JP2019198236A - 二本鎖ｄｎａ合成方法 - Google Patents
二本鎖ｄｎａ合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019198236A JP2019198236A JP2018093024A JP2018093024A JP2019198236A JP 2019198236 A JP2019198236 A JP 2019198236A JP 2018093024 A JP2018093024 A JP 2018093024A JP 2018093024 A JP2018093024 A JP 2018093024A JP 2019198236 A JP2019198236 A JP 2019198236A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- double
- dna
- stranded dna
- stranded
- seconds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 616
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 391
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 title claims description 149
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 title claims description 75
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 209
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 77
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims abstract description 51
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 205
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 95
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 81
- 239000000047 product Substances 0.000 description 68
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 61
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 56
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 52
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 51
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 38
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 25
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 8
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 8
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 7
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- -1 GelRed nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012988 high-throughput synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
Abstract
【課題】本発明は、ＰＣＲ法を用いた二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法において、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を、その配列によらず、正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できる方法を開発することを目的とする。【解決手段】本発明は、短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する、二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法である。【選択図】なし
Description
本発明は、新規の二本鎖ＤＮＡ合成方法に関する。
遺伝子工学の分野において新規の配列を有する長鎖のＤＮＡを構築するためのＤＮＡ合成は種々の目的のために行われている。この長鎖のＤＮＡを合成するための方法は、大きく分けて２つの工程からなる。第一の工程は、多数の一本鎖オリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片を合成する工程である。第二の工程は、第一の工程にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片を多数集積して長鎖のＤＮＡを構築する工程である。この長鎖のＤＮＡの構築方法としては、酵母集積法（非特許文献１参照）、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｎｂｌｙ法（非特許文献２参照）、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ法（非特許文献３参照）、ＬＣＲ法（非特許文献４参照）、ＯＧＡＢ法（非特許文献５参照）等が知られている。
上記二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法としては、例えばＰＣＲ反応溶液中で多数の相同領域を含む一本鎖オリゴＤＮＡ同士を同時に貼り合わせ、アセンブルすることで、二本鎖ＤＮＡ断片を合成する方法がいくつか知られている（特許文献１、非特許文献６〜８参照）。これらの方法では、多数の一本鎖オリゴＤＮＡがひとつのＰＣＲ反応溶液に混在しているため、ＰＣＲ反応によってこれらの一本鎖オリゴＤＮＡを貼り合わせるとき、一本鎖オリゴＤＮＡ同士のミスマッチ、プライマーダイマーの形成等が起こるという不都合な事態を招く。上記理由のため、これらの合成方法では、合成しようとするいかなるＤＮＡ配列に対しても二本鎖ＤＮＡ断片を合成できるとは必ずしも限らない。特に、合成しようとする目的のＤＮＡ配列が、長い反復配列、連続した同一塩基配列等を含む複雑なＤＮＡ配列であると、合成が困難或いは不可能な場合もある。
また、これらの合成方法では、目的のＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成するために、その出発材料となる一本鎖オリゴＤＮＡを設計しなければならない。これら一本鎖オリゴＤＮＡの設計の際には、ＰＣＲ反応のアニーリング温度の設定のため、多数の一本鎖オリゴＤＮＡを貼り合わせるための相同領域の長さを調節しなければならない。加えて、合成工程での一本鎖オリゴＤＮＡのヘアピン形成等を防ぐため、各一本鎖オリゴＤＮＡの長さ、数及びＧＣ含有量の構成等を調節する必要がある。即ち、これまでの合成方法においては、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の一本鎖オリゴＤＮＡの設計が複雑であること、数個〜数１００個単位の多数の二本鎖ＤＮＡ断片を合成しようとしても、それらのＤＮＡ配列ごとに一本鎖オリゴＤＮＡを設計しなければならないことから、一本鎖オリゴＤＮＡの設計に時間と手間がかかるという不都合が生じる。
上記第二の工程である長鎖のＤＮＡの合成においては、上記第一の工程で得られた多数の二本鎖ＤＮＡ断片を集積材料として用いる。上記第二の工程で長鎖のＤＮＡの合成において二本鎖ＤＮＡ断片を集積する際には、その二本鎖ＤＮＡ断片がひとつでも欠けてしまうと、目的とする長鎖のＤＮＡを合成することが不可能となる。しかし、これまでの二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法では、数個〜数１００個単位の多数の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するまでに時間と手間がかかるという不都合が生じること、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の複雑性によっては、合成が困難或いは不可能であることから、集積材料となる全ての二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに取得することが困難な状況である。即ち、これまでの二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法では、長鎖のＤＮＡの合成のための集積材料となる二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに供給することができず、ボトルネックとなっているのが実情である。故に、これまでの合成方法に代わる、二本鎖ＤＮＡ断片の合成を効率よく迅速に合成できる新たな方法が強く求められていた。
Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ. Ｓｃｉｅｎｃｅ， ５８６７， １２１５−１２２０．，２００８
Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ. Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６， ３４３−３４５．，２００９
Ｅｎｇｌｅｒ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ. ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ４， ｅ５５５３．，２００９
Ｓｔｅｆａｎ ｄｅ Ｋｏｋ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ. ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ．， ３， ９７−１０６．，２０１４
Ｔｓｕｇｅ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３１， ｅ１３３．， ２００３、Ｔｓｕｇｅ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ５， １０６５５．， ２０１５
Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ， １６４， ４９−５３．，１９９５
Ｘｉｏｎｇ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． ｐｒｏｔｏｃ．， １， ７９１．，２００６
Ｘｉｏｎｇ， Ａ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３２， ｅ９８−ｅ９８．，２００４
Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ， Ｃ．， ａｎｄ Ｐｅａｒｌ， Ｌ． Ｈ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．， ５， ８２７−８２９．，１９９２
このような状況の中、本発明者らは、上述の不都合を解決し、長鎖ＤＮＡ合成のための集積材料として使用できる二本鎖ＤＮＡ断片を正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できる方法を開発することを目的として本研究を進めた。即ち、本発明は、ＰＣＲ法を用いた二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法において、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を、その配列によらず、正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できる方法を開発することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する二本鎖ＤＮＡ合成方法において、ＰＣＲサイクルのアニーリング温度設定を多段階とすることで、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を正確に、容易に、効率よく、且つ迅速に合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する、二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［２］上記アニーリング温度設定が、２段階〜２０段階である、［１］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［３］上記アニーリング温度設定が、６５℃〜８５℃である、［１］又は［２］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［４］上記アニーリング温度設定の各段階における温度保持時間が、１０秒〜２分である、［１］から［３］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［５］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおけるＤＮＡのオーバーラップ領域が１０塩基〜４０塩基である、［１］から［４］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［６］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて、３種〜２０種の短い二本鎖ＤＮＡが連結される、［１］から［５］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［７］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて用いられる短い二本鎖ＤＮＡが、プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される、［１］から［６］のいずかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［８］上記プライマーエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有する、［７］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［９］上記プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される短い二本鎖ＤＮＡのサイズが、１００塩基〜３００塩基である、［７］又は［８］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［１０］二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成するプライマーエクステンションＰＣＲ工程、及び
オーバーラップエクステンションＰＣＲにより、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程において合成された二本鎖ＤＮＡを連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程
