JP2007236392A - 核酸の合成方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】新規な構造のオリゴヌクレオチドと、それをプライマーとする核酸の合成方法である。このオリゴヌクレオチドは、プライマーの5'側に、このプライマーを合成起点として合成される領域と実質的に同じ塩基配列を備える。単純な試薬構成で等温反応に基づく核酸の合成を実現する。また、この核酸合成方法に基づいて、高い特異性を持った核酸の合成方法を提供する。
【選択図】なし
Description
i) 前記F2cに相補的な塩基配列を持つ領域の5'側に前記F1cと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド
ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
iii) 前記F3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
iv) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cの3'側に位置する任意の領域R3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
v) 鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ、および
vi) 要素v)の基質となるヌクレオチド
領域F3c、領域F2c、および領域F1cを3'側からこの順で含む鋳型核酸に対し、
i) 前記F2cに相補的な塩基配列を持つ領域の5'側に前記F1cと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド
ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
iii) 前記F3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
iv) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cの3'側に位置する任意の領域R3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
X2:特定の塩基配列を持つ核酸の領域X2cに相補的な塩基配列を持つ領域
X1c:特定の塩基配列を持つ核酸における領域X2cの5'側に位置する領域X1cと実質的に同じ塩基配列を持つ領域
・4種類のオリゴヌクレオチド:FA、RA、アウタープライマーF3、およびアウタープライマーR3、
・鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼ、
・DNAポリメラーゼの基質となるヌクレオチド
5'-[プライマー内に位置する領域X1cにアニールする領域X1]−[塩基対結合が可能な状態にあるループ形成配列]−[領域X1c]−[鋳型に相補的な配列を持つ領域]-3'
Bst DNAポリメラーゼ
Bca(exo-)DNAポリメラーゼ
DNA ポリメラーゼIのクレノウ・フラグメント
Vent DNAポリメラーゼ
Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ(Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの)
DeepVent DNAポリメラーゼ
DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ(DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの)
Φ29ファージDNAポリメラーゼ
MS-2ファージDNAポリメラーゼ
Z-Taq DNAポリメラーゼ(宝酒造)
KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡績)
M13mp18を鋳型として、本発明による1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を試みた。実験に使用したプライマーは、M13FA、M13RA、M13F3、そしてM13R3の4種類である。M13F3とM13R3は、それぞれM13FAとM13RAを合成起点として得られた第1の核酸を置換するためのアウタープライマーである。アウタープライマーはM13FA(あるいはM13RA)よりも後から相補鎖合成の起点となるべきプライマーなので、M13FA(あるいはM13RA)と隣接する領域にコンティギュアス スタッキング現象を利用してアニールするように設計した。また、M13FA(あるいはM13RA)のアニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定した。
プライマー 5'側の領域 / 3'側の領域
M13FA M13FAによる合成相補鎖の領域F1cと同じ
/M13mp18の領域F2cに相補
M13RA M13RAによる合成相補鎖の領域R1cと同じ
/M13FAによる合成相補鎖の領域R2cに相補
M13F3 M13mp18の領域F2cの3'側に隣接するF3cに相補
M13R3 M13FAによる合成相補鎖の領域R2cの3'側に隣接するR3cに相補
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
6mM MgSO4
0.1% Triton X-100
5% ジメチルスルホキシド(DMSO)
0.4mM dNTP
プライマー:
800nM M13FA/配列番号:1
800nM M13RA/配列番号:2
200nM M13F3/配列番号:3
200nM M13R3/配列番号:4
ターゲット:M13mp18 dsDNA /配列番号:5
反応:上記反応液を95℃で5分間加熱し、ターゲットを変性させて1本鎖とした。反応液を氷水上に移し、Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を4U 添加し、65℃で1時間反応させた。反応後、80℃10分間で反応を停止し再び氷水上に移した。
反応の確認:上記反応液の5μL に1μLのloading bufferを添加し、2%アガロースゲル(0.5% TBE)を使って、1時間、80mVで電気泳動した。分子サイズマーカーとして、XIV(100bp ladder、 Boehringer Mannheim製)を使用した。泳動後のゲルをSYBR Green I (Molecular Probes、Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図8に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。
1. XIV size marker
2. 1fmol M13mp18 dsDNA
3. targetなし
実施例1で得られた本発明による1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の構造を明らかにすることを目的として、制限酵素による消化を行った。制限酵素を使った消化によって理論どおりの断片を生じる一方、実施例1で観察された高サイズのスメアなパターンや泳動されないバンドが消滅すれば、これらがいずれも本発明によって合成された1本鎖上に相補的な塩基配列を交互に連結した核酸であることが推定できる。
1. XIV size marker
2. 精製物のBamHI消化物
3. 精製物のPvuII消化物
4. 精製物のHindIII消化物
増幅反応液中へのベタイン(betaine: N、N、N、-trimethylglycine、SIGMA)添加による、核酸の増幅反応に対する効果を調べる実験を行った。実施例1と同様に、M13mp18を鋳型とし、本発明による1本鎖上に相対的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を、種々の濃度のベタイン存在下で行った。実験に使用したプライマーは、実施例1で使用したものと同じである。鋳型DNA量は、10-21mol (M13mp18)で、陰性対照として水を用いた。添加するベタインは、0、0.5、1、2 Mの濃度になるように反応液に加えた。反応液組成を以下に示す。
