JP2000037194A - 核酸を増幅するため、核酸配列のための終結後標識プロセス、および減少した熱力学安定性を有する核酸を生成するための新規の方法 - Google Patents

核酸を増幅するため、核酸配列のための終結後標識プロセス、および減少した熱力学安定性を有する核酸を生成するための新規の方法

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 核酸増幅、核酸配列決定及び重要な特徴を有
する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能な新規プロセ
スの提供。 【解決手段】 特定の核酸配列を直線的に増幅するため
のプロセスであって、以下の工程：該特定の核酸配列、
初期プライマー又は核酸構築物であって、特定の条件下
で第２のプライマー又は核酸構築物の第１のセグメント
の続く該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供
し得る２つのセグメントを含む、初期プライマーまたは
核酸構築物；並びに基質、緩衝液、及びテンプレート依
存性重合化酵素；を提供する工程；並びに均衡または限
定サイクリング条件下で該基質、緩衝液、及びテンプレ
ート依存性重合化酵素の存在下で該特定の核酸配列およ
び該新規プライマー又は核酸構築物をインキュベート
し；それにより該特定の核酸配列を直線的に増幅する工
程を包含するプロセス。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え核酸技術の
分野に関し、より詳細には、核酸増幅、核酸配列決定の
ための終結後標識、および減少した熱力学安定性を有す
る核酸の生成のためのプロセスに関する。
【０００２】本明細書において引用または同定される全
ての特許、特許明細書、特定の文献などは、本発明が属
する最先端技術をより完全に記載するために、それらの
全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００３】
【従来の技術】標的核酸の首尾良いインビトロ指数関数
的増殖について記載されている最初の系は、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（Ｓａｉｋｉら、１９８５
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１３５０−１３５４）。Ｐ
ＣＲは、対立遺伝子決定、法医学的同定、遺伝子分析、
診断、クローニング、直接配列決定、および他の適用に
幅広く使用されている。続いて、逆転写酵素（ＲＴ）
は、ＲＮＡ分子をＤＮＡコピーに形質転換するために使
用され、ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅のための
基質としてＲＮＡ分子の使用を可能にした。さらに、特
定のＤＮＡポリメラーゼがそれら自身による逆転写を行
うことを可能にする条件が記載されており（Ｍｙｅｒ
ｓ，Ｔ．Ｗ．およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．［１９９
１］ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０；７６６１−７６６
６）、その内容を本明細書中で参考として援用する。最
後に、Ｒｏｓｅら（米国特許第５，５０８，１７８号、
これもまた本明細書中で参考として援用する）は、単一
のプライマーの使用が、標的核酸の各末端からポリマー
化を開始して、１本鎖形態のＰＣＲアンプリコンを作製
することを可能にする、ＰＣＲプライマー配列の選択と
しての逆反復配列の使用を記載しており、この逆反復配
列は、各末端での自己相補配列を有する「パン−ハンド
ル（ｐａｎ−ｈａｎｄｌｅ）」として描かれ得る。逆反
復を欠く標的を利用するために、この群はまた、ＰＣＲ
アンプリコンに配列を導入し、その結果最終産物が、各
末端で自己相補配列を有するための種々の方法を記載し
ている（米国特許第５，４３９，７９３号、同第５，５
９５，８９１号、および同第５，６１２，１９９号、そ
の各々を、本明細書中で参考として援用する）。
【０００４】本来のＰＣＲ増幅系および種々の改良され
たＰＣＲ系の両方は、ＰＣＲ法に本来備わっている複数
の温度条件を提供するための高価な専用サーモサイクラ
ーの必要性の限定で悩む。この必要性は、プライマーの
伸長が、それを作製するのに使用されたプライマーより
も強力なテンプレートとの会合を有する産物を作製する
という問題に由来する。そのようなものとして、ＰＣＲ
の様な系において、プライマーの結合を可能にする温度
は、そのテンプレートから伸長産物の分離させるために
は低すぎる温度、そして伸長産物を分離させるのに十分
上昇される温度は、他のプライミング事象を可能にする
には高すぎる。第２のプライミング事象は、第１の伸長
鎖がそのテンプレートから分離された後まで、生じ得な
い。そのようなものとして、ＰＣＲ増幅において、テン
プレートへのプライマー結合およびテンプレートから伸
長したプライマーの続く遊離は、別々の異なった温度で
行われなければならず、そして別々の温熱工程の反復配
列を提供するためのサーモサイクラーが必要である。異
なる条件を有する不連続サイクルの存在もまた、各個別
の温度工程の至適温度ならびに各工程のための適切なタ
イミングを必要とする。同様の問題もまた、ＬＣＲ反応
において連結が使用される場合に適用し（Ｂａｃｋｍａ
ｎ，Ｋら、欧州特許出願公開第０ ３２０ ３０８号、
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、１９８８ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１；１０７７、Ｗｕ，ＤおよびＷａｌｌａｃ
ｅ，Ｒ．Ｂ． １９８９ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４；５６
０、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ． １９９１， Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８；１８９）、ここで
個別のプローブを結合するのに必要な温度は、連結事象
によってそれらが安定化された後にそれらを遊離するの
に必要な温度よりも低い。前述の文書の全てを、本明細
書中で参考として援用する。
【０００５】他者は、これらの限定を認識しており、そ
して等温条件下で複数のサイクルを達成する手段を提供
することによってそれらを克服することを試みている。
この例は、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６；１１７３−
１１７７）およびＮＡＳＢＡ（Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔら、
１９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５；２
７３−２８６、その各々の内容を、本明細書中で参考と
して援用する）。前述の各系は、増幅される核酸の構造
へのＲＮＡプロモーターの導入の必要性の限定を有す
る。従って、これらの系が、目的の配列のＤＮＡとＲＮ
Ａ形態との間のサイクリング反応に依存するという限定
もまた存在する。ＲＮＡ中間体の生成に基づく依存性
は、ＲＮａｓｅ（環境に偏在し、そして生物学的由来の
試料に頻繁に存在する酵素）への感受性の限定を誘導す
る。さらに、これらの増幅系の設計の性質は、それらが
以下の４つの別々の酵素活性を必要とするさらなる限定
を有する：ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮａｓ
ｅＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ。ＴＭＡ反応におい
て、これらの活性は、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラ
ーゼ酵素によって提供されるのに対して、３ＳＲおよび
ＮＡＳＢＡにおいて、それらは、逆転写酵素、ＲＮａｓ
ｅＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ酵素によって提供され
る。これらの各々の活性は、機能的である系に必要であ
り、そしてそれ自体、各機能を個別に試験および適定す
る製造者の必要性が存在し、それにより単一の酵素活性
を利用する系と比較してコストが増加する。さらに、最
小限で、少なくとも２つの異なった酵素が、全ての必要
な機能を提供するために使用されなければならず、従っ
て、これらの系を、単一の酵素を利用するものより高価
にする。さらに、これらの系は、反応のための試薬とし
て存在するリボヌクレオチドならびにデオキシリボヌク
レオチドを必要とする。複数の活性の存在はまた、生物
学的試料に存在し得る種々のインヒビターによる不活化
に弱いより多くの工程を作製する。
【０００６】Ｗａｌｋｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９２，８９；３９２
−３９６、本明細書中で参考として援用する）によって
記載される鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃ
ｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法におい
て、等温増幅は、プライマー内の制限酵素部位の封入に
よって行われ、その結果制限酵素による消化は、単一の
温度で所定のテンプレートからの、一連のプライミン
グ、伸長、および置換反応を可能にする。しかし、それ
らの系は、ポリメラーゼおよび基質についての基本的な
必要性に加えて、３つのさらなるエレメントがそれらの
発明を行うために必要であるという限定を有する。第１
に、プライミングが行われる部位での適切な制限酵素部
位の存在の必要性が存在する；第２に、示される第２の
酵素（制限酵素）の存在の必要性が存在し、そして最後
に、特異的に改変された基質（例えば、存在するｄＮＴ
Ｐのチオ誘導体）の必要性が存在する。この方法のバリ
エーションが記載されており（米国特許第５，２７０，
１８４号、本明細書中で参考として援用する）、ここ
で、標的における制限酵素部位の必要性の限定が、制限
酵素部位を有するプライマーに隣接する第２のプライマ
ーセットの使用によって排除されている。しかし、この
バリエーションにおいて、系は、第２のプライマーセッ
トについての必要性の新たな限定を有する一方、制限酵
素および改変基質についての他の２つの限定の必要性を
有することが記載される。
【０００７】完全なサイクル増幅の種々の工程に使用さ
れる温度は、各工程に本来備わる物理学的制約によって
決定される。そのようなものとして、先行技術におい
て、テンプレートから伸長した鎖の完全な置換に使用さ
れる温度は、代表的には約９２〜９５℃である。この高
温は、分離の適切な効率を保証するために使用されてお
り、その結果、伸長鎖は、続く反応のためのテンプレー
トとして使用され得る。ＰＣＲが最初に記載された場
合、ポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来し、そしてそ
のようなものとして、より多くの酵素の添加を必要とす
る各変性工程の後のポリメラーゼの本質的に完全な熱不
活化が存在した（Ｓａｉｋｉら、１９８５Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３０；１３５０−１３５４）。この問題は、ＰＣ
Ｒ反応における、好熱性細菌Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ由
来のＤＮＡポリメラーゼの使用によって取り組まれた
（Ｓａｉｋｉら、１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９；
４８７−４９１）。前述のＳａｉｋｉの刊行物の各々
を、本明細書中で参考として援用する。その固有の熱安
定性に起因して、酵素は、ＰＣＲサイクルを通して持続
的に存在し、そしてさらなる添加を必要としなかった。
この時以来、他の好熱性由来のポリメラーゼもまた単離
されており、そして完全なサイクル反応において使用さ
れている。しかし、それらは、熱不活化への耐性におい
てより頑強であるにもかかわらず、これらのポリメラー
ゼは全て、変性に使用される温度での特定の酵素につい
ての半減期によって決定される各変性工程後に、特定の
レベルの不活化の限定に苦しむ。高い変性温度もまた、
加水分解によってｄＮＴＰ基質のレベルを減少し得、そ
して補充物に反応の効率または特異性を付加し得るタン
パク質の不活化を導く。
【０００８】完全なサイクルのＰＣＲの条件は、より低
い変性温度が使用され得るように改変されている。Ａｕ
ｅｒら（１９９６， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
２４；５０２１−５０２５、本明細書中で参考として援
用する）は、ｄＩＴＰ（ｄＧＴＰの天然の中性アナロ
グ）を使用する手順を記載している。この置換によっ
て、彼らは、それらのサンプルに存在し得る２本鎖ＤＮ
Ａの増幅を回避することに成功し、そしてＲＮＡ標的の
み増幅した。決して、ＤＮＡ標的の有用性の認識または
適用は存在しない。実際、彼らは、彼らの目的が、ＤＮ
Ａ標的をテンプレートとして使用することを避けること
である場合、教示する。彼らの教示は、ｄＩＴＰの置換
もまた、アニーリングに使用される温度（５０℃）にお
ける代償的な減少を必要とする、という限定を有する。
さらに、Ａｕｅｒらに記載される分野は、塩基対形成の
区別を欠くことが公知であるヌクレオチドアナログの使
用に依存し、それにより、増幅される配列に導入される
ランダムな変化の可能性を誘導する。これらの変化がプ
ライマー結合領域にある場合、それらはプライミング効
率における問題を引き起こし得、そして変化がプライマ
ー間の配列にある場合、変化は効率的な結合を可能にす
る検出プローブにおける困難を誘導し得る。本発明は、
正常なレベルの塩基対形成識別を示す塩基を用い得、そ
れにより先行技術の一部である変異原生事象を回避し得
る。
【０００９】遺伝子およびゲノムの核酸配列の決定は、
商業および非営利団体の研究室の両方における主要な働
きである。この目的に使用されている２つの基本的な系
は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７７，７
４，５６０−５６４）によって記載される塩基特異的切
断法、およびＳａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７７，７４，５４９
３−５４６７）によって記載されるジデオキシ法であ
る。前述の古典的な両方の文献を、本明細書中で参考と
して援用する。その使用の簡単さに起因して、後者の方
法が、より一般的に使用される。これらの両方の方法
は、最初に、配列情報を得るための放射活性基質に依存
した。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｔ配列決定につい
て、このことは、各鎖を末端標識し、次いで各標識化末
端を分離することによって最も一般的に行われた。Ｓａ
ｎｇｅｒ配列決定について、いずれかのプライマーが標
識されるか、または放射活性ｄＮＴＰが鎖伸長の間に取
り込まれる。配列データは、ポリアクリルアミドゲルの
電気泳動によって分離されている種々の長さの放射活性
標識されたＤＮＡバンドの位置のオートラジオグラフィ
ー決定によって生成された。
【００１０】より近年において、配列決定法は、非放射
活性標識の代替によって改良されている。これらの標識
についての非放射活性標識した潜在的な位置、およびそ
れらの使用の適用は、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔらによっ
て、米国特許第５，２４１，０６０号（これは、当初、
１９８２年に出願された）に記載される。このような標
識は、オリゴプライマー、または合成に使用される基質
（すなわち、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰヌクレオチド）
に存在し得る。シグナル生成部分は、蛍光標識化プライ
マーの使用によって例示されるように、直接作用し得る
か（Ｂｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． １９８９，１７；５１１５−５１２３）、または
ビオチン標識したプライマーの使用によって例示される
ように間接的に作用し得る（Ａｎｓｏｒｇｅら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９
８６，１３；３１５−３２３および）。さらに、ビオチ
ン化ヌクレオチドは、限定されたプライマー伸長の間に
取り込まれ得る（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＩｍａｇｅｓTM
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ １９９３ Ｕｎｉｔｅ
ｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｏｈｉ
ｏ）。前述の４つの文書を、本明細書中で参考として援
用する。限定された伸長は、ヌクレオチドにおける改変
によって生じるバンドシフトの量を規格化するために必
要である。
【００１１】しかし、プライマー標識は、その位置につ
いての適切な塩基の割り当てにおいて曖昧さを作製す
る、不適切な鎖終結を生じ得るテンプレート鎖におい
て、二次構造または問題性配列が存在し得るという限定
を有する。プライマーの伸長の間の標識化ｄＮＴＰの取
り込みもまた、この限定で苦しむ。この限定は、放射活
性または非放射活性標識が使用されるかどうかに関係な
く、有効である。
【００１２】この限定は、標識の供給源としての鎖終結
ヌクレオチド自体の選択によって回避されている。この
ことは、蛍光性標識化ｄｄＮＴＰについては、米国特許
第５，０４７，５１９号においてＨｏｂｂｓおよびＣｏ
ｃｕｚｚａによって、および米国特許第４，４２９，９
４７号においてＭｉｄｄｅｎｄｏｒｆらによって、そし
て蛍光アビジンによって後に標識されるビオチン標識化
ｄｄＮＴＰについては、米国特許第４，７２９，９４７
においてＭｉｄｄｅｎｄｏｒｆらによって記載されてい
る。（さらなる参照については、米国特許第５，０２
７，８８０号；同第５，３４６，６０３号；同第５，２
３０，７８１号；同第５，３６０，５２３号；および同
第５，１７１，５３４号を参照のこと）。前出の７つの
特許の各々を、本明細書中に参考として援用する。この
方法によって、シグナルは、鎖終結を組み込む鎖によっ
て作製される。ターミネーターヌクレオチドを組み込ま
ずに終結されている鎖の存在は、現在無関係である。な
ぜならそれらは、シグナルを生成し得ないからである。
しかし、この方法は、シグナル生成を提供するさらなる
化学基の存在が、標識化ターミネーターヌクレオチドの
取り込みに関するポリメラーゼについての立体的または
他の阻害性問題を生じ、それにより、反応の効率を減少
するという制限を有する（Ｐｒｏｂｅｒら、米国特許第
５，３３２，６６６号、本明細書中に援用される）。ビ
オチン化ジデオキシヌクレオチドは、シグナル生成を提
供するのに使用され得るが、これらの改変ターミネータ
ーは、それらの蛍光化対応物として同じ限定を共有する
（すなわち、最も一般的に使用されるポリメラーゼによ
る取り込みにおける困難）こと示唆されている（Ｓ．Ｂ
ｅｃｋ １９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ １８４；６１１、また、本明細書中で援用
する）。取り込みのこの非効率についてのいくつかの代
償は、反応におけるポリメラーゼの量を増加させるこ
と、および／またはコピーされるテンプレートＤＮＡの
量を増加させることによって達成され得る。これらの代
償的工程は、高価な酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）のより
高い量、または高品質のテンプレートの適切な量の調製
に関連して増加する費用の制限を受ける。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸増幅、
核酸配列決定、および重要な特徴（例えば、低減した熱
力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応
用可能である新規のプロセスを提供することを目的とす
る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の核酸配
列を直線的に増幅するためのプロセスを提供する。この
プロセスは、以下の工程：該特定の核酸配列、初期プラ
イマーまたは核酸構築物であって、以下の２つのセグメ
ント：（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定
の核酸配列に第１の部分に実質的に相補的であり、そし
て（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、
セグメント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、
（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、
（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一
であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的な配列
に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生
成され、そして第１のプライマー伸長を置換するよう
に、均衡（ｉｓｏｓｔａｔｉｃ）または限定サイクリン
グ条件下で、第２のプライマーまたは核酸構築物の第１
のセグメントの、続く該特定の核酸配列の該第１の部分
への結合を提供し得る、セグメントを含む、初期プライ
マーまたは核酸構築物；ならびに、基質、緩衝液、およ
びテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程；な
らびに、均衡または限定サイクリング条件下で該基質、
緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下
で、該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核
酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核
酸配列を直線的に増幅する工程、を包含する。
【００１５】１つの実施態様では、上記初期プライマー
または核酸構築物と上記第２のプライマーまたは核酸構
築物とは同じであり得る。
【００１６】１つの実施態様では、上記初期プライマー
または核酸構築物と上記第２のプライマーまたは核酸構
築物とは異なり得る。
【００１７】１つの実施態様では、上記第１のセグメン
トもしくは該第２のセグメントもしくは上記プライマー
伸長、または前述の任意のものは、少なくとも１つ改変
されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み
得る。
【００１８】１つの実施態様では、上記第２のセグメン
トは、上記プライマー伸長においてその相補体に対する
上記第１のセグメントの熱力学的安定性を増加する少な
くとも１つ改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド
アナログを含み得る。
【００１９】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログはインタ
ーカレート剤を含み得る。
【００２０】１つの実施態様では、上記第１のセグメン
トまたは上記プライマー伸長あるいはその両方は、少な
くとも１つ改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド
アナログを含み得る。
【００２１】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、その
相補体に対する上記第１のセグメントまたは上記プライ
マー伸長の熱力学的安定性を減少させ得る。
【００２２】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、負に
荷電した化学基を含み得る。
【００２３】１つの好ましい実施態様では、上記負に荷
電した化学基はカルボン酸を含み得る。
【００２４】１つの実施態様では、上記初期プライマー
もしくは核酸構築物、または上記第２のプライマーもし
くは核酸構築物、あるいはその両方は、直鎖状核酸、分
枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、あるいは
任意の前述の組み合わせを含み得る。
【００２５】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的
に増幅するためのプロセスを提供する。このプロセス
は、以下の工程：該特定の核酸配列、該特定の核酸配列
ついての第１の初期プライマーまたは核酸構築物であっ
て、該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が、以下
の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであっ
て、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相
補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１
の伸長をし得る、セグメント、および（Ｂ）第２のセグ
メントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に
非同一であり、そして（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２
の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグ
メントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２の
プライマー伸長が生成されて第１のプライマー伸長を置
換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、
続く第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメ
ントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提
供し得る、セグメント、を含む；ならびに、該特定の核
酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸
構築物であって、該続く初期プライマーまたは該核酸構
築物が、以下の２つのセグメント、（Ａ）第１のセグメ
ントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に
実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依
存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および（Ｂ）
第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメント
に実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の
第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２の
セグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第
