CN107636164B - 用柠康酸酐灭活微生物的方法 - Google Patents

用柠康酸酐灭活微生物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107636164B
CN107636164B CN201680030692.1A CN201680030692A CN107636164B CN 107636164 B CN107636164 B CN 107636164B CN 201680030692 A CN201680030692 A CN 201680030692A CN 107636164 B CN107636164 B CN 107636164B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
nucleic acid
inactivated
microorganism
citraconic anhydride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680030692.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107636164A (zh
Inventor
E.菲斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN107636164A publication Critical patent/CN107636164A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107636164B publication Critical patent/CN107636164B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/60—Two oxygen atoms, e.g. succinic anhydride
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了灭活微生物、制备和使用它们的方法、以及含有它们的组合物和试剂盒。所述灭活微生物可用在内部对照试剂的制剂中，所述内部对照试剂用于重组核酸技术、特别是(例如，通过聚合酶链式反应(PCR)的)核酸扩增中。

Description

用柠康酸酐灭活微生物的方法
技术领域
本发明提供了包含灭活微生物的物质组合物，所述灭活微生物适合在核酸扩增检测方法中用作对照。
背景技术
可靠的阳性对照是分子诊断试验(特别是使用核酸扩增来检测微生物的那些试验)的重要组分。例如，可靠的阳性对照为微生物在疑似含有所述微生物的患者样品中的阴性检测结果的准确度提供置信度。这样的对照可以是“内部对照”或“IC”，其加入进行平行试验以扩增和/或检测对照核酸靶序列的一部分样品中，而所述样品的另一部分针对要通过测定检测的靶分析物核酸序列的扩增和/或检测进行分析。通常在对照靶核酸序列和分析物核酸序列都在相同反应容器中纯化、扩增和/或检测的情况下使用“内部对照”(参见，例如，美国专利号7,718,402)。全过程内部对照(即，测定的所有步骤的对照，所述步骤包括样品处理、核酸提取、扩增、检测等)是利用核酸扩增的诊断试验的重要组分。在将微生物用作全过程内部对照的情况下，非常合乎需要的是(如果没有要求遵守某些管理指南)非传染性的(参见，例如，WO 2002/033129；美国2002-0076773 A1)。
某些化合物已经被用于可逆地灭活热稳定的聚合酶，包括甲醛、二羧酸酸酐和柠康酸酐(参见，例如，美国专利号6,183,998; 6,479,264；和7,972,830)。需要包含灭活微生物的新物质组合物以及制备和使用它们的方法。本发明提供了在保留靶核酸序列的完整性的同时用柠康酸酐灭活含有靶核酸序列的微生物的方法，以及使用这样的方法制备的灭活微生物。
发明内容
本发明提供了灭活微生物、制备和使用它们的方法、以及含有它们的组合物和试剂盒。所述灭活微生物可用在内部对照试剂的制剂中，所述内部对照试剂用在重组核酸技术、特别是(例如，通过聚合酶链式反应(PCR)的)核酸扩增中。
在一个方面，本发明提供了微生物的外源灭活方法。在一个实施方案中，所述方法包括使传染性微生物与柠康酸酐外源地接触。在某些实施方案中，所述微生物包含对照核酸序列。在某些实施方案中，所述柠康酸酐是有效量的柠康酸酐。在某些实施方案中，与所述微生物的接触在保留对照核酸序列的完整性的同时灭活所述微生物。在一个实施方案中，提供了微生物的外源灭活方法，所述方法包括使含有对照核酸序列的传染性微生物与有效量的柠康酸酐外源地接触，由此在保留对照核酸序列的完整性的同时灭活所述微生物。在某些实施方案中，柠康酸酐的有效量是(i)在约5 mM至约25 mM之间的浓度；(ii)在约5.5 mM至约22 mM之间的浓度，或(iii)在选自约5.5 mM、约11 mM和约22 mM的浓度。在一个实施方案中，所述微生物在接触步骤之前包含含有至少一个伯胺基团的蛋白质外表面。在另一个实施方案中，所述灭活微生物包含含有至少一个经修饰的伯胺基团的蛋白质外表面。在一个实施方案中，将所述至少一个经修饰的伯胺基团修饰成酰胺键和末端羧酸。在某些实施方案中，所述灭活微生物包含蛋白质外表面，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。在其它实施方案中，所述接触步骤在环境温度进行，和/或所述接触进行约1小时。在某些实施方案中，所述微生物是病毒，更具体地是RNA或DNA病毒。在其它实施方案中，所述微生物是装甲的核酸(an armored nucleic acid)，更具体地是装甲的RNA或DNA。在另一个实施方案中，所述微生物选自病毒、RNA病毒、DNA病毒、装甲的核酸、装甲的RNA或DNA、和细菌噬菌体。
在一个其它方面，本发明提供了一种验证试验样品在核酸扩增测定中的检测结果的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在包含试验样品和灭活微生物的混合物上执行样品制备，其中所述灭活微生物包含(i)对照核酸序列；和(ii)蛋白质外表面，其具有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团，其中所述样品制备从所述试验样品和所述灭活微生物二者释放核酸。所述方法还包括以下步骤：在释放的核酸上执行核酸扩增，检测所述对照核酸靶标，由此验证所述检测结果。
在另一个方面，本发明提供了包含灭活微生物的样品制备混合物。在一个实施方案中，所述混合物包含具有蛋白质外表面的灭活微生物，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。在本文中，所述混合物进一步包含样品制备试剂。在某些实施方案中，所述样品制备试剂是蛋白酶。在某些实施方案中，所述样品制备试剂是固体支持材料。在某些实施方案中，所述样品制备试剂是裂解缓冲液。在另一个实施方案中，所述样品制备试剂选自蛋白酶、固体支持材料和裂解缓冲液。在某些实施方案中，所述微生物选自病毒、RNA或DNA病毒、装甲的核酸、装甲的RNA或DNA和细菌噬菌体。
在另一个方面，本发明提供了包含微生物的微生物灭活反应混合物。在一个实施方案中，所述混合物包含具有蛋白质外表面的微生物、反应缓冲液和有效量的柠康酸酐。在某些实施方案中，所述柠康酸酐的有效量是(i)在约5 mM至约25 mM之间的浓度；或(ii)在选自约5.5 mM、约11 mM和约22 mM的浓度。在一个实施方案中，所述微生物包含含有至少一个伯胺基团的蛋白质外表面。在某些实施方案中，所述微生物是病毒，更具体地是RNA或DNA病毒。在其它实施方案中，所述微生物是装甲的核酸，更具体地是装甲的RNA或DNA。在另一个实施方案中，所述微生物灭活反应混合物包含选自病毒、RNA病毒、DNA病毒、装甲的核酸、装甲的RNA、装甲的DNA和细菌噬菌体的微生物。
