的荧光物质产生的荧光L21，执行对扩增产物的熔解曲线分析。
控制单元4将驱动模式从核酸扩增反应模式切换至熔解曲线分析模式，并开始熔解曲线分析步骤S3。优选在基于从反应区域52（反应场所）产生的光L11，核酸扩增反应溶液的浑浊度达到预定值时，由控制单元4执行驱动模式的切换。
该“熔解曲线分析模式”是一种其中由控制单元4基于从检测单元2的信号输入将碱基序列分析装置A1的每一结构控制在适于对包含在反应区域52中的核酸扩增反应溶液中的扩增后核酸链和探针核酸链进行熔解曲线分析的状态的模式。具体地，在像碱基序列分析装置A1的具有两种类型的光源（第一光源11和第二光源12）的装置中，将照射光输出至反应区域52的第一光源11从第一光源11（第一光源）被切换至第二光源12（第二光源）。应注意，在步骤S3中，控制单元4也可控制输出定时和功率（激发光的波长、光量等）以及激发光L2的时间分割。此外，在步骤S3中，除光源外，控制单元4也驱动温度调节单元3a以使核酸扩增反应溶液处于期望的温度。
熔解曲线分析步骤S3中使用的荧光物质的实例包括通过结合至双链核酸发射荧光的嵌入剂以及通过形成双链产生荧光或使荧光消失的被标记的探针核酸链。如果使用探针核酸链，基于利用熔解为单链核酸而增加或减少的荧光的强度可获得熔解曲线。可使用的通过形成双链失去其荧光的探针核酸链的实例包括能市场上可买到的Q探针（QProbe）。
在熔解曲线分析步骤S3中，可使用具有不同的碱基序列的多个探针核酸链。例如，通过设计具有不同的扩增后核酸链的探针核酸链，具有多个扩增后核酸链部分的碱基序列可通过执行熔解曲线分析而被一次分析出。此外，在具有不同的碱基序列的多个探针核酸链中，一个探针核酸链可被设计成使得完全地匹配包含在扩增产物中的一部分碱基序列。在使用为碱基序列未知的部分设计的探针核酸链的熔解曲线分析中，也可基于从完全与扩增的一部分核酸链匹配的探针核酸链获得的熔解曲线执行熔解曲线分析。
当在一个熔解曲线分析中使用具有不同的碱基序列的多个探针核酸链时，优选标记有发射各种不同的波长的光的荧光物质。荧光物质的实例可包括荧光素和异硫氰酸荧光素（FITC）（它是荧光素的衍生物的一种）、罗丹明及其衍生、物以及BODIPY染料。
在熔解曲线分析步骤S3中，当使用标记有荧光物质的多种类型的探针核酸链时，优选基于上述时间分割方式检测各种荧光物质的强度。
在熔解曲线分析步骤S3中，首先，控制单元4将反应区域52中的核酸扩增反应溶液冷却至探针核酸链的熔解温度以下的温度。当核酸扩增反应溶液的温度已经冷却至低于探针核酸链的熔解温度之下时，探针核酸链杂交入扩增产物并形成双链。通常执行从核酸扩增反应的反应温度（大约65℃）至约室温～40℃的冷却。
在冷却样品之前，可将扩增产物（扩增后核酸链）热变性。一般通过加热至大约90℃至100℃（优选为大约95℃）执行热变性。扩增产物的双链形成部分通过热变性被部分地解离。如果探针核酸链为扩增产物的双链形成部分而设计，通过在步骤S3开始之前增加热变性扩增后核酸链的步骤，可将探针核酸链杂交入扩增后核酸链的靶序列中。
随后，为获得熔解曲线，控制单元4驱动温度调节单元3a以加热被冷却的核酸扩增反应溶液。此外，在加热核酸扩增反应溶液的同时，控制单元4开始来自第二光源12的激发光L2的输出。
在反应区域52中处于杂交状态的扩增后核酸链和探针核酸链由于核酸扩增反应溶液的温度的增加熔解为单链核酸。用激发光L2照射核酸扩增反应溶液中的荧光物质从而发射荧光L21。荧光L21通过荧光滤波器17和聚光透镜15并被检测单元2检测。在熔解曲线分析中，通常温度从冷却后的室温（室温～40℃）增加至大约90℃并且测量相对于温度的改变的检测出的荧光量的改变。
