JP2000037194A5 - - Google Patents
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Claims (108)
- 核酸を増幅する方法であって、該方法は、以下の工程:
A)テンプレートを提供する工程であって、該テンプレートは、
(i)適切な条件下で互いにアニーリングして第1のループを形成する、3’末端に位置する第1の領域および第1の相補領域、を含む、3’末端部分、
(ii)適切な条件下で互いにアニーリングして第2のループを形成する、5’末端に位置する第2の領域および第2の相補領域、を含む、5’末端部分、ならびに
(iii)該3’末端部分および該5’末端部分を接続する領域、
を有する、工程;
B)該第1の領域および該第1の相補領域が互いにアニーリングして該第1のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの3’末端を該テンプレートの5’末端へと伸長させて、該第2の相補領域および第2の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第3のループを形成する、3’末端に位置する第3の領域および第3の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程;
C)3’末端で該第1のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列および5’末端で該第1の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの第1のループにアニーリングさせる、工程;
D)鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートに相補的な新規テンプレートを形成し、それによって、工程B)における該伸長の間に形成された該テンプレート伸長を置換する、工程;
E)該第3の領域および該第3の相補領域が互いにアニーリングして該第3のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートの3’末端を該伸長したテンプレートの5’末端へとさらに伸長させ、それによって、該伸長したテンプレートから該新規テンプレートを置換する、工程;ならびに
F)該新規テンプレートを、工程A)におけるテンプレートとして使用して工程A)〜E)を繰り返して、該核酸を増幅する、工程、
を包含する、方法。 - 前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記提供工程A)が、さらに以下の工程:
A1)第1のオリゴヌクレオチドプライマーを、サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該サンプル一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
A2)適切なポリメラーゼを使用して、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、第1の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第1の一本鎖核酸分子は、(i)該サンプル一本鎖核酸分子の少なくとも一部に相補的な領域、および(ii)該第1のオリゴヌクレオチドプライマーの5’末端部分を含む5’末端部分を含む、工程;
A3)該サンプル一本鎖核酸分子から該第1の一本鎖核酸分子を置換する工程;
A4)第2のオリゴヌクレオチドプライマーを該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該第1の一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
A5)適切なポリメラーゼを使用して、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、前記テンプレートを形成する、工程;ならびに
A6)該第1の一本鎖核酸分子から該テンプレートを置換する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項3に記載の方法であって、前記工程A1)の前記アニーリング工程の間に使用される前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー、または前記工程A4)の前記アニーリング工程の間に使用される前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記工程C)の前記アニーリング工程の間に使用される前記オリゴヌクレオチドプライマーと同じである、方法。
- サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、該方法は、以下の工程:
請求項1に従う増幅方法を実行する工程であって、前記テンプレートが、該標的ヌクレオチド配列を含む、工程、および
該標的ヌクレオチド配列が該増幅方法の産物中に存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項5に記載の方法であって、前記決定する工程が、以下:
前記増幅方法の産物を、前記第1のループまたは前記第2のループに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブと合わせる、工程;および
該プローブと該増幅方法の産物との間のハイブリダイゼーションが生じるか否かを観察する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項5に記載の方法であって、前記増幅方法を実行する前記工程が、核酸についての検出器の存在下で実施され、ここで、該検出する工程は、該検出器のシグナルの変化を検出する工程を包含する、方法。
- 方法であって、以下:
A)テンプレートを提供する工程であって、該テンプレートは、以下:
(i)適切な条件下で互いにアニーリングして第1のループを形成する、3’末端に位置する第1の領域および第1の相補領域、を含む、3’末端部分、
(ii)適切な条件下で互いにアニーリングして第2のループを形成する、5’末端に位置する第2の領域および第2の相補領域、を含む、5’末端部分、ならびに
(iii)該3’末端部分および該5’末端部分を接続する領域、
を有する、工程;
B)該第1の領域および第1の相補領域が互いにアニーリングして該第1のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの3’末端を該テンプレートの5’末端へと伸長させて、該第2の相補領域および第2の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第3のループを形成する、3’末端に位置する第3の領域および第3の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程;