反応液組成(25μL中)
20mM Tris-HCl pH8.8
4mM MgSO4
0.4mM dNTPs
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
0.1% TritonX-100
プライマー:
800nM M13FA/配列番号:1
800nM M13RA/配列番号:2
200nM M13F3/配列番号:3
200nM M13R3/配列番号:4
ターゲット:M13mp18 dsDNA /配列番号:5
HBV遺伝子の部分配列を組み込んだM13mp18 dsDNAを鋳型として、本発明による核酸の合成方法を試みた。実験に使用したプライマーは、HB65FA(配列番号:6)、HB65RA(配列番号:7)、HBF3(配列番号:8)、そしてHBR3(配列番号:9)の4種類である。HBF3とHBR3は、それぞれHB65FAとHB65RAを合成起点として得られた第1の核酸を置換するためのアウタープライマーである。アウタープライマーはHB65FA(あるいはHB65RA)よりも後から相補鎖合成の起点となるべきプライマーなので、HB65FA(あるいはHB65RA)と隣接する領域にコンティギュアススタッキング現象を利用してアニールするように設計した。また、HB65FA(あるいはHB65RA)のアニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定した。M13mp18に組みこまれたHBVに由来する本実施例のターゲット配列(430bp)を配列10に示した。
プライマー 5'側の領域 / 3'側の領域
HB65FA HB65FAによる合成相補鎖の領域F1cと同じ
/HBV-M13mp18の領域F2cに相補
HB65RA HB65RAによる合成相補鎖の領域R1cと同じ
/HB65FAによる合成相補鎖の領域R2cに相補
HBF3 HBV-M13mp18の領域F2cの3'側に隣接するF3cに相補
HBR3 HB65FAによる合成相補鎖の領域R2cの3'側に隣接するR3cに相補
1. XIV size marker
2. 1fmol HBV-M13mp18 dsDNA
3. targetなし
本発明に基づいて合成された核酸の構造を確認するために、その長さをアルカリ変性条件下での電気泳動によって分析した。実施例1と実施例4のターゲット存在下での反応液の5μLに、それぞれ1μLのalkaline loading bufferを添加し、0.7%アガロースゲル(50mM NaOH、 1mM EDTA)を使って、14時間、50mAで電気泳動した。分子サイズマーカーとして、ラムダファージのHindIII消化断片を使用した。泳動後のゲルを1M Tris pH 8で中和後、SYBR Green I (Molecular Probes、Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図13に示す。各レーンは以下のサンプルに対応している。
1. ラムダファージのHindIII消化断片
2. 実施例1の反応生成物
3. 実施例4の反応生成物
本発明による核酸の合成方法に及ぼす、ターゲットの濃度変化の影響を観察した。ターゲットであるM13mp18 dsDNAを0〜1 fmolとし、反応時間を1時間および3時間とする他は、実施例1と同じ条件で本発明による核酸の合成方法を実施した。実施例1と同様に、2%アガロースゲル(0.5% TBE)で電気泳動し、SYBRGreen I (Molecular Probes、Inc.)染色により核酸を確認した。分子サイズマーカーとして、XIV(100bp ladder、 Boehringer Mannheim)を使用した。結果は図14(上:反応時間1時間、下:反応時間3時間)に示した。各レーンは、次のサンプルに対応する。
1. M13mp18 dsDNA 1x10-15mol/tube
2. M13mp18 dsDNA 1x10-16mol/tube
3. M13mp18 dsDNA 1x10-17mol/tube
4. M13mp18 dsDNA 1x10-18mol/tube
5. M13mp18 dsDNA 1x10-19mol/tube
6. M13mp18 dsDNA 1x10-20mol/tube
7. M13mp18 dsDNA 1x10-21mol/tube
8. M13mp18 dsDNA 1x10-22mol/tube
9. target なし
10. XIV size marker
(1)M13mp18FM(変異型)の作製
ターゲットDNAとして、M13mp18(野生型)、およびM13mp18FM(変異型)を用いた。変異型であるM13mp18FMの作製は、LA PCRTMin vitro Mutagenesis Kit(宝酒造)を使用し、1塩基置換を導入した。その後、シークエンシングにより配列を確認した。F1領域での配列を以下に示す。
野生型:CCGGGGATCCTCTAGAGTCG(配列番号:19)
変異型:CCGGGGATCCTCTAGAGTCA(配列番号:20)
使用するプライマーは、FAプライマーのF1c領域の5'末端に野生型、変異型で配列の異なる塩基となるようにした。変異の位置、および標的塩基配列(target)に対する各領域の位置関係を図15に示す。
M13mp18(野生型)、およびM13mp18FM(変異型)を鋳型にして、以下に示すそれぞれに特異的なプライマーの組み合わせで鋳型特異的な増幅反応が起きるかどうか実験を行った。
野生型増幅用プライマーセット: FAd4、 RAd4、 F3、 R3
変異型増幅用プライマーセット: FAMd4、 RAd4、 F3、 R3
各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
FAd4: CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(配列番号:21)
FAMd4: TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(配列番号:22)
RAd4: CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC(配列番号:23)
F3: ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA(配列番号:24)
R3: GTTGGGAAGGGCGATCG(配列番号:25)
反応液の組成は以下のとおりである。
終濃度
D2W 3.75μL
10X Thermo pol buffer(NEB) 2.5μL 20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
6mM MgSO4
0.1% TritonX-100
2.5mM dNTP 4μL 400μM
100mM MgSO4 0.5μL
4M Betaine 6.25μL 1M
M13FAd4 primer(10pmol/μL)又は
M13FAMd4 primer(10pmol/μL) 2μL 800nM
M13RAd4 primer(10pmol/μL) 2μL 800nM
M13F3 primer(10pmol/μL) 0.5μL 200nM
M13R3 primer(10pmol/μL) 0.5μL 200nM
全量 22μL
ターゲットとなる核酸をmRNAとして、本発明による核酸の合成方法を試みた。ターゲットとなるmRNAは、前立腺特異抗原(Prostate specific antigen; PSA)を発現した細胞である前立腺癌細胞株LNCaP cell (ATCC No. CRL-1740)と、非発現細胞である慢性骨髄性白血病細胞株K562 cell (ATCC No. CCL-243)を、1:106〜100:106で混合し、Qiagen社(ドイツ)のRNeasy Mini kitを用いて全RNAを抽出した。実験に使用したプライマーは、PSAFA、PSARA、PSAF3、そしてPSAR3の4種類である。PSAF3とPSAR3は、それぞれPSAFAとPSARAを合成起点として得られた第一の核酸を置換するためのアウタープライマーである。また、PSAFA(あるいはPSARA)のアニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定した。各プライマーを構成する塩基配列は以下のとおりである。