当通过温度调节单元3a加热的核酸扩增反应溶液达到大约90℃的预定温度时，控制单元4停止来自第二光源12的光L2的输出并且结束熔解曲线分析步骤S3。此外，伴随激发光L2的停止，控制单元4也停止通过温度调节单元3a对核酸扩增反应溶液的加热。
在根据本技术的实施方式的碱基序列分析装置A1中，通过在核酸扩增反应溶液的浑浊度达到预定值时从核酸扩增反应模式切换至熔解曲线分析模式，控制单元4可连续地执行核酸扩增反应和熔解曲线分析。
此外，通过在扩增后核酸链已经达到预设的浓度之后切换所驱动的光源，碱基序列分析装置A1的控制单元4可在样品被保持在与执行核酸扩增反应的反应场所相同的反应场所的状态下执行核酸扩增反应和熔解曲线分析，而不用增加其他步骤，例如确认核酸链的存在。
此外，在使用碱基序列分析装置A1执行的碱基序列分析方法中，因为探针核酸链的熔解温度低于核酸扩增反应中的熔解温度，在核酸扩增反应的过程中，防止探针核酸链被杂交入扩增靶核酸链中。因此，即使处于其中探针核酸链已经被添加至核酸扩增反应溶液的状态中，在核酸扩增反应开始之前可将用于熔解曲线分析的试剂引入反应场所而不会阻碍核酸扩增反应，这简化了分析碱基序列的操作。
此外，在测量核酸扩增反应溶液的浑浊度的浑浊度测量步骤中，可以仅对其探针核酸链已被确定为已经扩增至具有适于熔解曲线分析的水平的样本执行熔解曲线分析。因此，基于根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法，提高了扩增后核酸链的熔解曲线分析的准确度。
3.根据本技术的第二实施方式的碱基序列分析装置的配置
图4是根据本技术的第二实施方式的碱基序列分析装置A2的示意图。除激发滤波器18和遮光结构19a、19b、19c及19d之外，碱基序列分析装置A2具有与本技术的第一实施方式具有相同的配置。与本技术的第一实施方式中相同的组成部分用相同的参考标号表示，并且将在此省略其描述。
（1）激发滤波器
碱基序列分析装置A2包括激发滤波器18，其仅允许由第二光源12输出的光L2中特定波长的光通过。激发滤波器18优选布置在第二光源12和反应区域52之间。此外，优选激发滤波器18将由第二光源12输出的光L2转换成可检测到期望荧光的特定波长的激发光。
如图4中所示，在碱基序列分析装置A2中，因为激发滤波器18没有设置在用于浑浊度测量的从光源11输出的光L1的光路上，光引导构件132设置在反应区域52和激发滤波器18之间。光引导构件132包括光学入射端部132a。从第一光源11输出的光入射在光学入射端部132a上。与本技术的第一实施方式相似，使入射光朝向反应区域52的方向的构件（如：棱镜、反射板、凹凸部等）被设置在光引导构件132中。由第二光源12输出的光L2和由第一光源11输出的光L1沿着它们重叠的光路传递，并到达反应区域52。
应注意，尽管两种类型的光源（第一光源11和第二光源12）设置在根据本技术的第一实施方式的碱基序列分析装置A1中和根据本技术的第二实施方式的碱基序列分析装置A2中，但是设置在根据本技术的实施方式的碱基序列分析装置中的光源的数目可为一个。在这种情况下，在浑浊度测量步骤S2的适当的定时，仅允许在适于浑浊度测量的波长区域内的光通过的激发滤波器18可被布置在至反应区的光路上，并且在熔解曲线分析步骤S3的适当的定时，仅允许在适于荧光物质的激发的波长区域内的光通过的激发滤波器18可被布置在至反应区的光路上。
（2）遮光结构