２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプライマ
ー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング
条件下で、続くプライマーの第１のセグメントの、該特
定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セ
グメント、を含む：ならびに基質、緩衝液、およびテン
プレート依存性重合化酵素；を提供する工程：ならびに
均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝
液、またはテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、
該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構
築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配
列を非線形に増幅する、工程、を包含する。
【００２６】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーまたは核酸構築物と上記第２の初期プライマーま
たは核酸構築物とは同じであり得る。
【００２７】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーまたは核酸構築物と上記第２の初期プライマーま
たは核酸構築物とは異なり得る。
【００２８】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーまたは核酸構築物の上記第１のセグメントまたは
上記第２のセグメント、上記第２の初期プライマーまた
は核酸構築物の上記第１のセグメントまたは上記第２の
セグメント、および上記プライマー伸長、または前述の
任意のものからなる群から選択される少なくとも１つの
メンバーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチド
またはヌクレオチドアナログを含み。
【００２９】１つの好ましい実施態様では、上記第１の
初期プライマーまたは上記第２の初期プライマーまたは
その両方の上記第２のセグメントは、上記プライマー伸
長における上記第１のセグメントのその相補体に対する
熱力学的安定性を増加させる少なくとも１つの改変され
たヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得
る。
【００３０】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログはインタ
ーカレート剤を含み得る。
【００３１】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーの上記第１のセグメント、または上記第２の初期
プライマーの上記第１のセグメント、またはその両方、
またはそれらのプライマー伸長、またはそれらの任意の
組合せは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドま
たはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００３２】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、上記
第１のセグメントまたは上記プライマー伸長、またはそ
の両方の、その相補体に対する熱力学的安定性を減少さ
せ得る。
【００３３】１つのさらに好ましい実施態様では、上記
改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
は、負に荷電した化学基を含み得る。
【００３４】１つのさらにまた好ましい実施態様では、
上記負に荷電した化学基は、カルボン酸を含み得る。
【００３５】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーまたは核酸構築物、あるいは上記第２の初期プラ
イマーまたは核酸構築物、あるいはその両方が、直鎖状
核酸、分枝核酸、逆方向核酸およびペプチド−核酸、ま
たは前述の任意のものの組合せからなる群から選択され
る核酸を含み得る。
【００３６】本発明はさらにまた、特定の核酸配列を非
直線的に増幅するためのプロセスを提供する。このプロ
セスは、以下の工程：該特定の核酸配列およびその相補
体；該特定の核酸配列のための第１の初期プライマーま
たは核酸構築物、ここで該第１の初期プライマーまたは
核酸構築物が、以下の２つのセグメント：（Ａ）第１の
セグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の
部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレ
ート依存性の第１の伸長が可能であるセグメント、およ
び（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセ
グメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核
酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）
該第２のセグメントの相補的な配列へ結合し得、そして
（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されそして該第１
のプライマー伸長を置換するような、均衡または限定サ
イクリング条件下で、続く第１のプライマーの第１のセ
グメントの該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を
提供し得る、セグメントを含む；および該第１のプライ
マー伸長に対して相補的な第２の初期プライマーまたは
核酸構築物、ここで該第２の初期プライマーまたは核酸
構築物が、均衡または限定サイクリング条件下で、テン
プレート依存性の伸長をし得ることを特徴とするセグメ
ントを含む；ならびに基質、緩衝液、およびテンプレー
ト依存性の重合化酵素；を提供する工程、均衡または限
定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、およびテン
プレート依存性の重合化酵素の存在下で、該特定の核酸
配列および上記新規プライマーまたは核酸構築物をイン
キュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非直線
的に増幅する工程、を包含する。
【００３７】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーまたは核酸構築物の上記第１のセグメントまたは
上記第２のセグメント、上記第２の初期プライマーまた
は核酸構築物の該セグメント、および該プライマー伸
長、または前述の任意のものからなる群から選択される
少なくとも１つのメンバーは、少なくとも１つの改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得
る。
【００３８】１つの好ましい実施態様では、上記第１の
初期プライマーの上記第２のセグメントは、上記プライ
マー伸長において上記第１のセグメントのその相補体に
対する熱力学的安定性を増加させる少なくとも１つの改
変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含
み得る。
【００３９】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、イン
ターカレート剤を含み得る。
【００４０】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーの上記第１のセグメントまたは上記第２の初期プ
ライマーの上記セグメント、またはその両方、またはそ
れらのプライマー伸長、またはそれらの任意の組合せ
は、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌ
クレオチドアナログを含み得る。
【００４１】１つの好ましい実施態様では、上記改変さ
れたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、上記
第１のセグメントまたは上記プライマー伸長、またはそ
の両方の、その相補体に対する熱力学的安定性を減少さ
せ得る。
【００４２】１つのさらに好ましい実施態様では、上記
改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
は、負に荷電した化学基を含み得る。
【００４３】１つのさらにより好ましい実施態様では、
上記負に荷電した化学基は、カルボン酸を含み得る。
【００４４】１つの実施態様では、上記第１の初期プラ
イマーまたは核酸構築物、あるいは上記第２の初期プラ
イマーまたは核酸構築物、あるいはその両方は、直鎖状
核酸、分枝核酸、逆方向核酸およびペプチド−核酸、ま
たは前述の任意のものの組合せからなる群から選択され
る核酸を含み得る。
【００４５】本発明はさらに、特定の核酸配列を非直線
的に増幅するためのプロセスを提供する。このプロセス
は、以下の工程：該特定の核酸配列；非直線的な増幅が
可能な単一のプライマーまたは単一の核酸構築物であっ
て、以下の３つのセグメント：（ａ）第１のセグメント
であって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質
的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性
の第１の伸長が可能である、セグメント；（ｂ）該特定
の核酸配列の第２の部分に実質的に同一である第２のセ
グメント；および（ｃ）該第１のセグメントに実質的に
同一である第３のセグメント；を含み、ここで、上記第
１のプライマー伸長は該第２のセグメントにハイブリダ
イズし得、そして該第３のセグメントに対する相補体を
生成するように自己プライミングおよび自己伸長し得る
配列を生成し得る、および基質、緩衝液、およびテンプ
レート依存性の重合化酵素；を提供する工程、ならびに
該基質、緩衝液およびテンプレート依存性の重合化酵素
の存在下で、該特定の核酸配列および該プライマーまた
は核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定
の核酸配列を非直線的に増幅する工程、を包含する。
【００４６】１つの実施態様では、上記プロセスは、均
衡条件、限定サイクリング条件、および完全なサイクリ
ング条件からなる群から選択される条件下で行われ得
る。
【００４７】１つの実施態様では、上記第１のセグメン
ト、上記第２のセグメント、上記第３のセグメント、上
記第１のプライマー伸長、上記第２のプライマー伸長、
または前述の任意のものからなる群から選択されるメン
バーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまた
はヌクレオチドアナログを含み得る。
【００４８】１つの実施態様では、上記単一プライマー
または核酸構築物は、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核
酸、およびペプチド−核酸、または前述の任意のものの
組合せからなる群から選択される核酸を含み得る。
【００４９】１つの実施態様では、上記第１のセグメン
ト、上記第２のセグメント、上記第３のセグメント、上
記第１のプライマー伸長および上記自己プライミング伸
長、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択さ
れるメンバーは、少なくとも１つの改変されたヌクレオ
チドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。
【００５０】１つの実施態様では、上記第１のプライマ
ー伸長は、限定された基質条件、限定された伸長持続時
間、またはその両方からなる群から選択される条件下で
行われ得る。
【００５１】１つの好ましい実施態様では、上記特定の
核酸配列は、１本鎖または２本鎖の形態であり得る。
【００５２】１つの好ましい実施態様では、上記特定の
核酸配列は、フラグメント中に見出されるかまたは含ま
れている。
【００５３】１つのより好ましい実施態様では、上記フ
ラグメントは、物理的手段、化学的手段、物理化学的
（ｐｈｙｓｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ）手段、および酵素
的手段、またはそれらの組合せからなる群から選択され
る手段によって生成され得る。
【００５４】１つのさらに好ましい実施態様では、上記
物理的手段は、超音波処理および加熱、またはその両方
からなる群から選択され得る。
【００５５】１つのさらにまた好ましい実施態様では、
上記化学的手段は酸処理を含み得る。
【００５６】１つのよりさらに好ましい実施態様では、
上記酵素的手段は、ヌクレアーゼおよび制限酵素によっ
てまたはそれらを用いて行われ得る。
【００５７】１つのよりさらに好ましい実施態様では、
上記ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼを含み得る。
【００５８】本発明はさらにまた、核酸の配列決定のた
めの終結後標識プロセスを提供する。このプロセスは、
以下の工程：タグ化されていないまたは標識されていな
い基質、タグ化されていないまたは標識されていないプ
ライマー、重合化酵素、緩衝液、およびそれぞれのヌク
レオチド塩基についての適切なタグ化されていないまた
は標識されていないターミネーターの存在下で、目的の
該核酸配列に対応する核酸フラグメントを生成する工程
であって、ここで、該ターミネーターのそれぞれは、内
部配列が該タグ化分子に対して実質的に非反応性であ
り、そして該化学反応が媒体またはマトリックス中で該
フラグメントの分離を実質的に妨げないような条件下
で、タグ化分子と共有結合する化学的な反応基を含む工
程；媒体またはマトリックス中で生成された該フラグメ
ントを分離する工程；および該媒体またはマトリックス
中で該タグ化分子を検出することによって該分離された
フラグメントを検出する工程、を包含する。
【００５９】１つの実施態様では、上記生成工程の、上
記ターミネーターの上記化学的反応基は、生成されそし
て任意のタグ化分子に共有結合する前に脱保護された上
記フラグメントへの酵素的取り込み前に保護され得る。
【００６０】１つの実施態様では、上記生成工程の、上
記化学的反応基は、窒素、硫黄または酸素原子を含み得
る。
【００６１】１つの実施態様では、上記ターミネーター
上の上記化学的反応基は、異なり得る。
【００６２】１つの実施態様では、上記ターミネーター
上の上記化学的反応基は、同じであり得る。
【００６３】１つの実施態様では、上記生成工程の、上
記タグ化分子は、それぞれのターミネーターと同じであ
り得る。
【００６４】１つの実施態様では、上記生成工程の、上
記タグされた分子は、それぞれのターミネーターと異な
り得る。
【００６５】１つの実施態様では、上記タグ化分子は、
蛍光色素、化学発光色素、赤外色素、化学発光実体およ
び電気化学発光実体、またはそれらの組合せからなる群
から選択され得る。
【００６６】１つの実施態様では、上記分離工程は、電
気泳動的に行われ得る。
【００６７】１つの実施態様では、上記分離工程の上記
媒体またはマトリックスは、ゲルを含み得る。
【００６８】１つの実施態様では、上記ゲルは、ポリア
クリルアミドゲルを含み得る。
【００６９】１つの実施態様では、上記分離工程は、キ
ャピラリーゲル電気泳動によって行われ得る。
【００７０】１つの実施態様では、上記検出工程は、光
度測定、分光光度測定、比色定量測定、蛍光定量測定、
遅延蛍光測定および化学発光測定、またはそれらの組合
せから選択される手段によって行われ得る。
【００７１】本発明はまた、相補的な配列に対する減少
した熱力学的安定性を有する核酸配列を生成するプロセ
スを提供する。このプロセスは、負に荷電した化学部分
を有する少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまた
はヌクレオチドアナログを、該生成された核酸配列へと
組み込む工程を包含する。
【００７２】本発明はさらにまた、直鎖状核酸、分枝核
酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述の
任意のものの組合せからなる群から選択される１本鎖ま
たは２本鎖の核酸ポリマーを提供する。ここでこの核酸
ポリマーは、１つまたは両方の鎖において１つの負に荷
電した化学部分を含む少なくとも１つのプリンまたはピ
リミジン塩基を含む。
【００７３】本発明は、特定の核酸配列を直線的に増幅
するためのプロセスを提供する。最初に、増幅されるこ
とが求められている目的の特定の核酸配列、最初のプラ
イマーまたは２つのセグメントを含む核酸構築物が提供
される。第１セグメント（Ａ）は独特であり、（ｉ）特
定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的、および
（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特
徴づけられる。第２セグメント（Ｂ）は、以下の４つの
事項において独自に特徴づけられる。第１に、これは、
（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、
これは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に
同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉ
ｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、
第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｖ）均衡または限定サイ
クル条件下で、第２プライマーの第１セグメントまたは
核酸構築物の、特定の核酸配列の第１部分への後続の結
合を提供し得る。この方法において、第２プライマー伸
長が生成され、そして第１プライマー伸長を置換する。
また、この方法において提供されるのは、基質、緩衝
液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素である。
この増幅プロセスを行うために、特定の核酸配列および
新規のプライマーまたは核酸構築物を、基質、緩衝液、
およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、
均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートす
る；それにより、この特定の核酸配列が直線的に増幅さ
れる。
【００７４】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的
に増幅するプロセスを提供する。このプロセスにおい
て、増幅されることが求められている目的の特定の核酸
配列、第１初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列
のための核酸構築物、後続の初期プライマーまたは目的
の特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物、ならび
に基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化
酵素が提供される。第１初期プライマーまたは核酸構築
物は、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）
は独特であり、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実
質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存
性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメ
ントもまた独特であり、以下の４つの特徴で特徴づけら
れる。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと実質的
に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配
列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグ
メントは、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合
し得る。第４に、第２セグメントは、（ｉｖ）均衡また
は限定サイクル条件下で、第２プライマーの第１セグメ
ントまたは核酸構築物の、特定の核酸配列の第１部分へ
の続く結合を提供し得る。この方法において、第１プラ
イマー伸長を置換するために、第２プライマー伸長を生
成する。後続の初期プライマーまたはこの特定の核酸配
列の相補体に対する核酸構築物はまた、２つのセグメン
トを含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸
配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉ
ｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づ
けられる。第２セグメント（Ｂ）は、以下の４つの特徴
で独特に特徴づけられる。第１に、第２セグメント
（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でな
い。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部
分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント
（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合
し得る。第４に、それは、（ｉｖ）均衡または限定サイ
クル条件下で、後続のプライマーの第１セグメントの、
特定の核酸配列の第１部分への後続の結合を提供し得
る。このような条件下およびこの方法において、第１プ
ライマー伸長を置換する第２プライマー伸長が生成され
る。このプロセスを行うために、特定の核酸配列および
新規のプライマーまたは核酸構築物が、基質、緩衝液、
およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、
均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートされ
る；それにより、目的の特定の核酸配列が非直線的に増
幅される。
【００７５】また、本発明によって提供されるのは、特
定の核酸配列を非直線的に増幅するプロセスである。こ
の非直線的増幅プロセスにおいて、増幅されることが求
められている目的の特定の核酸配列およびその相補体が
提供される。また、第１初期プライマーまたは特定の核
酸配列のための核酸構築物が提供され、この第１初期プ
ライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含
む。第１セグメント（Ａ）は２つの有用かつ新規の特徴
を有する。第１に、それは、（ｉ）特定の核酸配列の第
１の部分に実質的に相補的である。第２に、第１のセグ
メントは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能
である。第２セグメント（Ｂ）は、４つの有用かつ新規
の特徴を有する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメン
トと実質的に同一でない。第２に第２セグメント（Ｂ）
は、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一
である。第３に、それは、（ｉｉｉ）第２セグメントの
相補配列に結合し得る。第４に、第２セグメント（Ｂ）
は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、続く第
１プライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第
１の部分への続く結合を提供し得る。このような条件下
およびこの方法において、第１プライマー伸長を置換す
る第２プライマー伸長が生成される。また、このプロセ
スにおいて提供されるのは、第２初期プライマーまたは
第１プライマー伸長に相補的な核酸構築物である。第２
初期プライマーまたは核酸構築物は、代表的には、均衡
または限定サイクル条件下で、テンプレート依存性伸長
を可能にすることによって特徴づけられる単一のセグメ
ントを含む。適切な基質、緩衝液、およびテンプレート
依存性ポリマー化酵素もまた提供される。本発明のこの
プロセスを行うために、特定の核酸配列および新規のプ
ライマーまたは核酸構築物が、適切な基質、緩衝液、お
よびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、均
衡または限定サイクル条件下で、インキュベートされ
る。これらの条件下で行われるこのようなインキュベー
ションの下で、目的の特定の核酸配列が、非直線的に増
幅される。
【００７６】本発明はさらに、増幅されることが求めら
れている目的の特定の核酸配列を非直線的に増幅するた
めのプロセスを提供する。この新規のプロセスにおい
て、目的の特定の核酸配列が提供され、各プライマーま
たは各核酸構築物は、非直線的増幅され得、そして３つ
のセグメントを含む。第１セグメント（ａ）は、（ｉ）
特定の核酸配列の第１部分に実質的に相補的であり、そ
して（ｉｉ）テンプレート依存的に第１伸長し得る。第
２セグメント（ｂ）は、特定の核酸配列の第２部分に実
質的に同一である。第３セグメント（ｃ）は、第１セグ
メントに実質的に同一である。第１プライマー伸長は、
上記の第２セグメントにハイブリダイズし得る配列を生
成し得、そしてまた、第３セグメントに対する相補体を
生成するように自己プライミングおよび自己伸長し得
る。また、提供されるのは、適切な基質、緩衝液、およ
びテンプレート依存性ポリマー化酵素である。この増幅
プロセスを行うために、特定の核酸配列およびプライマ
ーまたは核酸構築物が、適切な基質、緩衝液、およびテ
ンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下でともにイン
キュベートされる。目的の特定の核酸配列は、それによ
り、非直線的に増幅される。
【００７７】また、手近に本発明によって提供されるの
は、核酸配列決定のための終結後標識プロセスである。
ここで、このプロセスは、未タグ化または未標識化基
質、未タグ化または未標識化プライマー、ポリマー化酵
素、緩衝液、および各ヌクレオチド塩基についての適切
な未タグ化または未標識化ターミネーター、配列が求め
られている目的の核酸配列に対応する核酸フラグメント
の存在下で生成される第１工程を含む。このプロセスに
おいて、ターミネーターの各々は、内部配列がタグ化分
子に対して実質的に非反応性であり、そして化学反応
が、実質的に、媒体またはマトリックスにおけるフラグ
メントの分離に影響しないような条件下で、タグ化分子
に共有結合する化学反応基を含む。フラグメントの生成
の後、後者は媒体またはマトリックスにおいて分離さ
れ、続いて分離されたフラグメントの検出が、媒体また
はマトリックスにおけるタグ化分子の検出によって達成
される。
【００７８】本発明によって提供される別のプロセス
は、相補配列に対する熱力学安定性を減少した核酸配列
を生成するためのプロセスである。このプロセスにおい
て、負に荷電した化学部分を有する少なくとも１つの改
変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、生成さ
れる核酸配列に取り込まれる。
【００７９】本発明の他の局面に加えて、直鎖状核酸、
分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸またはそ
れらの任意の組合せからなる群より選択される１本鎖ま
たは２本鎖核酸ポリマーが提供される。この核酸ポリマ
ーは、ポリマーの片方また両方の鎖において１つの負に
荷電した化学部分を含む少なくとも１つのプリンまたは
ピリミジン塩基を含む。
【００８０】これらのプロセスおよびポリマーの全て
は、以下により詳細に記載される。
【００８１】
【発明の実施の形態】以下の定義は、本発明および本開
示の理解に有用である。 定義 均衡条件は、実質的に定常な温度および／または化学条
件をいう。
【００８２】限定サイクル条件は、使用される最高温度
が、そのテンプレートから伸長プライマーを分離するの
に必要な温度以下である一連の温度をいう。
【００８３】完全なサイクル条件は一連の温度をいい、
ここで、そのテンプレートから伸長プライマーを分離す
るのに十分な、少なくとも１つの温度が使用される。
【００８４】直線的増幅は、核酸の１つの鎖のみの２つ
以上のコピーが生成される場合に行われる。
【００８５】非直線的増幅は、核酸配列の２つ以上のコ
ピーが、核酸およびその相補体の各鎖から生成される場
合に行われる。
【００８６】初期プライマーは、伸長されていないプラ
イマーまたはプライマー構築物である。
【００８７】標準的なプライマーは、伸長後に合成され
る配列での二次構造形成に実質的に関与しないプライマ
ーである。
【００８８】伸長配列が、プライマーまたはプライマー
構築物における任意の配列に実質的に同一でも相補的で
もない、テンプレート依存性様式において合成された配
列である。
【００８９】核酸のセグメントは、上記の他のセグメン
トの相補体が、上記の第１セグメントの伸長のためのテ
ンプレートとして作用し得る場合に、別のセグメントに
実質的に同一である。
【００９０】本発明は、ａ）自己相補的配列を有する
か、またはテンプレート依存性伸長後に二次構造を形成
し得る少なくとも１つのセグメントを含み、そしてｂ）
適切な条件下で適切な特定のテンプレートの存在下で、
適切な条件下で特定の核酸配列の２つ以上のコピーを生
成し得る、新規のプライマーおよび核酸構築物のための
組成物および使用法を提供する。
【００９１】特定の核酸配列の合成のためのプライマー
結合および伸長反応を使用する標的増幅の全ての方法
は、この配列の２つ以上のコピーが所望される場合、結
合部位を再生するか、または新たなプライマー結合部位
を合成する必要性を有する。以前に記載されている当該
分野の全ての方法において、外側調節因子が、プライマ
ー結合部位を再生または作製するために使用されてい
る。これらの因子としては、ＰＣＲによって例示される
ような熱変性、３ＳＲによって例示されるようなエンド
ヌクレアーゼ、およびＳＤＡによって例示されるような
制限酵素および改変ヌクレオチドが挙げられている。
【００９２】本発明の特定の局面において、新規のプラ
イマーおよび核酸構築物が開示され、これらは、新規の
プライマーまたは核酸構築物の少なくとも１つのセグメ
ントが、適切な条件下で二次構造形成し得るという固有
の特徴を有する。本発明において、二次構造の形成は、
結合部位の再生を提供し得、その結果それらは、上記の
外側調節因子のいずれも必要とせずに、新規のプライマ
ーまたは核酸構築物の複数の結合および伸長のために使
用され得る。
【００９３】先行技術において、非直線的な増幅を達成
するために、標的核酸の各相補鎖において、プライマー
結合部位の存在が必要である。本発明の特定の局面にお
いて、二次構造の形成はこの限定を克服し、その結果、
片方の核酸鎖にのみ相補的であるが、他方には相補的で
なく、しかしなお所望の核酸配列の非直線的増幅を行い
得る単一のプライマーが使用され枝る。
【００９４】本発明の新規のプライマーおよび核酸構築
物は、均衡、限定サイクル、または完全サイクル条件下
で、単一のプライマーまたは１つより多いプライマーを
必要とする、直線的および非直線的な増幅系において使
用され得る。二次構造の形成能は、新規のプライマーま
たは核酸構築物における自己相補的配列の存在に起因す
るか、または新規のプライマーのセグメントまたは核酸
構築物に相補的な配列の、テンプレート依存性取り込み
に由来し得る。また、これは、既存および合成後の配列
の両方にも由来し得る。本発明の新規のプライマーおよ
び核酸構築物は、単一の極性を有する線状分子、１つよ
り多い極性または分枝核酸を有する構築物であり得る。
このような構築物の合成の方法および使用例は、以前に
開示されている（米国特許出願第０８／７４９，２６６
号；米国特許第５，４６２，８５４号、両方の文書を本
明細書中で援用する）。本発明の特定の局面において、
新規のプライマーおよび核酸構築物は、少なくとも２つ
のセグメントを含む：テンプレートに結合し得、そして
伸長のためにそれを使用し得る第１セグメント、および
目的の標的の配列に実質的に同一であり、その結果、第
１セグメントの伸長が伸長配列を有する第２セグメント
の自己ハイブリダイゼーションによって形成される二次
構造の形成を可能にする第２セグメント。本発明の特定
の局面において、新規のプライマーおよび核酸構築物
は、少なくとも３つのセグメントを含む：上記のように
規定された第１および第２セグメント、ならびに自己伸
長のための鎖内または構造内テンプレートとして作用し
得る第３セグメント。
【００９５】セグメントは、共有または非共有のいずれ
かで互いに結合され得る。共有結合を介してセグメント
を結合する手段としては、正常な直線核酸のリン酸骨
格、１つより多い極性および分枝したＤＮＡ構築物を有
する構築物が挙げられ得るがこれらに限定されない。こ
れらの構築物を合成するための方法は、米国特許出願第
０８／７４９，２６６号（１９９６年１１月１５日出
願、その内容を本明細書中で援用する）に記載されてい
る。非共有結合によりセグメントを結合する手段として
は、リガンド−レセプター結合および相補的塩基対形成
が挙げられ得るがこれに限定されない。セグメントは、
互いに隣接し得るか、または互いに空間的に離れ得る。
セグメントの配列は、互いに区別され得るか、または互
いに実質的もしくは部分的に相補もしくは同一であり得
る。
【００９６】有用な二次構造の形成は、本発明の新規の
プライマーおよび核酸構築物の設計においてさらなるエ
レメントによって増強され得る。例えば、伸長依存性二
次構造がより容易に形成されることを可能にし得る二次
構造が、本発明の新規のプライマーの配列に導入され得
る。補充的なエレメントもまた、適切な二次構造の形成
を好むように反応混合物中に含まれ得る。これらのエレ
メントとしては、１本鎖結合タンパク質、Ｔ４遺伝子３
２タンパク質、ＲｅｃＡタンパク質、および種々のヘリ
カーゼのようなタンパク質が挙げられ得るがこれらに限
定されない。これらのエレメントとしてはまた、ホルム
アミドまたはＤＭＳＯのような化学試薬が挙げられ得る
がこれらに限定されない。これらのエレメントとしては
また、核酸配列のＴｍを上昇させるか低くするかのいず
れかの改変ヌクレオチドが挙げられ得るがこれらに限定
されない。改変ヌクレオチドは、新規のプライマーおよ
び核酸構築物に予め存在し得、伸長反応の間に取り込ま
れ得るかその両方であり得る。
【００９７】本発明の種々の新規のプライマーおよび新
規の核酸構築物は、以前の系の多くの制限を克服する。
当該分野において以前に記載されているサーモサイクラ
ーの使用に依存する方法とは対照的に、本発明の特定の
局面は、新たなプライミング事象の前に、鎖分離事象の
必要がない。さらに、本発明は、複数の酵素配置、リボ
ヌクレオチド、またはＲＮＡ中間体（例えば、３ＳＲ、
ＮＡＳＢＡ、およびＴＭＡ）の生成に依存する等温系に
内在するようなプロモーター配列の存在を必要としな
い。等温ＳＤＡ系について記載されているような、難解
な改変試薬および補充的制限酵素のいずれも必要ではな
い。
【００９８】また、本発明に含まれるのは、核酸の標識
のために使用され得る新規の方法および組成物である。
これらは、本発明の種々の局面と組み合わせて使用され
得るか、または先行技術に記載される方法と組み合わせ
て使用され得る。
【００９９】本発明は、増幅されることが求められる目
的の特定の核酸配列を直線的に増幅するプロセスを提供
する。このようなプロセスは、以下の成分および試薬を
提供する工程を包含する：目的の特定の核酸配列、２つ
のセグメントを含む初期プライマーおよび核酸構築物、
ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存
性重合化酵素。初期プライマーまたは核酸構築物の２つ
のセグメントは、（Ａ）２つの規定された特徴を有する
第１セグメントを含む。第１に、それは、（ｉ）特定の
核酸配列の第１部分に実質的に相補的であり、そして第
２に、それは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長を
可能にする。第２セグメント（Ｂ）は、４つの規定され
た特徴を有する。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、
（ｉ）第１セグメントに実質的に非同一である。次に、
それは（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分に実質的に同
一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉ
ｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、
この第２セグメントは、（ｉｖ）均衡または限定サイク
リング条件下で、第２プライマーまたは核酸構築物の第
１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結
合を提供し得る。そうすることにおいて、第２プライマ
ー伸長が生成され、そしてそれは第１プライマー伸長を
置換する。この直線的増幅プロセスの別の重要な工程
は、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸
構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依
存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクリン
グ条件下でインキュベートすることである；それによ
り、増幅されることが求められる目的の特定の核酸配列
が直線的に増幅される。
【０１００】記載したばかりのプロセスの他の局面にお
いて、初期プライマーまたは核酸構築物と第２プライマ
ーまたは核酸構築物とは、同じであり得るか、または異
なり得る。さらに、少なくとも１つの改変ヌクレオチド
またはヌクレオチドアナログは、有用には、プロセスの
種々の成分またはエレメント（第１セグメント、第２セ
グメント、またはプライマー伸長産物、またはこの様式
のための前述のエレメントのいずれかを含む）に取り込
まれ得る。このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオ
チドアナログは、有用には、上記の第２セグメントに取
り込まれ得る。有用には、第２セグメントに取り込まれ
る場合、このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチ
ドアナログは、プライマー伸長におけるその相補体に対
する第１セグメントの熱力学安定性を増加させる。改変
ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、例えば、
インターカレート剤を含み得る。
【０１０１】当業者は、第１セグメントまたはプライマ
ー伸長産物、これらのエレメントの両方が、少なくとも
１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを
含み得ることを認識する。このような場合において、改
変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、その相
補物に対する第１セグメントまたはプライマー伸長産物
の熱力学安定性を減少させる。このような熱力学安定性
を減少させる改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナ
ログは、例えば、カルボン酸のような負に荷電した化学
基を含む。
【０１０２】核酸形態に関して、初期プライマーまたは
核酸構築物あるいは第２プライマーまたは核酸構築物
（または両方のプライマーおよび核酸構築物）は、多数
の核酸を含み得る。これらは、直鎖状核酸、分枝核酸、
逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前述のいず
れかの組合せを含むがこれらに限定されない。直線的増
幅のさらなる説明を、すぐ下に記載する。
【０１０３】（１つのステムループ形成プライマーとの
直線的増幅）本発明の１つの局面において、特定の核酸
配列の直線的増幅は、均衡または限定サイクリング条件
下で、少なくとも２つのセグメントを有する新規の単一
のプライマーまたは新規の単一の核酸構築物の使用によ
って行われる。本発明の新規の核酸構築物は、１つより
多い極性を有し得るか、またはそれらは分枝ＤＮＡであ
り得る。これらの構築物を合成するための方法は、米国
特許出願第０８／７４９，２６６号（先に引用および本
明細書中で援用される）に記載されている。新規のプラ
イマーおよび核酸構築物の第１セグメントは、標的核酸
配列に存在する配列に実質的に相補的である配列を含
む。新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメン
トは、標的核酸に存在する配列に実質的に同一である配
列を含む。新規の核酸構築物は、第１セグメントおよび
第２セグメントの１つ以上のコピーを有し得る。新規の
プライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長
は、自己ハイブリダイゼーションによって形成されるス
テムループ構造、ならびに新規のプライマーまたは核酸
構築物を含む配列に同一または相補的でない伸長配列を
有する産物を作製し得る。
【０１０４】この産物は、図１に例示される、連続する
一連の以下の工程によって、形成され得る。新規のプラ
イマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、
この新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメン
トを含む配列に相補的である伸長部分配列において生成
する。これらの自己相補性領域は、テンプレートに結合
しままであり得るか、または自己相補性構造を形成し得
る。二次構造の形成は、テンプレートからの、伸長した
新規のプライマーの第１セグメントの全てまたは一部の
除去を提供し得る。このことは、別の初期プライマー
が、テンプレートからの新規の第１伸長プライマーの除
去の前に、テンプレート配列に結合することを可能にす
る。テンプレート上の第２プライマーの伸長は、テンプ
レートからの第１伸長プライマーの置換を導き得る。こ
のことは、伸長プライマーの分離が、別の結合および伸
長反応のためのテンプレートの使用の前に常に起こる先
行技術とは対照的である。これらの手段によって、単一
のテンプレートは、均衡条件下で、２つ以上の初期事象
を提供し得る。さらに、この方法は、全ての温度が伸長
産物およびそのテンプレートのＴｍのものを下回る、限
定サイクル条件下で使用され得る。連続するプロセスに
おいて、新規の第２伸長プライマーにおける二次構造の
形成は、新規の第３プライマーの結合および続く伸長を
提供し得る。このようにして、変性条件の非存在下にお
いて、本発明の新規のプロセスは、核酸テンプレートの
単鎖からの多重プライミング、伸長、および遊離事象を
提供し得る。さらに、これらの工程の全ては、均衡条件
下で、同時および連続的に起こり得る。
【０１０５】複数の同一の第１セグメントおよび第２セ
グメントを有する新規の核酸構築物はまた、図１に示さ
れている同じプロセスによって直線的増幅を行うために
使用され得る。この新規の構築物は、潜在的に、１つの
極性を有する線状構築物と比較して、効率の増加に恵ま
れている。構築物分子の第１セグメントの１つの結合お
よび伸長は、再生されたプライマー結合部位に結合し得
る構築物の他の第１セグメントの局在化高濃度を生じ
る。複数のプライミングおよび伸長反応の後、１本鎖で
ある標的ＤＮＡの複数のコピーを含む構築物が作製され
得る。
【０１０６】新規の伸長プライマーおよび核酸構築物
の、自己相補性構造を形成する能力は、適切な条件下で
実現化され得る。先行技術は、その特徴が短い相補性オ
リゴヌクレオチドの会合および解離が、温度、塩条件、
塩基含有量、および相補配列の長さによって決定される
平衡反応として生じることを示している。これらの要因
の影響は、Ｊ．Ｇ．Ｗｅｃｈｓｌｅｒ（［１９９１］
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２６；２７７−２５９、本明細書中で援用する）に
よって概説されている。相補性ＤＮＡの大きな方の鎖
は、広範な条件にわたって容易に解離しない安定な立体
配置における２本鎖分子として存在するが、それらは、
鎖間結合の一時的および局在した弛緩を形成することが
周知である。用語「呼吸」は、水素結合のこの局在化破
壊を説明するために使用されている。パリンドローム配
列を含む２本鎖ＤＮＡ分子における二次元構造を作製す
る「呼吸」のための経路は、Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇおよ
びＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒによって、「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ，第２版」（１９９２）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． ＮＹ，ＮＹ（その内容を本明
細書中で参考として援用する）に記載されている。
【０１０７】本発明において、上記のように、線状２本
鎖分子のセグメントの、鎖内ステムループ構造への転移
は、プライマー開始事象を、伸長プライマーのそのテン
プレートからの分離の前に起こることを可能にし得る。
これらの２つの構造の間の平衡は、多数の要因に依存す
る。第１に、首尾良いプライマー結合のために、標的に
結合する初期プライマーのセグメントは、反応に使用さ
れる温度で、安定なプライミングが可能であるように適
切な長さおよび塩基組成でなければならない。第２に、
初期プライマーの伸長後に自己ハイブリダイゼーション
に関与するプライマーのセグメントは、適切な長さおよ
び塩基組成でなければならず、その結果伸長されたプラ
イマーのテンプレートからの部分解離は、十分に安定な
二次構造の形成（すなわち、ステムループ構造のステ
ム）を可能にし得る。
【０１０８】これらの反応に適切な温度は、伸長プライ
マーのそのテンプレートからの分離に必要な温度を下回
る。均衡反応において、単一の温度が、結合、伸長、お
よび二次構造形成に使用され得る。または所望される場
合、これらの事象を至適化するために異なる温度が使用
される、限定サイクル条件が使用され得る。限定サイク
リングのための異なる温度の使用は、プライマー結合、
プライマー伸長、または伸長産物のいくつかのそのテン
プレートからの局在化分離に有用であり得る。これらの
工程のいずれかおよび全てに使用される温度もまた、反
応において使用される特定のポリメラーゼに適切である
べきである。
【０１０９】伸長プライマーにおける分子内相補領域
は、ＰＣＲ増幅に単一のプライマーの使用を可能にする
ために、標的核酸の各鎖において同一の結合部位を提供
するようにＲｏｓｅら（米国特許第５，５９５，８９１
号、同第５，６１２，１９９号、両方を本明細書中で援
用する）によって以前に利用されている。しかし、Ｒｏ
ｓｅらによって提供されたすべての例および教示は、次
のプライマー結合および伸長事象のためのテンプレート
の使用の前にそのテンプレートから伸長プライマーを分
離するために、加熱工程（すなわち、サーモサイクラー
における完全な変性の複数のサイクル）を必要とする。
１本鎖ＲＮＡでの研究は、ループのサイズが増加するに
つれて鎖内ステム形成の減少した機会が存在することを
示している（Ｒ．Ｌ Ｐ．Ａｄａｍｓら、「Ｔｈｅ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ」［１９９２］ Ｃｈａｐｍａｎ ＆
Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．、本明細書中で
援用する）。なお、Ｒｏｓｅらによって提供された、プ
ライマー部位として天然または人工的のいずれかで導入
された逆方向反復配列を用いるＰＣＲ増幅のための方法
は、ステムループ構造のステムを形成する相補配列間の
１００〜２，０００ヌクレオチド、およびより好ましく
は５００〜１０，０００塩基の好ましい分離を利用す
る。このような方向付けは、ステムループ構造の形成
が、伸長プライマーの第１セグメントのそのテンプレー
トからの除去または部分除去を容易にし、伸長プライマ
ーのそのテンプレートからの完全分離を提供する条件の
負担を必要とすることなく結合部位を再生し得るのに十
分に相補配列が近位であるという、本発明に開示される
方法および組成物を教示しない。さらに、Ｒｏｓｅらに
よって提供される教示は、等温または限定サイクル条件
下での増幅を可能にする手段として、プライマーにおけ
る自己相補性の使用を除外する。なぜなら、それらの操
作範囲は、等温または限定サイクル条件下で、エネルギ
ー的に不利な二次構造形成をなす。安定なステム構造の
形成によって生成されるエネルギーの増加は、ステムル
ープ構造のループ部分を形成するためにその相補体から
長鎖を置換するエネルギーコストによって妥協され、そ
して上回る。従って、完全サイクル条件は、プライマー
結合部位を再生するために必要である。Ｒｏｓｅらの教
示およびプロセスの帰結は、伸長配列が、常にステムル
ープ構造のループに存在する産物を導くのに対して、本
発明のこの局面では、新規のプライマーおよびプロセス
の産物は、潜在的なステムループ構造の本質的に外側の
伸長配列を有する。
【０１１０】上記の本発明の局面は、標識化１本鎖ＤＮ
Ａプローブの調製、および核酸の配列の決定のための特
定の有用性を見いだす。本発明の開示の前に、１本鎖Ｄ
ＮＡプローブを得るために最も一般的に使用された方法
は、サーモサイクラーによって、またはＲＮＡプロモー
ターを含むテンプレートとのＲＮＡポリメラーゼの使用
によって提供される複数鎖変性事象に依存している。複
数鎖変性事象に依存するプロセスは、テンプレートの変
性に必要な高温で、試薬および酵素活性の特定の量の損
失という制限を受ける。熱安定性ポリメラーゼさえ、変
性条件温度の効果に対して完全に免疫性ではなく、そし
てこれらの温度で種々の半減期を有する。このような条
件の使用もまた、このような温度によって完全に不活化
されるいくつかの酵素の使用を除外する。これらのプロ
セスはまた、サーモサイクラーの必要性の制限を有す
る。ＲＮＡの生成に依存するプロセスは、プローブに所
望される配列に関連してＲＮＡプロモーターを導入する
必要性に関連する制限、およびＤＮＡより不安定な産物
に本来備わっている制限を受ける。等温または限定サイ
クル条件の使用について、本発明に開示される方法は、
サーモサイクラーを伴うかまたは伴わずに使用され得
る。それらは、酵素のより広範なアレイの使用を可能に
し、試薬は、極度に不安定な条件に供されず、そして安
定な再利用ＤＮＡプローブが、最終産物である。
【０１１１】本発明のこの局面はまた、テンプレート
を、均衡または限定サイクル条件下で、複数回使用する
ことを可能にすることによって、配列決定に使用され得
る。先行技術は、サーモサイクラーにおける複数鎖変性
事象の使用によって、これを達成し得たのみであった。
複数鎖変性事象について以前に引用された制限もまた、
この使用に適用可能である。さらに、変性に必要な高温
が、配列の曖昧性を創出し得る熱誘導脱プリン化または
脱アミノ化事象に寄与し得るという、さらなる制限が存
在する。テンプレートからの複数回の配列決定について
の本発明の方法の適用は、サーモサイクラーの必要性、
酵素の広範なアレイの有用性、およびテンプレートおよ
び試薬の整合性に対する熱効果の節度から独立している
という利点を提供する。
【０１１２】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的
に増幅するためのプロセスを提供する。非直線的増幅
は、以下の成分または試薬を提供する最初の工程を含
む：増幅されることが求められる目的の特定の核酸配
列、特定の核酸配列のための第１初期プライマーまたは
核酸構築物、この特定の核酸配列の相補体に対する続く
初期プライマーまたは核酸構築物、ならびに適切な基
質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。記
載したばかりの第１初期プライマーまたは核酸構築物
は、２つのセグメントを含む。第１に、２つの規定され
た特徴を有する第１セグメント（Ａ）が存在する。それ
は、（ｉ）この特定の核酸配列の第１の部分に実質的に
相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１
伸長が可能である。第１初期プライマーの第２セグメン
トは、４つの規定された特徴を有する。第１に、それ
は、（ｉ）第１セグメント（Ａ）と実質的に同一でな
い。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部
分と実質的に同一である。第２セグメントの第３の特徴
は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る
その能力である。第２セグメントの第４の特徴は、（ｉ
ｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマー
または核酸構築物の第１セグメントの、特定の核酸配列
の第１部分への続く結合を提供するためのその能力であ
る。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成さ
れて、第１プライマー伸長を置換する。
【０１１３】続く初期プライマーまたは核酸構築物に関
して、このエレメントは２つのセグメント、第１セグメ
ント（Ａ）および第２セグメント（Ｂ）を含む。第１セ
グメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分
に実質的に相補的であり、そしてそれは、（ｉｉ）テン
プレート依存性第１伸長が可能である。４つの特徴は、
第２セグメント（Ｂ）を規定する。第１に、第２セグメ
ント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一で
ない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２
部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント
（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合
し得る。第２セグメント（Ｂ）の第４の特徴は、（ｉ
ｖ）均衡または限定サイクル条件下で、続くプライマー
の第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続
く結合を提供するその能力である。このような条件下
で、第２プライマー伸長が生成され、そしてそれは第１
プライマー伸長を置換する。このプロセスの第２工程
は、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸
構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依
存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条
件下で、インキュベートすることを含む。それにより、
目的の特定の核酸配列は、非直線的に増幅される。
【０１１４】記載したばかりの非直線的増幅プロセスに
おいて、第１初期プライマーまたは核酸構築物および第
２初期プライマーまたは核酸構築物は、同じであり得る