附图说明
图1显示了来自柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的核酸扩增的结果。
图2显示了DNA酶处理以后，来自柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的核酸扩增的结果。
图3显示了DNA酶处理以后，来自柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的核酸扩增的结果。
图4显示了DNA酶处理并贮存1周以后，来自柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的核酸扩增的结果。
图5显示了DNA酶处理并贮存1个月以后，来自柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的核酸扩增的结果。
图6A-B解释了伯胺基团至酰胺键和末端羧酸的修饰。图6A描绘了在不同pH柠康酸酐与伯胺的反应。图6B描绘了在特定pH柠康酸酐与伯胺的反应以形成酰胺键(虚线椭圆形)和末端羧酸(实线椭圆形)。
定义
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管仅描述了示例性的方法和材料，但与本文描述的那些类似的基本上任何方法和材料都可以用于实践或试验本公开。为了本公开的目的，在下面定义了以下术语。
术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。
术语“约”包括指示的值的±15%、±10%、±5%、±3%、±2%或±1%的变化和指示的值本身。
术语“微生物”表示具有感染宿主(包括但不限于细菌宿主)的能力的传染剂。在本文中预见到的微生物具有蛋白质外表面，所述蛋白质外表面起促进宿主感染的作用。微生物的一个例子是病毒，包括但不限于，RNA病毒和DNA病毒。微生物也包括细菌噬菌体。
术语“病毒”、“病毒粒子”和“病毒颗粒”在本文中可互换地使用。病毒是在宿主细胞之外不能生长或繁殖的亚显微传染剂。每个病毒由在保护性蛋白外壳(被称作衣壳)内的遗传物质、DNA或RNA组成。衣壳形状从简单的螺旋形式和二十面体(多面体或接近球形)形式至具有尾巴或包膜的更复杂结构变化。根据被感染的宿主的类型，病毒感染细胞生命形式，包括但不限于细菌类型。本公开适用于不同的病毒，包括但不限于，细菌噬菌体、野生型病毒、减弱的病毒、空病毒颗粒以及遗传修饰的病毒载体(其可以是能复制的或不能复制的)。
本文中使用的术语“细菌噬菌体”是感染细菌的病毒。在一个实施方案中，所述细菌属于造成传染性疾病的类型。所述细菌噬菌体可以(i)构成单链或双链DNA或RNA病毒；和/或(ii)是有包膜的或无包膜的。本领域普通技术人员明白，合适的细菌噬菌体可以选自任何分类学的科、亚科、属或种。
术语“宿主细胞”表示单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如，细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养物中培养时来自高等植物或动物的单个细胞。在本公开的上下文中，所述宿主细胞被微生物(例如，病毒或细菌噬菌体)感染和/或包含微生物(例如，病毒或细菌噬菌体)。
术语“核酸”或“多核苷酸”表示聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸(诸如RNA和DNA)的聚合物，以及它们的合成形式、修饰(例如，化学修饰或生化修饰)形式，和混合的聚合物(例如，包括RNA和DNA亚基)。示例性修饰包括甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)、延伸的部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和经修饰的键(例如，α端基异构的核酸等)。也包括合成的分子，其在它们的通过氢键合和其它化学相互作用结合指定序列的能力方面模仿多核苷酸。通常，核苷酸单体经由磷酸二酯键连接，尽管合成形式的核酸可以包含其它键(例如，在Nielsen等人(Science 254:1497-1500,1991)中描述的肽核酸)。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸露DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链的、双链的、或三链的，且不限于任何特定长度。除非另有说明，除了明确指出的任何序列以外，特定核酸序列任选地包含或编码互补序列。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”互换使用。术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用。除非另外指出，否则氨基酸序列从氨基端至羧基端书写。除非另外指出，否则单链核酸序列从5'至3'书写。除非另外指出，否则双链核酸序列的上链从5'至3'书写，且下链从3'至5'书写。
术语“装甲的”颗粒表示基本上、部分地或完全地包封在由病毒外壳蛋白组成的结构内的核酸颗粒。如在美国专利号5,677,124和5,939,262中所述，可以异源地生产装甲的颗粒。例如，可以将RNA在细菌宿主中在体内转录，并至少部分地被细菌噬菌体蛋白包封，这使得所述RNA耐受核酸酶或核糖核酸酶降解。
“外源”在本公开的上下文中是指，在将允许灭活发生的适当缓冲液中，使用于微生物灭活的试剂与分离的微生物接触。细胞宿主的存在对于所述方法/技术而言不是必需的。
术语“蛋白质外表面”表示微生物的包括氨基分子序列的外表面，所述氨基分子序列包含天然地合成的蛋白内的20种常见氨基酸中的至少一种。例如，在根据本公开灭活以后，所述蛋白质外表面包含至少一个经修饰的氨基酸，例如，具有如在图6A-B中所示的经修饰的伯胺的氨基酸。
术语“Cp值”或“交叉点”值表示允许输入靶核酸的定量的值。可以根据二阶导数最大法确定Cp值(Van Luu-The, 等人, “Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and doublecorrection,”BioTechniques, 第38卷, 第2期, 2005年2月, 第287-293页)。在二阶导数方法中，Cp对应于二阶导数曲线的第一个峰。此峰对应于对数线性阶段的开始。二阶导数方法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值，且仅获得一个值。初始Cp方法是基于强度值的局部地定义的可区分的近似值，例如，通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小根。还可以使用拟合点法确定Cp，其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉点确定Cp (Van Luu-The, 等人, BioTechniques, 第38卷, 第2期, 2005年2月, 第287-293页)。通过根据二阶导数最大法计算，由Roche提供的LightCycler仪器提供Cp值。
术语“PCR效率”表示循环之间扩增效率的指标。使用以下方程式计算每种条件的PCR效率：%PCR效率= (10(-斜率)-1) x 100，其中通过y-轴上绘制的对数拷贝数和x-轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。可以使用完美匹配的或错配的引物模板测量PCR效率。