C)3’末端で該第1のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で該テンプレートの該第1の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの該第1のループにアニーリングさせる、工程;
D)鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートに相補的な新規テンプレートを形成する工程;ならびに
E)該新規テンプレートを該伸長したテンプレートから置換する工程、
を包含する、方法。 - 請求項8に記載の方法であって、前記新規テンプレートが、(i)適切な条件下で互いにアニーリングして第2のループを形成する、3’末端に位置する前記第2の領域および前記第2の相補領域、を含む、3’末端部分、(ii)適切な条件下で互いにアニーリングして第1のループを形成する、5’末端に位置する前記第1の領域および前記第1の相補領域、を含む、5’末端部分、および(iii)該3’末端部分および該5’末端部分を接続する領域、を有し、該方法は、さらに以下の工程:
F)該第2の領域および第2の相補領域が互いにアニーリングして該第2のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該新規テンプレートの該3’末端を該新規テンプレートの該5’末端へと伸長させて、該第1の相補領域および第1の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第3のループを形成する、第3の領域および第3の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程;
G)3’末端で該第2のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で該第2の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長した新規テンプレートの該第2のループにアニーリングさせる、工程;ならびに
H)鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長した新規テンプレートに沿って該第2のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートと実質的に同じ第3のテンプレートを形成する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項9に記載の方法であって、以下:
I)前記新規テンプレートから前記第3のテンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。 - 請求項9に記載の方法であって、前記第3のテンプレートを使用して、前記工程B)〜H)を繰り返す工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記工程D)の伸長工程が、前記テンプレートの5’末端に相補的な前記テンプレート伸長中の配列を置換して、前記第3の領域および前記第3の相補領域を互いにアニーリングさせて、前記第3のループを形成させる方法であって、該方法は、以下:
該伸長したテンプレートの該3’末端を該テンプレートの該5’末端へと伸長させ、それによって、工程E)の該新規テンプレートを置換する、工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項12に記載の方法であって、
3’末端で該第3のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で該第3の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを、該第3のループにアニーリングさせる、工程;ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端を伸長させる、工程、
をさらに包含する、方法。 - 前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項13に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタミンを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項15に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタミンを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項17に記載の方法。
- 特定の核酸配列を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程:
I.該特定の核酸配列、
II.該特定の核酸配列のための第1の初期プライマーまたは核酸構築物であって、該第1の初期プライマーまたは核酸構築物が以下の2つのセグメントを含む、第1の初期プライマーまたは核酸構築物:
(A)第1のセグメントであって、(i)該特定の核酸配列の第1の部分に実質的に相補的であり、そして(ii)テンプレート依存性の第1の伸長をし得る、セグメント、および
(B)第2のセグメントであって、(i)該第1のセグメントと実質的に非同一であり、(ii)該特定の核酸配列の第2の部分と実質的に同一であり、(iii)該第2のセグメントの相補的配列に結合し得、そして(iv)均衡条件下または限定サイクリング条件下で、第2のプライマー伸長が生成されて、第1のプライマー伸長を置換するように、第2のプライマーまたは核酸構築物の第1のセグメントの、該特定の核酸配列の該第1の部分への次の結合を提供し得る、セグメント;および
III.該第1の初期プライマーとは異なる第2の初期プライマーまたは核酸構築物であって、以下の2つのセグメントを含む、第2の初期プライマーまたは核酸構築物:
(A)第1のセグメントであって、(i)該特定の核酸配列の相補体の第1の部分に実質的に相補的であり、そして(ii)テンプレート依存性の第1の伸長をし得る、セグメント、および
(B)第2のセグメントであって、(i)該第1のセグメントと実質的に非同一であり、(ii)該特定の核酸配列の該相補体の第2の部分に実質的に同一であり、(iii)該第2のセグメントの相補的配列に結合し得、そして(iv)均衡条件下または限定サイクリング条件下で、第2のプライマー伸長が生成され、そして第1のプライマー伸長を置換するように、次のプライマーの第1のセグメントの、該特定の核酸配列の該相補体の第1の部分への次の結合を提供し得る、セグメント;および