か、または異なり得る。改変ヌクレオチドまたはヌクレ
オチドアナログは、通常、さらなるエレメントとして取
り込まれ得る。例えば、これらは、第１初期プライマー
または核酸構築物の第１セグメントまたは第２セグメン
ト、あるいは第２初期プライマーまたは核酸構築物の第
１セグメントまたは第２セグメントに取り込まれ得る。
または、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
は、任意のプライマー伸長産物に取り込まれ得る。さら
に言えば、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナロ
グは、先行エレメントのいずれかに取り込まれ得るか、
または先行エレメントのいずれかを改変するために使用
され得る。
【０１１５】上に記載したばかりのこの非直線的増幅プ
ロセスのさらなる実施態様において、第１初期プライマ
ーまたは第２初期プライマーの第２セグメントは、改変
ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得、こ
れはプライマー伸長産物におけるその相補体に対する第
１セグメントの熱力学安定性を増加することを提供す
る。このような改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドア
ナログは、例えば、インターカレート剤を含むか、また
はその形態をとる。
【０１１６】目前にあるプロセスの他の局面において、
第１初期プライマーの第１セグメントまたは第２初期プ
ライマーの第１セグメント（または両方）、あるいはプ
ライマー伸長産物（または、さらに言えば前述の要素の
いずれかの組合せ）は、改変ヌクレオチドまたはヌクレ
オチドアナログを含み得る。ここに、改変ヌクレオチド
またはヌクレオチドアナログは、それらの対応する相補
体に対する第１セグメントまたはプライマー伸長、ある
いはその両方の熱力学安定性を減少させることを提供す
る。このような安定性を減少する改変ヌクレオチドまた
はヌクレオチドアナログは、カルボン酸のような負に荷
電した化学基を含み得る。
【０１１７】記載したばかりの非直線的増幅プロセスの
別の局面は、核酸の型または形態である。ここに、第１
初期プライマーもしくは核酸構築物または第２初期プラ
イマーもしくは核酸構築物、あるいはその両方は、任意
の数または任意の形態の核酸を含む。このようなメンバ
ーは、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプ
チド−核酸、または前述のいずれかの組合せを含むがこ
れらに限定されない。
【０１１８】別の有意な非直線的増幅プロセスが、本発
明によって提供される。このプロセスは、特定の核酸配
列を非直線的に増幅し、そして以下の成分および試薬を
提供する第１工程を含む：特定の核酸配列およびその相
補体：特定の核酸配列のための第１初期プライマーまた
は核酸構築物、第１プライマー伸長に相補的な第２初期
プライマーまたは核酸構築物、ならびに適切な基質、緩
衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。第１初期
プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含
む：第１セグメント（Ａ）および第２セグメント
（Ｂ）。前者に関して、２つの特徴がそれを規定する。
第１に、それは、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に
実質的に相補的であり、そして第２に、それは、（ｉ
ｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第２セ
グメント（Ｂ）に関して、４つの特徴がこのエレメント
を規定する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと
実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の
核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第２セグメ
ント（Ｂ）の第３の特徴は、（ｉｉｉ）第２セグメント
の相補配列に結合し得るその能力である。第２セグメン
ト（Ｂ）の第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイ
クリング条件下で、続く第１プライマーの第１セグメン
トの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供す
るためのその能力である。このような条件下で、第２プ
ライマー伸長が生成され、そしてそれが第１プライマー
伸長を置換する。第２初期プライマーまたは核酸構築物
は、均衡または限定サイクリング条件下で、テンプレー
ト依存性伸長についてのその能力によって特徴づけられ
るセグメントを含む。このプロセスの重要な工程は、も
ちろん、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは
核酸構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレー
ト依存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイク
リング条件下でインキュベートする工程である。
【０１１９】他の局面または特徴は、非直線的増幅のた
めに、後記のプロセスに取り込まれ得る。１つの重要な
特徴は、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
を含有させることである。例えば、少なくとも１つの改
変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが取り込ま
れ得るか、またはプロセスにおける以下のメンバーエレ
メントのいずれかを改変するために使用され得る：第１
初期プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントまた
は第２セグメント、第２初期プライマーまたは核酸構築
物のセグメント、プライマー伸長、あるいは、前述のい
ずれかまたは前述のいずれかの組合せ。一様に重要なこ
とは、少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレ
オチドアナログを第１初期プライマーの第２セグメント
に含有させることである。このような改変ヌクレオチド
またはヌクレオチドアナログを含有させることは、プラ
イマー伸長におけるその相補体に対する第１セグメント
の熱力学安定性を増加させることを提供する。改変ヌク
レオチドまたはヌクレオチドアナログは、当該分野で周
知であり、そして例えば、インターカレート剤を含む。
【０１２０】さらに、第１初期プライマーの第１セグメ
ントまたは第２初期プライマーのセグメント（または両
方）、あるいは、それらのプライマー伸長（または、さ
らに言えば、前述のいずれかの組合せ）は、少なくとも
１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログで
改変されるかまたは取り込まれ得る。このような改変ヌ
クレオチドまたはヌクレオチドアナログは、それらのそ
れぞれの相補体に対する第１セグメントまたはプライマ
ー伸長（または両方）の熱力学安定性を減少させること
を提供する。安定性を減少させることを提供する改変ヌ
クレオチドまたはヌクレオチドアナログは、負に荷電し
た化学基（例えば、カルボン酸）を含み得る。
【０１２１】本願に記載される非直線的増幅のための他
のプロセスの場合におけるように、核酸の形態または型
は変化し得る。第１初期プライマーもしくは核酸構築
物、または第２初期プライマーまたは核酸構築物、ある
いは両方は、以下のいずれかから選択される核酸を含み
得る：直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプ
チド−核酸（または、前述のいずれかの組合せ）。
【０１２２】本発明はまた、増幅されることが探索され
る目的の特定の核酸配列を非直線的に増幅するための別
のプロセスを提供する。このプロセスは、以下の成分お
よび試薬を提供する第一工程を含む：目的の特定の核酸
配列；非直線的に増幅し得る単一のプライマーまたは単
一の核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、および
テンプレート依存性重合化酵素。この単一のプライマー
または核酸構築物は、３つのセグメント、（ａ）、
（ｂ）、および（ｃ）を含む。第１セグメント（ａ）
は、（ｉ）特定の核酸配列の第１部分に実質的に相補的
であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が
可能である。第２セグメント（ｂ）は、特定の核酸配列
の第２部分に実質的に同一である。第３セグメント
（ｃ）は、第１セグメントに実質的に同一である。第１
プライマー伸長は、第２セグメントにハイブリダイズし
得る配列を生成し得、そして自己プライミングおよび自
己伸長をして、第３セグメントに対する相補体を生成す
るその能力によっても特徴づけられる。このプロセスの
第１工程に続いて、特定の核酸配列およびプライマーま
たは核酸構築物は、適切な基質、緩衝液、およびテンプ
レート依存性重合化酵素の存在下でインキュベートされ
る。インキュベーション後；特定の核酸配列は、それに
より非直線的に増幅される。
【０１２３】非直線的増幅について最後に記載されるプ
ロセスについての他の実施態様が、本発明によって提供
される。例えば、プロセスは、均衡条件、限定サイクル
条件、および完全サイクル条件から選択される条件下で
行われ得る。
【０１２４】さらに、改変ヌクレオチドまたはヌクレオ
チドアナログは、プロセスの種々のエレメントの改変に
おいて使用され得る。例えば、第１セグメント、第２セ
グメント、第３セグメント、第１プライマー伸長、第２
プライマー伸長のいずれかまたは全ては、少なくとも１
つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含
み得るかまたは包含し得る。さらに、改変ヌクレオチド
またはヌクレオチドアナログは、第１セグメント、第２
セグメント、第３セグメント、第１プライマー伸長、お
よび自己プライミング伸長のいずれかまたは全てに取り
込まれ得る。
【０１２５】当業者はまた、単一のプライマーまたは核
酸構築物が、多数の核酸形態（例えば、直鎖状核酸、分
枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド核酸、または前述
のいずれかの組合せが挙げられる）を含み得ることを認
識する。当業者はさらに、第１プライマー伸長が、種々
の条件下（例えば、限定された基質条件、限定された伸
長持続時間、またはその両方を含む）で行われ得ること
をさらに認識する。
【０１２６】目的の特定の核酸配列の増幅についての上
記のいずれかのプロセス（直線的または非直線的増幅で
あれ）に関して、特定の核酸配列は、１本鎖または２本
鎖形態であり得る。さらに、特定の核酸配列は、フラグ
メントに見いだされ得るか、または含まれる。このよう
なフラグメントは、多数の手段によって生成され得、こ
れらの手段としては、物理的手段（超音波処理、加熱、
またはその両方）、化学的手段（酸処理）、物理化学的
手段、および酵素的手段（ヌクレアーゼ（例えばエンド
ヌクレアーゼ）および制限酵素）が挙げられる。
【０１２７】非直線的増幅は、以下にさらに記載され
る。
【０１２８】（ステムループ形成プライマーおよび構築
物との非直線的増幅）所望の配列の非直線的増幅は、各
鎖における結合部位がプライマーまたは核酸構築物によ
って使用される場合に、行われ得る。本発明の別の局面
において、非直線的増幅は、均衡または限定サイクル条
件下で、少なくとも１つの上記のプライマーまたは構築
物が、第１および第２セグメントを有する新規のプライ
マーまたは構築物である場合に、行われ得る。本発明の
新規の核酸構築物は、１つより多い極性を有し得るか、
または分枝ＤＮＡであり得る。これらの構築物を合成す
るためのプロセスは、米国特許出願第０８／７４９，２
６６号（前に引用および本明細書中で援用する）に記載
されている。第１および第２セグメントは、以前に定義
されている。新規のプライマーまたは核酸構築物の第１
セグメントは、標的核酸配列に存在する配列に実質的に
相補的である配列を含む。新規のプライマーまたは核酸
構築物の第２セグメントは、標的核酸に存在する配列と
実質的に同一である配列を含む。
【０１２９】プライマーが非直線的増幅に使用される場
合、一方の鎖における結合部位は、第１および第２セグ
メントを有する新規のプライマーによって使用され、そ
して他方の鎖における結合部位は、標準的なプライマー
または別の新規のプライマーのいずれかによって使用さ
れ得る。新規の単一のプライマーは、各鎖における結合
部位が実質的に互いに類似する場合に、それ自身によっ
て使用され得る。構築物が非直線的増幅に使用される場
合、構築物は、標的核酸の一方の鎖に相補的な１つ以上
の第１セグメントおよび他方の鎖に相補的な１つ以上の
第１セグメントを含む、新規の構築物である。構築物は
また、一方の鎖に同一である１つ以上の第２セグメント
も含み、そして他方の鎖における配列に同一である１つ
以上の第２セグメントもまた含み得る。新規の構築物の
第１セグメントは、互いに実質的に同一であり得るか、
または互いに実質的に異なり得る。新規の構築物の第２
セグメントは、互いに実質的に同一であり得るか、また
は互いに実質的に異なり得る。標準的なプライマー、新
規のプライマー、構築物および新規の構築物の組合せも
また、少なくともそれらの１つが第１および第２セグメ
ントを含む限りは、ともに使用され得ることもまた理解
される。
【０１３０】以前に記載されるように、新規のプライマ
ーまたは核酸構築物の結合および伸長は、均衡または限
定サイクル条件下で、複数のプライマー結合および伸長
事象についてのテンプレートの使用を可能にし得る。新
規の結合および伸長事象が生じるので、それらは、以前
にそのテンプレートに対して伸長している核酸鎖の分離
を可能にする。このことは、変性事象に必要ではない第
２プライマーまたは核酸構築物の結合についてのテンプ
レートとして使用され得る１本鎖核酸鎖の生成を生じ
る。なぜなら、それらは既に、１本鎖形態であるからで
ある。一方のプライマーが標準的なプライマーであり、
そして他方が新規のプライマーである場合、テンプレー
ト依存性結合および伸長の最終産物は、一方の末端にお
いて、各鎖のステムループ構造を含む２本鎖分子であり
得る。両方のプライマーが新規のプライマーである場
合、テンプレート依存性結合および伸長の最終産物は、
各末端において、各鎖のステムループ構造を含む２本鎖
分子であり得る。構築物が、その各々が一方の鎖または
他方に相補的である２つの第１セグメント、および一方
の鎖のみに相補的である１つの第２セグメントを含む場
合、最終産物は、相補的なステムループ構造を有する単
一の分子であり得る。構築物が、その各々が、一方の鎖
または他方に相補的である２つの第１セグメントおよび
その各々が、一方の鎖または他方と同一である２つの第
２セグメントを含む場合、最終産物は、相補的なステム
ループ構造の２つの対を有する単一の分子であり得る。
【０１３１】非直線的増幅産物は、均衡または限定条件
下で、連続した一連の以下の工程によって、新規のプラ
イマーおよび標準的なプライマーによって合成され得
る。新規のプライマーは標的鎖に結合し、そして新規の
単一プライマーとの直線的増幅について以前に記載され
るのと、同じ一連の伸長、二次構造形成、プライマー結
合部位の再生、第２結合、第２伸長、およびテンプレー
トからの第１伸長プライマーの分離が存在する。新規の
伸長プライマーは、他方の新規のプライマーの連続する
結合および伸長によって置換されるので、これらの１本
鎖産物は標準的なプライマーに結合し得、そしてそれら
を伸長させて、完全な２本鎖アンプリコンを作製し得
る。この潜在的な一連の事象を、図２に示す。得られる
２本鎖構造は一方の鎖において新規のプライマーについ
てのプライマー結合部位に相補的な配列と、および他方
の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結
合部位に同一の配列と隣接する各鎖自己相補配列を含
む。この結果として、各鎖は、アンプリコンの一方の末
端で、ステムループ構造を形成し得る。次いで、１本鎖
ループ構造におけるプライマー結合部位の露出は、図１
において以前に示した同じプロセスによって、さらなる
一連のプライマー結合および置換反応をもたらし、それ
により均衡または限定サイクル条件下で、目的の配列の
非直線的増幅の生成を可能にする。この産物は、非直線
的増幅によって、Ｒｏｓｅらによって作製されたものと
は異なる。なぜなら、それらのプロセスは、伸長配列が
自己相補領域間に常に位置するように導くのに対して、
本発明のこの局面において、伸長配列は、ステムループ
領域の外側にあるからである。さらに、本発明のこの局
面のプロセスは、二次構造情報によって結合部位を再生
するのに対して、Ｒｏｓｅらにおいては、結合部位は潜
在的なステムループ構造のステム領域に存在し、そして
増幅産物の変性なしでは別の結合事象には決して利用可
能ではない。
【０１３２】本発明のこの局面を行うのに適切なプライ
マー配列は、直線的増幅について以前に記載された因子
に依存する。標的に結合するプライマーのセグメント
は、反応に使用される温度で安定なプライミングを可能
にするために、適切な長さおよび塩基組成のものでなけ
ればならない。プライマーの伸長後の自己ハイブリダイ
ゼーションに関与するプライマーのセグメントは、テン
プレートからの伸長プライマーの部分解離が、安定な二
次構造（すなわち、ステムループ構造のステム）の作製
に十分である適切な長さおよび塩基組成でなければなら
ない。この構造は、恒久でなくても良いが、別のプライ
ミング事象を可能にし得るのに充分安定でなければなら
ない。さらに、本発明のこの局面は、新規の伸長プライ
マーのステムループ配列の相補的コピーの作製を含む。
このことは、プライマーの伸長後の自己ハイブリダイゼ
ーションに関与するプライマーのセグメントが、二次構
造に関与する配列がテンプレートとして使用され得るよ
うに適切な長さおよび塩基組成のものでなければならな
いことを必要とする。塩基組成および長さに加えて、一
次および二次構造の安定性は、プライマー、伸長配列、
またはその両方への改変塩基の取り込みによって影響さ
れ得る。これらは、それらが存在するセグメントのＴｍ
を、上昇または低下させ得る。セグメントのＴｍを上昇
させ得る塩基の改変の例は、ＥＮＺ ＸＸに記載される
ようなエチジウムブロマイド部分の添加であり得るがこ
れに限定されない。セグメントのＴｍを低下させ得る塩
基の改変の例は、Ａｕｅｒら（１９９６， Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４；５０２１−５０２５、内
容は本明細書中で既に引用されている）によって記載さ
れるような、イノシンの使用であり得るがこれに限定さ
れない。
【０１３３】非直線的増幅産物はまた、均衡または限定
サイクル条件下で、２つの第１セグメントおよび１つの
第２セグメントを含む新規の核酸構築物によって合成さ
れ得る。第１セグメントの各々は、核酸の鎖またはその
相補体に相補的であり、そして第２セグメントは、第１
セグメントの１つの伸長後に、二次構造を形成し得る。
この構築物は、一対の相補的な潜在的ステムループ構造
を有する産物を作製し得る。この産物は、連続する一連
の以下の工程によって形成され得る。新規の構築物の１
つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントは、新
規の単一プライマーによる直線的増幅について以前に記
載されているのと同様の連続する一連の結合、伸長、二
次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第
２伸長、および鎖分離工程を行い得る。さらに、この合
成の産物は、一連の結合および伸長工程のためのテンプ
レートとして、新規のプライマーおよび標準的なプライ
マーでの非直線的増幅について上に記載されているよう
な他方の第１セグメントによって使用され得る。これら
の工程が作製し得る潜在的な一連の異なる形態は、図３
および４に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行
い得る一連の事象は、以前に記載されたのと同じであ
り、そして図４に示される最終産物は、ともに結合した
プライマーの２つの５'末端を有する図２の最終産物の
位相的等価体である。
【０１３４】非直線的増幅産物は、標的核酸の異なる鎖
に相補的な２つの新規のプライマーの使用によって、連
続する一連の以下の工程によって、均衡または限定サイ
クル条件下で合成され得る。新規のプライマー（Ａ）
は、標的鎖に結合し、そして新規の単一プライマーでの
直線的増幅について以前に記載されたのと同様の一連の
伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２
結合、第２伸長、伸長プライマーのテンプレートからの
分離が存在する。新規の伸長プライマーは、他の新規の
プライマーの結合および伸長と置き換えられるので、こ
れらの１本鎖産物は、新規のプライマー（Ｂ）と結合し
得、そして伸長させて完全な２本鎖アンプリコンを作製
することを可能にする。この潜在的な一連の事象は、図
５に示される。以前に記載したように、伸長して置換し
たプライマーの相補体の形成は、均衡または限定サイク
ル条件下で、複数の結合、伸長、および置換事象を可能
にするべき二次構造を有するテンプレートを作製する。
新規の第１プライマーおよびその相補体から寄与される
配列に由来する一方の末端での二次構造、および新規の
第２プライマーおよびその相補体によって寄与される配
列に由来する他方の末端での二次構造を有する産物が形
成され得る。この構造は、プライマー結合部位として使
用され得る１本鎖セグメントを再生する各鎖において、
ループ構造を有するので、新規のプライマーまたは核酸
構築物のさらなる結合および伸長が、均衡または限定サ
イクル条件下で、いずれかの鎖において開始され得る。
例示するために、図５に示される一連の事象は、新規の
プライマー（Ａ）による一方の末端での最初の開始事象
の結果であるが、相補的なテンプレート鎖の利用可能性
とともに、一連の事象が、新規のプライマー（Ｂ）によ
る、相補的な標的鎖のプライマー結合部位での最初の開
始と、類似の様式で示されている。
【０１３５】新規のプライマーはまた、第２セグメント
はテンプレートとして使用され得ないが、自己ハイブリ
ダイゼーションを介する二次構造形成になお関与し得る
ように改変され得る。このような改変を誘導するのに使
用され得る手段としては、無塩基性部位およびペプチド
−核酸の封入が挙げられ得るがこれに限定されない。こ
のようなプライマーの合成の方法は、米国特許出願番号
第０８／７４９，２６６号（先に引用および既に本明細
書中で援用されている）に記載されている。このような
新規のプライマーまたはプライマー構築物のテンプレー
ト依存性結合および伸長によって作製され得る産物は、
各鎖において一方の末端での単一ステムループおよび他
方の末端での１本鎖プライマー結合部位を有し得る２本
鎖アンプリコンである。
【０１３６】この産物は、これらの改変された新規のプ
ライマーによって、連続する一連の以下の工程において
合成され得る。第１の一連の潜在的なプライマー結合、
伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２
結合、第２伸長、および伸長プライマーのテンプレート
からの分離は、新規の単一プライマーでの直線的増幅に
ついて以前に記載されたものと同様であり得る。第２の
改変した新規のプライマーとの一連の反応は、図６に示
される。テンプレートとして使用され得るので、新規の
改変プライマーの第２セグメントは、伸長によって作製
された配列との第２セグメントの自己ハイブリダイゼー
ションに対して別の方法で競合する相補鎖を有さず、そ
れにより二次構造のより効果的な形成を可能にする。従
って、分子の３'末端でステムループ構造が存在しない
としても、よりさらなるプライミング事象に使用され得
るセグメントが、十分に曝露される。
【０１３７】非直線的増幅産物は、均衡または限定サイ
クル条件下で、２つの第１セグメントおよび２つの第２
セグメントを含む新規の核酸構築物によって形成され得
る。第１セグメントの各々は、一方の鎖またはその相補
体に実質的に相補的であり、そして第２セグメントの各
々は、第１セグメントの１つの伸長後に二次構造を形成
し得る。この構築物は、相補的な潜在的ステムおよびル
ープ構造の２つの対を有する産物を形成し得る。この産
物は、新規の単一プライマーによる非直線状増幅につい
て以前に記載されているものと同じ連続する一連の結
合、伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、
第２結合、および第２伸長工程を行う、一方の第１セグ
メントおよび一方の第２セグメントによって合成され
る。次いで、上記の一連の反応を行うために、このセッ
トの反応の産物は、新規の構築物の他方の第１セグメン
トおよび第２セグメントによって使用され得る。これら
の工程が生成し得る潜在的な一連の異なる形態は、図７
および８に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行
われ得る一連の事象は、以前に記載されたものと同様で
あり、そして図８に示される最終産物は、ともに結合し
たプライマーの２つの５'末端を有する図６の最終産物
の位相的等価体である。１つより多い極性を有する新規
の構築物が使用されて、等温または限定サイクル条件下
で、直線的および非直線的増幅が行われ得る種々の配置
が例示されているが、分枝ＤＮＡを有する構築物もま
た、同様のプロセスに使用され得ることが理解される。
【０１３８】上に記載されている本発明の局面の使用の
組成物および方法は、以前に記載された技術のいずれの
限定も伴わずに、直線的または非直線的増幅を行い得
る。本発明のこれらの局面において、先行技術に必要で
あった、完全サイクル条件、ＲＮＡ中間体、改変ヌクレ
オチド、または複数の酵素は必要ではない。
【０１３９】（自己複製する新規のプライマーおよび核
酸構築物）先行技術において記載されている全ての他の
増幅系において、２つの結合部位（各標的鎖におけるも
の）を必要としない非直線的増幅を開示しているものは
ない。この必要性は、各鎖からの配列の提示の必要性に
起因する。この必要性を伴う系としては、ＰＣＲおよび
ＬＣＲのような温熱系ならびに３ＳＲおよびＳＤＡのよ
うな等温系が挙げられている。このように、ＰＣＲ反応
は、２つのプライマーで行われ、ここで標的核酸の各鎖
は、一方または他方のプライマーによって使用される。
Ｒｏｓｅらの開示においてさえ、２つの同一な結合部位
は、ＰＣＲを行うのに必要であり、同じプライマーが各
鎖について使用され得る。
【０１４０】本発明の１つの局面は、非直線的増幅のた
めの使用の組成物および方法を開示し、ここで新規のプ
ライマーおよび核酸構築物についての１つ以上の結合部
位は、標的核酸の一方の鎖のみに限定される。本発明の
この局面の新規のプライマーおよび新規の構築物は、少
なくとも３つのセグメントを有する。これらのセグメン
トは、共有的または非共有的のいずれかでともに結合さ
れ得る。共有結合を介してセグメントを結合する手段と
しては、正常な直鎖状核酸のリン酸骨格、１つより多い
極性を有する構築物、および分枝ＤＮＡ構築物が挙げら
れ得るがこれらに限定されない。このような構築物の合
成の方法は、（ＩＮＶ特許）に記載されている。非共有
結合によってセグメントを結合する手段としては、リガ
ンド−レセプター結合および相補的塩基対形成が挙げら
れ得るがこれらに限定されない。セグメントは互いに隣
接し得るか、または互いに空間的に離れ得る。セグメン
トの配列は互いに異なり得るか、または互いに相補的も
しくは同一であり得る。
【０１４１】新規の単一プライマーが単一の極性を有す
る場合、以下の特徴を有する３つのセグメントを有す