术语“核酸延伸速率”表示生物催化剂(例如，酶，诸如聚合酶、连接酶等)通过将一个或多个核苷酸(例如，共价地)连接至核酸而以模板依赖性的或模板非依赖性的方式延伸核酸(例如，引物或其它寡核苷酸)的速率。
术语“5'-核酸酶探针”表示这样的寡核苷酸：其包含至少一个发光标记部分且其被用在5'-核酸酶反应中以实现靶核酸检测。在某些实施方案中，例如，5'-核酸酶探针仅包括单个发光部分(例如，荧光染料等)。在某些实施方案中，5'-核酸酶探针包括自互补性的区域，使得所述探针能够在选择的条件下形成发夹结构。为了进一步举例说明，在某些实施方案中，5'-核酸酶探针包含至少两个标记部分，并在所述两个标记中的一个被切割或以其它方式从寡核苷酸分离以后发射增加强度的辐射。在某些实施方案中，将5'-核酸酶探针用两种不同的荧光染料标记，例如，5'末端报告染料和3'末端猝灭剂染料或部分。在某些实施方案中，将5'-核酸酶探针在不包括或包括末端位置的一个或多个位置处标记。当所述探针是完整的时，通常发生在两个荧光团之间能量转移，使得来自报告染料的荧光发射至少部分地被淬灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤中，例如，与模板核酸结合的5'-核酸酶探针通过(例如，Taq聚合酶或另一种具有该活性的聚合酶的) 5'至3'核酸酶活性被切割，使得报告染料的荧光发射不再被淬灭。示例性的5'-核酸酶探针也描述在，例如，美国专利号5,210,015、美国专利号5,994,056和美国专利号6,171,785中。在其它实施方案中，可以将5'核酸酶探针用两种或更多种不同的报告染料和3'末端猝灭剂染料或部分标记。
术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”表示至少两个生色团供体生色团和受体生色团(被称作猝灭剂)之间的能量转移。当供体被适当波长的光辐射激发时，供体通常向受体转移能量。受体通常将转移的能量以不同波长的光辐射的形式重新发射。当受体是“暗”猝灭剂时，它以光以外的形式消散转移的能量。特定的荧光团充当供体还是受体取决于FRET对的其它成员的性能。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™ (BHQ)(Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa Black™ (Integrated DNATech., Inc., Coralville, Iowa)和BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry &Assoc., Dexter, Mich.)。
具体实施方式
本发明提供了灭活微生物、制备和使用它们的方法、以及含有它们的组合物和试剂盒。所述灭活微生物可用在内部对照试剂的制剂中，所述内部对照试剂用于重组核酸技术，特别是(例如，通过聚合酶链式反应(PCR))核酸扩增中。具体地，本发明提供了灭活的或非传染性的含有靶核酸序列的微生物，其可以用作验证来自核酸扩增的检测结果的内部对照。
灭活微生物
微生物通常以蛋白质外表面为特征，所述蛋白质外表面尤其用于保护RNA或DNA基因组。例如，细菌噬菌体具有主要包含蛋白的外表面，所述外表面不仅包封基因组，而且提供所述噬菌体感染宿主细胞以复制的工具。病毒的外表面通常含有糖蛋白，所述糖蛋白帮助促进向宿主细胞表面的附着和随后遗传物质的注射。
根据本公开，灭活微生物包含具有至少一个伯胺基团的经修饰的蛋白质外表面。在一个实施方案中，所述至少一个伯胺基团是赖氨酸伯胺基团。在一个其它实施方案中，所述伯胺基团是经修饰的伯胺基团。在另一个实施方案中，所述经修饰的伯胺基团被修饰成酰胺键和末端羧酸。在一个另外的实施方案中，所述灭活微生物是具有蛋白质外表面的衍生化微生物，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。在某些实施方案中，所述衍生化微生物是病毒，包括但不限于，细菌噬菌体。在其它实施方案中，所述衍生化微生物是RNA或DNA病毒。在一个其它实施方案中，所述衍生化微生物是装甲的核酸，包括但不限于，装甲的RNA或DNA。
本公开提供了“改变的”、“经修饰的”、“灭活的”或“衍生化的”微生物。这些术语在本公开的上下文中互换使用，且表示具有蛋白质外表面的微生物，其中所述外表面的组成包含被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。图6A-B图解说明了将伯胺基团修饰成酰胺键和末端羧酸。图6A-B描绘了呈具有羟基的羧酸形式的末端羧酸。但是，本领域普通技术人员明白，根据本公开的末端羧酸是羧酸解离成羧酸阴离子和带正电荷的氢离子的结果。如下所示，在去质子化以后羧酸离子的负电荷在处于稳定共振结构的两个负电性氧原子之间发生移位。
Figure 282417DEST_PATH_IMAGE001
在一个实施方案中，所述微生物是在病毒颗粒从其各自宿主细胞释放以后，优选地在完整病毒颗粒从它们的天然环境分离和浓缩或技术生产方法以后，已经按照本公开的方法修饰过的病毒。病毒蛋白的组成的修饰可以用于改变病毒颗粒的化学和/或生物特征。例如，可以调节所述病毒的附着于宿主细胞并注射它的遗传物质的能力，由此改变病毒粒子的侵染性。
在另一个方面，按照本文所述的方法用柠康酸酐处理以后，通过本公开的方法灭活的微生物保持在灭活状态。可以通过本领域普通技术人员已知的方法验证或试验灭活状态。在一个实施方案中，通过试验灭活微生物的繁殖自身的能力来验证灭活状态。在灭活的病毒的情况下，可以通过测量病毒在宿主细胞单层中形成噬斑的能力，试验灭活状态。噬斑形成单位(PFU)是每个单位体积能够形成噬斑的颗粒(诸如病毒颗粒)的数目的量度。pfu/mL的量度是被充分接受的病毒颗粒的感染宿主细胞的能力的功能测量。有缺陷的或不能感染它们的靶宿主细胞的病毒颗粒(即，灭活的病毒颗粒)将不产生噬斑且因而不被计数。在一个实施方案中，在通过本公开的方法灭活以后，本公开的灭活微生物保持灭活至少1个月。在一个特定实施方案中，所述灭活微生物是灭活的病毒。
在一个方面，本公开的灭活微生物含有对照靶核酸序列。对照靶核酸可以来自生物的或合成的来源。所述靶标可以是，例如，DNA或RNA。通常，在产生扩增子的情况下，所述扩增子将由DNA组成，尽管核糖核苷酸或合成的核苷酸也可以掺入所述扩增子中。当必须检测RNA病毒时，扩增过程通常包括使用反转录，包括例如，反转录PCR (RT-PCR)。
本公开提供了这样的实施方案：其中所述内部对照核酸是DNA，其中所述内部对照核酸是RNA，且进一步，其中所述内部对照核酸是装甲的核酸。由于RNA比DNA更易于降解(归因于影响诸如碱性pH、核糖核酸酶等)，可以将由RNA制成的内部对照核酸作为装甲的颗粒提供。装甲的颗粒诸如特别是装甲的RNA描述在例如美国专利号6,214,982中。简而言之，将RNA (其可以化学地或异源地生产，例如通过细菌例如大肠杆菌生产)至少部分地包封在病毒外壳蛋白中。后者赋予所述RNA对外部影响(特别是核糖核酸酶)的抗性。必须理解，也可以将内部对照DNA作为装甲的颗粒提供。装甲的RNA和DNA都可用作在本公开的上下文中的内部对照核酸。在一个实施方案中，在大肠杆菌中，用MS2外壳蛋白将RNA对照核酸装甲化。在另一个实施方案中，使用λ噬菌体GT11，将DNA对照核酸装甲化。
进一步，本公开提供了这样的实施方案：其中内部对照核酸的序列不同于在一个或多个样品中存在的其它核酸的序列，其中所述内部对照核酸的序列源自天然存在的基因组，其中所述内部对照核酸的序列是杂乱的，且其中所述内部对照核酸具有约50℃至约90℃的解链温度。所述内部对照核酸可以具有任意合适的长度。