IV.基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素
を、提供する工程;ならびに、
均衡条件下または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下、該特定の核酸配列と、該その相補体と、該第1および該第2の初期プライマーまたは核酸構築物とをインキュベートし;それにより、該特定の核酸配列を非直線的に増幅する工程、
を包含する、方法。 - 前記工程のいずれか、またはすべてを繰り返すことをさらに包含する、請求項19に記載の増幅する方法。
- 溶融温度調節因子を提供することをさらに包含する、請求項20に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項22に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
請求項20に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記特定の核酸配列のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に存在するか否かを決定する工程、を包含する、方法。 - 請求項24に記載の方法であって、前記決定する工程が:
前記増幅する方法の生成物を、前記特定の核酸配列の第1の部分または該特定の核酸配列の相補体の第1の部分に相補的な核酸を含むプローブと組み合わせること;および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと、該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察すること、を包含する、方法。 - 標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程:
(i)標的核酸の鎖を提供する工程であって、該標的の鎖が、該標的の鎖上の3’から5’の方向に、第1の部分、該第1の部分のすぐ5’側に位置する第2の部分、該第2の部分の5’側に位置する第3の部分、該第3の部分の5’側に位置する第4の部分および該第4の部分のすぐ5’側に位置する第5の部分を含む、少なくとも5つの実質的に非同一の部分を有する、工程;
(ii)該標的の鎖の第1の部分に実質的に相補的である第1の3’プライミングセグメント、および該標的の鎖の第2の部分に実質的に同一である第1の5’テイルセグメントを含む、順方向プライマーを提供する、工程;
(iii)鎖置換活性をもつテンプレート依存性ポリメラーゼを提供する工程;
(iv)該標的の鎖の第5の部分に実質的に同一である第2の3’プライミングセグメント、および該標的の鎖の第4の部分に実質的に相補的である第2の5’テイルセグメントをも含む、逆方向プライマーを提供する、工程;および
(v)反応溶液を、増幅および鎖置換重合に適切な条件下で、かつ増幅および鎖置換重合に適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。 - 標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下:
(i)標的核酸の鎖を提供する工程であって、該標記の鎖が、該標的の鎖上の3’から5’の方向に、第1の部分、該第1の部分のすぐ5’側に位置する第2の部分、該第2の部分の5’側に位置する第3の部分、該第3の部分の5’側に位置する第4の部分および該第4の部分のすぐ5’側に位置する第5の部分を含む、少なくとも5つの実質的に非同一の部分を有する、工程;
(ii)第1の3’プライミングセグメントおよび第1の5’テイルセグメントを含む、順方向プライマーを提供する工程であって、
ここで、該第1の3’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第1の部分に実質的に相補的であり、そして少なくとも該標的の鎖の第2の部分に沿って、テンプレート依存性ポリメラーゼで伸長されて、テンプレートを形成し得、そして
ここで、該第1の5’テイルセグメントが、該標的の鎖の第2の部分と実質的に同一である、工程;
(iii)該ポリメラーゼを提供する工程であって、該ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、工程;
(iv)第2の3’プライミングセグメントおよび第2の5’テイルセグメントを含む、逆方向プライマーを提供する、工程であって、
ここで、該第2の3’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第5の部分と実質的に同一であり、そして少なくとも該標的の鎖の第4の部分に実質的に相補的であるテンプレートの領域に沿って、該ポリメラーゼで伸長されて、アンプリコンを形成し得、そして
ここで、該第2の5’テイルセグメントが、該標的の鎖の第4の部分に実質的に相補的である、工程;および
(v)反応溶液を、増幅および鎖置換重合に適切な条件下で、かつ増幅および鎖置換重合に適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。 - 前記工程(i)〜(v)のいずれか、またはすべてを繰り返すことをさらに包含する、請求項26または27に記載の増幅する方法。
- 溶融温度調節因子を提供する工程をさらに包含する、請求項28に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効量のベタインを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項3 0に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
請求項28に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記標的の鎖のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に存在するか否かを決定する工程、を包含する、方法。 - 請求項32に記載の方法であって、前記決定する工程が:
前記増幅する方法の生成物を、前記標的の鎖の第1の部分または該標的の鎖の第5の部分に相補的な核酸を含むプローブと組み合わせること;および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと、該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察すること、を包含する、方法。 - 前記標的の鎖の第2の部分が、前記第1の部分の3’末端から約100ヌクレオチドより少なく離れており、そして前記第5の部分が、前記第4の部分の3’末端から約100ヌクレオチドより少なく離れて位置している、請求項28に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法であって、前記第1の3’プライミングセグメントが、前記標的の鎖の第1の部分またはそのアンプリコンにアニールし、そして、前記順方向プライマーが、少なくとも、前記標的の鎖の第3の部分またはアンプリコンに伸長されるとき、前記第1の5’テイルセグメントが、該標的の鎖の第2の部分またはアンプリコンを超えて伸長した伸長順方向プライマーの一部分にアニールし、それによって、次の順方向プライマーの第1の3’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第1の部分またはアンプリコンに結合することを可能にする、方法。
- 請求項35に記載の方法であって、前記第2の3’プライミングセグメントが、前記標的の鎖の第5の部分またはそのアンプリコンの相補体上の該標的の鎖またはそのアンプリコンのテンプレートにアニールし、そして、前記逆方向プライマーが、テンプレート上を、少なくとも、前記標的の鎖の第3の部分の相補体またはアンプリコンに伸長されるとき、前記第2の5’テイルセグメントが、該標的の鎖の第4の部分の相補体またはアンプリコンを超えて伸長した伸長逆方向プライマーの一部分にアニールし、それによって、次の逆方向プライマーの第2の3’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第5の部分の相補体またはアンプリコン上のテンプレートに結合することを可能にする、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、前記順方向プライマーが、前記標的の鎖またはそのアンプリコン上で少なくとも部分的に伸長され、そして、伸長された後、それが伸長される前より該標的の鎖またはアンプリコンとのより弱い結合を有する、方法。
- 請求項37に記載の方法であって、前記逆方向プライマーが、前記標的の鎖またはそのアンプリコンのテンプレート上で少なくとも部分的に伸長され、そして、伸長された後、それが伸長される前より該テンプレートとのより弱い結合を有する、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、(a)前記第1の部分の3’側上の前記標的の鎖にアニールする第1の標準プライマー、および(b)前記第5の部分の相補体の3’側上の該標的の鎖のテンプレートにアニールする第2の標準プライマーを提供する工程をさらに包含し、
ここで、該第1の標準プライマーおよび該第2の標準プライマーが、鎖置換重合を補助して開始する、方法。 - 前記条件が、限定サイクリング条件である、請求項28に記載の方法。
- 前記条件が、実質的に均衡条件である、請求項28に記載の方法。
- 前記条件が、実質的に等温である、請求項28に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法であって、サーマルサイクラーを採用しない、方法。
- 前記条件が、前記標的の鎖のその相補体からの初期熱変性を除いて実質的に均衡である、請求項28に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法であって、その全体が任意の熱変性なくして実施される、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、その全体が92℃未満の温度で実施される、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、前記標的の鎖のその相補体からの初期熱変性を除いて、実質的に均衡な条件下、70℃未満の温度で実施される、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、実質的に均衡条件下、70℃未満の温度で実施される、方法。
- 前記実質的に非同一の部分が実質的に非類似である、請求項28に記載の方法。
- 標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程:
(A)該標的核酸の鎖のアンプリコンを提供する工程であって、該アンプリコンが、以下を含む実質的に非同一な領域を含む工程:
(i)3’末端における、3’末端領域、該3’末端領域に実質的に隣接する第1の3’内部領域、および該第1の3’内部領域に実質的に隣接する第2の3’内部領域であって、ここで、該3’末端領域および該第2の3’内部領域が実質的に相補的であり、そして互いにアニールして増幅に適切な条件下でループを形成する、領域、
(ii)5’末端における、5’末端領域、該5’末端領域に実質的に隣接する第1の5’内部領域、および該第1の5’内部領域に実質的に隣接する第2の5’内部領域であって、ここで、該5’末端領域および該第2の5’内部領域が相補的であり、そして増幅に適切な条件下で互いにアニールしてループを形成する、領域、および
(iii)該第2の3’内部領域を、該第2の5’内部領域に連結する、中央領域;
(B)鎖置換活性を有するテンプレート依存性ポリメラーゼを提供する工程;
(C)順方向プライマー、逆方向プライマーまたはその両方を提供する工程であって、
該順方向プライマーが、該3’末端領域に実質的に相補的である第1の5’テイルセグメント、および該第1の3’内部領域に実質的に相補的である第1の3’プライミングセグメントを含み;
該逆方向プライマーが、該5’末端領域に実質的に同一である第2の5’テイルセグメント、および該第1の5’内部領域と実質的に同一である第2の3’プライミングセグメントを含む、工程;および
(D)反応混合物を、増幅および鎖置換重合のために適切な条件下、増幅および鎖置換重合のために適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。 - 標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程:
(A)該標的核酸の鎖のアンプリコンを提供する工程であって、該アンプリコンが、以下を含む実質的に非同一な領域を含む工程:
(i)3’末端における、3’末端領域、該3’末端領域に実質的に隣接する第1の3’内部領域、および該第1の3’内部領域に実質的に隣接する第2の3’内部領域であって、ここで、該3’末端領域および該第2の3’内部領域が相補的であり、そして互いにアニールして増幅に適切な条件下でループを形成する、領域、