碱基序列分析装置A2包括限制从反应区域52（反应场所）输出的光L11及L21的前进方向的遮光结构19a及19b。此外，独立于限制由反应区域52输出的光L11及L21的输出方向的目的，遮光结构19c及19d被设置为限制从光源（第一光源11和第二光源12）输出的光L1和L2的前进方向。也就是，在碱基序列分析装置A2中，抑制来自邻近的光学系统的杂散光的进入的遮光结构19a、19b、19c及19d被设置在光源（第一光源11和第二光源12）与检测单元2之间的光路附近的多个位置。因为设置遮光结构19a、19b、19c及19d抑制杂散光，所以提高使用碱基序列分析装置A2执行的分析的准确度。
在图4中示出的碱基序列分析装置A2中，设置为与检测单元2邻近的遮光结构19a和设置为与反应区域52邻近的遮光结构19b限制由反应区域52输出的光L11及L21的前进方向。另一方面，设置为与第二光源12邻近的遮光结构19d和设置为与反应区域52邻近的遮光结构19c限制由光源（第一光源11及第二光源12）输出的光L1及L2的前进方向。在根据本技术的实施方式的碱基序列分析装置A2中，不特别地限制遮光结构19a、19b、19c及19d的数目。遮光结构可为从光源（第一光源11和第二光源12）或者反应区域52中的任意一个输出的光而设。然而，为提高使用碱基序列分析装置A2执行的分析的准确度，优选的是，遮光结构19a、19b、19c及19d被设置在抑制从光源（第一光源11和第二光源12）和反应区域52输出的各束光的杂散光的位置。
优选的是，遮光结构19a、19b、19c及19d是具有预定厚度的板状结构。此外，如图4中所示，如果遮光结构19b、19c及19d被设置在形成反应区域52的微芯片B1的基板51和51接触的位置，遮光结构也可用作温度调节单元3b及3c的结构。此外，遮光结构19a、19b、19c及19d也可具有开口部191a、191b、191c及191d。优选提供对应于光源（第一光源11和第二光源12）和检测单元2之间的多个光路的位置的多个开口部191a、191b、191c及191d。
例如，可通过使用光刻法蚀刻在不锈钢、铜（Cu）、镍（Ni）等的金属膜上图案形成（pattern-forming）一个或者多个开口部191a、191b、191c及191d，制造出遮光结构19a、19b、19c及19d。多个开口部191a、191b、191c及191d优选地被设置成与遮光结构19a、19b、19c及19d的光源（第一光源11或第二光源12）或者反应区域52相对。
在根据本实施方式的碱基序列分析装置A2中，即使当使用输出各种波长的混合波长的普通的光源（如：氘灯、钨丝灯、氙灯、汞灯、卤素灯等）时，在碱基序列分析装置A2中包括的激发滤波器18仅允许具有适于激发荧光物质的波长的光照射反应区域52。此外，如果上述第二光源12是激光源，取决于荧光物质，可能难以获得具有有效激发波长的激光。然而，通过使用激发滤波器18，因为可产生具有期望波长的激发光，可以在大范围内选择荧光物质用于熔解曲线分析中。
此外，在碱基序列分析装置A2中，包含物遮光结构19a、19b、19c及19d能够抑制来自周围光源和来自反应区域的杂散光。因此，即使像微芯片B1中一样存在多个相邻的反应区域52，在碱基序列分析方法中可实现高准确度的光检测而无需通过时间分割来检测来自各个反应区域52的激发光。此外，可大幅减少检测从多个反应区域52输出的光L11及光L21所需的时间。此外，本实施方式的其它配置和有利的效果与本技术的上述第一实施方式相同。
4.根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法和碱基序列分析程序
根据本技术的实施方式的碱基序列分析方法与由上述碱基序列分析装置A1及A2中的控制单元4执行的操作相对应。此外，在碱基序列分析装置A1及A2中的控制单元4包含执行这些操作的碱基序列分析程序。