优选地，内部对照核酸的序列具有不同于靶标的引物结合位点且因而结合不同的引物。这样的策略的优点尤其包括以下事实：反应混合物中的不同核酸的单个扩增事件可以彼此独立地发生，而没有任何竞争效应。对于这样的设置，所述内部对照核酸具有不同于任何靶序列的序列，以便不竞争它们的引物和/或探针。例如，内部对照核酸的序列可以不同于流体样品中的其它核酸序列。作为一个例子，如果流体样品源自人，那么所述内部对照核酸可能没有也在人类中内源性地产生的序列。序列中的差异因而应当至少足够显著以不允许引物和/或探针在严谨条件下结合各自的一种或多种内源性核酸，并由此使所述方案具有竞争性。为了避免这样的干扰，在本公开中使用的内部对照核酸的序列可以源自不同于流体样品起源的来源。例如，它衍生自天然存在的基因组，例如植物基因组，或源自葡萄基因组。在一个实施方案中，衍生自天然存在的基因组的核酸是杂乱的。如本领域已知的，“杂乱”是指在序列中引入到达一定程度的碱基突变。例如，在本公开中使用的内部对照核酸的序列相对于衍生出它的天然存在的基因而言发生实质改变。
在另一个方面，本公开提供了灭活反应混合物和灭活反应容器，其中所述混合物或容器包含微生物，即，尚未被灭活的微生物。在一个实施方案中，本公开提供了包含微生物、缓冲液和柠康酸酐的灭活反应混合物。在另一个实施方案中，所述柠康酸酐是有效量的柠康酸酐。在另一个实施方案中，本公开提供了用于微生物灭活的灭活反应容器，其包含微生物、缓冲液和柠康酸酐。在某些实施方案中，所述用于灭活反应混合物或容器中的缓冲液是在本文实施例部分中描述的SM缓冲液(0.1 M NaCl, 10mM MgSO4, 50 mM Tris pH 7.5,0.01%明胶)。在一个其它实施方案中，灭活反应容器是在其中发生微生物和柠康酸酐之间的灭活反应的容器。在一个另外的实施方案中，灭活反应混合物是允许发生微生物和柠康酸酐之间的灭活反应的混合物。
如本文中所述的，本公开的灭活微生物可用在用于核酸扩增的内部对照试剂的制剂中。在一个另外的方面，本公开提供了包含如本文中所述的灭活微生物的测定反应混合物和测定反应容器，其中这样的混合物和容器可以用在核酸的转录和扩增之前的步骤中。样品制备发生在转录和扩增之前，所以所述测定反应混合物可以被称作样品制备混合物，且所述测定反应容器可以被称作样品制备容器。在一个方面，本公开预见到不同的测定试剂，包括但不限于，在样品制备中涉及的测定试剂。所述测定试剂也可以被称作“样品制备”试剂。例如，为了释放微生物的内容物，可以将它们用酶或化学物质处理以溶解、降解或变性微生物的蛋白质外表面。该过程通常被称作裂解。得到的含有这样的经裂解的物质的溶液被称作裂解物。在一个实施方案中，本公开提供了包含衍生化微生物和测定试剂的测定反应混合物，所述衍生化微生物具有蛋白质外表面，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。
在一个实施方案中，本公开提供了包含衍生化微生物和测定试剂(或样品制备试剂)的反应混合物，所述衍生化微生物具有蛋白质外表面，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。在另一个实施方案中，将所述测定试剂用在核酸扩增的转录和扩增步骤前面的步骤中。在一个实施方案中，所述反应混合物还包含疑似含有靶核酸序列的生物样品，例如，患者样品。在这样的情况下，所述灭活微生物将充当内部阳性对照以验证核酸检测结果。在一个实施方案中，所述测定试剂选自蛋白酶、固体支持材料和裂解缓冲液。
在另一个实施方案中，所述测定试剂是裂解缓冲液。合适的裂解缓冲液包含选自离液剂、缓冲物质、醇和还原剂的一种或多种组分。离液剂通常扰乱溶液中水分子的有序结构以及分子内部和分子之间的非共价结合力，且这样的试剂可以为样品制备操作做出几个贡献。具体地，但是不仅如此，它们可以通过扰乱核酸酶的三级结构而作为RNA酶抑制剂来应用。通常，不必向裂解缓冲液应用其它RNA酶抑制剂。并且，它们可以在核酸向表面(如玻璃)的粘着结合中起显著作用。在本公开的上下文中，示例性的离液剂是胍盐如硫氰酸胍或盐酸胍或氯化胍或异硫氰酸胍、尿素、高氯酸盐诸如例如高氯酸钾、其它硫氰酸盐或碘化钾。但是，也可以使用其它离液剂。缓冲物质通常对于维持溶液中的特定pH值或pH范围而言是重要的。这是大多数生物学系统的先决条件，并且通常对于体外反应而言也是合乎需要的。它对于与本公开的灭活微生物一起使用而言也可以是有利的。在本公开的上下文中，示例性的缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂诸如柠檬酸钠，以及Tris (三-(羟甲基)-氨基甲烷)缓冲剂诸如Tris HCl，磷酸盐、N-(2-羟基乙基)-哌嗪-N'-(2-乙磺酸) (HEPES)、乙酸盐缓冲剂，而且在本公开的上下文中也可以使用其它缓冲剂。醇在用于核酸制备的裂解缓冲液中的应用也可以是有利的，如本领域技术人员已知的。在本公开的上下文中，一个实施例是使用聚多卡醇(polidocanol)，而其它醇也可以用在上述的裂解缓冲液中。聚多卡醇用于制备核酸的用途已经例如描述在EP 1 932 913中。还原剂也可以促成不希望的组分(诸如上文提及的RNA酶A)的变性。具体地，如本领域中公知的，还原剂切割对于许多蛋白质的三级结构而言特别重要的分子间和分子内二硫键。在本公开的上下文中，一个实施例是还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)。本领域已知的其它还原剂(例如，2-巯基乙醇)也可以有利地用在本公开的上下文中。
在某些替代实施方案中，本公开的测定反应混合物和/或测定反应容器明确地排除或缺乏还原剂。这样的测定反应混合物和/或测定反应容器在没有还原剂的情况下提供，和/或以还原剂的缺失为特征。
考虑到前述内容，本公开的一个方面是上述的方法，其中所述裂解缓冲液包含下述组分：硫氰酸胍、柠檬酸钠、聚多卡醇和DTT。在本公开的一个实施方案中，所述裂解缓冲液的上述组分的浓度如下：硫氰酸胍：4 M，柠檬酸钠：50 mM，聚多卡醇：5%w/v，和DTT: 2%w/v (参见美国公开的专利申请号20120045751)。上述裂解缓冲液的pH不限于具体pH值。但是，在一个实施方案中，所述裂解缓冲液具有酸性pH，或在5.5和6.5之间或约5.8的pH。
在另一个实施方案中，所述测定试剂是蛋白酶。使用快速地降解前述酶或不希望的蛋白的蛋白酶，是有利的。但是，这可能产生另一个问题，因为所述物质或酶可以在随后步骤中干扰试剂或组分。在上文提及的这类裂解或样品制备方法中可以使用的酶是这样的酶：其切割蛋白底物中的酰胺键，并且其被归类为蛋白酶或(可互换地)肽酶(参见Walsh,1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, SanFrancisco, 第3章)。合适的蛋白酶包括但不限于，碱性蛋白酶(WO 98/04730)或酸性蛋白酶(美国专利号5,386,024)。在现有技术中已经在核酸分离中广泛用于样品制备的蛋白酶是来自白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白酶K (参见例如Sambrook J. 等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)，其在中性pH左右是有活性的，并且属于本领域技术人员称为枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶家族。在上文提及的裂解或样品制备方法中使用的一个实施例是esperase酶，即一种在高碱度和高温下都保留其活性的稳健蛋白酶(EP 1 201753)。