(ii)5’末端における、5’末端領域、該5’末端領域に実質的に隣接する第1の5’内部領域、および該第1の5’内部領域に実質的に隣接する第2の5’内部領域であって、ここで、該5’末端領域および該第2の5’内部領域が相補的であり、そして増幅に適切な条件下で互いにアニールしてループを形成する、領域、および
(iii)該第2の3’内部領域を、該第2の5’内部領域に連結する、中央領域;
(B)順方向プライマー、逆方向プライマーまたはその両方を提供する工程であって、
該順方向プライマーが、該3’末端領域に実質的に相補的である第1の5’テイルセグメント、および該第1の3’内部領域に実質的に相補的である第1の3’プライミングセグメントを含み;
該逆方向プライマーが、該5’末端領域に実質的に同一である第2の5’テイルセグメント、および該第1の5’内部領域と実質的に同一である第2の3’プライミングセグメントを含む、工程;
(C)鎖置換活性を有するテンプレート依存性ポリメラーゼを用い、該アンプリコンの3’末端を、5’末端に伸長し、それによって、増幅に適切な条件下、各々がループを形成し得る3つのセクションを含む伸長したアンプリコンを形成する、工程;および
(D)反応混合物を、増幅および鎖置換重合のために適切な条件下、そして増幅および鎖置換重合のために適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。 - 前記工程(A)−(D)のいずれか、またはすべてを繰り返すことをさらに含む、請求項50または51に記載の増幅する方法。
- 溶融温度調節因子を提供することをさらに含む、請求項52に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項52に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項54に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程:
請求項45に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記標的の鎖のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に検出可能に存在するか否かを決定する工程、を包含する、方法。 - 請求項56に記載の方法であって、前記決定する方法が、以下の工程:
該増幅する方法の生成物を、前記第1の3’内部領域または前記第1の5’内部領域に相補的な核酸を含むプローブと組み合わせる工程;および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察する工程、を包含する、方法。 - 前記第2の3’内部領域が、前記3’末端領域から約100ヌクレオチドより少なく離れており、そして前記第2の5’内部領域が、前記5’末端領域から約100ヌクレオチドより少なく離れている、請求項52に記載の方法。
- 請求項52に記載の方法であって、前記順方向プライマーが、前記アンプリコンまたはそのテンプレート上で少なくとも部分的に伸長され、伸長された後、それが伸長される前より該アンプリコンまたはテンプレートとのより弱い結合を有する、方法。
- 請求項59に記載の方法であって、前記逆方向プライマーが、前記アンプリコンまたはそのテンプレート上で少なくとも部分的に伸長され、伸長された後、それが伸長される前より該アンプリコンまたはテンプレートとのより弱い結合を有する、方法。
- 前記条件が、限定サイクリング条件である、請求項52に記載の方法。
- 前記条件が、実質的に均衡条件である、請求項52に記載の方法。
- 前記条件が、実質的に等温である、請求項52に記載の方法。
- 請求項52に記載の方法であって、サーマルサイクラーを採用しない、方法。
- 前記条件が、初期熱変性を除いて実質的に均衡である、請求項52に記載の方法。
- 前記方法全体が、いかなる熱変性もなしに実施される、請求項52に記載の方法。
- 前記方法全体が、92℃より下の温度で実施される、請求項52に記載の方法。
- 前記方法が、開始熱変性を除いて実質的に均衡な条件下で70℃より下の温度で実施される、請求項52に記載の方法。
- 前記方法が、実質的に均衡な条件下で70℃より下の温度で実施される、請求項52に記載の方法。
- 前記実質的に非同一の領域が、実質的に類似しない、請求項52に記載の方法。
- その5’末端および3’末端にステムおよびループの形成を有する一本鎖核酸分子を作製する方法であって、以下の工程:
第1のオリゴヌクレオチドプライマーをサンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする工程であって、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該サンプル一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
適切なポリメラーゼを用いて、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、第1の一本鎖核酸分子を形成させる工程であって、該第1の一本鎖核酸分子が、適切な条件下で互いにアニーリングしてループを形成する、第1の領域および5 ' 末端に位置する第1の相補的な領域を含む5 ' 末端部分を含む、工程;
該サンプル一本鎖核酸分子から該第1の一本鎖核酸分子を置換する工程;
第2のオリゴヌクレオチドプライマーを該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングする工程であって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該該第1の一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
適切なポリメラーゼを用いて、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、第2の一本鎖核酸分子を形成させる、工程であって、該第2の一本鎖核酸分子が、(i)該第1の一本鎖核酸分子の5’末端部分に相補的な3’末端部分であって、該3’末端部分は、適切な環境下で互いにアニーリングして第1のループを形成する、3’末端に位置する該第1の領域および該第1の相補的な領域を含む、3 ' 末端部分、ならびにii)適切な環境下で互いにアニーリングして第2のループを形成する、5’末端に位置する第2の相補的な領域および第2の領域を含む、5 ' 末端部分、を含む、工程;ならびに
該第1の一本鎖核酸分子から該第2の一本鎖核酸分子を置換する工程、
