JP5725670B2 - リアルタイム遺伝子発現プロフィール解析 - Google Patents
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Description
感度がよくそして選択的な特定の核酸配列の増幅を特色とするポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、例えば、クローニング、遺伝子発現解析、DNAシーケンシング、遺伝子地図作成および診断学での利用において、ほとんど比類ない重要なリサーチ手段となってきた。
本明細書で使用する用語「サンプル」は、自然環境から単離され、ポリヌクレオチドを含む生体物質を指す。本発明の「サンプル」は、精製もしくは単離されたポリヌクレオチドから構成されてもよく、またはポリヌクレオチドを含有する組織サンプル、体液サンプルもしくは細胞サンプル等の生体サンプルを含んでもよい。体液は、血液、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、洗浄液および白血球泳動サンプルを含む。本発明のサンプルは、ポリヌクレオチドを含むあらゆる植物、動物、細菌またはウイルス材料であり得る。
本発明は、1つの個体またはサンプル中および2つ以上の個体またはサンプル間の双方における、遺伝子発現のレベルを解析するための方法に関する。本方法は、サンプル中の対象となる配列の1つ以上のコピーを、それらのコピーをサンプル中に存在する他の配列のバックグラウンドを超えて検出するのに十分に多く、定量的に産生するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の能力に依存する。
Log(コピー数)=aCt +b、ここでaおよびbは定数
により、初めのコピー数またはDNAの開始濃度と関連する。
増幅処理中のサンプリングは、望ましい任意の回数またはパターンで実施され得る。サンプリングは前記処理における各々のサイクルの後に行われるのが好ましいが、しかしより少ない回数(例えば2サイクル毎、3サイクル毎、4サイクル毎等)のサンプリングもまた採用され得る。一定のサンプル間隔が多くの場合望ましい一方で、サンプリングが一定の間隔で実施される必要はない。1つの例示として、サンプリング手順は、初めの5サイクルについては全サイクルの後のサンプリング、そして次に1サイクルおきのサンプリングを含み得る。
本発明の核酸の分離は、核酸の分離に適した任意の手段によって達成することができ、例えば、電気泳動、HPLCまたは質量分析法を含む。分離は好ましくはキャピラリー電気泳動(CE)で実施される。
本発明において有用な増幅産物検出法は、蛍光標識の励起スペクトル内の光で照射された場合に、標識されたプライマーによって放射される蛍光強度を計測する。蛍光検出技術は高度に発展し、そして非常に感度が良く、場合によっては1分子に至るまでの実証された検出を伴う。高感度の蛍光検出は、多くの市販のプレートリーダー、マイクロアレイ検出セットアップおよびCE装置の標準的な態様である。CE機器について、励起および発光シグナルの光ファイバー伝送が多くの場合採用される。Spectrumedix、Applied Biosystems, Beckman CoulterおよびAgilentの各社が、本明細書に記載する方法のために必要な蛍光検出に十分な蛍光検出器を備えたCE機器を販売している。
本発明において有用な多数の蛍光マーカーは、市販のものを入手可能である。例えば、Molecular Probes, Inc.(Eugene, OR)は、多様な蛍光色素を販売している。非限定的な例示は、数例を挙げると、Cy5、Cy3、TAMRA、R6G、R110、ROX、JOE、FAM、Texas Red(商標)およびOregon Green(商標)を含む。本発明において有用な蛍光色素は、当技術分野でよく知られている方法を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーに連結され得る。例えば、蛍光標識をオリゴヌクレオチドに付加するための1つの一般的な方法は、色素のN‐ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを標的の活性アミノ基と反応させることである。ヌクレオチドは活性アミノ基を有するように修飾され、それらは例えば核酸塩基にアリルアミノ基を含むことによる。アリルアミンを介した標識は、例えば米国特許5,476,928号および5,958,691号に記載され、これらは参照により本明細書に組み入れる。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを蛍光標識する他の手段は、当業者によく知られている。
発現プロファイリングについてPCR増幅を使用することに関する1つの問題点は、起こり得る増幅の偏りである。いくつかの配列は他より高い効率で増幅される。この偏りが、開始サンプルと比較した場合のPCR産物の最終的な発現量を変化させ得る。さらに、RNA抽出の効率および増幅効率を測定することが困難なため、定量PCRは、あるサンプル中の標的RNAの絶対量を測定するためというよりはむしろ、2つのサンプル間の遺伝子発現における相対的な違いを調べるために最も容易に用いられる。検出された蛍光シグナル強度は(例えば、CE分離の後)記録され、そして2つのサンプルにおける標的配列からの各ピークの相対的な割合を測定するために使用され得る。
サンプルDNA構築物:pcDNA3ベクター(Invitrogen)内にクローニングされたDNA断片を、フォワードプライマー(5'-ATCGAAATTAATACGACTCACTAT-3')およびリバースプライマー(5'-AGCTCTAGCATTTAGGTGACACTA-3')を用いたPCR反応において増幅させた。増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、そして精製キット(Qiagen)を用いてゲルから抽出した。独自の配列タグを含む相当するRNA断片を、T7 RNAポリメラーゼ転写キット(Invitrogen)を用いて調製し、そして「RNA Easy」RNA精製キット(Qiagen)によって精製した。RNA断片の濃度は、SmartSpec 3000分光光度計(Bio-Rad)において計測した。
対照RNAの2つのサンプルをヌクレアーゼ非含有水中で調製した:
サンプル1:VS31 RNA 53pg/μlおよびVS32 RNA 42pg/μlを含み、
サンプル2:VS31 RNA 53pg/μlおよびVS32 RNA 102pg/μlを含む。
5×バッファー 5μl
0.1mM DTT 2.5μl
Superscript II RT(200 U/μl) 0.5μl(RNAの量によって25〜100 U)
80%トレハロース 6.4μl
10mg/ml BSA 0.5μl
SUPERase In(20 U/μl) 1μl
1UのRNAseH(Invitrogen)を各々のチューブに添加して、37℃で20分間インキュベートした後に、75℃で15分間インキュベートして、RNAse Hを失活させた。5μl EXO-SAP-ITヌクレアーゼ(USB)をRT反応液に添加し、37℃で20分間インキュベートして未使用のプライマーを分解することにより後のPCR解析における干渉を回避し、次に80℃で15分間インキュベートすることにより酵素を失活させた。
5μlのRT反応液をSSS反応混合液と混合した:
10×Ventバッファー 5.0μl
20mM dNTP 0.5μl
DMSO 1.0μl
Q液 10μl
100μM-HA 0.5μl
Ventポリメラーゼ 0.5μl Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)
水 27.5μl
1× 94℃/5分* 50℃/5分** 68℃/5分* *94℃で第2鎖プライマーを添加
2× 95℃/2分 40℃/5分 68℃/5分 **72℃でVentを添加
1× 72℃/10分
20μlの調製cDNAを下記のものと混合した:
10×Ventバッファー 7.0μl
20mM dNTP 0.7μl
DMSO 4μl
Q液(Qiagen) 15.0μl
LHA(100mM) 0.8μl
LFAM2プライマー(100mM) 1μl (Fam(Applied Biosystems)で5’標識されている)
LROXプライマー (100mM) 1μl (Rox(Applied Biosystems)で5’標識されている)
Taqポリメラーゼ(Qiagen)0.5μl
Ventポリメラーゼ 0.5μl
水 全量を100μlとする
本発明が、その好ましい実施形態に関して特に示され、そして記載されると同時に、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細における様々な変更がなされることが、当業者によって理解されるであろう。
Claims (35)
- 少なくとも4つの異なる、対象となる核酸配列の増幅をモニタリングする方法であって、
(a)反応容器内で核酸サンプルを少なくとも4組のオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させるステップであって、
各々の前記対は、前記対象となる核酸配列を含有する核酸分子と特異的にハイブリダイズする第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および前記対象となる核酸配列の相補物に含まれる配列と特異的にハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、1つのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長産物は、その相補物から解離した場合、他のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型となることができ、
各々の前記オリゴヌクレオチドプライマー対は、対象となる核酸配列の1つに特異的であり、
前記少なくとも4組のオリゴヌクレオチドプライマー対のうちの各々のオリゴヌクレオチドプライマー対を選択することで、後の増幅処理において、区別可能なサイズの増幅産物が得られるようにし、そして
各々の前記オリゴヌクレオチドプライマー対における1つのオリゴヌクレオチドプライマーは検出できるように標識される、
ステップと、
(b)前記ステップ(a)で得られた混合物を、核酸鎖の解離、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびアニールしたプライマーのポリメラーゼ伸長の反復サイクルを少なくとも2回含む増幅処理にかけるステップであって、前記増幅処理中において、複数回の前記反復サイクルの後に、前記混合物の一定分量を前記反応容器から採取して、前記一定分量中の核酸分子を分離し、そして採取した一定分量と同量の、前記核酸サンプルを含まず、かつ前記プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼを含む反応混合物を、一定分量で補充するステップと、
(c)前記一定分量中に存在する区別可能なサイズのプライマー伸長産物における検出可能な標識の取り込みを検出するステップであって、前記検出が、サイクリング処理と同時に実施され、かつ前記少なくとも4つの対象となる核酸配列の増幅のリアルタイムプロフィールを提供するステップと、
(d)ステップ(c)で検出された、区別可能なサイズのプライマー伸長産物のそれぞれについて、サイクル数Ctを算出するステップであって、プライマー伸張産物の量が予め定義された閾値と交差し、閾値サイクル数と前記サンプル中の標的核酸の量とを関連づけるステップ
とを含む、方法。 - 前記検出可能な標識が、吸光色素、蛍光色素または放射性標識を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光色素を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記増幅処理における各々のサイクルの後に一定分量が採取され、そして前記一定分量中の核酸分子が分離および検出される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸分子の分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが逆転写反応の産物を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(a)〜(c)が、サーマルサイクラー、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュール装置において実施される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュール装置がロボットアームを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記モニタリングが、前記サンプル中の前記少なくとも4つの対象となる核酸配列を含む核酸の存在量の測定を可能にする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも4つの異なる、対象となる核酸配列の増幅をモニタリングする方法であって、