在另一个实施方案中，所述测定试剂是固体支持材料。在本公开中，将固体支持材料与灭活微生物组合在一起(例如，在裂解之前或之后)。术语“固体支持材料”包含上面关于核酸的固定化提及的固体材料中的任一种，例如磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维过滤器、滤纸等，同时所述固体支持材料不限于这些材料。在一个实施方案中，在裂解以后，在足以允许从灭活微生物释放的核酸固定化在固体支持材料上的一段时间和条件下，组合所述固体支持材料。在一个优选的实施方案中，所述核酸包含对照核酸序列。然后将所述固体支持材料与存在的其它材料分离，并通过如下纯化核酸：将剩余物与固体支持材料分离，并将所述固体支持材料用洗涤缓冲液洗涤一次或多次。在本公开的意义上，核酸的“纯化”、“分离”或“提取”涉及以下内容：在可以在诊断测定中分析核酸(例如通过扩增)之前，它们通常必须从内部对照试剂(和从对应的生物样品，其可以含有不同组分的复杂混合物)中纯化、分离或提取。对于这些首先的步骤，可以使用允许富集所述核酸的方法。
本公开的一个方面是上述的方法，其中所述固体支持材料包含核酸结合颗粒，或选自二氧化硅、金属、金属氧化物、塑料、聚合物和核酸的一种或多种材料。在本公开的一个实施方案中，所述固体支持材料是磁性玻璃颗粒。
在本公开的上下文中，“固定化”是指以可逆的或不可逆的方式捕获对象例如核酸。具体地，“固定化在固体支持材料上”是指，出于将其与任何周围介质分离的目的，使一个或多个对象与固体支持材料结合，并且可以回收，例如通过在以后的时点与固体支持材料分离。在该背景下，“固定化”可以例如包括将核酸吸附至玻璃或如上所述的固体材料的其它合适的表面。此外，可以通过结合捕获探针，而将核酸特异性地“固定化”，其中核酸通过碱基配对而结合连接于固体支持物的、基本上互补的核酸。在后一种情况下，这样的特异性的固定化导致靶核酸的优势结合。
在本公开的另一个方面，公开了柠康酸酐用于微生物的外源灭活的用途，由此在保留对照核酸序列的完整性的同时将微生物灭活。在本文中，将有效量的柠康酸酐应用于微生物。在某些实施方案中，在与有效量的柠康酸酐接触之前，所述微生物包含含有至少一个伯胺基团的蛋白质外表面。在某些实施方案中，灭活以后，所述微生物包含蛋白质外表面，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。柠康酸酐的“有效量”表示足以灭活微生物的量。例如，根据本文描述的或在本领域中另外描述的方案，可以证实足够的微生物灭活。在一个实施方案中，所述柠康酸酐的有效量是在约5 mM至约25 mM之间、约1 mM至约7 mM之间、约5 mM至约15 mM之间和约11 mM至约22 mM之间的浓度。在其它实施方案中，所述有效量是约1 mM、约2 mM、约3 mM、约4 mM、约4.5 mM、约5 mM、约5.5 mM、约6 mM、约6.5 mM、约7 mM、约7.5 mM、约8 mM、约8.5 mM、约9 mM、约9.5 mM、约10mM、约10.5 mM、约11 mM、约11.5 mM、约12 mM、约12.5 mM、约13 mM、约13.5 mM、约14 mM、约15 mM、约16 mM、约17 mM、约18 mM、约19 mM、约19.5 mM、约20 mM、约20.5 mM、约21 mM、约21.5 mM、约22 mM、约22.5 mM、约23 mM、约24mM和约25 mM。在某些实施方案中，所述柠康酸酐的有效量是(i) 在约5 mM至约25 mM之间的浓度；(ii) 在约5.5 mM至约22 mM之间的浓度，或(iii) 在选自约5.5 mM、约11 mM和约22 mM的浓度。在某些实施方案中，使所述微生物与柠康酸酐的接触在环境温度和/或持续约1小时。在某些实施方案中，所述微生物是病毒，更具体地是RNA或DNA病毒。在某些实施方案中，所述微生物是装甲的核酸，更具体地是装甲的RNA或DNA。
灭活微生物的方法
在一个方面，本公开提供了灭活微生物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在液体基质中提供含有对照核酸序列的传染性微生物。在另一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：使所述微生物与有效量的柠康酸酐接触。在一个其它实施方案中，所述方法在保留对照核酸序列的完整性的同时将所述微生物灭活。在本公开中，保留对照核酸序列的完整性是指，所述序列没有因为柠康酸酐处理而受到损伤或损害使得它不能用作核酸扩增反应中的内部对照试剂。通过本领域普通技术人员已知的标准技术可以证实所述序列的完整性。
在一个其它方面，本公开的微生物灭活方法是微生物的外源修饰方法。例如，在适当的缓冲液中使柠康酸酐与分离的微生物外源地接触以允许修饰(和灭活)发生。在一个实施方案中，所述适当的缓冲液是液体(或水性的)基质或悬浮介质如缓冲盐水或生理盐水。在一个其它实施方案中，所述悬浮流体是Tris-缓冲盐水或包含三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)的缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述微生物是病毒。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在柠康酸酐处理之前或之后，浓缩来自悬浮流体的分离的病毒颗粒。在另一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：使经浓缩的病毒颗粒与柠康酸酐接触或温育，使得所述病毒颗粒被修饰。在一个另外的实施方案中，所述方法包括以下步骤：将经修饰的病毒颗粒与过量的柠康酸酐分离。在其它实施方案中，通过超速离心、超滤、色谱法或亲和色谱法，实现分离的病毒颗粒的浓缩和/或经修饰的病毒颗粒的分离。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：检测经修饰的病毒颗粒。在其它实施方案中，所述方法包括以下步骤：验证经修饰的病毒颗粒的灭活状态，诸如通过测量pfu/mL。
在另一个方面，本发明提供了通过使用有效量的柠康酸酐灭活微生物的方法。柠康酸酐的“有效量”表示足以灭活微生物的量。例如，根据本文描述的或在本领域中另外描述的方案，可以证实足够的微生物灭活。在一个实施方案中，所述柠康酸酐的有效量是在约5 mM至约25 mM之间、约1 mM至约7 mM之间、约5 mM至约15 mM之间和约11 mM至约22 mM的浓度。在其它实施方案中，所述有效量是约1 mM、约2 mM、约3 mM、约4 mM、约4.5 mM、约5mM、约5.5 mM、约6 mM、约6.5 mM、约7 mM、约7.5 mM、约8 mM、约8.5 mM、约9 mM、约9.5 mM、约10 mM、约10.5 mM、约11 mM、约11.5 mM、约12 mM、约12.5 mM、约13 mM、约13.5 mM、约14mM、约15 mM、约16 mM、约17 mM、约18 mM、约19 mM、约19.5 mM、约20 mM、约20.5 mM、约21mM、约21.5 mM、约22 mM、约22.5 mM、约23 mM、约24mM和约25 mM。在其它实施方案中，所述有效量是超过25 mM。在一个优选的实施方案中，将有效量的柠康酸酐提供在约5 mM或以上的Tris缓冲盐水中。
在一个另外的方面，本公开提供了具有接触或温育步骤的方法，所述接触或温育步骤通过在如本文所述的合适缓冲液中的缓慢搅拌实现。在一个实施方案中，所述接触或温育在约20℃至约40℃之间的温度进行。在一个其它实施方案中，所述温度优选地是在约25℃至约35℃之间，和/或所述温育时间是在约1至约3小时之间。在其它实施方案中，将所述接触或温育步骤执行约30分钟至90分钟之间的时间段。在另一个实施方案中，将所述接触或温育步骤执行约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟或约90分钟。在一个优选的实施方案中，在室温或环境温度执行所述接触或温育步骤。通常，室温或环境温度是控温环境的温度。室温或环境温度的范围是约18℃至约30℃。在一个实施方案中，室温或环境温度是约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃。在另一个实施方案中，室温或环境温度是约25℃。在其它实施方案中，可以在约4℃执行所述接触或温育步骤。