を含み、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［２］上記アニーリング温度設定が、２段階〜２０段階である、［１］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［３］上記アニーリング温度設定が、６５℃〜８５℃である、［１］又は［２］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［４］上記アニーリング温度設定の各段階における温度保持時間が、１０秒〜２分である、［１］から［３］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［５］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおけるＤＮＡのオーバーラップ領域が１０塩基〜４０塩基である、［１］から［４］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［６］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて、３種〜２０種の短い二本鎖ＤＮＡが連結される、［１］から［５］のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［７］上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて用いられる短い二本鎖ＤＮＡが、プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される、［１］から［６］のいずかに記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［８］上記プライマーエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有する、［７］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［９］上記プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される短い二本鎖ＤＮＡのサイズが、１００塩基〜３００塩基である、［７］又は［８］に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
［１０］二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成するプライマーエクステンションＰＣＲ工程、及び
オーバーラップエクステンションＰＣＲにより、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程において合成された二本鎖ＤＮＡを連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程
を含み、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
本発明によると、ＰＣＲサイクルにおいて複数段階のアニーリング温度設定を有することで、様々なＴｍ値を有する複数のＤＮＡの貼り合せに適用可能となるため、多数の相同領域を含む一本鎖オリゴＤＮＡ同士のアセンブルを容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に行うことができる。また、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法は、様々なＴｍ値のＤＮＡの貼り合せに適用可能であることから、材料とする一本鎖オリゴＤＮＡ配列を最適化する手間が不要であり、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片毎に細かく温度設定をしなおす必要がない。さらに、本発明によると、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片の配列によらず、容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に合成することが可能なので、従来複雑な配列（例えば長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ、ＧＣ−ｒｉｃｈな配列等）であるために合成が困難、或いは不可能であった二本鎖ＤＮＡ断片も合成することができる。
以下、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、分子生物学的手法は特に明記しない限り当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
＜二本鎖ＤＮＡ合成方法＞
本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法は、短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する方法であって、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする。このように本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法が、ＰＣＲサイクルにおいて複数段階のアニーリング温度設定を有することで、様々なＴｍ値を有する複数のＤＮＡの貼り合せに適用可能となるため、多数の相同領域を含む一本鎖オリゴＤＮＡ同士のアッセンブルを容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に行うことができる。また、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法は、様々なＴｍ値のＤＮＡの貼り合せに適用可能であることから、材料とする一本鎖オリゴＤＮＡ配列を最適化する手間が不要であり、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片毎に細かく温度設定をしなおす必要がない。さらに、本発明によると、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片の配列によらず、容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に合成することが可能なので、従来複雑な配列（例えば長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ、ＧＣ−ｒｉｃｈな配列等）であるために合成が困難、或いは不可能であった二本鎖ＤＮＡ断片も合成することができる。
本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法は、短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する方法であって、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする。このように本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法が、ＰＣＲサイクルにおいて複数段階のアニーリング温度設定を有することで、様々なＴｍ値を有する複数のＤＮＡの貼り合せに適用可能となるため、多数の相同領域を含む一本鎖オリゴＤＮＡ同士のアッセンブルを容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に行うことができる。また、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法は、様々なＴｍ値のＤＮＡの貼り合せに適用可能であることから、材料とする一本鎖オリゴＤＮＡ配列を最適化する手間が不要であり、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片毎に細かく温度設定をしなおす必要がない。さらに、本発明によると、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片の配列によらず、容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に合成することが可能なので、従来複雑な配列（例えば長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ、ＧＣ−ｒｉｃｈな配列等）であるために合成が困難、或いは不可能であった二本鎖ＤＮＡ断片も合成することができる。
また、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて用いられる短い二本鎖ＤＮＡは、プライマーエクステンションＰＣＲにより合成されることが好ましい。そこで、本発明は、プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成するプライマーエクステンションＰＣＲ工程、及びオーバーラップエクステンションＰＣＲにより、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程において合成された二本鎖ＤＮＡを連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程を含み、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする二本鎖ＤＮＡ合成方法であると説明することもできる。以下に本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法を工程毎に、詳細に説明する。図１には本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法の工程を模式的に示した。
［プライマーエクステンションＰＣＲ工程］
本工程は、プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成する工程である。本工程で得られる短い二本鎖ＤＮＡは、後述するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程において連結され、長鎖ＤＮＡ合成のための集積材料として使用できる二本鎖ＤＮＡ断片となる。したがって、最終的に合成したい長鎖二本鎖ＤＮＡの配列から、集積材料としてどのような二本鎖ＤＮＡ断片が必要か決定され、その二本鎖ＤＮＡ断片をいくつかに分断して配列デザインされたものが本工程で合成される短い二本鎖ＤＮＡとなる。
本工程は、プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成する工程である。本工程で得られる短い二本鎖ＤＮＡは、後述するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程において連結され、長鎖ＤＮＡ合成のための集積材料として使用できる二本鎖ＤＮＡ断片となる。したがって、最終的に合成したい長鎖二本鎖ＤＮＡの配列から、集積材料としてどのような二本鎖ＤＮＡ断片が必要か決定され、その二本鎖ＤＮＡ断片をいくつかに分断して配列デザインされたものが本工程で合成される短い二本鎖ＤＮＡとなる。
ここで、本発明においてプライマーエクステンションＰＣＲとは、互いの末端部分に相補的に結合する領域を持つ一対の一本鎖オリゴＤＮＡを貼り合わせ、それぞれの鎖をポリメラーゼにより伸長させることで二本鎖ＤＮＡを合成する反応のことをいう。
（ｉ）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法によって得られる二本鎖ＤＮＡ断片の全長配列を任意の数の短い二本鎖ＤＮＡに分割する。この短い二本鎖ＤＮＡのサイズとしては、通常１００塩基〜３００塩基であり、１２０塩基〜２５０塩基であることが好ましく、１４０塩基〜１８０塩基であることがより好ましく、１５０塩基前後であることが更に好ましい。分割する短い二本鎖ＤＮＡの数は、全長配列の長さにより適宜決めることができるが、通常３〜２０であり、２〜１０であることが好ましく、２〜５であることがより好ましく、３程度であることがさらに好ましい。
本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法によって得られる二本鎖ＤＮＡ断片の全長配列を任意の数の短い二本鎖ＤＮＡに分割する。この短い二本鎖ＤＮＡのサイズとしては、通常１００塩基〜３００塩基であり、１２０塩基〜２５０塩基であることが好ましく、１４０塩基〜１８０塩基であることがより好ましく、１５０塩基前後であることが更に好ましい。分割する短い二本鎖ＤＮＡの数は、全長配列の長さにより適宜決めることができるが、通常３〜２０であり、２〜１０であることが好ましく、２〜５であることがより好ましく、３程度であることがさらに好ましい。
上記分割された短い二本鎖ＤＮＡは５´−又は３´−末端に任意の長さの、互いにオーバーラップする領域を含むように設計される。このオーバーラップ領域の長さは、通常５塩基〜５０塩基であり、１０塩基〜４０塩基が好ましく、１５塩基〜４０塩基がより好ましく、３０塩基程度がさらに好ましい。上記のように設計された短い二本鎖ＤＮＡの合成に用いる一対の一本鎖オリゴＤＮＡは、上記オーバーラップ領域を含む６０塩基〜３００塩基であり、１００塩基〜２００塩基であることが好ましく、１５０塩基〜２００塩基であることがより好ましい。本工程においては、比較的長鎖の一本鎖オリゴＤＮＡを用いることによって、二本鎖ＤＮＡ合成に使用する一本鎖オリゴＤＮＡの本数を減らすと共に、一本鎖オリゴＤＮＡ配列中のＧＣ含有比の偏りをなくすことができるため、ヘアピン構造などのＤＮＡ二次構造の形成を防ぐこともできる。なお、これらの一本鎖オリゴＤＮＡは化学合成により調製することができる。
これらの一本鎖オリゴＤＮＡには、完全長の一本鎖オリゴＤＮＡとは異なる、化学合成の過程にて生じる不完全長の一本鎖オリゴＤＮＡが含まれていてもよい。本工程では、使用する一本鎖オリゴＤＮＡ中、完全長の一本鎖オリゴＤＮＡが１５％以上あれば、目的の合成二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ増幅産物が得られ、クローン化することにより正確な配列の二本鎖ＤＮＡを取得することが可能である。即ち、使用する一本鎖オリゴＤＮＡ中、未反応物を含む不完全長の一本鎖オリゴＤＮＡが８５％程度含まれているような状態においても、目的の合成二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ増幅産物を得ることができる。
（ｉｉ）ＰＣＲサイクル
上記分割数に応じた組数の対の一本鎖オリゴＤＮＡを、それぞれ別々に滅菌水又はＴＥ緩衝液等にて任意の濃度に調整する。上記濃度は通常０．１〜１０μＭであり、０．２５〜５μＭであることが好ましく、１μＭ前後であることがより好ましい。ＰＣＲ反応溶液（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＮＥＢ社等）を調整し、上記一対の一本鎖オリゴＤＮＡをそれぞれ加え全量が等量になるように調製する。このとき、それぞれの短い二本鎖ＤＮＡの合成毎にＰＣＲ反応溶液を準備し、そのひとつのＰＣＲ反応溶液に一対となる２本の一本鎖オリゴＤＮＡのみを混合している状態である。このため、一本鎖オリゴＤＮＡの貼り合せの間に引き起こる一本鎖オリゴＤＮＡ同士のミスマッチングやプライマーダイマーの形成を防ぐことができる。
上記分割数に応じた組数の対の一本鎖オリゴＤＮＡを、それぞれ別々に滅菌水又はＴＥ緩衝液等にて任意の濃度に調整する。上記濃度は通常０．１〜１０μＭであり、０．２５〜５μＭであることが好ましく、１μＭ前後であることがより好ましい。ＰＣＲ反応溶液（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＮＥＢ社等）を調整し、上記一対の一本鎖オリゴＤＮＡをそれぞれ加え全量が等量になるように調製する。このとき、それぞれの短い二本鎖ＤＮＡの合成毎にＰＣＲ反応溶液を準備し、そのひとつのＰＣＲ反応溶液に一対となる２本の一本鎖オリゴＤＮＡのみを混合している状態である。このため、一本鎖オリゴＤＮＡの貼り合せの間に引き起こる一本鎖オリゴＤＮＡ同士のミスマッチングやプライマーダイマーの形成を防ぐことができる。
次に、サーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、短い二本鎖ＤＮＡを合成する。このときのＰＣＲ反応の温度条件としては、９８℃、２分の後、熱変性段階／アニーリング段階／伸長段階（エクステンション）を１サイクルとして任意のサイクル数行う。サイクル数としては通常５サイクル以上であり、１０サイクル以上が好ましい。１０サイクルを超えても問題はないが、１０サイクル程度で本工程においては十分といえる合成量が得られる。
上記熱変性段階及び伸長段階においては、従来のＰＣＲ法と同様の条件を選択することができる。例えば、熱変性段階においては９８℃、３０秒で、伸長段階においては、使用するポリメラーゼにより条件が変わってくるが、例えば７２℃、５０秒である。
本発明においては、上記アニーリング段階において、複数段階のアニーリング温度設定を有する点が従来の方法と大きく異なる。アニーリング温度設定としては、５０℃〜９０℃範囲で、好ましくは６０℃〜８５℃の範囲で、２段階〜２０段階、好ましくは２段階〜１５段階、より好ましくは２段階〜１０段階、さらに好ましくは２段階から８段階の温度設定を有する。各段階のアニーリング温度の保持時間としては、通常１０秒以上であり、２０秒以上が好ましく、３０秒以上がより好ましく、４０秒以上がさらに好ましく、５０秒以上が特に好ましい。５０秒を超える長い時間反応させても問題はなく２分程度まで反応させてもよいが、５０秒程度で十分ともいえる。なお、プライマーエクステンションＰＣＲ工程が終了した後は終夜インキュベートしても問題はない。その時の温度は４℃〜７２℃の範囲とすることが好ましい。
本工程のＰＣＲにおいて複数段階のアニーリング温度設定を有することで、各対の一本鎖オリゴＤＮＡの組み合わせ毎のＴｍ値の違いを補完することができるため、本工程での全ての二本鎖ＤＮＡ合成のためのＰＣＲを一度に行うことができる。
［オーバーラップエクステンションＰＣＲ工程］