(a)鋳型核酸サンプルにアニールした逆転写プライマーの伸長によって、複数の逆転写産物を合成するステップであって、各々の前記逆転写産物は前記逆転写プライマーに含まれる共通配列タグを含むステップと、
(b)反応容器内で前記逆転写産物を、
(i)前記少なくとも4つの対象となる核酸配列を認識する少なくとも4つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、各々のオリゴヌクレオチドプライマーは、後の増幅処理において区別可能なサイズの増幅産物を生成するように選択される、オリゴヌクレオチドプライマー、および
(ii)前記共通配列タグを含む、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマー
と接触させるステップと、
(c)前記ステップ(b)から得られた混合物を、核酸鎖の解離、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびアニールしたプライマーのポリメラーゼ伸長の反復サイクルを少なくとも2回含む増幅処理にかけるステップであって、前記増幅処理中において、複数回の前記反復サイクルの後に、前記混合物の一定分量を前記反応容器から採取して、前記一定分量中の核酸分子を分離し、そして採取した一定分量と同量の、前記核酸サンプルを含まず、かつ前記プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼを含む反応混合物を一定分量で補充するステップと、
(d)前記一定分量中に存在する区別可能なサイズのプライマー伸長産物における前記検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの取り込みを検出するステップであって、前記検出が、サイクリング処理と同時に実施され、かつ前記少なくとも4つの対象となる核酸配列の増幅のプロフィールを提供するステップと、
(e)ステップ(d)で検出された、区別可能なサイズのプライマー伸長産物のそれぞれについて、サイクル数Ctを算出するステップであって、プライマー伸張産物の量が予め定義された閾値と交差し、閾値サイクル数と前記サンプル中の標的核酸の量とを関連づけるステップとを含む、方法。 - 前記検出可能な標識が、吸光色素、蛍光色素または放射性標識を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光色素を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記増幅処理における各々のサイクルの後に一定分量が採取され、そして前記一定分量中の核酸分子が分離および検出される、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 一定分量の採取、分離および検出のステップが、前記増幅のリアルタイムモニタリングを可能にする、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸分子の分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(a)〜(d)が、サーマルサイクラー、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュール装置において実施される、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュール装置がロボットアームを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記モニタリングが、前記サンプル中の前記少なくとも4つの対象となる核酸配列を含む核酸の存在量の測定を可能にする、請求項10〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも4つの異なる、対象となる核酸配列の増幅をモニタリングする方法であって、
(a)鋳型核酸サンプルにアニールした逆転写プライマーの伸長によって、複数の逆転写産物を合成するステップであって、各々の前記逆転写産物は前記逆転写プライマーに含まれる第1の共通配列タグを含むステップと、
(b)第2の共通配列タグを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、相補的cDNA鎖を合成するステップであって、各々のオリゴヌクレオチドプライマーを選択することで、後の増幅処理において区別可能なサイズの増幅産物を生成するようにするステップと、
(c)反応容器内で前記ステップ(a)および(b)の核酸合成産物を、前記第1および第2の共通配列タグを含むオリゴヌクレオチドを含む少なくとも4つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、前記第1および第2のオリゴヌクレオチドの1つは検出可能に標識されているステップと、
(d)前記ステップ(c)から得られた混合物を、核酸鎖の解離、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびアニールしたプライマーのポリメラーゼ伸長の反復サイクルを少なくとも2回含む増幅処理にかけるステップであって、前記増幅処理中において、複数回の前記反復サイクルの後に、前記混合物の一定分量を前記反応容器から採取して、前記一定分量中の核酸分子を分離し、そして採取した一定分量と同量の、前記核酸サンプルを含まず、かつ前記プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼを含む反応混合物を一定分量で補充するステップと、