在另一个优选的实施方案中，在室温或环境温度执行所述接触或温育步骤约60分钟。在一个优选的实施方案中，室温或环境温度是约25℃。
验证检测结果的方法
本公开的灭活微生物、以及制备和使用它们的方法可以用于其中需要或期望这样的灭活微生物的任意目的。在一个方面，本公开提供了适合在多核苷酸延伸(例如，PCR)或核酸扩增测定的方法中用作阳性内部对照的灭活微生物。例如，通过样品制备(核酸提取)、RNA的反转录(如果需要的话)以提供cDNA、DNA的扩增和扩增的DNA的检测(参见美国专利号8,609,340)的步骤，将阳性内部对照与样品一起处理。在一个实施方案中，所述灭活微生物是灭活的病毒。在一个优选的实施方案中，所述灭活微生物是细菌噬菌体。
一般而言，本公开的灭活微生物适合用在任何核酸扩增和检测方法中。要在本公开的上下文中使用的其它核酸扩增方法包括连接酶链式反应(LCR) (Wu D. Y. 和WallaceR. B., Genomics 4 (1989) 560-69；和Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany F., PCR Methods and Applic. 1(1991) 5-16); Gap-LCR (WO 90/01069)；修复链式反应(EP 0439182 A2；美国专利号4,851,331)，重组酶聚合酶扩增(RPA)方法(参见例如美国专利号7,485,428)；滚环扩增(RCA)(参见例如Fire和Xu, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:4641-4645 (1995)；Lui等人, J.Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 (1996)；Lizardi等人, Nature Genetics 19:225-232(1998), 美国专利号5,714,320和6,235,502)；解螺旋酶依赖性扩增(HDA) (参见例如Vincent等人, EMBO Reports 5(8): 795-800 (2004)；美国专利号7,282,328)；多重置换扩增(MDA) (参见例如Dean等人, Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5261-5266 (2002))；自我持续序列复制(3SR) (Kwoh D. Y. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)1173-1177；Guatelli J. C., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878；WO 92/08808)，环介导的等温扩增(LAMP) (美国专利号6,410,278; Notomi等人,Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15; 28(12): e63)，和基于核酸序列的扩增(NASBA) (美国专利号5,130,238)。此外，还有链置换扩增(SDA) (美国专利号5,455,166和5,470,723)、转录介导的扩增(TMA) (参见例如，Guatelli等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (1990))和Qb-扩增(关于综述，参见例如Whelen A. C.和Persing D. H.,Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373；Abramson R. D.和Myers T. W., CurrOpin Biotechnol 4 (1993) 41-47)。
因此，在本公开的另一个方面，提供了使用所述灭活微生物的多核苷酸延伸(例如，PCR)方法。适合用于多核苷酸延伸的条件是本领域已知的(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York, N.Y., 2001年第3版; Ausubel等人, Short Protocols in MolecularBiology (第4版, John Wiley & Sons 1999))。通常，使引物退火(即，杂交)至靶核酸(在样品中和/或在对照中)以形成引物-模板复合物。在合适的环境中使引物-模板复合物与DNA聚合酶和核苷三磷酸接触以允许一个或多个核苷酸向引物的3'末端的添加，由此产生与靶核酸互补的延伸的引物。所述引物可以包括，例如，一个或多个核苷酸类似物。另外，所述核苷三磷酸可以是常规核苷酸、非常规核苷酸(例如，核糖核苷酸或经标记的核苷酸)或其混合物。在某些变体中，所述多核苷酸延伸反应包含靶核酸的扩增。适合用于使用DNA聚合酶和引物对的核酸扩增的条件也是本领域已知的(例如，PCR扩增方法)。(参见，例如，Sambrook等人, 出处同上; Ausubel等人, 出处同上; PCR Applications: Protocolsfor Functional Genomics (Innis等人编, Academic Press 1999)。在其它非相互排斥的实施方案中，所述多核苷酸延伸反应包含RNA模板的反转录(例如，RT-PCR)。
在某些实施方案中，将本公开的灭活微生物用在反转录反应中。在某些实施方案中，在含有本公开的灭活微生物、RNA模板、一种或多种引物和热稳定的DNA聚合酶的混合物中进行所述反转录反应。所述反应混合物通常含有所有四种标准脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)以及含有二价阳离子和单价阳离子的缓冲液。示例性的阳离子包括，例如，Mg2+，尽管其它阳离子(诸如Mn2+或Co2+)可以活化DNA聚合酶。在其它实施方案中，用合适的热活性的DNA聚合酶进行所述反转录反应。
在另一个方面，本公开提供了验证试验样品在核酸扩增测定中的检测结果的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在包含试验样品和衍生化微生物(例如，修饰的或改变的微生物)的混合物上执行样品制备。在另一个实施方案中，所述衍生化微生物包含(i) 对照核酸序列；和(ii) 蛋白质外表面，其具有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。在一个其它实施方案中，所述样品制备从所述试验样品和所述衍生化微生物释放核酸。在另一个实施方案中，所述样品制备从所述试验样品和所述衍生化微生物释放(或提取)核酸。在其它实施方案中，来自所述试验样品的核酸包含要扩增(在DNA的情况下)或逆转录(在RNA的情况下)的靶核酸。在RNA提取的情况下，所述方法还包括反转录步骤以提供cDNA用于随后核酸扩增。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在从试验样品和衍生化微生物释放的核酸上执行核酸扩增。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：检测所述靶核酸(如果存在的话)、以及所述对照核酸靶标，由此验证检测结果。在另一个实施方案中，所述检测步骤包括，使扩增的靶核酸与可检测地标记的核酸探针杂交，和检测所述杂交的扩增的靶核酸。前述方法步骤是本领域普通技术人员众所周知的。通过使用例如5'-核酸酶探针和用FRET方法的扩增子检测，可以完成杂交和检测。在一个特别优选的实施方案中，所述方法可以进一步包括对生物样品中所含的靶核酸的定量。
