JP2005270108A5

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Publication number: JP2005270108A5
Application number: JP2005120409A
Authority: JP
Filing date: 2005-04-18
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2019-06-24

Claims

標的核酸を非線形的に増幅する方法であって、以下の工程：
（ｉ）標的核酸の鎖を添加する工程であって、該標的の鎖が、少なくとも５つの非同一の部分を有し、該少なくとも５つの非同一の部分が、該標的の鎖上の３’→５’の方向に、第１の部分、該第１の部分の５’側に位置する第２の部分、該第２の部分の５’側に位置する第３の部分、該第３の部分の５’側に位置する第４の部分、および該第４の部分の５’側に位置する第５の部分を含む、工程；
（ｉｉ）該標的の鎖の第１の部分に相補的である第１の３’プライミングセグメントと該標的の鎖の第２の部分と同一である第１の５’テイルセグメントとを含む、順方向プライマーを添加する工程；
（ｉｉｉ）鎖置換活性をもつテンプレート依存性ポリメラーゼを添加する工程；
（ｉｖ）該標的の鎖の第５の部分と同一である第２の３’プライミングセグメントと該標的の鎖の第４の部分と相補的である第２の５’テイルセグメントとを含む、逆方向プライマーを添加する、工程；ならびに
（ｖ）反応溶液を、増幅および鎖置換重合についての等温条件下もしくは均衡条件下で、かつ増幅および鎖置換重合のための試薬とインキュベートする工程、
を包含する、方法。
標的核酸を非線形的に増幅する方法であって、以下：
（ｉ）標的核酸の鎖を添加する工程であって、該標的核酸の鎖が、少なくとも５つの非同一の部分を有し、該少なくとも５つの非同一の部分が、該標的の鎖上の３’→５’の方向に、第１の部分、該第１の部分の５’側に位置する第２の部分、該第２の部分の５’側に位置する第３の部分、該第３の部分の５’側に位置する第４の部分、および該第４の部分の５’側に位置する第５の部分を含む、工程；
（ｉｉ）第１の３’プライミングセグメントと第１の５’テイルセグメントとを含む、順方向プライマーを添加する工程であって、
該第１の３’プライミングセグメントは、該標的の鎖の第１の部分と相補的であり、該第１の３’プライミングセグメントは、少なくとも該標的の鎖の第２の部分に沿って、テンプレート依存性ポリメラーゼで伸長されて、テンプレートを形成し得、そして
該第１の５’テイルセグメントは、該標的の鎖の第２の部分と同一である、工程；
（ｉｉｉ）該ポリメラーゼを添加する工程であって、該ポリメラーゼは鎖置換活性を有する、工程；
（ｉｖ）第２の３’プライミングセグメントと第２の５’テイルセグメントとを含む、逆方向プライマーを添加する、工程であって、
該第２の３’プライミングセグメントは、該標的の鎖の第５の部分と同一であり、該第２の３’プライミングセグメントは、少なくとも該標的の鎖の第４の部分と相補的であるテンプレートの領域に沿って、該ポリメラーゼで伸長されて、アンプリコンを形成し得、そして
ここで、該第２の５’テイルセグメントは、該標的の鎖の第４の部分と相補的である、工程；ならびに
（ｖ）反応溶液を、増幅および鎖置換重合についての等温条件下もしくは均衡条件下で、かつ増幅および鎖置換重合のための試薬とインキュベートする工程、
を包含する、方法。
前記工程（ｉ）〜（ｖ）のいずれかまたはすべてを繰り返すことをさらに包含する、請求項１または２に記載の増幅する方法。
融解温度調節因子を提供する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
前記ＰＣＲエンハンサーが、有効濃度にて提供される、請求項４に記載の方法。
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程：
請求項３に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記標的の鎖のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
請求項６に記載の方法であって、前記決定する工程が：
前記増幅する方法の生成物を、前記標的の鎖の第１の部分と相補的な核酸を含むプローブ、または前記標的の鎖の第５の部分と相補的な核酸を含むプローブと、組み合わせること；および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと、該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察すること、
を包含する、方法。
前記標的の鎖の第２の部分が、前記第１の部分の３’末端から約１００ヌクレオチド未満離れており、前記第５の部分が、前記第４の部分の３’末端から約１００ヌクレオチド未満離れて位置している、請求項３に記載の方法。
請求項３に記載の方法であって、
前記第１の３’プライミングセグメントが、前記標的の鎖またはそのアンプリコンの第１の部分にアニールし、
前記順方向プライマーが、少なくとも、前記標的の鎖またはそのアンプリコンの第３の部分まで伸長された場合、前記第１の５’テイルセグメントは、該標的の鎖またはそのアンプリコンの第２の部分を越えて伸長した伸長済み順方向プライマーの一部分にアニールし、それによって、次の順方向プライマーの第１の３’プライミングセグメントが、該標的の鎖またはそのアンプリコンの第１の部分に結合することを可能にする、