(e)前記一定分量中に存在する区別可能なサイズのプライマー伸長産物における前記検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの取り込みを検出するステップであって、前記検出が、サイクリング処理と同時に実施され、かつ前記少なくとも4つの対象となる核酸配列の増幅のプロフィールを提供するステップと、
(f)ステップ(e)で検出された、区別可能なサイズのプライマー伸長産物のそれぞれについて、サイクル数Ctを算出するステップであって、プライマー伸張産物の量が予め定義された閾値と交差し、閾値サイクル数と前記サンプル中の標的核酸の量とを関連づけるステップ
とを含む、方法。 - 前記検出可能な標識が、吸光色素、蛍光色素または放射性標識を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光色素を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記増幅処理における各々のサイクルの後に一定分量が採取され、そして前記一定分量中の核酸分子が分離および検出される、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一定分量の採取、分離および検出のステップが、前記増幅のリアルタイムモニタリングを可能にする、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸分子の分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項19〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(a)〜(e)が、サーマルサイクラー、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュール装置において実施される、請求項19〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュール装置がロボットアームを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記モニタリングが、前記サンプル中の前記少なくとも4つの対象となる核酸配列を含む核酸の存在量の測定を可能にする、請求項19〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも4つの異なる、核酸配列の増幅をモニタリングする方法であって、
(a)逆転写産物のセット中に存在する少なくとも4つの異なる核酸配列を増幅するステップであって、
前記増幅は、鎖の解離、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびアニールしたプライマーのポリメラーゼ伸長の少なくとも2回のサイクルの処理を含み、
前記セット中の各々の逆転写産物は、逆転写プライマーの伸長によって作製されたものであり、
前記逆転写産物のセットは、逆転写産物の1つ以上のサブセットを含み、ここで、各々のサブセットは1つの核酸サンプル由来の少なくとも4つの逆転写産物を含み、逆転写産物の各々のサブセットのメンバーは、前記逆転写プライマー内に取り込まれたサンプル特異的な配列タグを含み、
かつ、
前記増幅は、前記逆転写産物のセットを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー:
(i)少なくとも4つの遺伝子特異的プライマーのセットであって、前記セット中の各々の前記遺伝子特異的プライマーは、核酸サンプル中で発現する特定の核酸配列を認識し、かつ、前記セット中の各々の前記遺伝子特異的プライマーを選択することで、前記セット中の他の遺伝子特異的プライマーと共に生成する増幅産物とサイズで区別可能な増幅産物を生成するようにする、遺伝子特異的プライマーのセット、および
(ii)サンプル特異的なプライマーのセットであって、各々のサンプル特異的なプライマーは、前記逆転写プライマー内に取り込まれたサンプル特異的なタグに特異的にハイブリダイズし、かつ、前記サンプル特異的なプライマーのセット中の各々のサンプル特異的なプライマーは、識別可能に標識されている、サンプル特異的なプライマーのセット
の2つのセットと接触させることを含む、ステップと、
(b)前記処理中において、プライマー伸長ステップの後に、増幅混合物の一定分量を採取し、前記一定分量中の核酸を分離するステップと、
(c)前記一定分量中の各々のサンプル特異的なプライマーの取り込みを検出するステップであって、前記検出は、各サンプルにおいて、前記遺伝子特異的プライマーのセットによって認識される少なくとも4つの核酸のセットの増幅をリアルタイムでモニターするステップと、
(d)ステップ(c)で検出された、各サンプル中の区別可能なサイズの増幅産物のそれぞれについて、サイクル数Ctを算出するステップであって、増幅産物の量が予め定義された閾値と交差し、閾値サイクル数と前記サンプル中の標的核酸の量とを関連づけるステップ
とを含む、方法。 - 前記一定分量を採取し、前記一定分量中の核酸を分離し、そしてプライマー伸長産物を検出する前記ステップが、前記増幅処理中の各々のサイクルの後に実施される、請求項28に記載の方法。
- 前記サンプル特異的プライマーが、蛍光色素、吸光色素または放射性標識で識別可能に標識されている、請求項28または29に記載の方法。
- 前記サンプル特異的プライマーが、蛍光色素で識別可能に標識されている、請求項30に記載の方法。
- 核酸分子の分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項28〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(a)〜(c)が、サーマルサイクラー、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュール装置において実施される、請求項28〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記モジュール装置がロボットアームを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記モニタリングが、前記逆転写産物が作製されたサンプル中の前記少なくとも4つの対象となる核酸配列を含む核酸の存在量の測定を可能にする、請求項28〜34のいずれか1項に記載の方法。
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