本工程は、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程で合成した短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する工程である。このＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする。
本工程は、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程で合成した短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する工程である。このＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする。
ここで、オーバーラップエクステンションＰＣＲとは、ＰＣＲ反応における標的ＤＮＡの増幅に際し、標的ＤＮＡ特異的なプライマーの５´末端側に別の配列を付加しておくことによって、新たな配列をＰＣＲ産物に付加し、この新たな配列が複数の標的ＤＮＡ間で相補的になるよう設計しておくことによって、アニーリング時に複数の標的ＤＮＡの末端同士を融合させ、その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応で１本のＰＣＲ産物を合成する反応をいう。本発明においては、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程で合成された複数種類の短い二本鎖ＤＮＡを連結させて１本の二本鎖ＤＮＡ断片を作成するために行われる反応である。上記短い二本鎖ＤＮＡは連結部分に相同領域を有しており、熱変性により一本鎖になると、アニーリング段階で、その相同領域部分が相補的に結合し、互いの５´末端側の新たな配列をＰＣＲ産物に付加することができる。この新たな配列は別の二本鎖ＤＮＡとの間で相補的になるように設計されているので、アニーリング時にＤＮＡの末端同士が融合し、その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応で１本のＰＣＲ産物を合成できる。
具体的には、以下のように行う。上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程で合成された短い二本鎖ＤＮＡを、全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液（１ ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６ Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＮＥＢ社製等）に等量ずつ添加する。このＰＣＲ反応溶液は、全長二本鎖ＤＮＡを増幅させるためのプライマーを含んでいる。
次に、サーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応により、全長二本鎖ＤＮＡ断片を合成する。このときのＰＣＲ反応の温度条件としては、９８℃、２分の後、熱変性段階／アニーリング段階／伸長段階（エクステンション）を１サイクルとして任意のサイクル数行う。サイクル数としては通常１０サイクル以上であり、２０サイクル以上が好ましい。２０サイクルを超えても問題はないが、２０サイクル程度で本工程においては十分といえる合成量が得られる。
上記熱変性段階及び伸長段階においては、従来のＰＣＲ法と同様の条件を選択することができる。例えば、熱変性段階においては９８℃、３０秒で、伸長段階においては、使用するポリメラーゼにより条件が変わってくるが、例えば７２℃、５０秒である。
本発明においては、上記アニーリング段階において、複数段階のアニーリング温度設定を有する点が従来の方法と大きく異なる。アニーリング温度設定としては、５０℃〜９０℃範囲で、好ましくは６０℃〜８５℃の範囲で、２段階〜２０段階、好ましくは２段階〜１５段階、より好ましくは２段階〜１０段階、さらに好ましくは２段階から８段階の温度設定を有する。各段階のアニーリング温度の保持時間としては、通常１０秒以上であり、２０秒以上が好ましく、３０秒以上がより好ましく、４０秒以上がさらに好ましく、５０秒以上が特に好ましい。５０秒を超える長い時間反応させても問題はなく２分程度まで反応させてもよいが、５０秒程度で十分ともいえる。
本工程のＰＣＲにおいて複数段階のアニーリング温度設定を有することで、短い二本鎖ＤＮＡのアセンブリや、各々の一本鎖ＤＮＡ同士を貼り合わせるときに生じるＴｍ値の違いを補完することができるため、貼り合わせに必要な一本鎖オリゴＤＮＡの相同領域に対するＴｍ値を合わせるように最適化する必要がない。このため、一本鎖オリゴＤＮＡの相同領域の長さは３０塩基に固定した状態にて設計でき、数多くの配列の異なる二本鎖ＤＮＡを合成するときの一本鎖オリゴＤＮＡの設計を簡便にできる。また、プライマーエクステンションＰＣＲ反応とオーバーラップエクステンションＰＣＲ反応のそれぞれの温度条件を統一化することもできる。
さらに、本発明の方法によると、異なる配列の二本鎖ＤＮＡ断片を複数同時に並行して合成することができる。これらの同時に合成可能な二本鎖ＤＮＡ断片数は特に限定されないが、数１０から数１００個単位での同時合成も可能であるため、スループット性が著しく高い。また、本発明の合成方法を液体分注ロボットのプログラムに適用することによって、複数同時に二本鎖ＤＮＡ断片の合成を自動化することもできる。
本発明の合成方法によって合成されうる二本鎖ＤＮＡ断片は、配列や長さにおいて特に限定されないが、ＰＣＲで使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの正確性を踏まえると５，０００塩基対までの長さが好ましい。このため、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応によって連結する短い二本鎖ＤＮＡ断片の数は通常３から２０断片程度であり、２から１０断片であることが好ましく、２から５断片であることがより好ましく、３断片程度であることがさらに好ましい。
また本発明の合成方法によると、長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ、ＧＣ−ｒｉｃｈなどの一般的に複雑な配列といわれているＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片の合成も可能となる。
本発明の合成方法にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片は、酵母集積法（非特許文献１参照）、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｎｂｌｙ法（非特許文献２参照）、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ法（非特許文献３参照）、ＬＣＲ法（非特許文献４参照）、ＯＧＡＢ法（非特許文献５参照）等の長鎖のＤＮＡの合成方法を用いることにより、多数集積して長鎖のＤＮＡを構築することができる。
長鎖のＤＮＡの合成においては、二本鎖ＤＮＡ断片を集積材料として用いるが、その二本鎖ＤＮＡ断片がひとつでも欠けてしまうと、目的の長鎖のＤＮＡを合成することが不可能となる。本発明の合成方法は、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の複雑性に関わらず、二本鎖ＤＮＡ断片を複数同時に合成することができることから、長鎖のＤＮＡの合成のための集積材料となる二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに合成できる。そのため、本発明の合成方法は、長鎖のＤＮＡの合成のために必要な二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに供給することできるため、長鎖のＤＮＡの合成方法へのスループット性を大幅に向上することができる。
本発明の合成方法によって得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＰＣＲ産物はベクターと混合し、ＤＮＡライゲーション反応することでＤＮＡクローニングされた後、大腸菌コンピテントセルを用いてプラスミドを導入する形質転換を行う。合成二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物のＤＮＡクローニングは、制限酵素的クローニング法、ＴＡクローニング法、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法、平滑末端クローニング法などいずれでもよく特に限定されない。使用するベクターＤＮＡは、制限酵素的クローニング用ベクター、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング用ベクター、ＴＡクローニング用ベクター、平滑末端用クローニング用ベクターなどいずれでもよく特に限定されない。
本発明の合成方法によって得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、ＰＣＲ反応によって生じる目的配列の長さよりも短い非特異的ＤＮＡ増幅産物の出現を抑えることができる。このため、本発明の合成方法によって得られた合成二本鎖ＤＮＡ断片は、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。
＜プログラム＞
本発明は、上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法におけるＰＣＲのプログラムも含む。本発明のＰＣＲ条件についてのプログラムは、サーマルサイクラー等のＰＣＲに繋用される装置において用いることができる。本発明のプログラムは、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法におけるＰＣＲの温度条件等を規定するものであり、内容の詳細は「二本鎖ＤＮＡ合成方法」の項の説明を適用できる。
本発明は、上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法におけるＰＣＲのプログラムも含む。本発明のＰＣＲ条件についてのプログラムは、サーマルサイクラー等のＰＣＲに繋用される装置において用いることができる。本発明のプログラムは、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法におけるＰＣＲの温度条件等を規定するものであり、内容の詳細は「二本鎖ＤＮＡ合成方法」の項の説明を適用できる。
＜装置＞
本発明は、上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法を実現することができる装置も含む。また、本発明の装置は、上記本発明のプログラムが組み込まれた装置である。具体的には、上記本発明のプログラムが組み込まれたサーマルサイクラー等のＰＣＲに繋用される装置である。上記プログラムは、本発明のＤＮＡ合成方法におけるＰＣＲの温度条件等を規定するものであり、内容の詳細は「二本鎖ＤＮＡ合成方法」の項の説明を適用できる。
本発明は、上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法を実現することができる装置も含む。また、本発明の装置は、上記本発明のプログラムが組み込まれた装置である。具体的には、上記本発明のプログラムが組み込まれたサーマルサイクラー等のＰＣＲに繋用される装置である。上記プログラムは、本発明のＤＮＡ合成方法におけるＰＣＲの温度条件等を規定するものであり、内容の詳細は「二本鎖ＤＮＡ合成方法」の項の説明を適用できる。
＜二本鎖ＤＮＡ自動合成システム＞
本発明は、上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法を用いることを特徴とした二本鎖ＤＮＡ自動合成システムも含む。上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法においては、目的とするＤＮＡの配列に関わらず同一条件でＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを合成できることから、液体分注ロボット等を用いたハイスループット合成システムや、それらの一連の工程を自動で行うことができる自動合成システムが可能となる。このような本発明の二本鎖ＤＮＡ自動合成システムは、上述した本発明のプログラム、本発明の装置を使用するものであってもよい。
本発明は、上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法を用いることを特徴とした二本鎖ＤＮＡ自動合成システムも含む。上述した本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法においては、目的とするＤＮＡの配列に関わらず同一条件でＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを合成できることから、液体分注ロボット等を用いたハイスループット合成システムや、それらの一連の工程を自動で行うことができる自動合成システムが可能となる。このような本発明の二本鎖ＤＮＡ自動合成システムは、上述した本発明のプログラム、本発明の装置を使用するものであってもよい。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例において用いた試薬等、共通する試験方法等は以下のとおりである。
二本鎖ＤＮＡ合成の材料となる一本鎖オリゴＤＮＡは、日本テクノサービス社製及びファスマック社製のものを用いた。二本鎖ＤＮＡ合成に用いたＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅は、ＮＥＢ社のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡ増幅産物のＤＮＡクローニングには、東洋紡社製の１０ｘ Ａ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｉｘ、ＴａＫａＲａ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）及びＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いた。大腸菌コンピテントはＴａＫａＲａ社製の大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを用い、プラスミドベクターを用いた形質転換法は添付の説明書に従い行った。ＬＢ培地の培地成分及び寒天は、ベクトンディッキントン社製のものを用いた（ＢａｃｔｏＴＭ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、ＢａｃｔｏＴＭ Ａｇａｒ）。アンピシリンとカルベニシリンの抗生物質は、ナカライテスク社から購入した。大腸菌コロニーからのＰＣＲ反応用テンプレートの調製は、関東化学社製のシカジーニアスＤＮＡ抽出試薬を用い、添付の説明書に従い行った。大腸菌コロニーからのコロニーダイレクトＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅は、ＴａＫａＲａ社製のＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔを用い、添付の説明書に従い行った。コロニーダイレクトＰＣＲ反応の温度条件は次のとおりである。９５℃、２分の後、以下の温度サイクル；９５℃、２０秒；５８℃、３０秒；７２℃、増幅長さ１ｋｂあたり１分；を３０サイクル行った。ＤＮＡの精製は、キアゲン社製のＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用い、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡシーケンス反応は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用い、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡシーケンス反応の温度条件は次のとおりである。９５℃、２分後、以下の温度サイクル；９５℃、５秒；５０℃、１０秒；６０℃、２分３０秒；を３０サイクル行った。ＤＮＡシーケンス反応産物の精製は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡシーケンスは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、添付の説明書に従い行った。ＰＣＲ反応産物のアガロースゲル電気泳動は、コスモバイオ社製のアガロースゲル電気泳動装置（ｉ−ＭｙＲｕｎ．ＮＣ）を用いて、添付の説明書に従い行った。電気泳動後のＤＮＡ染色はＢｉｏｔｉｕｍ社製のＧｅｌＲｅｄ核酸蛍光染色試薬を用いて、添付の説明書に従い行った。一本鎖オリゴＤＮＡの電気泳動は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセル電気泳動装置と１０％Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルを用いて、添付の説明書に従い行った。電気泳動後の一本鎖オリゴＤＮＡの染色は、ＴａＫａＲａ社製のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ核酸蛍光染色試薬を用いて、添付の説明書に従い行った。一本鎖オリゴＤＮＡの解析は、バイオ・ラッド社製のゲル撮影解析装置 Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ システムを用いて、添付の説明書に従い行った。その他のすべての生化学試薬としては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製及びナカライテスク社製のものを使用した。