方法。
請求項９に記載の方法であって、前記第２の３’プライミングセグメントが、前記標的の鎖またはそのアンプリコンの第５の部分の相補体上にある、前記標的の鎖またはそのアンプリコンのテンプレートにアニールし、
前記逆方向プライマーが、該テンプレートを越えて、少なくとも、前記標的の鎖またはそのアンプリコンの第３の部分の相補体まで伸長された場合、前記第２の５’テイルセグメントが、該標的の鎖またはそのアンプリコンの第４の部分の相補体を越えて伸長した伸長済み逆方向プライマーの一部分にアニールし、それによって、次の逆方向プライマーの第２の３’プライミングセグメントが、該標的の鎖またはそのアンプリコンの第５の部分の相補体上にあるテンプレートに結合することを可能にする、
方法。
請求項３に記載の方法であって、前記順方向プライマーは、前記標的の鎖またはそのアンプリコン上を少なくとも部分的に伸長され、該順方向プライマーは、伸長された後には、該順方向プライマーが伸長される前よりも弱い結合を、該標的の鎖またはアンプリコンに対して有する、方法。
請求項１１に記載の方法であって、前記逆方向プライマーは、前記標的の鎖またはそのアンプリコンのテンプレート上を少なくとも部分的に伸長され、該逆方向プライマーは、伸長された後には、該逆方向プライマーが伸長される前よりも弱い結合を、該テンプレートに対して有する、方法。
請求項３に記載の方法であって、
（ａ）前記第１の部分の３’側上の前記標的の鎖にアニールする第１の標準プライマー、および（ｂ）前記第５の部分の相補体の３’側上にある前記標的の鎖のテンプレートにアニールする第２の標準プライマーを提供する工程
をさらに包含し、
該第１の標準プライマーおよび該第２の標準プライマーは、鎖置換重合の開始を補助する、方法。
前記条件が、限定サイクル条件である、請求項３に記載の方法。
前記条件が、実質的に均衡条件である、請求項３に記載の方法。
前記条件が、実質的に等温条件である、請求項３に記載の方法。
請求項３に記載の方法であって、サーモサイクリングを使用しない、方法。
前記条件が、前記標的の鎖をその相補体から初期熱変性すること以外は、実質的に均衡である、請求項３に記載の方法。
請求項３に記載の方法であって、その方法全体はいかなる熱変性も行わずに実施される、方法。
請求項３に記載の方法であって、その方法全体は９２℃未満の温度で実施される、方法。
請求項３に記載の方法であって、前記標的の鎖をその相補体から初期熱変性すること以外は、実質的に均衡な条件下で７０℃未満の温度にて実施される、方法。
請求項３に記載の方法であって、実質的に均衡条件下にて７０℃未満の温度で実施される、方法。
前記実質的に非同一の部分が実質的に類似していない、請求項３に記載の方法。
キットであって、以下：
第１のオリゴヌクレオチドプライマーであって、
（ｉ）サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングし、該サンプル一本鎖核酸分子に少なくとも部分的と相補的な第１の一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く、３’末端ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）該第１の一本鎖核酸分子の任意の領域と相補的な５’末端ヌクレオチド配列を含む、
第１のオリゴヌクレオチドプライマー；
第２のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該サンプル一本鎖核酸分子に該第１のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置よりも３’側に位置する該サンプル一本鎖核酸分子の領域にアニーリングする、ヌクレオチド配列を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマー；
第３のオリゴヌクレオチドプライマーであって、
（ｉ）該第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製された該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングし、そして該第１の一本鎖核酸分子に少なくとも部分的と相補的な第２の一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く、３’末端ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）該第２の一本鎖核酸分子の任意の領域と相補的な５’末端ヌクレオチド配列を含む、
第３のオリゴヌクレオチドプライマー；
鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
該プライマーを伸長させるために該ＤＮＡポリメラーゼによって使用される、１つ以上のヌクレオチド、
を備える、キット。
請求項２４に記載のキットであって、
第４のオリゴヌクレオチドプライマー
をさらに備え、該第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第１の一本鎖核酸分子に前記第３のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置よりも３’側に位置する該第１の一本鎖核酸分子の領域にアニーリングする、ヌクレオチド配列を含む、
キット。
請求項２４に記載のキットであって、
該キットの残りの構成要素を使用して調製された核酸合成生成物を検出するための、検出器
をさらに備える、キット。