を包含し、それにより、該第2の一本鎖核酸分子が、該3’末端部分および該5’末端部分の両方で形成されるステムおよびループの形成を伴うコンフォメーションをとる、方法。 - 前記伸長工程が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて実施される、請求項71に記載の方法。
- 請求項71に記載の方法であって、ここで、前記サンプル一本鎖核酸分子から前記第1の一本鎖核酸分子を置換する前記工程が、以下の工程:
前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置の3’側の位置で、該サンプル一本鎖核酸分子に第3のオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程;ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、該第3のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、該サンプル一本鎖核酸分子から該第1の一本鎖核酸分子を置換する工程、
を包含する、方法。 - 請求項71に記載の方法であって、ここで、前記第1の一本鎖核酸分子から前記第2の 一本鎖核酸分子を置換する前記工程が、以下の工程:
前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置の3’側の位置で、該第1の一本鎖核酸分子に第4のオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程;ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、該第4のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、該第1の一本鎖核酸分子から該第2の一本鎖核酸分子を置換する工程、
を包含する、方法。 - 前記置換の各々が、熱変性によって実行されている、請求項71に記載の方法。
- 前記サンプル一本鎖核酸分子がRNAであり、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する工程が、逆転写活性を有する酵素により行われる、請求項71に記載の方法。
- 前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項71に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項78に記載の方法。
- 前記第1の一本鎖核酸分子を置換する工程が、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端部分が前記サンプル一本鎖核酸分子にアニールする場所から始まって、該第1の一本鎖核酸分子の3’末端へと続いて行われる、請求項71に記載の方法。
- 前記第2の一本鎖核酸分子を置換する工程が、前記第2オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端部分が、第1の一本鎖核酸分子にアニールする場所から始まって、該第2の一本鎖核酸分子の3’末端へと続いて行われる、請求項71に記載の方法。
- 以下を含む核酸分子をコピーする方法であって、該方法は、
A)請求項216に記載の方法に従って、第2の一本鎖核酸分子を調製し、それにより、テンプレートを形成する工程;
B)第1の領域および第1の相補領域が互いにアニーリングして第1のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの3’末端を該テンプレートの5’末端へと伸長させて、それぞれ3’末端に位置する、第2の相補領域および第2の領域を含み、適切な条件下で互いにアニーリングして第3のループを形成する、テンプレート伸長を形成する、工程;
C)3’末端で該第1のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で該テンプレートの該第1の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの該第1のループにアニーリングさせる、工程;ならびに
D)鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、工程(A)において形成された該テンプレートに相補的な新規テンプレートを形成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項82に記載の方法であって、
E)前記伸長したテンプレートから前記新規テンプレートを置換する工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項83に記載の方法であって、前記工程(D)の伸長工程は、前記工程(B)の伸長の間に形成された前記テンプレート伸長を置換して、前記第2の相補的領域および前記第2の領域が互いにアニーリングして第3のループを形成することを可能にし、前記工程(E)の置換する工程が、該伸長したテンプレートの3’末端を該テンプレートの5’末端へと伸長させ、それによって、前記新規テンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項84に記載の方法であって、該方法は、以下の工程:
3’末端で前記第3のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で前記テンプレートの前記第2の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを、該第3のループにアニールさせる工程;ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端を伸長させる工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項83に記載の方法であって、前記テンプレートとして、工程(D)において形成された前記新規テンプレートを使用して、前記工程(B)〜(E)を繰り返す工程、をさらに包含する、方法。
- 前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項82に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項87に記載の方法。
- 反応溶液中の前記ベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項88に記載の方法。
- キットであって、以下:
第1のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、(i)サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングし、そして該サンプル一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第1の一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く、3’末端ヌクレオチド配列、および(ii)該第1の一本鎖核酸分子の任意の領域に相補的な5’末端ヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー;
第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子に該第1のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置より3’側に位置する、該サンプル一本鎖核酸分子の領域にアニーリングするヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマー;
第3のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第3のオリゴヌクレオチドプライマーは、(i)該第1のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製された該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングし、そして該第1の一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第2の一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く、3’末端ヌクレオチド配列、および(ii)該第2の一本鎖核酸分子の任意の領域に相補的な5’末端ヌクレオチド配列を含む、第3のオリゴヌクレオチドプライマー;
鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ;ならびに
該プライマーを伸張させるために該DNAポリメラーゼによって使用される、1つ以上のヌクレオチド、
を備える、キット。 - 請求項90に記載のキットであって、第4のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに備え、該第4のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の一本鎖核酸分子に前記第3の オリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置より3’側に位置する、該第1の一本鎖核酸分子の領域にアニーリングするヌクレオチド配列を含む、キット。
- 前記キットの残りの構成要素を使用して調製された、核酸合成生成物の検出のための、検出器をさらに備える、請求項90に記載のキット。
- 5’末端および3’末端においてステムおよびループの形成を有する、一本鎖核酸分子を作製する方法であって、以下:
第1の一本鎖核酸分子を提供する工程であって、該第1の一本鎖核酸分子は、適切な条件下で互いにアニーリングしてループを形成する、5’末端に位置する第1の領域および第1の相補領域、を含む、5’末端部分を含む、工程;
第1のオリゴヌクレオチドプライマーを、第1の一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該第1の一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
適切なポリメラーゼを使用して、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、第2の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第1の一本鎖核酸分子は、(i)該第1の一本鎖核酸分子の5’末端部分に相補的な3’末端部分であって、該3’末端部分は、適切な条件下で互いにアニーリングして第1のループを形成する、3’末端に位置する第1の領域および第1の相補領域、を含む、3’末端部分、ならびに(ii)適切な条件下で互いにアニーリングして第2のループを形成する、5’末端に位置する第2の領域および第2の相補領域、を含む、5’末端部分を含む、工程;
該第1の一本鎖核酸分子から、該第1の一本鎖核酸分子に該第1のオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端部分がアニーリングした位置から該第2の核酸分子の3’末端まで続く該第2の一本鎖核酸分子を置換する工程であって、該第1の一本鎖核酸分子からの該第2の一本鎖核酸分子の置換の際に、該第2の一本鎖核酸分子が、該第1のループを形成する3’末端部分および該第2のループを形成する5’末端部分を有するコンフォメーションを呈する、工程;
を包含する、方法。 - 前記伸長工程が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して実行される、請求項93に記載の方法。
- 前記アニーリング工程および前記伸長工程が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項93に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項95に記載の方法。
- 反応溶液中の前記ベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項96に記載の方法。
- 核酸をコピーする方法であって、以下:
A)請求項238に記載の方法に従って、第2の一本鎖核酸分子を調製し、それによりテンプレートを形成する工程;
B)該第1の領域および第1の相補領域が互いにアニーリングして該第1のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの3’末端を該テンプレートの5’末端へと伸長させて、該第2の相補領域および第2の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第3のループを形成する、3’末端に位置する第3の領域および第3の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程;
C)3’末端で該第1のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および 5’末端で該テンプレートの該第1の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの該第1のループにアニーリングさせる、工程;ならびに
D)鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、工程(A)において形成されたテンプレートに相補的な新規テンプレートを形成する工程、