二本鎖ＤＮＡ合成の材料となる一本鎖オリゴＤＮＡは、日本テクノサービス社製及びファスマック社製のものを用いた。二本鎖ＤＮＡ合成に用いたＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅は、ＮＥＢ社のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡ増幅産物のＤＮＡクローニングには、東洋紡社製の１０ｘ Ａ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｉｘ、ＴａＫａＲａ社製のＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）及びＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いた。大腸菌コンピテントはＴａＫａＲａ社製の大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを用い、プラスミドベクターを用いた形質転換法は添付の説明書に従い行った。ＬＢ培地の培地成分及び寒天は、ベクトンディッキントン社製のものを用いた（ＢａｃｔｏＴＭ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、ＢａｃｔｏＴＭ Ａｇａｒ）。アンピシリンとカルベニシリンの抗生物質は、ナカライテスク社から購入した。大腸菌コロニーからのＰＣＲ反応用テンプレートの調製は、関東化学社製のシカジーニアスＤＮＡ抽出試薬を用い、添付の説明書に従い行った。大腸菌コロニーからのコロニーダイレクトＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅は、ＴａＫａＲａ社製のＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔを用い、添付の説明書に従い行った。コロニーダイレクトＰＣＲ反応の温度条件は次のとおりである。９５℃、２分の後、以下の温度サイクル；９５℃、２０秒；５８℃、３０秒；７２℃、増幅長さ１ｋｂあたり１分；を３０サイクル行った。ＤＮＡの精製は、キアゲン社製のＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用い、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡシーケンス反応は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用い、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡシーケンス反応の温度条件は次のとおりである。９５℃、２分後、以下の温度サイクル；９５℃、５秒；５０℃、１０秒；６０℃、２分３０秒；を３０サイクル行った。ＤＮＡシーケンス反応産物の精製は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、添付の説明書に従い行った。ＤＮＡシーケンスは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、添付の説明書に従い行った。ＰＣＲ反応産物のアガロースゲル電気泳動は、コスモバイオ社製のアガロースゲル電気泳動装置（ｉ−ＭｙＲｕｎ．ＮＣ）を用いて、添付の説明書に従い行った。電気泳動後のＤＮＡ染色はＢｉｏｔｉｕｍ社製のＧｅｌＲｅｄ核酸蛍光染色試薬を用いて、添付の説明書に従い行った。一本鎖オリゴＤＮＡの電気泳動は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセル電気泳動装置と１０％Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルを用いて、添付の説明書に従い行った。電気泳動後の一本鎖オリゴＤＮＡの染色は、ＴａＫａＲａ社製のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ核酸蛍光染色試薬を用いて、添付の説明書に従い行った。一本鎖オリゴＤＮＡの解析は、バイオ・ラッド社製のゲル撮影解析装置 Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ システムを用いて、添付の説明書に従い行った。その他のすべての生化学試薬としては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製及びナカライテスク社製のものを使用した。
（実施例１）本発明の合成方法におけるＰＣＲ反応条件の検討（多段階の温度勾配ごとの温度保持時間の検討）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。すなわち、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号１から６）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号７）及びリバースプライマー（配列番号８）も設計した。
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。すなわち、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号１から６）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号７）及びリバースプライマー（配列番号８）も設計した。
（２）二段階型の二本鎖ＤＮＡ合成
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な上記６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。オーバーラップエクステンションＰＣＲにより全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号７、０．１μＭリバースプライマー：配列番号８）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な上記６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。オーバーラップエクステンションＰＣＲにより全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号７、０．１μＭリバースプライマー：配列番号８）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、以下のとおりである。
９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
（熱変性段階）
９８℃、３０秒；
（アニーリング段階）
７７．５℃、１０秒；７５℃、１０秒；７２．５℃、１０秒；７０℃、１０秒；６７．５℃、１０秒；６５℃、１０秒；６２．５℃、１０秒
（伸長段階）
７２℃、５０秒
９８℃、３０秒；
（アニーリング段階）
７７．５℃、１０秒；７５℃、１０秒；７２．５℃、１０秒；７０℃、１０秒；６７．５℃、１０秒；６５℃、１０秒；６２．５℃、１０秒
（伸長段階）
７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次に、ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応により、上記調製した３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長の二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、以下のとおりである。
９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
（熱変性段階）
９８℃、３０秒；
（アニーリング段階）
７７．５℃、１０秒；７５℃、１０秒；７２．５℃、１０秒；７０℃、１０秒；６７．５℃、１０秒；６５℃、１０秒；６２．５℃、１０秒
（伸長段階）
７２℃、５０秒。
（熱変性段階）
９８℃、３０秒；
（アニーリング段階）
７７．５℃、１０秒；７５℃、１０秒；７２．５℃、１０秒；７０℃、１０秒；６７．５℃、１０秒；６５℃、１０秒；６２．５℃、１０秒
（伸長段階）
７２℃、５０秒。
その後、７２℃で３分処理をした。
アニーリング段階における全ての温度保持時間を２０秒、３０秒、４０秒、５０秒又は２分とした以外は上記と同じＰＣＲ条件でそれぞれ全長の二本鎖ＤＮＡを合成した。その後、本発明の合成方法の６条件（アニーリング段階の温度保持時間が１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、２分）から得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物の一部をアガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。結果を図２に示す。
その結果、本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件の温度保持時間が５０秒以上のときに得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、ＰＣＲ反応条件の温度保持時間が５０秒未満のときに得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物よりも、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を抑えることができた。即ち、本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件の温度保持時間は、５０秒以上が特に好ましい。一方、ＰＣＲ反応条件の温度保持時間が１０秒、２０秒、３０秒、４０秒のときに得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的なＤＮＡ増幅産物を含むものの、目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得することは可能である。なお、本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件の温度保持時間を５０秒以上とした場合には上述のとおり非特異的ＤＮＡ増幅産物の出現を抑えることが可能であるため、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等などのＤＮＡクローニングを適用し、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することが可能である。
（実施例２）本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件の検討（温度勾配の段階数の検討）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。すなわち、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号９〜１４）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号１５）及びリバースプライマー（配列番号１６）も設計した。
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。すなわち、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号９〜１４）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号１５）及びリバースプライマー（配列番号１６）も設計した。
（２）二段階型の二本鎖ＤＮＡ合成
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製された。短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１０）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１２）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１４）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号１５、０．１μＭリバースプライマー：配列番号１６）を調製した。このとき全量が２５μＬとなるように調製した。
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製された。短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１０）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１２）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１４）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号１５、０．１μＭリバースプライマー：配列番号１６）を調製した。このとき全量が２５μＬとなるように調製した。
下記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の条件（アニーリング温度設定の段階数が異なる）にて全長の二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。
（ｉ）０段階
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
（ｉｉ）１段階
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
（ｉｉｉ）２段階
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
（ｉｖ）３段階
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒。
その後、７２℃で３分処理した。
その後、７２℃で３分処理した。
（ｖ）７段階
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
（ｖｉ）８段階
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５．４℃、５０秒；７３．２℃、５０秒；７１．１℃、５０秒；６８．９℃、５０秒；６６．８℃、５０秒；６４．６℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５．４℃、５０秒；７３．２℃、５０秒；７１．１℃、５０秒；６８．９℃、５０秒；６６．８℃、５０秒；６４．６℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
（ｖｉｉ）連続的な温度勾配
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃から６２．５℃、０．０４℃／秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲの反応条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃から６２．５℃、０．０４℃／秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
その後、本発明の合成方法の７条件から得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物の一部をアガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。結果を図３に示す。