る： １）新規のプライマーの第１セグメントは、結合および
伸長され得、そして目的の標的の一方の鎖のみにおける
配列に実質的に相補的である配列を含み、その結果、標
的に結合し得、そしてテンプレートのような標的配列を
用いて伸長され得る。
【０１４２】２）新規のプライマーの第２セグメント
は、目的の標的における配列に実質的に同一である配列
を含み、その結果、第２セグメントは、第１セグメント
の標的依存性伸長によって作製される配列と自己ハイブ
リダイゼーションし得、自己プライミング事象を促進す
る二次構造を形成することを可能にする。
【０１４３】３）新規のプライマーの第３セグメント
は、鎖内テンプレートとして作用し得、そしてそれによ
り自己伸長を可能にする。
【０１４４】これらの特徴によって、適切な標的分子の
一方の鎖の存在は、新規の単一プライマーを非直線的増
幅し得る自己複製核酸に変換し得る。本発明の新規の単
一プライマーは、標的に結合し得、そして伸長のための
テンプレートとしてそれを利用する。次いで、第２およ
び第３セグメントの存在に起因して、この産物は、一連
の鎖内および鎖間の結合および伸長反応を経験し得る。
これらの反応の産物は、自己複製する１本鎖核酸または
自己複製する２本鎖核酸である。１本鎖核酸産物は、ス
テムループ構造を形成し得、そして２本鎖核酸は、１本
鎖にされた後、ステムループ構造を形成し得る。
【０１４５】標的核酸の適切な鎖の存在によって直線状
の新規のプライマーからこのような形態を合成するのに
使用され得る一連の工程は、図９、１０、および１１に
示される。新規のプライマーはテンプレートに結合し
得、そして伸長して、図９の工程２の構造を形成し得
る。ここで合成は、利用可能なテンプレートのばらばら
の部分のみをコピーすることに限定される。合成の限界
の制限は、種々の手段によって行われ得る。これらの手
段は、サイズ、時間、および基質制限からなり得るがこ
れらに限定されない。サイズ制限のために、標的は、ラ
ンダムまたは部位特異的末端を作製する手段による伸長
の前に処理され得る。ランダムな部位は、選択平均サイ
ズを有するプールを作製するために使用され得る。標的
核酸においてランダムな中断を生じるための手段として
は、剪断のような物理的方法およびヌクレアーゼのよう
な酵素的方法が挙げられ得るがこれらに限定されない。
部位特異的部位は、ばらばらのサイズを有する標的核酸
を作製するために使用され得る。部位特異的末端を作製
するための手段としては、制限酵素が挙げられるがこれ
らに限定されない。時間の制約のために、反応は、結合
および合成の所望の長さ、続く温度の調製が反応を停止
するに十分な時間間隔で行われ得る。時間間隔の持続
は、緩衝液および塩条件、結合および伸長に使用される
温度の選択、正常な基質と比較して異なる効率で使用さ
れる改変基質の使用、および特定のポリメラーゼの選択
を含み得るがこれらに限定されない要因によって決定さ
れる。基質制限のために、プライマー配列が選択され
得、その結果伸長反応の所望の限度は、限定された数の
特定のヌクレオチドによって行われ得、そして反応か
ら、所望の程度を越える合成をさらに可能にする特定の
ヌクレオチドを除外する。例えば、反応混合物からのｄ
ＴＴＰの除去は、ｄＴＴＰが必要とされる点で生じる伸
長鎖の終結とともに、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＡ
ＴＰでのプライマーのテンプレート依存性伸長を可能に
する。
【０１４６】伸長が適切な部位で停止される効率は、反
応の全体の効率に影響する。このプロセスについてさら
に記載される反応の工程に関与し得る中間体の最大量を
生成するために、標的テンプレートが使用されているこ
とを保証するためのできるだけ完全な停止が所望される
ことが理解される。一方では、制限は全く絶対的である
必要はないことに注意されるべきである。いくつかの伸
長反応が適切に制限される限りは、以下に記載されるさ
らなる工程を経験し得る反応産物が作製される。
【０１４７】プライマーが所望の程度まで伸長された
後、プライマーは、そのテンプレートから分離される
（図９、工程３）。この図に示されないが、このこと
は、伸長配列と新規のプライマーの第２セグメント（図
９に示される新規のプライマーのａ'−ｂ'およびａ−ｂ
セグメント）との間に自己ハイブリダイゼーションを介
する二次構造の形成によって潜在的に起こり得る。この
ことは、同じ標的分子を有する他方の新規の単一プライ
マーの結合および伸長、続いて、本発明の以前の局面に
記載されているような、均衡または限定サイクル条件下
で、伸長プライマーを置換することを可能にする。しか
し、この事象が生じることを可能にする新規のプライマ
ーにおける配列の設計の非存在下で、伸長プライマーの
そのテンプレートからの分離は、図９の工程３における
温熱変性（すなわち、完全サイクル条件）によって行わ
れ得る。 それらは、標的または図９に例示されるよう
なｃ−ｄ配列に隣接する配列であり、それらは、適切な
長さに設計されたｘ−ｙのセグメントによってこれらの
配列から分離され得るように、ａ−ｂについての配列が
選択され得る。
【０１４８】自己触媒または熱放出工程のいずれかの
後、部分的に伸長したプライマーは、図９の工程４に示
されるような相補的セグメントのハイブリダイゼーショ
ンによって、自己プライミング事象が可能である。この
ことは、テンプレートとして新規の単一プライマーの第
３のセグメントを用いるプライマーの自己伸長を可能に
する。４つのｄＮＴＰの限定されたサブセットが、図９
の工程２における伸長長さの制御のために使用される場
合、欠失ヌクレオチドは、このさらなる伸長工程に付加
される必要があり得る。同様に、反応条件における調整
もまた、緩衝液、塩、温度、ポリメラーゼ、または改変
ヌクレオチドのような要因が、限定された伸長工程につ
いての時間間隔に影響を及ぼすために使用されている場
合、必要であり得る。図９の工程５におけるプライマー
の第２伸長は、非伸長プライマーの３'末端に相補的で
ある配列を付加する。工程６は、図９の工程５の産物の
変性を示す。次いで、伸長プライマーは、鎖内自己ハイ
ブリダイゼーション事象または鎖間ハイブリダイゼーシ
ョン事象のいずれかを経験する。鎖内自己ハイブリダイ
ゼーションは、伸長末端と、伸長プライマーの第１セグ
メントまたは第３セグメントのいずれかとの間であり得
る。伸長プライマーの第１セグメントとの自己ハイブリ
ダイゼーションは、図１０の工程７に見られる構造を形
成する自己プライミング事象である。この形態は、自己
伸長を経験し得る（図１０の工程８）。これらの潜在的
な鎖内事象による配列の自己複製に加えて、自己複製
は、鎖間ハイブリダイゼーションによって起こり得る。
新規の初期プライマーの新規の伸長プライマーへの結合
は、図１０の工程９に示され、続いて、新規の初期プラ
イマーの伸長および新規の伸長プライマーのさらなる伸
長は図１０の工程１０に示される。この図に示されない
が、各々の伸長を可能にし得る新規の伸長プライマー間
の鎖間ハイブリダイゼーションもまた存在し得る。それ
ゆえ、分子内および分子間アニーリングの両方によっ
て、伸長プライマーは、変性事象後の、配列の連続付加
を経験し得る。図９および図１０に示されるような一連
の反応の産物は、とられた伸長の経路（分子内または分
子間）および何回の変性／伸長が行ったかに依存して種
々のサイズを有する一連のアンプリコンである。
【０１４９】本発明の別の局面において、３つのセグメ
ントを有する新規のプライマーが改変され得、その結
果、自己プライミングおよび自己伸長が、限定された合
成工程および自己複製が分子内結合および伸長によって
行われる間にのみ、行われる。このことは、テンプレー
トとしてその使用を部分的または全体的にブロックする
プライマーにおいてセグメントを有することによって行
われ得る（図１１）。この目的のために新規のプライマ
ーを改変するための方法は、以前に記載されている。伸
長テンプレートとしてブロックされる部位の存在は、図
９の工程１〜６に示されたのと同じ潜在的な一連の反応
をいっそう可能にし得る。しかし、新規の初期プライマ
ーの新規の伸長プライマーとの分子間ハイブリダイゼー
ション（図１１の工程９）の後、非伸長プライマーのみ
が、その３'末端に付加される新たな配列を有し得るの
に対して、以前の伸長プライマーは、同じ長さのままで
ある（図１１の工程１０）。この事象は、同様に、さら
なる伸長事象のためのテンプレートであり得る伸長プラ
イマーのさらなる生成を可能にし、それにより自己複製
構築物を作製する。この方法において、１本鎖５'テイ
ルに隣接する２本鎖セグメントを含むばらばらなサイズ
を有するアンプリコンの非直線的増幅が存在し得る。
【０１５０】（自己プライミングヘアピンを有する構築
物）自己複製する核酸の、標的核酸の１本鎖からの形成
もまた、１つ以上の第１、第２、または第３セグメント
を含む核酸構築物によって行われ得る。これらの構築物
は、１つより多い極性を有し得るか、または分枝ＤＮＡ
であり得る。本発明のこの局面において、構築物のセグ
メントは、以下の特徴を有する： １）１つ以上の第１セグメントは、目的の標的の一方の
鎖のみにおいて配列に実質的に相補的であり、その結
果、それらは結合し得、そしてテンプレートとして標的
配列の上記の鎖のみを用いて伸長され得る。
【０１５１】２）構築物の１つ以上の第２セグメント
は、目的の標的において配列に実質的に同一であり、そ
の結果それらは、構築物の第１セグメントの標的依存性
伸長によって作製される配列と自己ハイブリダイゼーシ
ョンが可能であり、二次構造が、自己プライミング事象
を促進する形態を可能にする。
【０１５２】３）構築物の１つ以上の第３セグメント
は、鎖内テンプレートとして作用し得、そしてそれによ
り自己伸長が可能である。
【０１５３】構築物の第１セグメントは、互いに実質的
に同一であり得るか、または互いに実質的に異なり得
る。第２および第３セグメントもまた、この方法におい
て記載され得る。配列の種々の配置が、このような構築
物に使用され得る。例示の目的で、このような配置の例
が、複数の極性を有する構築物について与えられる。本
発明のこの局面において、テンプレート依存性結合およ
び伸長、続く鎖内および鎖間結合および伸長の最終産物
は、分子内ハイブリダイゼーションによって１つ以上の
ステムおよび１つ以上のループを形成し得る構築物であ
る。
【０１５４】自己複製する核酸は、１つの第１、第２、
および第３セグメントを有する新規の核酸構築物によっ
て形成され得る。この例において、第２セグメントは、
その３'末端自身を有する。なぜなら、それは、１つよ
り多い極性を有する構築物の一部であるからである。し
かし、それは、３'末端の障害物に起因して、第２セグ
メントとしてのみ機能するままである。伸長のこの障害
物は、当業者に公知の多数の手段のいずれかによって行
われ得る。
【０１５５】この構築物が適切な標的鎖と接触される場
合に起こり得る潜在的な一連の事象は、図１２に示され
る。適切な標的鎖に結合した後、第１セグメントは、限
定された伸長を経験し得る。サイズ、時間、および基質
制限によって合成の程度を制限する、限定された合成に
ついて以前に記載されたのと同じ潜在的な手段もまた、
この構築物とのプロセスにおける有用性を見いだす。次
いで、伸長鎖は、同じ構築物の第２セグメントとの鎖内
結合（工程４ａ）、または別の構築物分子の第２セグメ
ントとの鎖間結合（工程４ｂ）のいずれかが可能であ
る。これらの配置のいずれかとともに、さらなる伸長
は、テンプレートとして第３セグメントを用いることに
よって起こり得る（工程５ａおよび５ｂ）。これらのプ
ロセスのいずれかの産物は、より初期のプライマー構築
物の結合および伸長のためのテンプレートとして用いら
れることによる自己複製し得る伸長構築物である（図１
２の工程６）。
【０１５６】自己複製する核酸もまた、２つ以上の第
１、第２、および第３セグメントを有する新規の核酸構
築物によって形成され得る。構築物の設計に依存して、
自己ハイブリダイゼーション事象は、同じ伸長鎖内で生
じ得るか、または構築物の異なる伸長鎖間に生じ得る。
複数の極性または分枝ＤＮＡを有する構築物は、１本鎖
を物理的に含むが、明確にするために、構築物における
鎖は、単一の極性を有する核酸の連続するストレッチを
いう。上記の鎖配置で２つの第１、第２，および第３セ
グメントを有する構築物の例は、図１３および図１５に
与えられる。本発明のこの局面において使用される構築
物は、図９、１０、および１１に例示された以前の局面
に関連する。これらに共通して、合成は、利用可能なテ
ンプレートのばらばらな部分のみをコピーすることに制
限される。合成を制限するための以前に記載された同じ
サイズ、時間、および基質限定はまた、本発明のこれら
の局面における有用性を見いだす。それにより、図１３
および１５の工程３は、単一テンプレート分子が、１つ
のみではなく２つの３'末端の伸長に使用されることを
除いて、図９の工程２に等しい。テンプレートからの放
出は、構築物における自己ハイブリダイゼーション、続
くさらなる鎖伸長を可能にし得る。図１３における配置
は、構築物内の鎖内結合および伸長を可能にするのに対
して、図１５においては、構築物内に鎖間結合および伸
長が存在する。これらの配置の両方について、構築物の
反復セグメントの異なるコピーの使用による、さらなる
自己プライミングおよび自己伸長反応を可能にし得る変
性事象が存在し得る。しかし、図１４および図１６は、
非伸長構築物に結合し、そして相互伸長事象を開始する
ことによる自己複製の能力を実証する一連の事象を例示
する。
【０１５７】図９〜１６に例示される標的依存性伸長反
応の産物は、初期構築物におけるセグメントの特定の配
置に依存して異なる。しかし、それらは、一般的な二次
構造特徴を共有する。本発明の産物は、１本鎖領域なら
び自己相補的２本鎖領域を構成する分子内形態を有す
る。これらの１本鎖領域は、ループとして描かれ得る
（図９、１０、１１、１３、および１４の産物）。それ
らは、環の一部であり得る（図１２の産物）。それら
は、２つの２本鎖領域の間に位置する非相補的配列から
なる二重の１本鎖ループの一部であり得る（図１４およ
び１５）。この特徴は、複数の極性を有する以前に記載
された構築物の産物（ＩＮＶ特許）と対照的であり、こ
こで分子内産物は、自己相補的配列から完全に構成され
ていた。
【０１５８】反応を進行するために１つより多い極性を
使用している新規の酸構築物が以前に記載されている
が、分枝ＤＮＡ構築物が、同じ一連の反応および等しい
産物に使用され得ることが理解される。また、本発明の
この局面に記載されている１つより多い極性を有する構
築物は、（ＩＮＶ特許）に記載されているものとは異な
る。以前に記載された技術において、伸長可能なセグメ
ントは、標的核酸の両方の鎖に相補的であったのに対し
て、本発明では、全体の反応が、標的核酸の１つであっ
て唯一の鎖に相補的であるセグメントのテンプレート依
存性プライミングおよび伸長によって行われる。
【０１５９】（反応の単純化および反応産物）本発明を
含む全ての増幅において、反応の間にも起こり得る副反
応が存在する。これらは、高分子量産物の複雑な多様性
を形成し得る。それらは、所望の配列の合成の効率また
はこれらの配列の検出の効率のいずれかを減少する点に
おいて有害であり得る。合成の効率の減少は、副反応
が、所望の配列の合成の量を、ポリメラーゼおよび基質
資源についての競合によって減少する場合に起こり得
る。副反応はまた、適切な配列が合成されるが、反応の
いくつかの工程に阻害的な二次構造にある場合、効率を
減少し得る。このことは、プライマーの結合または伸長
のいずれかを妨害する構造によって起こり得る。後者の
場合において、プライムされたテンプレートを使用でき
ないことに起因して、そして酵素が結合するが進行し得
ない場合のポリメラーゼ活性の欠失にも起因して、効率
が失われ得る。不適切な二次構造もまた、適切な配列の
検出における問題を生じ得る。
【０１６０】新規の方法が開示され、これは、これらの
二次反応の効果を減少するために使用され得る。これら
の方法は、以前に開示されている本発明の種々の局面と
ともに使用され得、そして他者によって記載されている
増幅の方法と組み合わせても使用され得ることが理解さ
れる。自己複製する系が、さらなる反応のためのテンプ
レートとして産物を使用するので、任意の産物の合成の
限度は、反応へのターミネーターヌクレオチドの限定さ
れた量を含むことによる平均サイズにおける減少によっ
て制御され得る。この方法において、副反応伸長を経験
し得ないが、他のプライマーまたはプライマー構築物に
よる伸長のためのテンプレートとして使用され得るまま
である産物が合成され得る。このことは、合成される適
切な配列の量を増加し得、そして潜在的に阻害性のエレ
メントの量を減少し得る。二次構造の効果の抑止はま
た、二次構造を除去するかまたはこのような構造との会
合から標的配列を放出するかのいずれかの合成後の方法
によって行われ得る。前者の方法の例は、二次構造のル
ープおよび結合部を消化する１本鎖特異的ヌクレアーゼ
で処理され得る。解離は、他のＤＮＡ配列から所望のセ
グメントを単利し得る制限酵素での消化によって行われ
得る。除去および解離は、ＤＮａｓｅでの限定消化また
は脱プリン化のような物理的処理によって同時に行われ
得る。次いで、これらの処理の産物は、種々の検出手段
によるシグナル生成の点でより効率的にされる。
【０１６１】（負に荷電した改変ヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチド）本発明の別の局面において、対応する
未置換の２本鎖セグメントの変性温度未満である変性温
度を用いる場合に、２本鎖ＤＮＡ標的の増幅を可能にす
るヌクレオチドアナログを使用する方法および組成物が
開示される。このことは、伸長産物のＴｍを減少する負
に荷電した構成物によって改変された塩基の導入によっ
て行われる。以前に記載されるＡｕｅｒらの教示とは対
照的に、本発明の塩基の改変塩基の置換は、結合のため
の温度が、未改変塩基とともに一般的に使用される範囲
内であることを可能にする。Ａｕｅｒらに記載されたも
のより低い温度は、プライマーの核酸標的への結合のた
めのより低い温度の使用が、非標的核酸テンプレートで
の非特異的プライミングおよび増加したプライマー−タ
イマー形成に寄与し得るということが当該分野で周知で
あるという限定を有する。本発明は、改変塩基の存在下
でより高い結合温度を使用する能力を保持することによ
ってこれらの限定を回避する。以前に記載された技術に
おいて、完全サイクルＰＣＲに使用される最も高い温度
と最も低い温度との間の差は、２５〜５０℃の範囲であ
り得るのに対して、本発明は、１０℃未満の異なる圧縮
された一連のサイクルを使用し得る。従って、本発明
は、プライマーの効率的な特異的アニーリングを保存す
るのに十分高い温度の使用を提供する一方、同時に、反
応に使用される時間の間、相当なレベルの不活化を可能
にする温度への、酵素およびヌクレオチド基質の曝露を
回避するのに十分低い温度である。
【０１６２】（合成後標識）本発明において、配列情報
を得るのに以前に使用されている大きなかさ高い基の使
用に固有の先行技術の限定を克服する、非放射性シグナ
ルを生成するための新規の組成物および方法が開示され
る。一般的に、鎖ターミネーターは、ポリメラーゼによ
って取り込まれる問題を有することが、当該分野で以前
から公知である。シグナル生成に有用な大きなかさ高い
基の存在が、取り込み効率においてさらなる減少を引き
起こすこともまた、長い間公知である。この例は、ＡＭ
Ｖ逆転写酵素およびＴ７ポリメラーゼによって使用され
得るが、ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントの
ための基質ではない、蛍光標識化デオキシヌクレオチド
の基である（Ｐｒｏｂｅｒら、１９８７， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３８；３３６−３４１、内容を本明細書中で援
用する）。両方のこれらの要因は、取り込みの全体のレ
ベルを減少し得、これは、順に、終結およびシグナル生
成の量を減少する。特に、ＤＮＡのより長い鎖は、悪影
響を受ける。なぜなら、これらの遺伝子座の終結は、通
常、正常なヌクレオチドに比べて、終結ヌクレオチドの
量が減少することによって生じるからである；それによ
り、それらの取り込みの可能性にさらなる圧力を付加す
る。
【０１６３】本発明において、これらの限定は、鎖伸長
および終結事象が完了した後に、ターミネーターヌクレ
オチドにおける反応基へのシグナル生成部分の共有結合
によって克服される。このことは、鎖延長の前か間のい
ずれかに標識を取り込む以前の方法とは対照的である。
【０１６４】本発明のこの局面において、反応基として
は、ａ）内部ヌクレオチドではなく末端ヌクレオチドへ
のシグナリング部分の実質的に特異的な共有結合を提供
するもの、およびｂ）改変ターミネーターヌクレオチド
の取り込みを実質的に阻害しないか、または電気泳動に
よる分析を妨害しないものが挙げられる。ターミネータ
ーヌクレオチドに付加され得る反応基の例としては、チ
オール、ハロゲン化アルキル、遊離または保護した一級
および二級アミン基が挙げられ得るがこれらに限定され
ない。反応基を有する誘導体を作製するための方法は、
Ｗａｒｄらによって、米国特許第５，４７６，９２８
号；同第５，２４１，０６０号；同第５，２６０，４３
３号、および同第４，７０７，４４０号（先に引用、お
よび既に本明細書中で参考として援用される）に記載さ
れるものであり得るが、これらに限定されない。次いで
シグナル生成に有用な基は、酵素活性または基質利用に
おけるいずれの阻害効果にも関することなく、終結した
鎖に結合され得る。検出に有用な基としては、ハプテ
ン、リガンド、レセプター、フルオレセイン（ｆｌｕｏ
ｒｏｓｃｅｉｎ）、ローダミン、クマリンおよび他の蛍
光分子、赤外蛍光基、化学発光部分、エネルギー移動
系、ならびに酵素が挙げられ得るがこれらに限定されな
い。他の有用な反応基としては、終結ヌクレオチドに取
り込まれた場合に、それらを酵素基質としては使用不可
能にするかさ高い基または荷電した基が挙げられる。こ
のような基としては、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、および遅延
蛍光のためのドナー結合体が挙げられる。シグナル生成
基の反応基への結合のための方法は、Ｗａｒｄらによっ
て、米国特許第５，４７６，９２８号において、また米
国特許第５，２４１，０６０号；同第５，２６０，４３
３号、および同第４，７０７，４４０号（既に本明細書
中で援用されている）において記載される。本発明のこ
の局面は、均衡または限定サイクル条件下で、単一テン
プレートからの複数のコピーの生成について以前に開示
された方法と組み合わせて行われ得る。さらに、ポリマ
ー化後標識もまた、本発明の開示に対して以前に記載さ
れている任意の手段を用いる場合に行われ得ることが理
解される。
【０１６５】この方法は、ＨｏｂｂｓおよびＣｏｃｕｚ
ｚａによって、米国特許第５，０４７，５１９号（本明
細書中で援用する）に記載されるような、シグナル生成
の供給源として鎖ターミネーターを用いる本来の説明と
は対照的である。これは、本発明とは異なることを教示
し、ここで彼らは、「蛍光に基づくＤＮＡ配列決定のた
めの鎖終結基質として有用であるために、基質は蛍光標
識を含まなければならない…。」と明らかにのべてい
る。本発明の方法は、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰのいず
れかが、標識化ＤＮＡ鎖の配列分析の一般的に使用され
る手段のいずれかにおける取り込みの前に、標識される
必要があるという限定を克服する。これらは、静止系お
よびリアルタイム分析の両方を含み得る。静止系の例と
しては、アクリルアミドゲル分離、続く写真または化学
発光検出を含むがこれに限定されない。リアルタイム分
析の例は、アクリルアミドゲル分離、続くＡｎｓｏｒｇ
ｅら（１９８６）によって使用されるような１つの色素
（または、色素は、Ｓｍｉｔｈら、米国特許第５，１７
１，５３４号、およびＰｒｏｂｅｒら、米国特許第５，
３３２，６６６号によって記載されるような各塩基終結
についての異なる色素であり得る）の検出が挙げられ得
るがこれに限定されない。前述の刊行物および２つの特
許書類の内容を、本明細書中で参考として援用する。本
発明は、ジデオキシヌクレオチドによる鎖終結に関して
記載されているが、他の鎖ターミネーターもまた使用さ
れ得ることもまた理解される。種々の鎖ターミネーター
の説明は、Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋ
ｅｒによる「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」第２版
（１９９２， ４４７−４４９， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ ＣＯ．， ＮＹ， ＮＹ、本明細書中で
援用される）に与えられる。糖環における変化の例とし
ては、アシクロ（ａｃｙｃｌｏ）およびアラビノシル
（ａｒａｂｉｎｏｓｙｌ）ｄＮＴＰが挙げられ得るがこ
れらに限定されない。末端ヌクレオチドとして使用され
る場合、これらの誘導体は、特定の使用のためのもので
あり得る。なぜなら、化学的および生化学的に、それら
は、ＤＮＡ鎖の他の部分を含む正常なヌクレオチドとは
十分に区別されるべきであるからである。蛍光標識化ア
シクロ誘導体が、放射活性標識によって誘導されるもの
に等しい配列ラダー（ｌａｄｄｅｒ）を生じ得ることも
また、米国特許第５，３３２，６６６号（本明細書中で
援用される）に示されている。さらに、ターミネーター
ヌクレオチドの３'位置におけるアミノ基の存在による
鎖終結の障壁はまた、シグナル生成部分の合成後の結合
のための官能基を提供し得る。鎖の活性な３'−ＯＨ末
端を再生し得る他のブロック基が使用され得る。例え
ば、光切断可能（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）基が
含まれる場合、当該分野に記載されるように、反応が終
結され、そして標識の結合に使用された後、３'ＯＨが
再生され得る。この機能に使用され得る系としては、蛍
光標識化ジデオキシヌクレオチドの末端トランスフェラ
ーゼによる取り込みが挙げられるがこれらに限定されな
い。
【０１６６】本発明の別の局面は、適切に終結されてい
るプライマー標識化伸長産物の、終結されていないもの
からの分離によって、プライマー標識系に固有の限定を
克服することに関する。このような分離は、改変ターミ
ネーターヌクレオチドの特性を用いることによって達成
され得る。このことは、ターミネーターヌクレオチドに
予め存在するマーカー、または上記の合成後改変によっ
て行われ得る。マーカーの存在と非存在との間の適切な
物理的分離を可能にし得る任意の手段は、本発明の範囲
内であると考えられる。このような予め存在するマーカ
ーの例は、ビオチン、イミノビオチン、フルオレセイ
ン、ハロゲン、チオール、およびアミンからなり得るが
これらに限定されない。このようなマーカーを有する鎖
を物理的に配列決定する手段は、ハロゲン、チオール、
またはアミンに結合するアビジン、ストレプトアビジ
ン、抗体、および物理的マトリックスからなり得るがこ
れらに限定されない。標識化鎖のターミネーターヌクレ
オチドを欠く鎖からの分離の後、産物は、配列に適切な
形態において放出され得る。このような放出のための手
段の例は、抗体のようなタンパク質の、加熱または化学
処理を介する物理的変性からなるがこれらに限定されな
い。放出はまた、ジスルフィド架橋またはイミノビオチ
ンのような切断可能な（ｓｃｉｓｓａｂｌｅ）結合の使
用によって行われ得る。切断可能な結合の使用の方法
は、Ｗａｒｄの開示（先に引用）に記載される。精製し
た鎖からのシグナル生成は、プライマーとして使用され
るオリゴヌクレオチドにおいて、またはプライマーに付
加されているｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰヌクレオチド
において、マーカーによって行われ得る。
【０１６７】本発明のプロセスは、単一のチャンネルお
よび４つの異なる色素を使用する手順を含む全ての配列
決定手順、ならびに４つのチャンネルおよび１つの色素
を使用する手順のために、シグナル生成に適用され得