使用本文描述的验证试验样品的检测结果的方法，来检测延伸产物或扩增产物的其它方法包括，使用荧光双链核苷酸结合染料或荧光双链核苷酸嵌入染料。荧光双链DNA结合染料的例子包括SYBR-绿(Molecular Probes)。所述双链DNA结合染料可以与解链曲线分析结合使用以测量引物延伸产物和/或扩增产物。所述解链曲线分析可以在实时PCR仪器上执行，诸如具有嵌入软件(SDS 2.1)的ABI 5700/7000 (96孔格式)或ABI 7900 (384孔格式)仪器。可替换地，所述解链曲线分析可以作为终点分析来执行。解链点分析的示例性方法描述在美国公开号2006/0172324中。
在其它实施方案中，所述方法包括以下步骤：通过将要测试病原体的存在的生物样品加入含有本文描述的灭活微生物的组合物中，制备用于测试的样品。在一个实施方案中，在样品制备步骤之前执行所述制备步骤。
在一个方面，所述灭活微生物适合用于验证定性或定量检测结果的方法。生物样品中核酸的定性检测对于例如识别个体的感染而言是至关重要的。由此，用于检测微生物感染的测定法的一个重要的要求是避免假阴性或假阳性结果，因为这样的结果几乎不可避免地导致就各个患者的治疗而言的严重后果。因而，特别是在基于PCR的方法中，将定性内部对照核酸加入检测混合物中。所述对照对于证实试验结果的有效性而言是特别重要的：至少在就各种靶核酸而言阴性结果的情况下，定性内部对照反应在给定的设置内必须表现为反应性的，即必须检测出定性内部对照，否则认为该试验自身是无效的。因而，本公开的一个方面是上述的方法，其中即使在没有一种或多种所述靶核酸的扩增产物存在下，所述内部对照核酸的扩增产物的存在指示在反应混合物中发生扩增(美国专利号8,877,464)。
除了定性检测核酸在样品中的存在或不存在以外，确定所述核酸的量通常是重要的。作为一个例子，可以基于病毒载量来评估病毒性疾病的阶段和严重程度。此外，任何治疗的监测需要关于在个体中存在的病原体的量的信息，以便评价所述治疗的成功。对于定量测定，必须引入定量标准核酸，其充当用于确定靶核酸的绝对量的参照。可以通过参考外部校准或通过实现内部定量标准，而完成定量。加入试验反应本身中的内部对照核酸的应用具有某些优点。当充当定量标准时，所述内部对照核酸在定量试验中具有至少以下两种功能：i)它监测反应的有效性，ii)它充当滴度计算中的参照，从而补偿抑制的效应并控制制备和扩增过程以允许更准确的定量(美国专利号8,877,464)。
试剂盒
在另一个方面，本公开提供了针对靶核酸(例如，病原体的核酸)的存在来分析生物样品的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包括含有根据本公开的灭活微生物的阳性内部对照组合物。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含在液体基质中的灭活微生物。所述液体基质包含稳定的生物流体，其对应于来自待分析的生物样品的流体。这样的流体包括但不限于血清、血浆、去纤维蛋白化的血浆、稳定化的血浆合并物、脑脊液(CSF)、尿、唾液、精液和痰。可替换地，所述液体基质可以包含被配制成模拟这样的生物流体的合成基质。制备合成的生物流体的方法是本领域众所周知的。此外，所述液体基质可以含有添加剂诸如抗氧化剂、缓冲盐、防腐剂、抗生素和稳定基质的填充剂诸如糖(单糖和多糖)、蛋白(包括白蛋白、卵白蛋白、γ球蛋白、红血细胞裂解物、酪蛋白、干燥奶粉和/或其它血清蛋白)和合成的稳定剂诸如聚-乙烯基吡咯烷、聚-1-赖氨酸和甲基化的牛血清白蛋白(BSA)。为了进行用于长期贮存和稳定性的冷冻干燥，也可以通过加入例如蔗糖和甘露糖，而修饰所述液体基质。
在本公开的实践中，所述试剂盒可以包含本领域普通技术人员已知的进行核酸扩增技术所需的另外材料。此外，本公开意图包括本公开的灭活微生物向用于核酸扩增技术的合适试剂盒的添加。
在本公开的另一个方面，提供了用于本文描述的引物延伸方法或核酸扩增测定中的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒为了便于使用而分隔化，且含有至少一个提供根据本公开的灭活微生物的容器。还可以包括一个或多个提供另外试剂的另外容器。在某些实施方案中，所述试剂盒还可以包括含有肝素或其盐、或向溶液中释放肝素的血液收集试管、容器或单元。所述血液收集单元可以是肝素化的试管。这样的另外容器可以包括技术人员认识到用于根据上述方法的引物延伸操作中的任意试剂或其它要素，包括用于例如核酸扩增操作(例如，PCR、RT-PCR)中的试剂。例如，在某些实施方案中，所述试剂盒还包括这样的容器：其提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5'正义引物、或包含5'正义引物和对应的3'反义引物的引物对。在另外其它非相互排斥的变体中，所述试剂盒包括一个或多个提供核苷三磷酸(常规和/或非常规)的容器。在具体实施方案中，所述试剂盒包括α-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dITP和/或标记的dNTP，例如，荧光素-或花青素-染料家族dNTP。在其它非相互排斥的实施方案中，所述试剂盒包括一个或多个提供适合引物延伸反应的缓冲液的容器。
尽管为了清楚和理解的目的已经比较详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开内容将清楚，可以在形式和细节上做出各种变化，而不脱离本发明的真实范围。例如，上述的所有组合物和方法可以以不同的组合使用。
给出以下实施例来举例说明本发明的实施方案，因为这是目前优选实践的。应该理解，所述实施例是说明性的，并且除了在所附权利要求书中指示以外，本发明不应视为受到限制。
实施例
实施例1：用柠康酸酐灭活细菌噬菌体
为了分析使用柠康酸酐(也被称作“Cit”或“cit”)的λ细菌噬菌体GT11灭活，进行了滴定。下面的表1.1显示了柠康酸酐11M的稀释度。
表1.1
试管 工作储备液 与噬菌体反应的终浓度
0 0 0
10-1 1.1M 11mM
10-2 0.11M 1.1mM
10-3 11mM 0.11mM
10-4 1mM 11µM
10-5 0.1mM 1.1µM
将10µl柠康酸酐在DMF中的工作溶液加入1 ml在SM缓冲液中的λ细菌噬菌体，所述SM缓冲液是0.1 M NaCl、10mM MgSO4、50 mM Tris pH 7.5、0.01%明胶(Sambrook和Russell, 出处同上，第A2.8页)，其中噬菌体以1 x 107 pfu/ml提供)。在室温进行反应1小时，并然后在4℃保存7天至1个月。滴定噬菌体溶液以确定柠康酸酐修饰对噬菌体的影响。