図３に示すとおり、本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件である温度勾配の段階数は、２から８段階が好ましい。温度勾配の段階数は８段階以上の段階数であっても問題はなく、８段階以上の温度勾配の段階数のＰＣＲ反応条件にて反応させてもよいが、２から８段階程度で十分ともいえる。一方、本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件の温度勾配ごとの温度保持時間がない（連続的な温度勾配）、又は、温度保持時間が非常に短い場合、温度勾配の段階数を増加させても目的の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物を取得することは困難であることは確認済みである（データは未掲載）。
（実施例３）従来の合成方法と本発明の合成方法により得られた二本鎖ＤＮＡ断片の比較−１
（合成受託会社の合成方法と本発明の合成方法により得られた二本鎖ＤＮＡ断片の比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。すなわち、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号１７〜２２）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）も設計した。
（合成受託会社の合成方法と本発明の合成方法により得られた二本鎖ＤＮＡ断片の比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。すなわち、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号１７〜２２）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号２３）及びリバースプライマー（配列番号２４）も設計した。
（２）二段階型の二本鎖ＤＮＡ合成
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１８）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２０）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２２）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号２３、０．１μＭリバースプライマー：配列番号２４）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１８）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号１９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２０）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２２）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号２３、０．１μＭリバースプライマー：配列番号２４）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
さらに、ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
本発明の手法にて得られた上記合成二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ増幅産物の一部と合成受託会社に依頼して合成した合成二本鎖ＤＮＡ（従来の合成方法による）の溶液の一部をアガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。結果を図４に示す。
図４に示すとおり、本発明の合成方法によって得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、合成受託会社の合成方法によって得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物よりも、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を大幅に抑えることができた。非特異的ＤＮＡ増幅産物が大幅に出現した合成受託会社の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経る必要があるため、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等などのＤＮＡクローニングを適用することは好ましくなく、速やかにクローン化ＤＮＡを取得することは難しい。
一方、本発明の合成方法によって得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を非常に抑えることができた。従って、本発明の合成方法のＰＣＲ反応条件にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。以上の結果、従来のＤＮＡ合成方法と比較し、本発明の合成方法は、ＤＮＡクローニングの効率を上げ、速やかに目的のクローン化ＤＮＡを取得することができる点でも優れているといえる。
（実施例４）異なる二本鎖ＤＮＡ配列の複数同時合成と化学合成一本鎖オリゴＤＮＡの解析
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする４つの全長二本鎖ＤＮＡの配列を、それぞれ３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片にそれぞれ分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。第１の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号２５〜３０）。第２の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号３１〜３６）。第３の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号３７〜４２）。第４の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号４３〜４８）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号４９）とリバースプライマー（配列番号５０）は設計した。
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする４つの全長二本鎖ＤＮＡの配列を、それぞれ３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片にそれぞれ分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。第１の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号２５〜３０）。第２の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号３１〜３６）。第３の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号３７〜４２）。第４の全長二本鎖ＤＮＡに対応する３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号４３〜４８）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号４９）とリバースプライマー（配列番号５０）は設計した。
（２）二段階型の二本鎖ＤＮＡ合成
目的とする４つの異なる配列の二本鎖ＤＮＡ合成に必要な２４本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。
目的とする４つの異なる配列の二本鎖ＤＮＡ合成に必要な２４本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。
第１の二本鎖ＤＮＡの合成に必要な短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するために、３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した。一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２６）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２８）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３０）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。一つ目の全長の二本鎖ＤＮＡを合成するために、ＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号４９、０．１μＭリバースプライマー：配列番号５０）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
第２の二本鎖ＤＮＡの合成に必要な短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するために、３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した。その後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３２）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３４）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。第２の全長の二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号４９、０．１μＭリバースプライマー：配列番号５０）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
第３の二本鎖ＤＮＡの合成に必要な短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するために、３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した。その後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３８）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号３９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４０）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４２）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。三つ目の全長の二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号４９、０．１μＭリバースプライマー：配列番号５０）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
第４の二本鎖ＤＮＡの合成に必要な短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するために、３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した。その後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４４）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４６）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号４８）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。第４の全長の二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号４９、０．１μＭリバースプライマー：配列番号５０）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応によりそれぞれの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
さらに、ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応により、３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
その後、二本鎖ＤＮＡ合成のＤＮＡ増幅産物の一部をアガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。結果を図５に示す。
図５に示すとおり、本発明の合成方法は、目的とする４つのＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物を同時に取得することができた。この結果は、ＰＣＲ反応条件の多段階の温度勾配ごとに温度保持時間を与えることで、Ｔｍ値を補うことができるからである。即ち、従来の合成方法と比較して、本発明の合成方法は配列設計をすることなく、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を複数同時に取得することができる。
本発明の合成方法は、長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ、ＧＣ−ｒｉｃｈ等の複雑な配列であるＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片においても取得することができるため、同時に合成しようとする目的のＤＮＡ配列の複雑さは特に限定されない。本発明の合成方法によると、数１０から数１００個単位の多数の二本鎖ＤＮＡ断片を同時に合成することができるため、スループット性が極めて高い。また、液体分注ロボットのプログラムに本発明の合成方法を適用することによって、複数同時に二本鎖ＤＮＡ断片の合成を自動化することもできる。
本発明の合成方法によって得られた複数の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を非常に抑えることができた。従って、このとき得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。
長鎖のＤＮＡの合成方法は、二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法にて得られた多数の二本鎖ＤＮＡ断片を集積材料として用いることで、二本鎖ＤＮＡ断片を集積するため、その二本鎖ＤＮＡ断片がひとつでも欠けてしまうと、長鎖のＤＮＡを合成することが不可能である。しかし、従来の合成方法は、多数の二本鎖ＤＮＡ断片を合成までに時間と手間がかかるという不都合が生じること、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の複雑性によっては、合成が困難或いは不可能であることから、集積材料となる全ての二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに取得することが困難な状況である。即ち、これまでの二本鎖ＤＮＡ断片の合成方法では、長鎖のＤＮＡの合成のための集積材料となる二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに供給することができず、ボトルネックとなっているのが実情である。一方、本発明の合成方法は、合成しようとする目的のＤＮＡ配列の複雑性に限らず、二本鎖ＤＮＡ断片を複数同時に合成することができることから、長鎖のＤＮＡの合成のための集積材料となる多数の二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに合成できる。即ち、本発明の合成方法は、長鎖のＤＮＡの合成のために必要な二本鎖ＤＮＡ断片を速やかに供給することできるため、長鎖のＤＮＡの合成方法へのスループット性を大幅に向上することができる。
（３）二本鎖ＤＮＡ合成にて使用する化学合成一本鎖オリゴＤＮＡの解析
本発明の二本鎖ＤＮＡ合成にて使用する化学的に合成された一本鎖オリゴＤＮＡを解析するため、一本鎖オリゴＤＮＡをゲル電気泳動した。一本鎖オリゴＤＮＡの電気泳動は、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセル電気泳動装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）と１０％ Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付の説明書に従い行った。電気泳動後の一本鎖オリゴＤＮＡのゲル染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ 核酸蛍光染色試薬（ＴａＫａＲａ社製の）を用いて、添付の説明書に従い行った。一本鎖オリゴＤＮＡのゲル解析には、ゲル撮影解析装置 Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ システム（バイオ・ラッド社製）を用いて、添付の説明書に従い行った。結果を図６に示す。