る。このような手順において生成されるシグナルは、走
査によってリアルタイムで分析され得る。
【０１６８】従って、本発明は、核酸配列決定のため
の、終結後標識プロセルを提供し、これは３つの工程を
含む。第１に、目的の核酸配列に対応する核酸フラグメ
ントは、各ヌクレオチド塩基についての、非タグ化また
は非標識化基質、非タグ化または非標識化プライマー、
ポリマー化酵素、緩衝液、および適切な非タグ化または
非標識化ターミネーターの存在下で生成される。ターミ
ネーターの各々は、内部配列がタグ化分子に実質的に非
反応性であり、そして化学反応が媒体またはマトリック
スにおけるフラグメントの分離を実質的に妨害しない条
件下で、タグ化分子に共有結合する化学反応基を含む。
次に、媒体またはマトリックスにおいて生成されるフラ
グメントが分離され、続いて、この媒体またはマトリッ
クスにおいてタグ化分子を検出する手段によって、分離
したフラグメントが検出される。
【０１６９】種々の実施態様は、上記の終結後標識プロ
セスに含まれ得る。生成工程において、例えば、ターミ
ネーターの化学反応基は、生成されるフラグメントへの
それらの酵素的取り込みの前に保護され得、次いで任意
のタグ化分子に共有結合する前に脱保護され得る。化学
反応基は、窒素、硫黄、または酸素原子を含み得る。さ
らに、上記のターミネーターにおける化学反応基は異な
り得るか、または同じであり得る。さらに、タグ化分子
は同じであり得るか、または各ターミネーターとは異な
り得る。当業者には、このようなタグ化分子が公知であ
り、そして蛍光色素、化学発光色素、赤外色素、化学発
光実体、および電子化学発光実体、またはそれらの組合
せからなる群から選択され得ることが容易に明らかであ
る。
【０１７０】終結後標識プロセスの記載されたばかりの
実施態様および特徴に加えて、分離工程は電気泳動的に
行われ得、そして媒体またはマトリックスは、ポリアク
リルアミドゲルのようなゲルを含み得る。分離はまた、
キャピラリーゲル電気泳動によって行われ得る。
【０１７１】検出に関して、この工程は、光度測定、分
光光度測定、比色測定、蛍光定量測定、遅延蛍光測定、
および化学発光測定、またはそれらの組合せから選択さ
れる手段によって行われ得る。
【０１７２】（発明の有用性）核酸配列の直線的および
非直線的増幅を行い得る、本発明の種々の局面は、等温
およびサーモサイクラー依存性方法についての先行技術
に記載される方法によって以前に行われている多くの機
能を満たし得る。これらとしては、配列決定、プローブ
合成および標識、法医学的同定、対立遺伝子同定、遺伝
的スクリーニング、所望の遺伝子の単離およびクローニ
ング、人工遺伝子構築、遺伝子発現、ならびに診断用同
定が挙げられ得るがこれらに限定されない。逆転写酵素
または逆転写が可能なＤＮＡポリメラーゼは、開始基質
としてＲＮＡ分子を用いて、本発明を実行するために使
用され得る。反応は、プライマーまたは試薬の任意の改
変の非存在下で行われ得るか、あるいは所望であれば、
標識または他の改変がなされ得る。増幅した配列の存在
は、標識化部分の取り込みまたは直接的視覚化のいずれ
かによって直接アッセイされ得る。同定の間接的手段も
また、適切なプローブとのハイブリダイゼーションによ
って行われ得る。これらの間接的手段としては、ドット
ブロット、スロットブロット、サザンブロットおよびプ
レートアッセイ形式が挙げられ得るがこれらに限定され
ない。
【０１７３】特定の核酸配列は、テンプレートに結合す
るプライマーに存在すること、または複数のプライミン
グ事象のための自己相補領域を作製することを必要とす
るが、さらなる核酸配列は、プライマー配列に含まれ
て、それらの存在により所望の特性が提供され得る。こ
れらとしては、所望の核酸配列およびアンプリコンの同
定または単離に使用される配列のさらなる増幅を可能に
するファージＲＮＡプロモーターが挙げられ得るがこれ
に限定されない。配列は、各末端で逆方向反復を有する
アンプリコンを作製するプライマーまたはプライマー構
築物に含まれ得る。次いで、このセグメントは、結合お
よび伸長のためにいずれかの鎖を使用し得る単一プライ
マーまたはプライマー構築物のための結合部位として使
用され得る。挿入された配列の選択は任意であるので、
このセグメントは、間の配列とは関係なく増幅に使用さ
れ得る普遍的な標的であり得る。
【０１７４】本発明によって提供されるのはまた、相補
的配列に対する熱力学的安定性が減少されている核酸配
列を生成するためのプロセスである。このプロセスにお
いて、負に荷電した化学部分を有する少なくとも１つの
改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが、生成
される核酸配列に取り込まれる。
【０１７５】本発明のさらなる提供は、直鎖状核酸、分
枝核酸、逆方向核酸、およびペプチド−核酸、または前
述のいずれかの組合せからなる群より選択される１本鎖
または２本鎖核酸ポリマーである。核酸ポリマーは、少
なくとも１つのプリンまたはピリミジン塩基を含み、こ
れらはポリマーの１つまたは両鎖において、１つの負に
荷電した化学部分を含む。
【０１７６】本発明はさらに、上記の種々のプロセスに
おける使用のために組成物およびキットを意図しそして
包含する。
【０１７７】以下の実施例は、本発明の種々の局面を例
示するために示されるが、本明細書下記の請求の範囲に
おいてより詳細に示され、そして規定されるような範囲
を限定することを決して意図されない。
【０１７８】
【実施例】（実施例１ ５３℃および６３℃でのＢｓｔ
ポリメラーゼによるＰＣＲ産物の等温増幅） （ｉ）ＨＢＶプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅 ＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイ（ＥＮＺＯ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＹ，ＮＹ）からのＨＢＶポ
ジティブコントロールを、ＰＣＲによる増幅のための標
的として使用した。製造業者によると、このＤＮＡは８
０ｐｇ／ｕｌ（ｕｌにつき１．２×１０7コピーのＨＢ
Ｖと同量）である。１ｕｌのＨＢＶ標的、１×ＰＥ緩衝
液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ
ｅ，ＣＡ）、４ｍＭのＭｇＣｌ2、２５０ｕｍのｄＮＴ
Ｐ、６単位のアンプリサーム（Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍ）
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、な
らびに１０ピコモルのＨＢＶオリゴプライマーＦＣおよ
びＲＣからなる５０ｕｌのＰＣＲ反応を実施した。 ＦＣ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡ
ＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＧＡＴＧＴＧＴＣ
Ｔ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’ ＲＣ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡ
ＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＡＧＧＴＴＴＴＧＣ
Ａ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１７９】この実施例において、ＦＣプライマーの
３’末端における２９塩基、およびＲＣプライマーの
３’末端における３０塩基は、テンプレートとしてＨＢ
Ｖ標的ＤＮＡを使用して伸長し得る第１のセグメントで
ある。ＦＣおよびＲＣプライマーの５’末端における３
０塩基は、テンプレートとしてＨＢＶ ＤＮＡを使用し
て、プライマーの伸長によって合成された最初の３０塩
基に相補的な第２のセグメントである。熱循環条件は、
９４℃を１’、５６℃を１５”、および６８℃を３０”
を３０サイクル行った。ＨＢＶ配列に基づいて、予想さ
れたＰＣＲ産物は長さが２１１ｂｐであるべきである。
ステムループ構造は、それぞれ、第２のセグメントおよ
びその相補体により与えられる３０塩基対のステム、な
らびにＦＣおよびＲＣの第１のセグメントにより与えら
れる２９および３０塩基のループを伴って、この生成物
のそれぞれの末端において起こり得る。
【０１８０】（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析 増幅は、０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下
で、０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いて流した４％Ｍｅｔａ
ｐｈｏｒアガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃ
ｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）中の１０ｕｌのサンプ
ルのゲル電気泳動によってアッセイした。ＵＶ照射下
で、３つのバンドが出現し、それらはＤＮＡサイズマー
カーによる判定で、長さがおよそ２１０、１８０、およ
び１７０ｂｐであった。２１０ｂｐに対応するバンド
は、予想された線状ＰＣＲ産物であり、そしておそらく
他の２つのバンドは、同じサイズのアンプリコンに対応
しており、ここで、二次構造が一方または両方のいずれ
かの末端上で形成され、それによってそれらの効果的な
移動度が変化している。
【０１８１】（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の等温増幅 上記のＰＣＲ産物の種々の希釈物５ｕｌは、１×Ｔｈｅ
ｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ，ＭＡ）、２００ｕＭのｄＮＴＰ、２０ピコモル
の正方向および逆方向プライマー、８単位のＢｓｔポリ
メラーゼ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ Ｍ
Ａ）からなる１００ｕｌの反応混合物中で使用された。
正方向プライマーはＦＣまたはＬＦＣのどちらかであ
り、逆方向プライマーはＲＣまたはＬＲＣのどちらかで
あった。ＦＣおよびＲＣプライマーの配列は上記に示し
た。ＬＦＣおよびＬＲＣプライマーは、ＦＣおよびＲＣ
プライマーだけの第１のセグメントに対応する配列を有
している。そのような配列は以下のとおりである： ＬＦＣ＝５’−ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴ
ＴＴ−３’ ＬＲＣ＝５’−ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣ
ＧＴＡ−３’。
【０１８２】インキュベーションは、３０分、１８０
分、もしくは終夜のインキュベーションであった。反応
温度は５３℃もしくは６３℃のどちらかであった。３０
分反応したものは２％アガロースゲルを用いてゲル電気
泳動で分析した；１８０分反応したものは４％Ｍｅｔａ
ｐｈｏｒアガロースを用いて分析した。
【０１８３】この分析結果を図１７に示す。３０分イン
キュベーションの後に取り出したサンプルの最初の組の
中で、ＰＣＲ産物の１０-2希釈物だけが５３℃でいくら
かの合成を示すが、６３℃からの反応物は、１０-2、１
０-3および１０-4希釈物で合成を示している。これらの
データは、合成量は加えた標的ＤＮＡの量に依存すると
いうことを示している。１８０分の合成の後に取り出さ
れたサンプルの組では、実質的により多くの合成が行わ
れている。これらの反応の生成物は、分離したパターン
を形成する一連のバンドである。これは、通常ＰＣＲで
見られる単一の分離したバンド、またはＰＣＲ増幅の後
でＬＣおよびＲＣプライマーを用いて以前に見られた２
つもしくは３つのバンドと対照をなしている。この複数
のバンドは、おそらく、アンプリコンをプライマーおよ
びテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因
し得るか、またはストランドスイッチングの徴候であり
得る。５３℃で３時間インキュベーションした後、標的
が少しもないようなコントロールでさえ、実質的な合成
の証拠を示している。しかし、標的テンプレートを有す
るすべての５３℃の反応物に見られる、単一の標的依存
性パターンが存在し、そして標的なしのコントロールに
存在するパターンは実質的に異なることが留意され得
る。これはおそらく標的が合成を開始した経路が異なっ
ていることに起因する。６３℃でインキュベーションし
たものは、全てのテンプレート希釈物で実質的な合成を
示し、そして同じパターンが５３℃の反応によって生成
されることを証明する。しかし、本実施例においては、
６３℃では、標的非依存性増幅の証拠はない。１０-5の
希釈でさえ実質的な量の合成があるということは、この
系が実質的な増幅をし得ることを示している。終夜のイ
ンキュベーションもまたゲルによって分析され、そして
３時間インキュベーションと同じパターンおよび同じ量
を示した（データ表示なし）。
【０１８４】（実施例２ ＨＢＶ配列の等温増幅の時間
経過／感度） （ｉ）増幅 Ｅｃｏ Ｒ１であらかじめ消化されたＨＢＶプラスミド
ＤＮＡを、等温増幅のテンプレートとして使用した。Ｄ
ＮＡ混合物は、 ＦＣおよびＲＣプライマーがそれぞれ
４０ｐＭ、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｂ
ｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）および４×１０
6、４×１０4、または０ ＨＢＶ分子を含む１００ｕｌ
からなった。これらはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｅｍ
ｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）製のサーモサイクラーモデル
４８０を使用して５分間で９４℃まで熱した。次いで装
置を６３℃で４８０分セットした。ブロックを６３℃に
調節した後、酵素混合物２５ｕｌを含有する個々のチュ
ーブをサーモサイクラーブロックの中に置いた。それぞ
れの酵素混合物チューブは、４単位のＢｓｔポリメラー
ゼ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ Ｍ
Ａ）、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏ
ｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、および４００ｕＭ
のｄＮＴＰを含有した。ＤＮＡ混合物、および酵素混合
物を６３℃に調節した後、２５ｕｌのサンプルをそれぞ
れのＤＮＡ混合物から採取し、合計容量がそれぞれ５０
ｕｌになるようにそれぞれの酵素混合物チューブに加え
た。ＤＮＡ混合物のそれぞれのチューブ用として、３件
のサンプルを採取した。それぞれのＤＮＡ濃度用につい
てひとつのサンプルを、２、４、および８時間後に６３
℃のブロックの外に取り出した。
【０１８５】（ｉｉ）増幅のアッセイ 標的依存性増幅と標的非依存性増幅とを区別するため
に、マイクロタイタープレートアッセイを標的特異的配
列の存在を検出するために使用した。このアッセイ用に
使用される試薬および説明書は、ＬＣおよびＲＣプライ
マーによって作られたアンプリコンに特異的なプレート
およびシグナルプローブを置換して、ＥＮＺＯ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）製
のＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイから得られ
た。
【０１８６】（ｉｉｉ）マイクロタイタープレートの調
製 プレートを、それぞれにおいて１２個の（ダイネル？）
ストリップ（製造業者）を有する５個のフレームを使用
したバッチプロセスで調製した。これらのプレートに使
用した捕獲オリゴヌクレオチドの配列は、ＦＣおよびＲ
Ｃプライマーの間にあるＨＢＶの領域に由来し、そして
以下のとおり記載される： ５’−ＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴ ＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴ
ＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴ−３’。
【０１８７】それぞれのマイクロタイタープレートのウ
ェルを１Ｍ酢酸アンモニウム２００ｕｌで２回リンス
し、次いで室温で２時間逆さにしておいた。上記捕獲オ
リゴヌクレオチド１００ｕＭを含有する溶液１０ｕｌ
を、１Ｍ酢酸アンモニウム２７．５ｍｌと混合した。こ
の溶液の５０ｕｌをそれぞれのウェルに加え、そしてプ
レートを、１Ｍ酢酸アンモニウム入りの開口容器と共に
インキュベーター中で３７℃で終夜インキュベートし
た。翌日、それぞれのウェルを１Ｍ酢酸アンモニウム２
００ｕｌで一回洗浄し、およびプレートを終夜乾燥し
た。次いでストリップは将来使用するために乾燥剤と共
にポーチ中に放置した。
【０１８８】（ｉｖ）プローブの調製 増幅のためのプライマーとして使用されるＲＣオリゴヌ
クレオチドは、プレートアッセイのためのシグナルプロ
ーブとしても使用される。ＲＣオリゴヌクレオチド１０
０ｕＭのＴ−テーリングは、ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）からの末端
テーリングキットの使用によって達成された。テーリン
グしたＲＣオリゴヌクレオチド２６ｕｌを、シグナルプ
ローブ緩衝液（３３％脱イオン化ホルムアミド、５ｍＭ
のＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００、２．５％デキストラン硫酸、０．１５ＭのＮａＣ
ｌ、０．１２ＭのＨＥＰＥＳ（遊離酸）、０．０１％フ
ェノールレッド）１２．８ｍｌと混合した。
【０１８９】ｅ）反応物からのサンプルを用いたマイク
ロタイタープレートアッセイの結果を以下に示す： ２時間 ４時間 ８時間 １×１０6標的 ０．４１３ １．４９１ １．４１９ １×１０4標的 ０．２０３ ０．０９８ １．０１７ 標的なし ０．０８６ ０．０８５ ０．０６３ 上記に見られるように、生成物の量は、初期の標的の量
および反応が進行する時間量の両方と関係があった。標
的がないときに形成された任意の生成物から発生したシ
グナルもなかった。またこのアッセイでは１．４以上の
値は飽和値であり、そして生成物の量は、はるかに大き
くなり得る。生成物の全量の評価には、それがアッセイ
のダイナミックレンジに入るまで生成物を希釈すること
が要求される。しかし、この実施例の目的のために、こ
れを実行しなかった。上記の増幅反応は、Ｂｓｔポリメ
ラーゼの使用には依存しない。違う酵素Ｂｃａポリメラ
ーゼ（ＰａｎＶｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が置換
される場合、実質的な量の合成もプレートアッセイ（デ
ータ表示なし）に見られ得る。さらに、Ｂｓｔ反応の最
大温度は６３℃であるようであるが、 Ｂｃａポリメラ
ーゼが置換された場合、増幅が６８℃で達成され得る。
それぞれの酵素に添付された文献によると、Ｂｓｔおよ
びＢｃａポリメラーゼの最適な温度はそれぞれ６５℃お
よび７０℃である。このことはそれらの最高温度が５℃
違うことを説明し得る。
【０１９０】（実施例３ ΔＴｔｈのポリメラーゼでの
増幅）ＢｓｔまたはＢｃａポリメラーゼの熱不安定性に
より、前実施例における反応は２つの段階で達成されな
ければならなかった。標的ＤＮＡの変性は、ポリメラー
ゼの不存在下で行われ、続いてより低温での平衡の後に
酵素が添加された。取り扱う工程を減少させ、およびア
ンプリコンキャリーオーバーの混入の機会を減少させる
ように、初期の段階においてポリメラーゼを含め得るこ
とが所望される。従って、等温増幅を達成するためのＴ
ｔｈのポリメラーゼの５’−３’エキソ誘導体の使用を
許容する条件が確立された。この特定の実施例におい
て、ＦＪおよびＲＪと称される２つのプライマーを使用
し、これは以下の配列を有していた： ＦＪ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡ
ＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＣＴ ＧＧＡＴＧ
ＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’ ＲＪ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡ
ＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＴＧＣ ＡＧＧＴＴ
ＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１９１】これらのプライマーのそれぞれは上記のＦ
ＣおよびＦＪプライマーと、それらが各々の第１のセグ
メント中に３つ多いヌクレオチド（上記下線部）を有し
ていることを除いて類似している。反応を１×１０6、
１×１０4、または１×１０2ＨＢＶ標的分子を用いて設
定した。１つの反応物は、ＨＢＶ ＤＮＡの代わりにＴ
７ ＤＮＡを５０ｎｇ含有し、そしてこれを標的なしの
コントロールとして使用した。反応条件は以下のとおり
である：２つの相で実施されなければならない等温増幅
を制限する；第１の工程は標的分子の９４℃の高温変性
であった。
【０１９２】（ΔＴｔｈのポリメラーゼでの増幅）Ｂｓ
ｔまたはＢｃａポリメラーゼの熱不安定性により、前実
施例における反応は２つの段階で実施されなければなら
なかった。標的ＤＮＡの変性を、ポリメラーゼの不存在
下で実施し、続いてより低温での平衡の後に酵素を添加
した。取り扱う工程を減少させ、およびアンプリコンキ
ャリーオーバーの混入の機会を減少させるように、初期
の段階においてポリメラーゼを含め得ることが所望され
る。従って、等温増幅を行うためのＴｔｈのポリメラー
ゼの５’−３’エキソ誘導体の使用を許容するように条
件が確立された。この特定の実施例において、ＦＪおよ
びＲＪと称される２つのプライマーを使用し、これは以
下の配列を有していた： ＦＪ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡ
ＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＣＴ ＧＧＡＴＧ
ＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’ ＲＪ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡ
ＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＴＧＣ ＡＧＧＴＴ
ＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。
【０１９３】これらのプライマーのそれぞれは上記のＦ
ＣおよびＦＪプライマーと、それらが各々の第１のセグ
メント中に３つ多いヌクレオチド（上記下線部）をそれ
ぞれ有していることを除いて類似している。等温反応ま
たはＰＣＲ反応のいずれかが、５０ｕｌの反応容積中で
１×１０6、１×１０4、または１×１０2ＨＢＶ標的分
子と共に行われた。標的なしのコントロールはＨＢＶ
ＤＮＡの代わりに５０ｎｇのＴ７ ＤＮＡを含有したも
のも含んだ。それぞれの標的濃度は、ΔＴｔｈのポリメ
ラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）１０単位、１×ΔＴｔ
ｈのポリメラーゼ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、２５
０ｕＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１×ＰＣ
Ｒエンハンサー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ならびにそれぞ
れが２０ピコモルのＦＪおよびＲＪプライマーを含む１
００ｕｌの反応混合物中で設定した。それぞれの混合物
を２つの５０ｕｌの部分に分けた。一方の５０ｕｌの部
分は、９４℃までの５分間の加熱、続いてサーモサイク
ラーの中で６８℃で２４０分間置くことによる等温反応
で使用した。他方の部分は、等温反応が終了するまで４
℃で保持し、そしてサーモサイクラーを用いて、９４℃
で１分間、そして６８℃で４５秒間を３５サイクル行
い、この部分でのＰＣＲを実施した。
【０１９４】等温反応の程度は、前記実施例で説明した
ように、ゲル電気泳動およびプレートアッセイによって
測定した。プレートアッセイは、Ｔ−テイル化プローブ
が、ＬＦＣプライマーに由来することを除いて上記のと
おりに実施した。各々のこれらの方法に基づく結果を図
１８に示す。ゲル電気泳動は、等温増幅後に１×１０ 6
および１×１０4の標的反応物について広範な合成を示
す。写真ではよく見えないが、ゲルは１×１０2の標的
反応物についてより小さなレベルの増幅も示した。ＰＣ
Ｒ反応も同じゲル中で調査した。そして１×１０6およ
び１×１０4の標的反応物について高いレベルの増幅を
伴った本質的に類似の結果を示す。これらの条件下で
は、適切なアンプリコンの合成量とは反対に増加するよ
り小さいアンプリコンを作り出した非特異的反応も見ら
れた。等温反応がプレートアッセイによってアッセイさ
れた場合も、より高いレベルの標的が飽和レベルを示
し、そして１×１０4の標的レベルがポジティブな反応
を与えると明確に示され得る。ネガティブなコントロー
ルは、２つのアッセイのいずれによってもシグナル発生
の徴候を示さないことに留意するべきである。
【０１９５】（実施例４ 増幅のための単一プライマー
の使用）それぞれのサンプルは、１×Ｔａｑ緩衝液（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃ
Ａ）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００ｕＭのｄＮＴＰｓ、
および５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（ Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ ）
を含む５０ｕｌの反応物からなった。それぞれの反応
は、以下の配列を有する５ｐＭのオリゴヌクレオチドプ
ライマーも有している： ５’ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡ ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ Ｇ
ＡＣＡＡＡＣＧＧＧ ＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴ ＣＣＴＧ
ＣＴＧＣＴＡ ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’。
【０１９６】単一プライマー増幅は、標的ＤＮＡ（実施
例１で上記の１ｕｌのコントロールＨＢＶ）ありもしく
は無しで２連で実施した。反応は、サーモサイクラー中
で９４℃で１サイクル、次いで９４℃１分間、６０℃１
５秒間、および６８℃１５秒間を５０サイクル行うこと
で実施した。非特異的プライミングを還元するために、
サンプルは初めのサイクルの間に９０℃に達するまで、
サーモサイクラーブロックに加えなかった。
【０１９７】反応の程度を、実施例２で説明した同じプ
レート、プローブ、および形式を使用してマイクロタイ
タープレートアッセイによって分析した。反応（２連）
の結果を以下に示した： ＨＢＶ＋ １．４０７ ０．３７７ 標的なし ０．０８３ ０．０８７。
【０１９８】上記に見られるように、２連の反応物から
生じるシグナルの量においていくらか変動が存在する
が、単一プライマーを伴う増幅を実行した後、標的配列