根据本技术的实施方式的碱基序列分析程序存储在硬盘并且在CPU和OS的控制下读入内存以执行上述分析操作。此外，可将碱基序列分析程序记录在计算机可读记录介质中。不特别地限制记录介质，只要其为计算机可读记录介质。具体的实例可包括诸如软盘和CD-ROM的圆片型记录介质。此外，也可使用基于磁带的介质，例如，磁带。而且，可使用诸如：DSP（数字信号处理器）、ASIC（专用集成电路）、PLD（可编程逻辑电路）、FPGA（现场可编程门阵列）等硬件执行一部分处理，以及与上述软件程序结合执行高速处理。
此外，本技术也可以如下方式配置。
（1）一种碱基序列分析方法，包括：
核酸扩增步骤，通过核酸扩增反应获得扩增产物；
浑浊度测量步骤，测量该核酸扩增反应的反应溶液的浑浊度；以及
熔解曲线分析步骤，对位于该核酸扩增反应的反应场所的探针核酸链和扩增产物执行熔解曲线分析。
（2）根据（1）所述的碱基序列分析方法，其中，当浑浊度已经达到预定值时执行熔解曲线分析步骤。
（3）根据（1）或（2）所述的碱基序列分析方法，其中，探针核酸链的熔解温度低于核酸扩增反应的反应温度，并且在探针核酸链存在下执行核酸扩增反应。
（4）根据（1）至（3）任一项所述的碱基序列分析方法，其中，探针核酸链的熔解温度低于核酸扩增反应中使用的引物的熔解温度。
（5）根据（4）所述的碱基序列分析方法，其中，探针核酸链的熔解温度比引物的熔解温度低5℃至15℃。
（6）根据（1）至（5）任一项所述的碱基序列分析方法，其中，各自具有不同的碱基序列的多个探针核酸链被用作探针核酸链。
（7）根据（6）所述的碱基序列分析方法，其中，各自具有不同的碱基序列的该多个探针核酸链各自被发射不同波长的光的荧光物质标记。
（8）根据（6）或（7）所述的碱基序列分析方法，其中，在各自具有不同的碱基序列的多个探针核酸链中，一个探针核酸链完全地匹配包含在扩增产物中的碱基序列的一部分。
（9）根据（1）至（8）中的任一项所述的碱基序列分析方法，其中，核酸扩增反应是等温核酸扩增反应。
（10）根据（9）所述的碱基序列分析方法，其中，等温核酸扩增反应通过环介导等温扩增方法执行。
（11）一种碱基序列分析装置，包括：
光源，被配置为将照射光输出在反应场所上；
检测单元，被配置为检测由于该照射光从在反应场所内的核酸扩增反应溶液产生的光；
温度调节单元，被配置为加热或者冷却反应场所；以及
控制单元，被配置为基于来自检测单元的信号输入来切换光源的驱动模式，
其中，控制单元被设置为将驱动模式从核酸扩增反应模式切换至熔解曲线分析模式。
（12）根据（11）所述的碱基序列分析装置，
其中，光源包括第一光源和第二光源，以及
其中，从第一光源输出的光的波长与从包含在被第二光源的光照射的核酸扩增反应溶液中的荧光物质中产生的荧光的波长区域匹配。
（13）根据（12）所述的碱基序列分析装置，其中，控制单元被配置为将照射光输出至反应场所的光源从第一光源切换至第二光源作为从核酸扩增反应模式至溶解曲线分析模式的切换。
（14）根据（12）或（13）所述的碱基序列分析装置，进一步包括：光引导构件，被配置为将从第一光源输出的光和从第二光源输出的光引导至光路，在该光路两个光束重叠。
（15）根据（12）至（14）任一项所述的碱基序列分析装置，其中，第二光源是一个或多个激光源和/或LED光源。
（16）根据（12）至（15）中任一项所述的碱基序列分析装置，其中，检测单元以时间分割方式检测由荧光物质产生的荧光。
（17）根据（11）至（16）中任一项所述的碱基序列分析装置，其中，碱基序列分析装置设置有遮光结构，该遮光结构被配置为限制从光源和/或反应场所输出的光的前进方向。
（18）根据（17）所述的碱基序列分析装置，其中，遮光结构具有与在光源与检测单元之间的多个光路的位置对应的多个开口部。