本発明の二本鎖ＤＮＡ合成にて使用する化学的に合成された一本鎖オリゴＤＮＡを解析するため、一本鎖オリゴＤＮＡをゲル電気泳動した。一本鎖オリゴＤＮＡの電気泳動は、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセル電気泳動装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）と１０％ Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付の説明書に従い行った。電気泳動後の一本鎖オリゴＤＮＡのゲル染色はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ 核酸蛍光染色試薬（ＴａＫａＲａ社製の）を用いて、添付の説明書に従い行った。一本鎖オリゴＤＮＡのゲル解析には、ゲル撮影解析装置 Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ システム（バイオ・ラッド社製）を用いて、添付の説明書に従い行った。結果を図６に示す。
図６に示すとおり、本発明の合成方法にて使用する一本鎖オリゴＤＮＡの含有率は、完全長の一本鎖オリゴＤＮＡの比が６０％から１５％含まれているのに対して、不完全長の一本鎖オリゴＤＮＡの比は４０％から８５％含まれていた。不完全長の一本鎖オリゴＤＮＡは、一本鎖オリゴＤＮＡの化学合成の過程にて生じる未反応物等の反応中間体産物である。
本発明の合成方法による二本鎖ＤＮＡ断片の合成では、不完全長の一本鎖オリゴＤＮＡが８５％（完全長の一本鎖オリゴＤＮＡが１５％以上）含まれている一本鎖オリゴＤＮＡを使用した。故に、本発明の合成方法は、二本鎖ＤＮＡ断片の合成に一本鎖オリゴＤＮＡ内に不完全長の一本鎖オリゴＤＮＡの比が８５％程度含まれている非常に低品質の一本鎖オリゴＤＮＡを使用した場合においても、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物を取得することができた。このとき得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を抑えることができるため、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。
（実施例５）本発明の合成方法にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のクローニングと配列解析
（１）本発明の合成方法にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物のＤＮＡライゲーションと形質転換
上記の実施例４にて合成した二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ増幅産物をクローニングするため、１０ｘＡ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＤＮＡ増幅産物の３´−末端部位にｄＡ突出を付加させた。その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＱＩＡｇｅｎ社製） を用いて、ＤＮＡ増幅産物を精製した。その後、精製した合成ＤＮＡとＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１９ （Ｓｉｍｐｌｅ） （ＴａＫａＲａ社製）を混合し、その混合ＤＮＡ溶液と１：１になるようにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を加えた。ＤＮＡライゲーション反応溶液は恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）により１６℃、１時間から終夜静置した。ＤＮＡライゲーション反応後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのカナマイシン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養した。
（１）本発明の合成方法にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物のＤＮＡライゲーションと形質転換
上記の実施例４にて合成した二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ増幅産物をクローニングするため、１０ｘＡ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＤＮＡ増幅産物の３´−末端部位にｄＡ突出を付加させた。その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＱＩＡｇｅｎ社製） を用いて、ＤＮＡ増幅産物を精製した。その後、精製した合成ＤＮＡとＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１９ （Ｓｉｍｐｌｅ） （ＴａＫａＲａ社製）を混合し、その混合ＤＮＡ溶液と１：１になるようにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を加えた。ＤＮＡライゲーション反応溶液は恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）により１６℃、１時間から終夜静置した。ＤＮＡライゲーション反応後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのカナマイシン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養した。
（２）ＤＮＡシーケンシング解析
シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。ＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、Ｍ１３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５１）、Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５２）を用いることで、目的ＤＮＡ配列を増幅した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃、２分の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行った。９５℃、２０秒；５８℃、３０秒；７２℃、６０秒。得られたＰＣＲ反応産物溶液の一部は１％アガロースゲル（サーモフィッシャー社製）により電気泳動した。その後、残りのＰＣＲ反応産物溶液はＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学社製）を用いて、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。ＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付の説明書に従い、Ｍ１３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５１）、Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５２）を用いることで、目的ＤＮＡ配列を増幅した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃、２分の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行った。９５℃、２０秒；５８℃、３０秒；７２℃、６０秒。得られたＰＣＲ反応産物溶液の一部は１％アガロースゲル（サーモフィッシャー社製）により電気泳動した。その後、残りのＰＣＲ反応産物溶液はＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
上記に得られた精製ＤＮＡ産物はＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付の説明書に従い、Ｍ１３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５１）、Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５２）を用いることで、シーケンス反応を行った。このときのＤＮＡシーケンスの反応条件は、９５℃、２分後、以下の温度サイクルを３０サイクル行った。９５℃、５秒；５０℃、１０秒；６０℃、２分３０秒。得られたＤＮＡシーケンス反応産物はＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付の説明書に従い精製した。その後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付の説明書に従って、目的ＤＮＡ配列を解析した。
ＤＮＡシーケンス解析の結果、本発明の合成方法にて得られた合成二本鎖ＤＮＡの正確な配列のクローン化ＤＮＡを取得することができた。
（実施例６）従来の合成方法と本発明の合成方法により得られた二本鎖ＤＮＡ断片との比較−２
（米国特許出願公開ＵＳ２００８０１８２２９６Ａ１に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法のＰＣＲ反応条件と本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法との比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。これらの３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号５３〜５８）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号５９）とリバースプライマー（配列番号６０）は設計した。
（米国特許出願公開ＵＳ２００８０１８２２９６Ａ１に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法のＰＣＲ反応条件と本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法との比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。これらの３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号５３〜５８）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号５９）とリバースプライマー（配列番号６０）は設計した。
（２）二段階型の二本鎖ＤＮＡ合成
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水ないしＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５４）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５６）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５８）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号５９、０．１μＭリバースプライマー：配列番号６０）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水ないしＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５４）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５６）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５７）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号５８）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号５９、０．１μＭリバースプライマー：配列番号６０）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
（ｉ）従来の合成方法（米国特許出願公開ＵＳ２００８０１８２２９６Ａ１；Ｐｃｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；に記載の方法）
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃、４分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃、４分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２℃、３０秒
その後、７２℃で５分処理し、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃、４分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２℃、３０秒
その後、７２℃で５分処理した。
（ｉｉ）本発明の合成方法
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
次にＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
従来の合成方法のＰＣＲ反応条件（ｉ）及び本発明の合成方法（ｉｉ）にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物の一部を、アガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。結果を図７に示す。
図７に示すように、従来の合成方法のＰＣＲ反応条件では、目的のＤＮＡ配列の長さの二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は得られなかった。一方で、本発明の合成方法は目的のＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物を取得することができた。このとき得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を抑えることができるため、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。
従来の合成方法のＰＣＲ反応条件（米国特許出願公開ＵＳ２００８０１８２２９６Ａ１に記載の方法）では、目的とするＤＮＡ配列が合成困難な場合であったとしても、本発明の合成方法を適用することによって、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を取得することができる。従って、本発明の合成方法は、目的のＤＮＡ配列の複雑さに限らず、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を合成することができるため、従来の合成方法よりも優れている。
（実施例７）従来の合成方法と本発明の合成方法により得られた二本鎖ＤＮＡ断片の比較−３
（非特許文献６に記載の一段階目のＰＣＲ反応にて全ての一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルした二段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法と本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法との比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。これらの３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号６１〜６６）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号６７）とリバースプライマー（配列番号６８）は設計した。
（非特許文献６に記載の一段階目のＰＣＲ反応にて全ての一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルした二段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法と本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法との比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。これらの３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号６１〜６６）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号６７）とリバースプライマー（配列番号６８）は設計した。