の存在の明らかな指標が存在した。
【０１９９】（実施例５ カルボキシ−ｄＵＴＰを伴う
プライマー伸長） （ｉ）カルボキシ−ｄＵＴＰの合成 ０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）中に１
００マイクロモルのアリルアミン−ｄＵＴＰ（ＥＮＺＯ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，
ＮＹ）を含む溶液５ｍｌを、５ｍｌのジクロロメタン
（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に溶解
した２０倍モル過剰の無水コハク酸（ Ａｌｄｒｉｃ
ｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ ）と共に混合した。こ
の懸濁液を５０ｍｌのファルコンチューブに移し、そし
てボルテックスした。水相のｐＨを、適量のトリエチル
アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）
を添加することで９．２の値に再調整した。振盪および
再調整をｐＨ値が安定するまで継続した。一定分量を採
取し、アリルアミンのピークの消滅、およびカルボキシ
改変生成物を表す遅れたピークの出現に対してＨＰＬＣ
で試験した。水相を取り除き、そして水で１０倍に希釈
し、そして０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム
緩衝液（ｐＨ７．８）で前もって平衡化したＤＥＡＥ−
ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−５０カラム中へ充填した。生成物
を炭酸水素トリエチルアンモニウムの０．０５Ｍ〜０．
７０Ｍの勾配で抽出した。フラクションを採取し、２９
０ｎＭでのＵＶ吸収で分析した。適切なフラクションは
ＨＰＬＣで純度をチェックした。＞９９．５％の純度を
有するフラクションを一緒にプールし、そして塩を３０
℃の真空中でロータリーエバポレーターで除去した。残
留している固形物は適切な量の水に溶解し、および２９
０ｎＭでの吸収により判定した場合に最終的に１０ｍＭ
の濃度に調整した。一定分量を調製し、そして使用する
まで−７０℃で貯蔵した。
【０２００】（ｉｉ）プライマー伸長反応 プライマー伸長のためのテンプレートは、ＨＢＶの１．
４ｋｂ挿入断片を含んだｍｐ１８クローンに由来するフ
ァージ粒子のＰＥＧ沈澱によって得られた１本鎖ＤＮＡ
であった。伸長のためのプライマーは、その配列がｍｐ
１８ベクターのｌａｃ領域の部分に対して相補的である
ＰＭ−１であった。このプライマーに由来する配列は以
下の通りである： ５’−ＣＧＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＧ
Ｔ ＣＡＣ ＧＡＣ−３’。
【０２０１】７．５ｕｇの１本鎖ＤＮＡおよび６０ｐＭ
のＰＭ１プライマーを含有するＤＮＡ混合物３００ｕｌ
を作製した。０．５ｕｌのポリメラーゼ、２×緩衝液、
および２００ｎＭのｄＮＴＰを含有する分離した酵素混
合物２５ｕｌを作製した。ここでそれぞれの条件につい
てひとつの反応物は通常のＴＴＰを有し、およびひとつ
の反応物はカルボキシ−ｄＵＴＰを有した。２５ｕｌの
ＤＮＡ混合物を、２５ｕｌの酵素混合物と混合し、そし
て３０分間適切な温度でインキュベートした。
【０２０２】次のポリメラーゼをこの実施例で使用し
た：Ｅｘｏ（−） Ｋｌｅｎｏｗ（Ｑ単位／ｍｌ、ＮＥ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡより）、Ｔａ
ｑポリメラーゼ（Ｔ単位／ｕｌ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより）、およびＢｓｔ
ポリメラーゼ（４単位／ｕｌ、ＮＥ Ｂｉｏｌａｂｓ，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡより）。
【０２０３】緩衝液およびそれらの組成は以下のとおり
である：１×ＮＥ緩衝液２（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、およ
び１ｍＭのＤＴＴ（２５℃でｐＨ７．９）からなる。
【０２０４】緩衝液２Ａは、ｐＨが７．１であり、そし
てＭｇＣｌ2が２ｍＭだけであること以外はＮＥ緩衝液
２と同じであった。
【０２０５】緩衝液２Ｍは、ＭｇＣｌ2が２ｍＭだけで
あり、そして１ｍＭのＭｎＳＯ4も含んでいること以外
はＮＥ緩衝液２と同じであった。
【０２０６】１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎ．Ｅ．
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は、２０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ
のＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭのＭｇ
ＳＯ4、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００から
なる。
【０２０７】（ｉｉｉ）プライマー伸長反応の分析 様々なポリメラーゼが基質としてカルボキシ−ｄＵＴＰ
を利用する能力の評価は、多数の違った方法で実施され
得る。本実施例において、これは、標識された前駆体を
使用せずに、ゲル分析による１本鎖ＤＮＡの２本鎖形態
への転換の評価によって定性的に観察された。この転換
現象は、１本鎖前駆体と比較してのアガロースゲル中で
のその移動の遅延によって、およびより効率的に臭化エ
チジウムに結合するその能力に起因する蛍光の増加によ
って見られ得る。この方法は、カルボキシ−ｄＵＴＰの
取り込みの研究の初期の評価で使用されたが、さらなる
情報が、制限酵素で伸長生成物を消化することで得られ
得る。この分析で使用される特定の制限酵素は１本鎖Ｄ
ＮＡを消化出来ないので、フラグメントの生成が制限酵
素部位で２本鎖領域の指標である。環状ＤＮＡの線状小
片への変形によって、異なったポリメラーゼによる転換
量の比較評価をするのがより容易になる。加えて、様々
な制限フラグメントの位置がプライマーに関連して知ら
れているので、伸長した生成物の長さの評価が可能とな
る。
【０２０８】（ｉｖ）制限酵素での消化 プライマー伸長反応からのテンプレートが改変していな
いＤＮＡからなるので、カルボキシ−ｄＵＴＰの反応
は、正常である一方の鎖、およびどのＴも認識部位の部
分である限り半置換された制限部位を生成するカルボキ
シ−ｄＵ誘導体で完全に置換された相補鎖を含む。評価
のために使用した酵素は、ＢｓｔＮ１であり、その認識
配列は、ＧＧ Ａ／Ｔ ＣＣである。コンピュータープ
ログラムＭａｃＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃ
ａ，Ｌｔｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃ
ｏ，ＣＡ）を個別にＧＧ（Ｔ）ＣＣ およびＧＧ（Ａ）
ＣＣ部位の位置を予測するために用いた。
【０２０９】（ｖ）反応の分析 図１９は、種々の緩衝液、酵素および温度を用いた伸長
反応の結果を示す。はじめに非置換ｄＮＴＰを用いた反
応が、カルボキシ−ｄＵＴＰを用いた反応と異なるパタ
ーンを形成することが認められ得た。生成物におけるＧ
Ｇ（Ｔ）ＣＣおよびＧＧ（Ａ）ＣＣ配列の位置の分析に
よって、非置換反応のＢｓｔＮ１消化からのパターン
が、ＧＧ（Ｔ）ＣＣおよびＧＧ（Ａ）ＣＣ部位の両方で
の期待された消化に起因するが、カルボキシ−ｄＵＴＰ
の反応がＧＧ（Ａ）ＣＣ配列でのみ消化を示したことが
示された。反応はまた、基質としてｄＵＴＰを使用して
行い、そして全ての部位に消化が存在し、このことはＢ
ｓｔＮ１による消化に対する耐性の原因がｄＵの使用よ
りはむしろカルボキシおよびそのリンカーの存在であっ
たことを示す（データは示していない）。図２０は、非
合成についての（−）から、わずかに可視についての
（＋／−）および（＋＋＋＋）の評価付けまでの評価さ
れた合成のレベルに関する図１９からの結果の編集であ
る。一般に、カルボキシ−Ｕ取り込みのための最もよい
合成は、Ｂｓｔポリメラーゼ／Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝
液条件で見られた。
【０２１０】（実施例６ ＰＣＲにおけるＭｇ＋＋の必
要性に対するカルボキシル−Ｕの効果）ＰＣＲ増幅を、
テンプレートとして２本鎖Ｔ７ ＤＮＡ、ならびにプラ
イマーとして２つのオリゴヌクレオチドＴＳ−１および
ＴＳ−４を用いて行った。これらのオリゴヌクレオチド
は、１９９５年１２月１５日出願された米国出願第０８
／５７４，４４３号に以前に記載され、そして６２２塩
基対産物を生成する。４００ｎｇのＴ７ ＤＮＡ、５０
ｐＭのＴＳ−１、５０ｐＭのＴＳ−４、１×ＰＥ緩衝液
（ＢＲＬ）２００ｍＭ ｄＮＴＰ、および１５ユニット
のＴａｑポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からなる１００μｌの反応を
行った。サイクリング条件は、９４℃で５０秒間、５０
℃で２５秒間および６８℃で３分間の２５サイクルであ
った。図２１にこの合成の結果を示す。通常のヌクレオ
チドを反応についての基質として使用した場合、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2は増幅に適切であった。対照的に、反応を
カルボキシ−ｄＵＴＰを用いて行った場合、２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2はオリゴのダイマーのみ生成し、最低３ｍＭＭ
ｇＣｌ2が適切なサイズのアンプリコンの合成に必要で
あった。
【０２１１】（実施例７ 種々の熱安定ポリメラーゼ）
増幅を、全ての反応を３ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在で行
い、そして５ユニットのポリメラーゼのみを各反応に使
用したことを除いて実施例Ｘ−２２で記載されているよ
うに行った。Ｔａｑポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をＴｆｌ、Ｔｔ
ｈ、ＡｍｐｌｉｔｈｅｒｍおよびＲｅｐｌｉｔｈｅｒｍ
ポリメラーゼ（全てＥｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ ＷＩから）と比較した。全ての反応は、各酵素とと
もに供給された緩衝液を使用した。反応のゲル分析を、
図２２に示す。Ｔａｑの量を少なくさせると、実施例６
で見られた反応と比較してカルボキシ−ＵＴＰの存在下
で合成がかなり減少した。通常のＴＴＰでは全く効果が
なかった。他のポリメラーゼについて、評価可能な量の
生成物を与えたたった１つの酵素はＴｔｈポリメラーゼ
であり、そしてこれは使用した条件下でＴａｑポリメラ
ーゼよりもより活性であった。
【０２１２】（実施例８）実施例７において、種々のポ
リメラーゼを用いる反応を、３ｍＭ ＭｇＣｌ2の存在
下で行った。しかし、これらのポリメラーゼのいくつか
による合成の欠失は、カルボキシ−ＵＴＰが基質の場
合、異なるＭｇ++の濃度の必要性を反映し得る。カルボ
キシ−ＵＴＰの存在下で合成を示さなかったが、通常の
ＴＴＰで多量の合成を与えた酵素の１つは、Ｔｆｌポリ
メラーゼであった。この酵素を、上記と同じ反応条件下
で試したが、２ｍＭ、４ｍＭおよび６ｍＭのＭｇＣｌ2
レベルを反応に使用した。さらに、同じ力価測定を、Ｐ
Ｅ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およ
び５μｌのＰＣＲ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を添加したＴｆｌポ
リメラーゼを用いて使用した。この結果を、図２３に示
す。使用した条件下で、６ｍＭ ＭｇＣｌ2がＴａｑポ
リメラーゼの合成に最良の量を与え、そしてＴｆｌ単独
では、２、４、または６ｍＭ ＭｇＣｌ2で合成を示さ
なかった。しかし、ＰＣＲ Ｅｎｈａｎｃｅｒをその反
応に含ませた場合、Ｔｆｌポリメラーゼは、検出可能な
合成量を生成し得た。Ｔａｑと同様に、最も高いレベル
を６ｍＭ ＭｇＣｌ2で達成した。Ｔｆｌ／ＰＣＲ Ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ反応について示された合成のレベルはま
た、Ｔａｑ反応よりも高かった。ＰＣＲ Ｅｎｈａｎｃ
ｅｒをカルボキシ−ＵＴＰを用いる増幅のために、他の
熱安定ポリメラーゼＴｔｈ、Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍおよ
びＲｅｐｌｉｔｈｅｒｍを用いて試した。この結果を、
図２４に示す。 Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍポリメラーゼに
よって増幅を回復し得なかったが、 Ｒｅｐｌｉｔｈｅ
ｒｍポリメラーゼについては、ここで合成が示された。
実施例７でカルボキシ−ＵＴＰを用いて増幅を示す唯
一のＴａｑ以外のポリメラーゼであったＴｔｈポリメラ
ーゼは、ＰＣＲ Ｅｎｈａｎｃｅｒを用いた最も高いレ
ベルの増幅を示した。また、一連のＴｔｈ／ＰＣＲ Ｅ
ｎｈａｎｃｅｒについて、８ｍＭ ＭｇＣｌ2を用いた
反応が６ｍＭ ＭｇＣｌ2の反応よりも多い増幅を与え
た。
【０２１３】（実施例９ 増幅の温度条件の改変）２つ
のオリゴヌクレオチド、ＴＳ１３およびＴＳ１４は（こ
れらはまた、ＥＮＺに記載された（？））を、カルボキ
シ−ｄＵＴＰの存在下でバクテリオファージＴ７ ＤＮ
Ａの異なったセグメントの増幅のために使用した。これ
らのプライマーの生成物は、以前の実施例で合成された
生成物より小さな１３６ｂｐのアンプリコンである。連
続的な一連のＰＣＲ反応は、２相で行った。各反応はＴ
ｔｈポリメラーゼならびに上記のＰＣＲ Ｅｎｈａｎｃ
ｅｒを使用した。各反応における第１相は、両方の鎖に
カルボキシ−ｄＵを含むテンプレートを作製するために
上記のサイクリング条件を使用する一連の５サイクルで
ある。各反応における第２相は、アニーリング工程、伸
長工程または変性の工程についての種々のより低い温度
を使用した。変動温度の予備的な試みは、８０℃未満の
温度がこのアンプリコンを用いて増幅を行うにおいて首
尾良くないことを示し、その結果、最も高い温度と最も
低い温度の間の差を近づける努力を、アニーリング温度
を上げることによって行った。各セットの温度条件につ
いて、ＭｇＣｌ2レベルもまた、変化させた。３セット
のこれらの反応のゲル分析から得た結果の編集を、以下
に与える：
【０２１４】
【表１】
【０２１５】上記の反応に加えて、一連の反応を、６８
℃で２分間のアニーリング／伸長工程と組み合わせた８
０℃で２分間の変性工程を用いて行った。種々の因子も
また、反応の効率が増大し得るか否かを見るために、こ
の圧縮サイクルに含ませた。これらの反応からの生成物
を伴うゲルを、図２５に示す。最高と最低の温度の間の
１２℃ほどの小さな差でもアンプリコンの増幅がなお存
在し、そしてこれらの温度条件下での合成を増幅するよ
うである唯一の因子は、さらなるポリメラーゼの添加で
あると理解され得る。
【０２１６】（実施例１０ プライマー配列における改
変による圧縮温度増幅条件に対する効果）上記のＴＳ１
３およびＴＳ１４プライマーに加えて、最高温度と最小
温度の間の範囲がさらに圧縮され得るか否かを見るため
にこれらの配列の変化を有するプライマーを設計した。
ＴＳ１３、ＴＳ１４プライマーのための配列およびそれ
らの改変ならびにそれらが由来したＴ７ゲノムの領域
を、図２６に示す。これらのプライマーの配列の違い
は、アンプリコンのサイズにおいていくつかの小さな変
化をつくるが、本質的に同じＴ７セグメントはこれらの
プライマーを用いた各反応で増幅された。
【０２１７】一連の反応を、図２６からプライマーの種
々の組み合わせを用いて行った。８０℃で２分間および
６８℃で２分３０秒間の２０サイクルを用い、変性工程
とアニーリング／伸長工程との間で１２℃の分離のみで
あった。これらの反応のゲル分析を、図２７に示す。全
てのプライマーの組み合わせは、適切なバンドの増幅を
示したがそれらの効率に違いが存在した。コントロール
もまた、正常のｄＴＴＰまたはアリルアミン−ｄＵＴＰ
のいずれかがカルボキシ−ｄＵＴＰの代わりに使われた
反応のこのセットに含まれた；これらの反応は、検出可
能なレベルの増幅を与えなかった。
【０２１８】プライマーの同じ組み合わせを、８０℃で
２分間および７２℃で２分３０秒間の２０サイクルで増
幅反応において試した。これらの反応のゲル分析を、図
２８に示す。これらの温度条件において、ほとんどのプ
ライマーの組み合わせは増幅し得なかった。しかし、プ
ライマー対の１つとしてＴＳ２３プライマーを含んでい
た全ての反応は、増幅を与えた。ＴＳ２３プライマーと
ともに用いられた他のプライマーに関して、増幅の相対
的レベルは、ＴＳ２１＞ＴＳ２２＞ＴＳ１３の順番であ
った。他の因子が含まれることもあり得るが、この順番
付けは、テンプレート鎖のセグメント中に存在するカル
ボキシ−ｄＵＴＰ部分、ここに、プライマーが結合する
数に対して逆の関係に関し得る。なぜなら、ＴＳ２１、
ＴＳ２２、ＴＳ１３プライマーについてそれぞれ１０、
１１、１４であるからである。図２８に示した結果は、
カルボキシ−ｄＵＴＰを基質として用いる場合、増幅が
変性温度とアニーリング／伸長温度との間がたった８℃
の違いで行われ得ることを示す。
【０２１９】（実施例１１ プライマー伸長生成物の合
成後の改変）プライマー伸長反応を、アリルアミンｄＵ
ＴＰの存在で行った。反応のためのテンプレートは、以
下の配列を有した； ５’−ＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡ ＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧ
ＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣ ＴＧＣ
ＡＧＡＡ−３’。
【０２２０】反応に用いたプライマーは、前記のＴＳ１
４であった。反応混合物は、各反応についての１２μｌ
の最終容量について１μｌのＴＳ１４プライマー（１０
０ｐｍｏｌｅｓ）、１μｌのテンプレート（１００ｐｍ
ｏｌｅｓ）、２μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μｌの
４００μＭ ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ、２μｌア
リルアミン ｄｄＵＴＰ（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）、１μｌのＡ
ｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、１〜３μｌ
のＴＡＰＳ緩衝液および０〜２μｌのＨ2Ｏからなっ
た。ＴＡＰＳ緩衝液は、他の指示がない限りｐＨ９．６
で２００ｍＭ ＴＡＰＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）、５００ｍＭ ＫＣｌからなった。反応は、
種々のレベルのＴＡＰＳ緩衝液を有し、そしてｐＨもま
た種々であった。各反応についての詳細を与え、そして
反応における量を評価し、そして図２９および３０に記
載する。コントロールとして、酵素を含まないまたはア
リルアミンｄｄＵＴＰの代わりにフルオレセインｄｄＵ
ＴＰ（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆａｒｍｉ
ｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いた反応もまた含んだ。反応
混合物を、９４℃で１分間加熱し、次に６８℃で１時間
インキュベートした。
【０２２１】反応物を、微小遠沈管中で短時間遠心分離
し、そして１μｌの５０ｍＭフルオレセイン−５（６）
カルボキシアミド−カプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（Ｆ１−ＮＨＳエステル）を各反応物
に添加し、そして３７℃で３時間インキュベートした。
合成および標識の程度を、アクリルアミドゲル電気泳動
により評価した。フルオレセイン標識は、ＵＶ照射器上
にゲルを置き、そしてＷｒａｔｔｅｎ ５８ Ｋｏｄａ
ｋ Ｆｉｌｔｅｒ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）を用いてポラロイド写真を撮ることにより同定し
た。次いでゲルを、２０分間エチジウムブロミドで染色
し、続いて２０分間脱染色し、そして通常のフィルター
を用いて写真を撮った。図２９は種々の反応条件の各々
の取り込まれたフルオレセイン（一番上のゲル）および
エチジウムブロミド染色（底のゲル）により提供される
蛍光を示す。これらのゲルの写真はまた、スキャンし、
そしてそれら各々のネガを作った。この結果を、図３０
に示す。ネガは、実験の結果のよりよい評価を提供す
る。反応に用いられる種々の条件下で蛍光シグナルを生
成し得る、生じた伸長生成物が存在することが写真上に
見られ得る。最も高いレベルは、ｐＨ９．７で３×ＴＡ
ＰＳで達成されたようである。この実験はまた、フルオ
レセインで予め改変したｄｄＵＴＰを用いたコントロー
ルよりも合成後改変でより高いシグナルの生成があるこ
とを示した（レーン８）。下方のゲル中で見られる合成
の程度はまた、たとえ予め改変したｄｄＵＴＰの最小の
取り込みが存在したとしても、通常の塩基の取り込みが
存在したレーン８における上位のバンドの存在で見られ
得、このアプローチの有用性を示す。
【０２２２】多くの明らかな改変は、本発明の上記の詳
細な説明を鑑みて当業者に示唆される。全てのそのよう
な明らかな改変は、十分に考えられ、これ以下の請求の
範囲に示す本発明の範囲および精神により包含される。
【０２２３】本発明は、直線的および非直線的な増幅を
含む、目的の核酸配列を増幅させるための新規プロセス
を提供する。直線的な増幅において、単一の初期プライ
マーまたは核酸構築物が増幅プロセスを行うために利用
される。非直線的な増幅においては、第１の初期プライ
マーまたは核酸構築物は続く初期プライマーおよび核酸
構築物を用いて使用される。本発明によって提供される
他の非直線増幅プロセスにおいて、第１の初期プライマ
ーまたは核酸構築物は、提供される目的の特定の核酸配
列およびその相補体を増幅するために第２の初期プライ
マーまたは核酸構築物を用いて配置される。非直線的な
増幅が可能な単一のプライマーまたは単一の核酸構築物
はまた、本発明に従う非直線的な増幅を行うためにも使
用され得る。核酸配列決定のための終結後標識プロセス
もまた、鎖ターミネーターとして提供された化学的反応
基に共有結合したタグ化分子の検出に基づく本発明中で
開示される。相補的な配列に対する熱力学的安定性が減
少した核酸配列を生成するためのプロセスもまた提供さ
れ、そして本発明によって達成される。他の新規組成
物、キット等に加えて、独特の核酸ポリマーもまた開示
され、そして提供される。
【０２２４】
【発明の効果】本発明により、核酸増幅、核酸配列決
定、および重要な特徴（例えば、低減した熱力学的安定
性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能であ
る新規のプロセスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】新規のプライマーによる直線的増幅を示す模式
図である。
【図２】新規のプライマーおよび標準的なプライマーに
よる非直線的増幅を示す模式図である。
【図３】一対の新規のプライマーによる非直線的増幅を
例示する模式図である。
【図４】それらの配列の一部を、テンプレートとして使
用されることから防ぐ改変を含む、一対の新規のプライ
マーによる非直線的増幅を示す模式図である。
【図５】構築物の一部がテンプレート依存性伸長後にヘ
アピン形成し得る２つの３'末端を有する核酸構築物に
よって行われ得る一連の反応を示す模式図である。
【図６】図５に示されるプロセスおよび事象の続きを示
す模式図である。
【図７】２つの３'末端を有する核酸構築物によって行
われ得る一連の反応を示す模式図である。ここで、３'
末端の各々は、テンプレート依存性伸長後にヘアピンを
形成し得る。
【図８】図７に示されるプロセスおよび事象の続きを示
す模式図である。
【図９】非直線的に増幅し得る単一のプライマーの、テ
ンプレート依存性伸長および自己プライミング／自己伸
長を例示する模式図である。
【図１０】図９のプロセスおよび事象の続きを示す模式
図である。潜在的な分子内アニーリングおよび分子間ア
ニーリングは、配列の連続付加を可能にする。
【図１１】図１０におけるプロセスおよび事象の改変を
さらに例示する模式図である。ここで、初期プライマー
は、プライマーの部分がテンプレートとして使用される
ことを可能にしない改変を含む。
【図１２】非直線的に増幅し得る２つの３'末端を有す
る新規の核酸構築物を例示する模式図である。
【図１３】非直線的に増幅し得る２つの３'末端を有す
る新規の核酸構築物についての別の設計の例示を示す模
式図である。
【図１４】図１３に示されるプロセスおよび事象の続き
を示す模式図である。
【図１５】非直線的に増幅し得る２つの３'末端を有す
る新規の核酸構築物についての別の設計を例示する模式
図である。
【図１６】図１５に示されるプロセスおよび事象の続き
を示す模式図である。
【図１７】ＰＣＲによって作製される標的の等温増幅の
ゲルアッセイを示す電気泳動写真である。
【図１８】ＨＰＶプラスミドＤＮＡの等温増幅について
のゲルアッセイおよびプレートアッセイの結果をそれぞ
れ示す電気泳動写真および表である。
【図１９】そこで規定される種々の反応条件下での、カ
ルボキシｄＵＴＰおよび正常なｄＴＴＰでのＰＣＲ反応
についてのゲルアッセイの結果を示す電気泳動写真であ
る。
【図２０】図１９の結果を要約する表である。
【図２１】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合
成における種々のレベルのＭｇＣｌ2の効果を示す電気
泳動写真である。
【図２２】カルボキシｄＵＴＰの存在下でＰＣＲ合成を
行うための、種々のポリメラーゼの能力についてのゲル
アッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図２３】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、種々の酵
素でのＰＣＲ合成における種々のレベルのＭｇＣｌ2の
効果を示す電気泳動写真である。
【図２４】カルボキシｄＵＴＰおよびＰＣＲエンハンサ
ーの存在下での、種々の酵素でのＰＣＲ合成における種
々のレベルのＭｇＣｌ2の効果を示す電気泳動写真であ
る。
【図２５】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合
成における種々の添加物の効果を示す電気泳動写真であ
る。
【図２６】カルボキシｄＵＴＰの存在下でのＰＣＲ合成
に使用される、テンプレートおよびプライマーの配列を
示す図である。
【図２７】カルボキシｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合
成のためのプライマーの種々の組合せについてのゲルア
ッセイの結果を示す電気泳動写真である。
【図２８】そこに示される異なる温度での、カルボキシ
ｄＵＴＰの存在下での、ＰＣＲ合成のためのプライマー
の種々の組合せについてのゲルアッセイの結果を示す電
気泳動写真である。
【図２９】蛍光マーカーの合成的な付着後に使用される
種々の条件についてのゲルアッセイの結果を示す電気泳
動写真である。