<实验1>
1.核酸扩增反应溶液的浑浊度测量
通过在要用于熔解曲线分析的探针核酸链存在下执行核酸扩增反应以及测量核酸扩增反应溶液的浑浊度来研究探针核酸链对核酸扩增反应的影响。
（材料和方法）
在本实验中，基于LAMP方法实施核酸扩增反应。将两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）的染色体组DNA用于核酸扩增反应中扩增靶的模板核酸链。两歧双歧杆菌（NBRC No.：100015）从国家技术评估研究所（National Institute of Technology and Evaluation，NITE）的生物资源中心（Biological Resource Center，NBRC）获得。此外，表1中示出的五种类型的引物用于模板核酸链的扩增。其中，引物FIP具有与模板核酸链的上游侧上的碱基序列的一部分的22个碱基互补的序列，并且具有与在下游侧上的模板核酸链的碱基序列的一部分的20个碱基同源的序列。此外，引物BIP具有与在上游侧上的模板核酸链的碱基序列的一部分的21个碱基同源的序列，并且具有与在下游侧上的模板核酸链的碱基序列的一部分的20个碱基互补的序列。在本实验中，为方便起见，在上游侧上的引物FIP的22个碱基部分将以引物FIP（F1c）表示，并且在下游侧的引物FIP的20个碱基部分将以引物FIP（F2）表示。类似地，在上游侧上的引物BIP的21个碱基部分将以引物BIP（F1）表示，并且在下游侧的引物BIP的20个碱基部分将以引物BIP（B2c）表示。
每一个引物的Tm值如下。引物F3：64.2℃、引物B3：61.2℃、引物FIP（F1c）：72.4℃、引物FIP（F2）：68.6℃、引物BIP（B1）：71.1℃、引物BIP（B2c）：66.7℃及引物LF：66.5℃。通过使用最近毗邻法并且将钠离子（Na+）浓度设置为50mM、F3及B3引物浓度均设置为0.25μM、FIP及BIP引物浓度均设置为0.2μM且LF引物浓度设置为1μM，计算引物Tm值。对于引物FIP和引物BIP，对上游侧和下游侧分别计算Tm值。这是因为LAMP方法反应机理中包含两种状态：一种状态是其中引物FIP或者引物BIP的上游侧用核酸链退火，一种状态是其中下游侧用核酸链退火。
表1
引物 碱基序列SEQ .NO.
F3 TGCTCCGGAA TAGCTCCTG 1
B3 TGCCTCCCGT AGGAGTCT 2
FIP CCAACAAGCT GATAGGACGC GACGCATGTG ATTGTGGGAA AG 3
BIP GAGGTAACGG CTCACCAAGG CGCCGTATCT CAGTCCCAAT G 4
LF CCATCCCACG CCGATAG 5
将用于下述实验2中的熔解曲线分析的探针核酸链（参考表2）在核酸扩增反应开始之前被添加至核酸扩增反应溶液。在本实验中，表2中示出的QProbe（荧光物质被结合到碱基序列的端部）被用作探针核酸链。从Nippon Steel Sumikin Echo-Tech Corporation获得这些QProbe。
表2中示出三种类型的探针核酸链，探针1的熔解温度（Tm值）为74.2℃，探针2的熔解温度为53.5℃并完全地匹配模板核酸链序列的一部分，以及探针3的熔解温度为54.5℃并且在碱基序列中具有一个不与模板核酸链匹配的碱基。通过使用最近毗邻法并将钠离子（Na+）浓度设置为50mM且将探针浓度设置为0.2μM来计算各个探针核酸链的Tm值。在本实验，这三种类型的探针核酸链（探针1至3）中一个被添加至核酸扩增反应溶液。
表2
探针核酸链 碱基序列 SEQ.NO.