（２）二本鎖ＤＮＡ合成
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水又はＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。
（ｉ）従来の合成方法（第一段階目のＰＣＲ反応にて全ての一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルした二段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法；非特許文献６）
第一段階目に全ての一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルするために、１つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６１から６６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。その後、全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号６７、０．１μＭリバースプライマー：配列番号６８）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
第一段階目に全ての一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルするために、１つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６１から６６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。その後、全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号６７、０．１μＭリバースプライマー：配列番号６８）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、第一段階目のＰＣＲ反応により全ての一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルした。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂにアセンブルした一本鎖オリゴＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａを１μＬ加えた。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、第二段階目のＰＣＲ反応によりアセンブルした一本鎖オリゴＤＮＡから全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
（ｉｉ）本発明の合成方法
短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６２）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６４）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号６７、０．１μＭリバースプライマー：配列番号６８）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６２）を１μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６４）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６５）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６６）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号６７、０．１μＭリバースプライマー：配列番号６８）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃に保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８℃、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８℃、３０秒；７７．５℃、５０秒；７５℃、５０秒；７２．５℃、５０秒；７０℃、５０秒；６７．５℃、５０秒；６５℃、５０秒；６２．５℃、５０秒；７２℃、５０秒
その後、７２℃で３分処理した。
従来の合成方法（ｉ）及び本発明の合成方法（ｉｉ）にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物の一部を、アガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。結果を図８に示す。
図８に示すように、従来の合成方法では、目的のＤＮＡ配列の長さの二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は得られなかった。一方で、本発明の合成方法は、目的のＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物を取得することができた。この結果、本発明の合成方法は、合成方法の第一段階目にプライマーエクステンションＰＣＲ反応を適用するによって短い二本鎖ＤＮＡを正確に合成することができたため、目的のＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を合成することができたといえよう。
このとき得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を抑えることができるため、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。
従来の合成方法では、目的とするＤＮＡ配列が合成困難な場合であったとしても、本発明の合成方法を適用することによって、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を取得することができる。従って、本発明の合成方法は、目的のＤＮＡ配列の複雑さに限らず、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を合成することができるため、従来の合成方法よりも優れている。
（実施例８）従来の合成方法と本発明の合成方法により得られた二本鎖ＤＮＡ断片の比較−４
（非特許文献９に記載の一段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法と本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法との比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。これらの３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号６９〜７４）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号７５）とリバースプライマー（配列番号７６）は設計した。
（非特許文献９に記載の一段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法と本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法との比較）
（１）一本鎖オリゴＤＮＡの配列設計
目的とする全長二本鎖ＤＮＡの配列を３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片に分割した。それらの短い二本鎖ＤＮＡ断片は、５´−又は３´−末端に３０塩基対のオーバーラップ領域が含まれるように設計した。これらの３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片の合成に用いる６本の一本鎖オリゴＤＮＡは３０塩基のオーバーラップ領域を含む１５０塩基程度の長さに設計した（配列番号６９〜７４）。また、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いるフォワードプライマー（配列番号７５）とリバースプライマー（配列番号７６）は設計した。
（２）二本鎖ＤＮＡ合成
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水ないしＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。
（ｉ）従来の合成方法（一段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法；非特許文献９）
全ての一本鎖オリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ合成するために、１つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号７５、０．１μＭリバースプライマー：配列番号７６）を調製した後、一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６９〜７４）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。
二本鎖ＤＮＡ合成に必要な６本の一本鎖オリゴＤＮＡは、滅菌水ないしＴＥ緩衝液（ナカライテスク社製）にて１μＭの濃度に調製した。
（ｉ）従来の合成方法（一段階型二本鎖ＤＮＡ合成方法；非特許文献９）
全ての一本鎖オリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ合成するために、１つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号７５、０．１μＭリバースプライマー：配列番号７６）を調製した後、一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６９〜７４）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応により一本鎖オリゴＤＮＡをアセンブルし、全長の二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８°Ｃ、２分の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行った。
９８°Ｃ、３０秒；７７．５°Ｃ、５０秒；７５°Ｃ、５０秒；７２．５°Ｃ、５０秒；７０°Ｃ、５０秒；６７．５°Ｃ、５０秒；６５°Ｃ、５０秒；６２．５°Ｃ、５０秒；７２°Ｃ、５０秒
その後、７２°Ｃで３分処理した。
（ｉｉ）本発明の合成方法
短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７０）を１ μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７２）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７４）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号７５、０．１μＭリバースプライマー：配列番号７６）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成するための３つのＰＣＲ反応溶液Ａ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を調製した後、一つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号６９）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７０）を１ μＬずつ加え、二つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７１）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７２）を１μＬずつ加え、三つ目のＰＣＲ反応溶液Ａに一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７３）と一本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号７４）を１μＬずつ加えた。このとき、全量が２５μＬになるように調製した。全長二本鎖ＤＮＡを合成するためのＰＣＲ反応溶液Ｂ（１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０１６Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１μＭフォワードプライマー：配列番号７５、０．１μＭリバースプライマー：配列番号７６）を調製した。このとき、全量が２５μＬとなるように調製した。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、プライマーエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８°Ｃ、２分の後、以下の温度サイクルを１０サイクル行った。
９８°Ｃ、３０秒；７７．５°Ｃ、５０秒；７５°Ｃ、５０秒；７２．５°Ｃ、５０秒；７０°Ｃ、５０秒；６７．５°Ｃ、５０秒；６５°Ｃ、５０秒；６２．５°Ｃ、５０秒；７２°Ｃ、５０秒
その後、７２°Ｃに保ったままＰＣＲ反応溶液Ｂに３つの短い二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ反応溶液Ａをそれぞれ１μＬずつ加えた。
ＴａＫａＲａ社製のサーマルサイクラーを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ反応により３つの短い二本鎖ＤＮＡ断片を多段連結することにより全長二本鎖ＤＮＡを合成した。このときのＰＣＲ反応の温度条件は、９８°Ｃ、２分の後、以下の温度サイクルを２０サイクル行った。
９８°Ｃ、３０秒；７７．５°Ｃ、５０秒；７５°Ｃ、５０秒；７２．５°Ｃ、５０秒；７０°Ｃ、５０秒；６７．５°Ｃ、５０秒；６５°Ｃ、５０秒；６２．５°Ｃ、５０秒；７２°Ｃ、５０秒
その後、７２°Ｃで３分処理した。
従来の合成方法（ｉ）及び本発明の合成方法（ｉｉ）にて得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物の一部を、アガロースゲル電気泳動装置（コスモバイオ）を用いて、１％アガロースゲルにて電気泳動した。その結果を図９に示す。
図９に示すように、従来の合成方法では、目的のＤＮＡ配列の長さの二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は得られなかった。一方で、本発明の合成方法は目的のＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物を取得することができた。この結果、本発明の合成方法は、プライマーエクステンションＰＣＲ反応とオーバーラップエクステンションＰＣＲ反応との第二段階に分割することによって、目的のＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を合成することができたといえよう。
このとき得られた二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ増幅産物は、非特異的ＤＮＡ増幅産物（目的ＤＮＡ配列の長さよりも短いＤＮＡ増幅産物）の出現を抑えることができるため、目的の二本鎖ＤＮＡ断片のみを取り出すゲルの切り出し精製等の工程を経ることなく、ＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法等のＤＮＡクローニング法を適用することができ、速やかに目的の二本鎖ＤＮＡ断片を含むクローン化ＤＮＡを取得することができる。
本実施例にて合成したＤＮＡ配列は、長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ領域を含む一般的に複雑な配列といわれているＤＮＡ配列であることから、本発明の二段階型の二本鎖ＤＮＡ合成法は、上記複雑なＤＮＡ配列に対しても目的のＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡを正確に合成することができることがわかった。