を包含する、方法。 - E)前記新規テンプレートを前記伸長したテンプレートから置換する工程、をさらに包含する、請求項98に記載の方法。
- 請求項99に記載の方法であって、前記工程(D)の伸長工程が、前記工程(B)の伸長工程の間に形成されるテンプレート伸長を置換し、前記第3の領域および前記第3の相補領域を互いにアニーリングさせて第3のループを形成させ、前記工程(E)の置換工程が、以下:前記伸長したテンプレートの3’末端を該テンプレートの5’末端に向かって伸長し、それにより新規テンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項100に記載の方法であって、以下:
3’末端で前記第3のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で前記テンプレートの第3の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを、該第3のループにアニーリングさせる、工程;ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端を伸長させる、工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項99に記載の方法であって、前記新規テンプレートが、(i)適切な条件下で互いにアニーリングして第1のループを形成する、5’末端に位置する前記第1の領域および前記第1の相補領域、を含む、5’末端部分、ならびに(ii)適切な条件下で互いにアニーリングして第2のループを形成する、3’末端に位置する前記第2の領域および前記第2の相補領域、を含む、3’末端部分、を有し、該方法は、さらに以下の工程:
F)該第2の領域および第2の相補領域が互いにアニーリングして該第2のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該新規テンプレートの該3’末端を該新規テンプレートの該5’末端へと伸長させて、該第1の相補領域および第1の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第3のループを形成する、第3の領域および第3の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程;
G)3’末端で該第2のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および5’末端で該テンプレートの該第2の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長した新規テンプレートの該第2のループにアニーリングさせる、工程;
H)鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長した新規テンプレートに沿って該第2のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートと実質的に同じ第3のテンプレートを形成する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項102に記載の方法であって、以下:
I)前記新規テンプレートから前記第3のテンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。 - 請求項103に記載の方法であって、前記第3のテンプレートを使用して、前記工程( B)〜(I)を繰り返す工程、をさらに包含する、方法。
- 前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項98に記載の方法。
- 前記溶融温度調節因子が、有効な濃度のベタインを含む、請求項105に記載の方法。
- 前記反応溶液中のベタインの濃度が、約0.55Mである、請求項106に記載の方法。
- 5’末端および3’末端にステムおよびループの形成を有する一本鎖核酸分子を作製する方法であって、該方法が、以下:
第1のオリゴヌクレオチドプライマーを、サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該サンプル一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
適切なポリメラーゼを使用して、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、第1の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第1の一本鎖核酸分子は、適切な条件下で互いにアニールしてループを形成する、5’末端に配置される第1領域および第1の相補性領域を含む5’末端部分を含む、工程;
該サンプル一本鎖核酸分子から該第1の一本鎖核酸分子を置換する工程であって、該第1のオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端部分が該サンプル一本鎖核酸分子にアニールする場所から始まり、そして該第1の一本鎖核酸分子の3’末端へと続く、工程;
第2のオリゴヌクレオチドプライマーを該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第1の一本鎖核酸分子にアニーリングする3’末端部分、および該第1の一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、工程;
適切なポリメラーゼを使用して、該第2のオリゴヌクレオチドプライマーをその3’末端から伸長させて、第2の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第2の一本鎖核酸分子は、(i)該第1の一本鎖核酸分子の5’末端部分に相補的な3’末端部分であって、該3’末端部分は、適切な条件下で互いにアニールして第1のループを形成する、3’末端に配置される第1領域および第1の相補性領域を含む、3’末端部分、および(ii)5’末端部分であって、該5’末端部分は、適切な条件下で互いにアニールして第2のループを形成する、5’末端に配置される第2領域および第2の相補性領域を含む、5’末端部分を含む、工程;ならびに
該第1の一本鎖核酸分子から該第2の一本鎖核酸分子を置換する工程であって、これによって、該第2の一本鎖核酸分子が3’末端部分および5’末端部分の両方において形成されるステムおよびループの形成を有するコンフォメーションをとる、工程、
を包含する、方法。
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