探针1 CCGGCCTGAG AGGGCGACC 6
探针2 CTGAGAGGGC GACC 7
探针3 CTGACAGGGC GACC 8
将上述模板核酸链、引物及探针核酸链与LAMP试剂（Eiken ChemicalCo.,Ltd.）混合。将所得混合物分配入核酸扩增反应容器以产生核酸扩增反应溶液（25μl）。包含探针1的核酸扩增反应溶液以测试组1表示，包含探针2的核酸扩增反应溶液以测试组2表示，以及包含探针3的核酸扩增反应溶液以测试组3表示。表3示出核酸扩增反应溶液中的模板核酸链、引物及探针核酸链的浓度。核酸扩增反应在63℃下进行。在核酸扩增反应溶液的浑浊度测量使用Loopamp EXIA（Eiken Chemical Co.,Ltd.）。
表3
核酸扩增反应溶液中的浓度
引物F3 0.25μM
引物B3 0.25μM
引物FIP 2μM
引物BIP 2μM
引物LF 1μM
探针核酸链 0.2μM
模板核酸链 100拷贝/μl
（结果）
图5示出本实验的结果。图5示出核酸扩增反应的测试组1至3的Tt值（分钟）。图5中所示的Tt值（分钟）是来自各个测试组的三个样品的平均值。Tt值是从核酸扩增反应开始直至核酸扩增反应溶液的浑浊度的增长率超过预定阈值所需的时间。Tt值越小，核酸扩增反应的效率越大。
如图5中示出，基于核酸扩增反应溶液的浑浊度测量的结果，证实了对于所有的测试组1至3核酸链被扩增。此外，包含具有熔解温度比核酸扩增反应的反应温度（63℃）低9℃的探针核酸链（探针2和探针3）的测试组2和3的Tt值比包含具有熔解温度接近于反应温度的探针1的测试组1小。
基于本实验的结果，确定即使在核酸链存在下通过核酸扩增反应模板核酸链被扩增。此外，此实验还显示在核酸链存在下进行的核酸扩增反应中，如果探针核酸链的熔解温度低于核酸扩增反应的反应温度，那么核酸链的扩增更有效。
<实验2>
2.扩增后核酸链和探针核酸链的熔解曲线分析
尝试了通过对在实验1中获得的扩增后核酸链（扩增产物）和探针核酸链进行熔解曲线分析来检测扩增后核酸链中单碱基差异。
（材料和方法）
将从上述实验1获得的包含在核酸扩增反应溶液中的扩增后核酸链和探针核酸链用于熔解曲线分析。即，将测试组1至3（已经在实验1中确认核酸被扩增）用作本实验的熔解曲线分析中，而不用更换或者增加其他试剂等。
用于实验1的测试组1至3被冷却至30℃，并且然后在30℃至90℃的温度范围进行熔解曲线分析。荧光测量装置Chromo4（Bio-rad）用于测量荧光强度。每隔1℃地测量各个测试组的荧光强度。在各温度下的保持时间设置为5秒。
（结果）
图6示出在本实验获得的测试组1至3的熔解曲线。图6中的纵轴表示基于作为QProbe的探针核酸链（探针1至3）的荧光强度，横轴表示温度。
因为被荧光标记的胞嘧啶存在于Q探针的末端，尽管荧光物质在未杂交状态下发射光，但是如果荧光物质与核酸链杂交，由于被荧光标记的胞嘧啶与鸟嘌呤配对，由于鸟嘌呤的影响，荧光物质被消光。因此，在熔解曲线分析中，当与核酸链杂交的探针核酸链由于核酸扩增反应溶液的温度的增加而从核酸链解链时，荧光物质发射荧光。此外，由于从核酸链解链的探针核酸链的增加，此荧光强度也增加。
图7示出测试组1至3的熔解曲线的在每单位时间的荧光强度（dI/dT）增加的数值。图7中纵轴表示荧光强度且横轴表示温度。从图7中所示的荧光强度估计出的各测试组中的核酸链和探针核酸链的熔解温度（Tm值）对于探针1（测试组1）为68℃，对于探针2（测试组2）为54℃，及探针3（测试组3）为48℃。对于探针3，基于根据熔解曲线分析的荧光强度的增加量的改变估计出的熔解温度（48℃）低于从表1中所示的碱基序列计算出的熔解温度（54.5℃）。这被认为是由于包含在碱基序列中的探针3，碱基不与扩增后核酸链匹配。
基于本实验的结果，可看出扩增后核酸链和探针核酸链的熔解曲线分析可通过在核酸扩增反应开始之前将探针核酸链添加到核酸扩增反应溶液进行。此外，可看出基于此熔解曲线分析，可检测出探针核酸链和扩增后核酸链之间的单碱基差异。
基于实验1和2的结果，可看出通过在测量核酸扩增反应溶液的浑浊度之后立即执行熔解曲线分析，由于在确认了核酸链已被扩增之后开始扩增后核酸链的溶解曲线分析，可对扩增后核酸链可靠地进行熔解曲线分析。此外，因为在探针核酸链存在下进行核酸扩增反应，在核酸扩增反应后，可使用相同的容器进行熔解曲线分析，而不用将其他的试剂添加到包含扩增后核酸链和探针核酸链的核酸扩增反应溶液。