従来の合成方法では、目的とするＤＮＡ配列が合成困難或いは不可能な場合であったとしても、本発明の合成方法を適用することによって、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を取得することができる。従って、本発明の合成方法は、目的のＤＮＡ配列の複雑さに限らず、目的とするＤＮＡ配列の二本鎖ＤＮＡ断片を合成することができるため、従来の合成方法よりも優れている。
本発明によると、ＰＣＲサイクルにおいて複数段階のアニーリング温度設定を有することで、様々なＴｍ値を有する複数のＤＮＡの貼り合せに適用可能となるため、多数の相同領域を含む一本鎖オリゴＤＮＡ同士のアセンブルを容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に行うことができる。また、本発明の二本鎖ＤＮＡ合成方法は、様々なＴｍ値のＤＮＡの貼り合せに適用可能であることから、材料とする一本鎖オリゴＤＮＡ配列を最適化する手間が不要であり、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片毎に細かく温度設定をしなおす必要がない。さらに、本発明によると、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片の配列によらず、容易に、正確に、効率よく、且つ迅速に合成することが可能なので、従来複雑な配列（例えば長い反復配列、連続した同一塩基配列、ＡＴ−ｒｉｃｈ、ＧＣ−ｒｉｃｈな配列等）であるために合成が困難、或いは不可能であった二本鎖ＤＮＡ断片も合成することができる。
Claims (10)
- 短い二本鎖ＤＮＡを、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を取得する、二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。 - 上記アニーリング温度設定が、２段階〜２０段階である、請求項１に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記アニーリング温度設定が、６０℃〜８５℃である、請求項１又は２に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記アニーリング温度設定の各段階における温度保持時間が、１０秒以上２分以下である、請求項１から３のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおけるＤＮＡのオーバーラップ領域が１０塩基〜４０塩基である、請求項１から４のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて、３〜２０種の短い二本鎖ＤＮＡが連結される、請求項１から５のいずれか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記オーバーラップエクステンションＰＣＲにおいて用いられる短い二本鎖ＤＮＡが、プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される、請求項１から６のいずか１項に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記プライマーエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有する、請求項７に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 上記プライマーエクステンションＰＣＲにより合成される短い二本鎖ＤＮＡのサイズが、１００塩基〜３００塩基である、請求項７又は８に記載の二本鎖ＤＮＡ合成方法。
- 二本鎖ＤＮＡ合成方法であって、
プライマーエクステンションＰＣＲにより短い二本鎖ＤＮＡを合成するプライマーエクステンションＰＣＲ工程、及び
オーバーラップエクステンションＰＣＲにより、上記プライマーエクステンションＰＣＲ工程において合成された二本鎖ＤＮＡを連結して目的の二本鎖ＤＮＡ断片を合成するオーバーラップエクステンションＰＣＲ工程
を含み、上記オーバーラップエクステンションＰＣＲのＰＣＲサイクルにおいて、複数段階のアニーリング温度設定を有することを特徴とする、二本鎖ＤＮＡ合成方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018093024A JP2019198236A (ja) | 2018-05-14 | 2018-05-14 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
| US16/185,106 US20190345527A1 (en) | 2018-05-14 | 2018-11-09 | Method for synthesizing double-stranded dna |
| JP2023029982A JP2023060013A (ja) | 2018-05-14 | 2023-02-28 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018093024A JP2019198236A (ja) | 2018-05-14 | 2018-05-14 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023029982A Division JP2023060013A (ja) | 2018-05-14 | 2023-02-28 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019198236A true JP2019198236A (ja) | 2019-11-21 |
| JP2019198236A5 JP2019198236A5 (ja) | 2021-06-10 |
Family
ID=68465238
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018093024A Pending JP2019198236A (ja) | 2018-05-14 | 2018-05-14 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
| JP2023029982A Pending JP2023060013A (ja) | 2018-05-14 | 2023-02-28 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023029982A Pending JP2023060013A (ja) | 2018-05-14 | 2023-02-28 | 二本鎖ｄｎａ合成方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20190345527A1 (ja) |
| JP (2) | JP2019198236A (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080182296A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-07-31 | Chanda Pranab K | Pcr-directed gene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides |
| JP2013099332A (ja) * | 2003-03-12 | 2013-05-23 | Primeradx Inc | リアルタイム遺伝子発現プロフィール解析 |
| JP2015536689A (ja) * | 2012-12-13 | 2015-12-24 | シンセティック ゲノミクス、インク． | Ｐｅｇを介した核酸分子のアセンブリ |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008061129A2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-05-22 | University Of Utah Research Foundation | Methods and compositions related to continuous flow thermal gradient pcr |
| WO2010132019A1 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Agency For Science, Technology And Research | Gene synthesis method |
| AU2012206487A1 (en) * | 2011-01-14 | 2013-07-18 | Genefirst Limited | Methods, compositions, and kits for determining the presence/absence of a variant nucleic acid sequence |
-
2018
- 2018-05-14 JP JP2018093024A patent/JP2019198236A/ja active Pending
- 2018-11-09 US US16/185,106 patent/US20190345527A1/en active Pending
-
2023
- 2023-02-28 JP JP2023029982A patent/JP2023060013A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013099332A (ja) * | 2003-03-12 | 2013-05-23 | Primeradx Inc | リアルタイム遺伝子発現プロフィール解析 |
| US20080182296A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-07-31 | Chanda Pranab K | Pcr-directed gene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides |
| JP2015536689A (ja) * | 2012-12-13 | 2015-12-24 | シンセティック ゲノミクス、インク． | Ｐｅｇを介した核酸分子のアセンブリ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023060013A (ja) | 2023-04-27 |
| US20190345527A1 (en) | 2019-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9957552B2 (en) | Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment | |
| US8003322B2 (en) | Method of amplifying a target nucleic acid by rolling circle amplification | |
| Quan et al. | Circular polymerase extension cloning | |
| Jäger et al. | Polymerase chain reaction | |
| JP2005270108A5 (ja) | ||
| JP2022511255A (ja) | ライブラリー富化を改善するための組成物および方法 | |
| EP2559764A1 (en) | Composition and methods for RT-PCR comprising an anionic polymer | |
| EP3498861A1 (en) | Rna reverse transcription amplification method | |
| JPWO2002036822A1 (ja) | 核酸塩基配列決定方法 | |
| JP2019198236A (ja) | 二本鎖ｄｎａ合成方法 | |
| JP2012512650A (ja) | Ｐｃｒに基づく核酸分子合成方法 | |
| US11760995B2 (en) | PCR primer pair and application thereof | |
| KR20240006024A (ko) | 단일 가닥 dna의 증폭 | |
| Shchur et al. | Programmed assembly of long DNA synthons: design, mechanism, and online monitoring | |
| JP5051423B2 (ja) | 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、及び該タンパク質を用いた核酸増幅方法 | |
| US20220411861A1 (en) | A Multiplex Method of Preparing a Sequencing Library | |
| US20230340462A1 (en) | Method for producing dna molecules having an adaptor sequence added thereto, and use thereof | |
| WO2022239632A1 (ja) | 合成ｄｎａ分子の製造方法 | |
| US20230183792A1 (en) | Methods for the multiplexed isothermal amplification of nucleic acid sequences | |
| Heuvel | Cloning by PCR | |
| CN115803433A (zh) | 序列偏倚降低的热稳定连接酶 | |
| WO2021156295A1 (en) | Methods for amplification of genomic dna and preparation of sequencing libraries | |
| CA3218561A1 (en) | Method for parallel real-time sequence analysis | |
| Beckett et al. | Rapid Full‐Length Cloning of Nonpolyadenylated RNA Virus Genomes | |
| Frey et al. | Production of in vitro amplified DNA pseudolibraries and high-throughput cDNA target amplification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20180529 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20210402 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210408 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210426 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210426 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220323 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220328 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220527 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220726 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20221130 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230228 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20230228 |
|
| C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20230308 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20230406 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230425 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20230426 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20230616 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20230712 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20230901 |