プライマー:
PSAFA: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG (配列番号:26)
PSARA: TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(配列番号:27)
PSAF3: TGCTTGTGGCCTCTCGTG(配列番号:28)
PSAR3: GGGTGTGGGAAGCTGTG(配列番号:29)
プライマー 5'側の領域 / 3'側の領域
PSAFA PSAFAによる合成相補鎖の領域F1cと同じ
/標的塩基配列の領域F2cに相補
PSARA PSARAによる合成相補鎖の領域R1cと同じ
/PSAFAによる合成相補鎖の領域R2cに相補
PSAF3 標的塩基配列の領域F2cの3'側に隣接するF3cに相補
PSAR3 PSAFAによる合成相補鎖の領域R2cの3'側に隣接するR3cに相補
反応液組成(25μL中)
20mM Tris-HCl pH8.8
4mM MgSO4
0.4mM dNTPs
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
0.1% TritonX-100
0.8M betaine
5mM DTT
1600nM PSAFA PSARA プライマー
200nM PSAF3 PSAR3 プライマー
8U Bst DNAポリメラーゼ
100U ReverTra Ace (TOYOBO、 日本)
5μg 全RNA
1 − + 0
2 − + 10
3 + − 0
4 + − 10
5 + + 0
6 + + 1
7 + + 10
8 レーン6の反応液1μL分をSau3A Iで消化したもの
9 レーン7の反応液1μL分をSau3A Iで消化したもの
10 サイズマーカー 100bpラダー(New England Biolabs)
配列番号2−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号3−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号4−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号6−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号7−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号8−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号9−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号11−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号12−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号13−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号14−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号15−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号16−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号17−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号18−人工配列の説明: 人工的に合成された配列
配列番号21−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号22−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号23−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号24−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号25−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号26−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号27−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号28−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
配列番号29−人工配列の説明: 人工的に合成されたプライマー配列
Claims (4)
- 領域F3c、領域F2c、および領域F1cを3'側からこの順で含む鋳型核酸と以下の要素を含む反応液を混合し、実質的に等温で反応させることを特徴とする、1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。
i) 前記F2cに相補的な塩基配列を持つ領域の5'側に前記F1cと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド
ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
iii) 前記F3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
iv) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cの3'側に位置する任意の領域R3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
v) 鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ、および
vi) 要素v)の基質となるヌクレオチド - ii)のオリゴヌクレオチドが、i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cとその5'側に位置する領域R1cに対し、前記R2cと相補な塩基配列を持つ領域の5'側に前記R1cと同じ塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーである請求項1に記載の方法。
- 以下のオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーを含む、1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用プライマーセット。
領域F3c、領域F2c、および領域F1cを3'側からこの順で含む鋳型核酸に対し、
i) 前記F2cに相補的な塩基配列を持つ領域の5'側に前記F1cと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド
ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
iii) 前記F3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
iv) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cの3'側に位置する任意の領域R3cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド - ii)のオリゴヌクレオチドが、i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域R2cとその5'側に位置する領域R1cに対し、前記R2cと相補的な塩基配列を持つ領域の5'側に前記R1cと同じ塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーである請求項3に記載のプライマーセット。
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