本领域中的技术人员应当理解的是，根据设计需要和其他因素，可以进行各种变形、组合、子组合和修改，只要它们在所附权利要求或其等价物的范围内。
Figure IDA0000396773730000011
Figure IDA0000396773730000021

Claims (19)

1.一种碱基序列分析方法，包括：
核酸扩增步骤，通过核酸扩增反应获得扩增产物；
浑浊度测量步骤，测量所述核酸扩增反应的反应溶液的浑浊度；以及
熔解曲线分析步骤，在所述核酸扩增反应的反应场所执行探针核酸链和所述扩增产物的熔解曲线分析。
2.根据权利要求1所述的碱基序列分析方法，其中，当所述浑浊度已经达到预定值时执行所述熔解曲线分析步骤。
3.根据权利要求2所述的碱基序列分析方法，其中，所述探针核酸链具有比所述核酸扩增反应的反应温度低的熔解温度，并且在所述探针核酸链存在下执行所述核酸扩增反应。
4.根据权利要求3所述的碱基序列分析方法，其中，所述探针核酸链具有比在所述核酸扩增反应中使用的引物的熔解温度低的熔解温度。
5.根据权利要求4所述的碱基序列分析方法，其中，所述探针核酸链具有比所述引物的熔解温度低5℃至15℃的熔解温度。
6.根据权利要求5所述的碱基序列分析方法，其中，各自具有不同的碱基序列的多个探针核酸链被用作所述探针核酸链。
7.根据权利要求6所述的碱基序列分析方法，其中，各自具有不同的碱基序列的所述多个探针核酸链各自标记有发射不同波长的光的荧光物质。
8.根据权利要求7所述的碱基序列分析方法，其中，在各自具有不同的碱基序列的所述多个探针核酸链中，一个探针核酸链与包含在所述扩增产物中的碱基序列的一部分完全匹配。
9.根据权利要求8所述的碱基序列分析方法，其中，所述核酸扩增反应是等温核酸扩增反应。
10.根据权利要求9所述的碱基序列分析方法，其中，所述等温核酸扩增反应通过环介导等温扩增方法来执行。
11.一种碱基序列分析装置，包括：
光源，被配置为将照射光输出在反应场所上；
检测单元，被配置为检测由于所述照射光而从在所述反应场所中的核酸扩增反应溶液产生的光；
温度调节单元，被配置为加热或者冷却所述反应场所；以及
控制单元，被配置为基于所述检测单元的信号输入来切换所述光源的驱动模式，
其中，所述控制单元被设置为将所述驱动模式从核酸扩增反应模式切换至熔解曲线分析模式。
12.根据权利要求11所述的碱基序列分析装置，
其中，所述光源包括第一光源和第二光源，以及
其中，从所述第一光源输出的光的波长与从被包含在利用来自所述第二光源的光照射的所述核酸扩增反应溶液中的荧光物质产生的荧光的波长区域匹配。
13.根据权利要求12所述的碱基序列分析装置，其中，所述控制单元被配置为将输出所述照射光至所述反应场所的所述光源从所述第一光源切换至所述第二光源作为从所述核酸扩增反应模式至所述溶解曲线分析模式的切换。
14.根据权利要求13所述的碱基序列分析装置，进一步包括：光引导构件，被配置为将从所述第一光源输出的光和从所述第二光源输出的光引导至两束光在其重叠的光路。
15.根据权利要求14所述的碱基序列分析装置，其中，所述第二光源是一个或多个的激光源和/或LED光源。
16.根据权利要求15所述的碱基序列分析装置，其中，所述检测单元以时间分割方式检测从所述荧光物质产生的荧光。
17.根据权利要求16所述的碱基序列分析装置，其中，所述碱基序列分析装置设置有遮光结构，所述遮光结构被配置为限制从所述光源和/或所述反应场所输出的光的前进方向。
18.根据权利要求17所述的碱基序列分析装置，其中，所述遮光结构具有与在所述光源与所述检测单元之间的多个光路上的位置对应的多个开口部。
19.一种碱基序列分析程序，所述碱基序列分析程序使计算机执行以下步骤：
核酸扩增步骤，通过核酸扩增反应获得扩增产物；
浑浊度测量步骤，测量所述核酸扩增反应的反应溶液的浑浊度；以及
熔解曲线分析步骤，在所述核酸扩增反应的反应场所执行探针核酸链和所述扩增产物的熔解曲线分析。
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