【図３０】図２９の結果のネガティブ画像である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599088586 ｃ／ｏ Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎ ｃ．， 527 Ｍａｄｉｓｏｎ Ａｖｅｎ ｕｅ （９ｔｈ Ｆｌｏｏｒ）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 10022, Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 イライザー ラバニ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10003, ニューヨーク， フィフス アベニュー （ナンバー19エイ） 69 (72)発明者 ジャニス ジー． スタブリアノポウラス アメリカ合衆国 ニューヨーク 11706, ベイ ショア ， ナンバー10シー， サウス クリントン アベニュー 99 (72)発明者 ジェイムズ ジェイ． ドネガン アメリカ合衆国 ニューヨーク 11561, ロング ビーチ， イースト ブロード ウェイ （ナンバー３ジー） 210 (72)発明者 ジャック コールマン アメリカ合衆国 ニューヨーク 11731, イースト ノースポート， ファーウッ ド ドライブ 37 (72)発明者 マーリーン ウォルナー アメリカ合衆国 ニューヨーク 11735, ファーミングデイル， アパートメント ３， ノース メイプル ストリート 15

Claims (59)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特定の核酸配列を直線的に増幅するため
    のプロセスであって、以下の工程： 該特定の核酸配列、 初期プライマーまたは核酸構築物であって、以下の２つ
    のセグメント： （Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸
    配列に第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉ
    ｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメ
    ント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）
    該第１のセグメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）
    該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、
    （ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的な配列に結合し
    得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成され、
    そして第１のプライマー伸長を置換するように、均衡ま
    たは限定サイクリング条件下で、第２のプライマーまた
    は核酸構築物の第１のセグメントの、続く該特定の核酸
    配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント
    を含む、初期プライマーまたは核酸構築物；ならびに、 基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；
    を提供する工程；ならびに、 均衡または限定サイクリング条件下で該基質、緩衝液、
    およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特
    定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物
    をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を
    直線的に増幅する工程、を包含する、プロセス。
  2. 【請求項２】 前記初期プライマーまたは核酸構築物と
    前記第２のプライマーまたは核酸構築物とが同じであ
    る、請求項１に記載のプロセス。
  3. 【請求項３】 前記初期プライマーまたは核酸構築物と
    前記第２のプライマーまたは核酸構築物とが異なる、請
    求項１に記載のプロセス。
  4. 【請求項４】 前記第１のセグメントもしくは該第２の
    セグメントもしくは前記プライマー伸長、または前述の
    任意のものが、少なくとも１つ改変されたヌクレオチド
    またはヌクレオチドアナログを含む、請求項１に記載の
    プロセス。
  5. 【請求項５】 前記第２のセグメントが、前記プライマ
    ー伸長においてその相補体に対する前記第１のセグメン
    トの熱力学的安定性を増加する少なくとも１つ改変され
    たヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請
    求項４に記載のプロセス。
  6. 【請求項６】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌク
    レオチドアナログがインターカレート剤を含む、請求項
    ４または請求項５に記載のプロセス。
  7. 【請求項７】 前記第１のセグメントまたは前記プライ
    マー伸長あるいはその両方が、少なくとも１つ改変され
    たヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む、請
    求項１に記載のプロセス。
  8. 【請求項８】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌク
    レオチドアナログが、その相補体に対する前記第１のセ
    グメントまたは前記プライマー伸長の熱力学的安定性を
    減少させる、請求項７に記載のプロセス。
  9. 【請求項９】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌク
    レオチドアナログが、負に荷電した化学基を含む、請求
    項８に記載のプロセス。
  10. 【請求項１０】 前記負に荷電した化学基がカルボン酸
    を含む、請求項９に記載のプロセス。
  11. 【請求項１１】 前記初期プライマーもしくは核酸構築
    物、または前記第２のプライマーもしくは核酸構築物、
    あるいはその両方が、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核
    酸、およびペプチド−核酸、あるいは任意の前述の組み
    合わせを含む、請求項１に記載のプロセス。
  12. 【請求項１２】 特定の核酸配列を非直線的に増幅する
    ためのプロセスであって、以下の工程： 該特定の核酸配列、 該特定の核酸配列ついての第１の初期プライマーまたは
    核酸構築物であって、該第１の初期プライマーまたは核
    酸構築物が、以下の２つのセグメント： （Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸
    配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉ
    ｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメ
    ント、および、 （Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグ
    メントに実質的に非同一であり、そして（ｉｉ）該特定
    の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉ
    ｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そし
    て（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されて第１のプ
    ライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイク
    リング条件下で、続く第２のプライマーまたは核酸構築
    物の第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の
    部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む；なら
    びに、 該特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマー
    または核酸構築物であって、該続く初期プライマーまた
    は該核酸構築物が、以下の２つのセグメント、 （Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸
    配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉ
    ｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメ
    ント、および、 （Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグ
    メントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸
    配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該
    第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉ
    ｖ）第２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプ
    ライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイク
    リング条件下で、続くプライマーの第１のセグメント
    の、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し
    得る、セグメント、を含む：ならびに基質、緩衝液、お
    よびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程：
    ならびに、 均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝
    液、またはテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、
    該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構
    築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配
    列を非線形に増幅する、工程、を包含する、プロセス。
  13. 【請求項１３】 前記第１の初期プライマーまたは核酸
    構築物と前記第２の初期プライマーまたは核酸構築物と
    が同じである、請求項１２に記載のプロセス。
  14. 【請求項１４】 前記第１の初期プライマーまたは核酸
    構築物と前記第２の初期プライマーまたは核酸構築物と
    が異なる、請求項１２に記載のプロセス。
  15. 【請求項１５】 前記第１の初期プライマーまたは核酸
    構築物の前記第１のセグメントまたは前記第２のセグメ
    ント、前記第２の初期プライマーまたは核酸構築物の前
    記第１のセグメントまたは前記第２のセグメント、およ
    び前記プライマー伸長、または前述の任意のものからな
    る群から選択される少なくとも１つのメンバーが、少な
    くとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチ
    ドアナログを含む、請求項１２に記載のプロセス。
  16. 【請求項１６】 前記第１の初期プライマーまたは前記
    第２の初期プライマーまたはその両方の前記第２のセグ
    メントが、前記プライマー伸長における前記第１のセグ
    メントのその相補体に対する熱力学的安定性を増加させ
    る少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌク
    レオチドアナログを含む、請求項１５に記載のプロセ
    ス。
  17. 【請求項１７】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌ
    クレオチドアナログがインターカレート剤を含む、請求
    項１５または１６に記載のプロセス。
  18. 【請求項１８】 前記第１の初期プライマーの前記第１
    のセグメント、または前記第２の初期プライマーの前記
    第１のセグメント、またはその両方、またはそれらのプ
    ライマー伸長、またはそれらの任意の組合せが、少なく
    とも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド
    アナログを含む、請求項１２に記載のプロセス。
  19. 【請求項１９】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌ
    クレオチドアナログが、前記第１のセグメントまたは前
    記プライマー伸長、またはその両方の、その相補体に対
    する熱力学的安定性を減少させる、請求項１８に記載の
    プロセス。
  20. 【請求項２０】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌ
    クレオチドアナログが、負に荷電した化学基を含む、請
    求項１９に記載のプロセス。
  21. 【請求項２１】 前記負に荷電した化学基がカルボン酸
    を含む、請求項２０に記載のプロセス。
  22. 【請求項２２】 前記第１の初期プライマーまたは核酸
    構築物、あるいは前記第２の初期プライマーまたは核酸
    構築物、あるいはその両方が、直鎖状核酸、分枝核酸、
    逆方向核酸およびペプチド−核酸、または前述の任意の
    ものの組合せからなる群から選択される核酸を含む、請
    求項１２に記載のプロセス。
  23. 【請求項２３】 特定の核酸配列を非直線的に増幅する
    ためのプロセスであって、以下の工程： 該特定の核酸配列およびその相補体；該特定の核酸配列
    のための第１の初期プライマーまたは核酸構築物、ここ
    で該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が、以下の
    ２つのセグメント： （Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸
    配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉ
    ｉ）テンプレート依存性の第１の伸長が可能であるセグ
    メント、および（Ｂ）第２のセグメントであって、
    （ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、
    （ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一
    であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的な配列
    へ結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生
    成されそして該第１のプライマー伸長を置換するよう
    な、均衡または限定サイクリング条件下で、続く第１の
    プライマーの第１のセグメントの該特定の核酸配列の該
    第１の部分への結合を提供し得る、セグメントを含む；
    および該第１のプライマー伸長に対して相補的な第２の
    初期プライマーまたは核酸構築物、ここで該第２の初期
    プライマーまたは核酸構築物が、均衡または限定サイク
    リング条件下で、テンプレート依存性の伸長をし得るこ
    とを特徴とするセグメントを含む；ならびに 基質、緩衝液、およびテンプレート依存性の重合化酵
    素；を提供する工程 均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝
    液、およびテンプレート依存性の重合化酵素の存在下
    で、該特定の核酸配列および前記新規プライマーまたは
    核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の
    核酸配列を非直線的に増幅する工程、を包含する、プロ
    セス。
  24. 【請求項２４】 前記第１の初期プライマーまたは核酸
    構築物の前記第１のセグメントまたは前記第２のセグメ
    ント、前記第２の初期プライマーまたは核酸構築物の該
    セグメント、および該プライマー伸長、または前述の任
    意のものからなる群から選択される少なくとも１つのメ
    ンバーが、少なくとも１つの改変されたヌクレオチドま
    たはヌクレオチドアナログを含む、請求項２３に記載の
    プロセス。
  25. 【請求項２５】 前記第１の初期プライマーの前記第２
    のセグメントが、前記プライマー伸長において前記第１
    のセグメントのその相補体に対する熱力学的安定性を増
    加させる少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまた
    はヌクレオチドアナログを含む、請求項２４に記載のプ
    ロセス。
  26. 【請求項２６】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌ
    クレオチドアナログがインターカレート剤を含む、請求
    項２４または２５に記載のプロセス。
  27. 【請求項２７】 前記第１の初期プライマーの前記第１
    のセグメントまたは前記第２の初期プライマーの前記セ
    グメント、またはその両方、またはそれらのプライマー
    伸長、またはそれらの任意の組合せが、少なくとも１つ
    の改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ
    を含む、請求項２３に記載のプロセス。
  28. 【請求項２８】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌ
    クレオチドアナログが、前記第１のセグメントまたは前
    記プライマー伸長、またはその両方の、その相補体に対
    する熱力学的安定性を減少させる、請求項２７に記載の
    プロセス。
  29. 【請求項２９】 前記改変されたヌクレオチドまたはヌ
    クレオチドアナログが、負に荷電した化学基を含む、請
    求項２８に記載のプロセス。
  30. 【請求項３０】 前記負に荷電した化学基がカルボン酸
    を含む、請求項２９に記載のプロセス。
  31. 【請求項３１】 前記第１の初期プライマーまたは核酸
    構築物、あるいは前記第２の初期プライマーまたは核酸
    構築物、あるいはその両方が、直鎖状核酸、分枝核酸、
    逆方向核酸およびペプチド−核酸、または前述の任意の
    ものの組合せからなる群から選択される核酸を含む、請
    求項２３に記載のプロセス。
  32. 【請求項３２】 特定の核酸配列を非直線的に増幅する
    ためのプロセスであって、以下の工程： 該特定の核酸配列；非直線的な増幅が可能な単一のプラ
    イマーまたは単一の核酸構築物であって、以下の３つの
    セグメント： （ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸
    配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉ
    ｉ）テンプレート依存性の第１の伸長が可能である、セ
    グメント； （ｂ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一で
    ある第２のセグメント；および （ｃ）該第１のセグメントに実質的に同一である第３の
    セグメント；を含みここで、前記第１のプライマー伸長
    は該第２のセグメントにハイブリダイズし得、そして該
    第３のセグメントに対する相補体を生成するように自己
    プライミングおよび自己伸長し得る配列を生成し得る、
    および基質、緩衝液、およびテンプレート依存性の重合
    化酵素；を提供する工程、ならびに該基質、緩衝液およ
    びテンプレート依存性の重合化酵素の存在下で、該特定
    の核酸配列および該プライマーまたは核酸構築物をイン
    キュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非直線
    的に増幅する工程、を包含する、プロセス。
  33. 【請求項３３】 均衡条件、限定サイクリング条件、お
    よび完全なサイクリング条件からなる群から選択される
    条件下で行われる、請求項３２に記載のプロセス。
  34. 【請求項３４】 前記第１のセグメント、前記第２のセ
    グメント、前記第３のセグメント、前記第１のプライマ
    ー伸長、前記第２のプライマー伸長、または前述の任意
    のものからなる群から選択されるメンバーが、少なくと
    も１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドア
    ナログを含む、請求項３２に記載のプロセス。
  35. 【請求項３５】 前記単一プライマーまたは核酸構築物
    が、直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、およびペプチ
    ド−核酸、または前述の任意のものの組合せからなる群
    から選択される核酸を含む、請求項３２に記載のプロセ
    ス。
  36. 【請求項３６】 前記第１のセグメント、前記第２のセ
    グメント、前記第３のセグメント、前記第１のプライマ
    ー伸長および前記自己プライミング伸長、またはそれら
    の任意の組合せからなる群から選択されるメンバーが、
    少なくとも１つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレ
    オチドアナログを含む、請求項３２に記載のプロセス。
  37. 【請求項３７】 前記第１のプライマー伸長が、限定さ
    れた基質条件、限定された伸長持続時間、またはその両
    方からなる群から選択される条件下で行われる、請求項
    ３２に記載のプロセス。
  38. 【請求項３８】 前記特定の核酸配列が１本鎖または２
    本鎖の形態である、請求項１、１２、２３、または３２
    のいずれかに記載のプロセス。
  39. 【請求項３９】 前記特定の核酸配列がフラグメント中
    に見出されるかまたは含まれている、請求項１、１２、
    ２３、または３２のいずれかに記載のプロセス。
  40. 【請求項４０】 前記フラグメントが物理的手段、化学
    的手段、物理化学的手段、および酵素的手段、またはそ
    れらの組合せからなる群から選択される手段によって生
    成される、請求項３９に記載のプロセス。
  41. 【請求項４１】 前記物理的手段が、超音波処理および
    加熱、またはその両方からなる群から選択される、請求
    項４０に記載のプロセス。
  42. 【請求項４２】 前記化学的手段が酸処理を含む、請求
    項４０に記載のプロセス。
  43. 【請求項４３】 前記酵素的手段がヌクレアーゼおよび
    制限酵素によってまたはそれらを用いて行われる、請求
    項４０に記載のプロセス。
  44. 【請求項４４】 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアー
    ゼを含む、請求項４３に記載のプロセス。
  45. 【請求項４５】 核酸の配列決定のための終結後標識プ
    ロセスであって、以下の工程：タグ化されていないまた
    は標識されていない基質、タグ化されていないまたは標
    識されていないプライマー、重合化酵素、緩衝液、およ
    びそれぞれのヌクレオチド塩基についての適切なタグ化
    されていないまたは標識されていないターミネーターの
    存在下で、目的の該核酸配列に対応する核酸フラグメン
    トを生成する工程であって、ここで、該ターミネーター
    のそれぞれは、内部配列が該タグ化分子に対して実質的
    に非反応性であり、そして該化学反応が媒体またはマト
    リックス中で該フラグメントの分離を実質的に妨げない
    ような条件下で、タグ化分子と共有結合する化学的な反
    応基を含む工程；媒体またはマトリックス中で生成され
    た該フラグメントを分離する工程；および該媒体または
    マトリックス中で該タグ化分子を検出することによって
    該分離されたフラグメントを検出する工程を包含する、
    プロセス。
  46. 【請求項４６】 前記生成工程の、前記ターミネーター
    の前記化学的反応基が、生成されそして任意のタグ化分
    子に共有結合する前に脱保護された前記フラグメントへ
    の酵素的取り込み前に保護される、請求項４５に記載の
    プロセス。
  47. 【請求項４７】 前記生成工程の、前記化学的反応基が
    窒素、硫黄または酸素原子を含む、請求項４５に記載の
    プロセス。
  48. 【請求項４８】 前記ターミネーター上の前記化学的反
    応基が異なる、請求項４５に記載のプロセス。
  49. 【請求項４９】 前記ターミネーター上の前記化学的反
    応基が同じである、請求項４５に記載のプロセス。
  50. 【請求項５０】 前記生成工程の、前記タグ化分子がそ
    れぞれのターミネーターと同じである、請求項４５に記
    載のプロセス。
  51. 【請求項５１】 前記生成工程の、前記タグされた分子
    がそれぞれのターミネーターと異なる、請求項４５に記
    載のプロセス。
  52. 【請求項５２】 前記タグ化分子が、蛍光色素、化学発
    光色素、赤外色素、化学発光実体および電気化学発光実
    体、またはそれらの組合せからなる群から選択される、
    請求項４５に記載のプロセス。
  53. 【請求項５３】 前記分離工程が電気泳動的に行われ
    る、請求項４５に記載のプロセス。
  54. 【請求項５４】 前記分離工程の、前記媒体またはマト
    リックスがゲルを含む、請求項４５に記載のプロセス。
  55. 【請求項５５】 前記ゲルがポリアクリルアミドゲルを
    含む、請求項４５に記載のプロセス。
  56. 【請求項５６】 前記分離工程がキャピラリーゲル電気
    泳動によって行われる、請求項４５に記載のプロセス。
  57. 【請求項５７】 前記検出工程が、光度測定、分光光度
    測定、比色定量測定、蛍光定量測定、遅延蛍光測定およ
    び化学発光測定、またはそれらの組合せから選択される
    手段によって行われる、請求項４５に記載のプロセス。
  58. 【請求項５８】 相補的な配列に対する減少した熱力学
    的安定性を有する核酸配列を生成するプロセスであり、
    該プロセスは負に荷電した化学部分を有する少なくとも
    １つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナ
    ログを、該生成された核酸配列へと組み込む工程を包含
    する、プロセス。
  59. 【請求項５９】 直鎖状核酸、分枝核酸、逆方向核酸、
    およびペプチド−核酸、または前述の任意のものの組合
    せからなる群から選択される１本鎖または２本鎖の核酸
    ポリマーであって、ここで該核酸ポリマーは、１つまた
    は両方の鎖において１つの負に荷電した化学部分を含む
    少なくとも１つのプリンまたはピリミジン塩基を含む、
    核酸ポリマー。
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