如下进行细菌噬菌体的滴定：使用0.1%接种物将宿主细菌大肠杆菌Y1088接种进15 ml补充了10 mM MgSO4和0.2%麦芽糖(w/v)的luria液体培养基中，并在37℃温育至OD<=1。通过离心(在500 xg 10分钟)浓缩细胞，并将细胞沉淀物再悬浮于1/2体积的无菌10 mMMgSO4中。将大肠杆菌细胞用10 mM MgSO4稀释至0.5 OD600。如下将细菌噬菌体在SM缓冲液中系列稀释。将10µL噬菌体吸入标记了10-2的试管中。通过涡旋进行再悬浮。使用新尖头，将10µL 10-2稀释液吸入标记了10-4的试管中。通过涡旋进行再悬浮。重复100倍系列稀释至10-8试管。从10-8试管，执行10倍稀释至10-9和10-10试管。将100µL噬菌体从10-8加入10-9试管，涡旋，并将100µL从10-9试管加入10-10试管。涡旋10-10试管。对于滴定每个样品，将300µL大肠杆菌加入5个无菌17x100mm Falcon聚丙烯圆底试管(#352057)中的每一个中。将100µL经稀释的λDNA加入试管中(稀释度10-4、10-6、10-8、10-9和10-10)。在室温静置10分钟。在37℃温育10分钟。同时，用噬菌体样品和稀释度标记NZCYM平板。向仍然在37℃加热块中的第一个试管中，加入3 mL顶琼脂(来自在50℃浴中的顶琼脂瓶子)，涡旋试管，并快速地倒在NZCYM平板上。快速地涡旋平板，使得顶琼脂覆盖整个平板。使顶琼脂在工作台上固化。用每个试管重复。将平板在倒置位置在37℃温育过夜。次日，计数噬斑，并使用提供最大可数数目的噬斑的稀释度计算滴度。
下面的表1.2提供了第1天和第8天的结果。发现11 mM提供完全灭活，其在7天以后持续。
表1.2
与噬菌体反应的终浓度 第1天- 滴度(pfu/ml) 第8天- 滴度(pfu/ml)
0 9.1 x 10<sup>6</sup> 2.8 x 10<sup>7</sup>
11 mM 0 0
1.1 mM 1.8 x 10<sup>6</sup> 2.0 x 10<sup>7</sup>
0.11 mM 5.5 x 10<sup>6</sup> 3.6 x 10<sup>7</sup>
11µM 9.0 x 10<sup>6</sup> 2.9 x 10<sup>7</sup>
1.1µM 6.7x 10<sup>6</sup> 3.9 x 10<sup>7</sup>
实施例2：从柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的扩增
该实验测试λ细菌噬菌体的柠康酸酐(Cit)处理对DNA扩增的影响。在滴定之前在3种不同浓度完成处理，并滴定。下面的表2.1提供了在实验中使用的处理条件(0A-0C：仅对照DMF；1A-1C：最高Cit浓度；2A-2C：中间Cit浓度；和3A-3C：最低Cit浓度)。
表2.1
样品 Cit的浓度 噬菌体的浓度
0A 0 1 x 10<sup>4</sup>个拷贝/uL
0B 0 1 x 10<sup>3</sup>个拷贝/uL
0C 0 1 x 10<sup>2</sup>个拷贝/uL
1A 11 mM 1 x 10<sup>4</sup>个拷贝/uL
1B 11 mM 1 x 10<sup>3</sup>个拷贝/uL
1C 11 mM 1 x 10<sup>2</sup>个拷贝/uL
2A 1.1 mM 1 x 10<sup>4</sup>个拷贝/uL
2B 1.1 mM 1 x 10<sup>3</sup>个拷贝/uL
2C 1.1 mM 1 x 10<sup>2</sup>个拷贝/uL
3A 0.11 mM 1 x 10<sup>4</sup>个拷贝/uL
3B 0.11 mM 1 x 10<sup>3</sup>个拷贝/uL
3C 0.11 mM 1 x 10<sup>2</sup>个拷贝/uL
将20微升经稀释的噬菌体加入400微升经稀释的全血中，并使用Magnapure盒(Roche)和MagNA Pure Compact核酸分离试剂盒I - 大体积(目录编号03 730 972 001)纯化核酸。在扩增之前将100µl洗脱物在4℃保存。将5微升样品与15µl含有引物的LCVM主混合物组合，并在LC480热循环仪(Roche)上扩增。方案：95℃30秒，继之以95℃ 5秒、60℃ 30秒的55个循环。
图1提供了实验的结果。如在下面表2.2中所示，用11 mM Cit处理过的噬菌体具有与未处理的(有活性的)噬菌体相同的Ct。
表2.2
Cit的浓度 拷贝/反应 平均Cp
0 mM 5000 25.28
11 mM 5000 25.30
1.1 mM 5000 25.25
0.11 mM 5000 25.18
0 mM 500 28.73
11 mM 500 27.89
1.1 mM 500 28.71
0.11 mM 500 28.82
0 mM 50 32.35
11 mM 50 31.19
1.1 mM 50 32.24
0.11 mM 50 32.36
实施例3：柠康酸酐灭活的细菌噬菌体的稳定性
该实验测试了柠康酸酐(Cit)处理过的λ细菌噬菌体的稳定性。将噬菌体使用不同的Cit浓度灭活，并在4℃保存1个月。如在表3.1中所示，发现在大于或等于11 mM灭活的噬菌体保持灭活1个月。
表3.1
工作储备液 与噬菌体反应的最终Cit浓度 滴度pfu/ml (第1天) 滴度pfu/ml (在1个月)
0 0 6.5 x 10<sup>6</sup> 1.4 x 10<sup>6</sup>
2.2 M 22 mM 0 0
1.1 M 11 mM 0 0
0.55 mM 5.5 mM 1.5 x 10<sup>6</sup> 1.5 x 10<sup>6</sup>
实施例4：DNA酶敏感性
该实验测试了柠康酸酐(Cit)处理过的λ细菌噬菌体的DNA酶敏感性。使用0.5单位或0.05单位的DNA酶(RPC稀释剂+ 0.095%叠氮化钠)试验了不同靶标。将40微升噬菌体与4µl 10x反应缓冲液(400mM Tris-HCl, pH 7.9, 100mM NaCl, 60mM MgCl2, 10mM CaCl2)和1µl经稀释的DNA酶I组合，并在37℃温育20分钟。通过加入2uL 0.2M EDTA，终止反应。DNA酶处理以后，将噬菌体加入全血样品中，并使用MagNA Pure Compact如上所述进行处理。
表4.1提供了关于使用0.5单位的DNA酶测试的靶标的信息。表4.2提供了关于使用0.05单位的DNA酶测试的靶标的信息。
表4.1
测试的DNA酶靶标 浓度 Cit处理
裸质粒(无噬菌体) 1 x 10<sup>6</sup>个拷贝/mL 无
0.095%叠氮化钠缓冲液中的噬菌体 1 x 10<sup>6</sup>个拷贝/mL 无
DMF缓冲液中的噬菌体 1 x 10<sup>7</sup>个拷贝/mL 无
噬菌体- 5.5 mM Cit 1 x 10<sup>7</sup>个拷贝/mL 0.5 M
噬菌体- 11 mM Cit 1 x 10<sup>7</sup>个拷贝/mL 1.0 M
噬菌体- 22 mM Cit 1 x 10<sup>7</sup>个拷贝/mL 2.0 M
表4.2
测试的DNA酶靶标 浓度
裸质粒(无噬菌体) 1 x 10<sup>6</sup>个拷贝/mL
0.095%叠氮化钠缓冲液中的噬菌体 1 x 10<sup>6</sup>个拷贝/mL
DMF缓冲液中的噬菌体 3.33 x 10<sup>5</sup>个拷贝/mL 无Cit处理
噬菌体- 5.5 mM Cit 3.33 x 10<sup>5</sup>个拷贝/mL 0.5 M Cit处理
噬菌体- 11 mM Cit 3.33 x 10<sup>5</sup>个拷贝/mL 1.0 M Cit处理
噬菌体- 22 mM Cit 3.33 x 10<sup>5</sup>个拷贝/mL 2.0 M Cit处理
将40微升噬菌体与4µl 10x反应缓冲液(400mM Tris-HCl, pH 7.9, 100mM NaCl,60mM MgCl2, 10mM CaCl2)和1µl经稀释的DNA酶I组合，在37℃温育20分钟。通过加入2uL0.2M EDTA，终止反应。DNA酶处理以后，将噬菌体加入全血样品中，并使用MagNA PureCompact如上所述进行处理。
将样品用每个反应0.5单位或0.05单位的DNA酶处理。没有执行DNA酶的热灭活，并将样品加入经稀释的血液中。立即在MagNA Pure Compact仪器上执行样品制备以除去所有DNA酶。通过qPCR执行扩增和检测(参见在实施例2中提供的方案)。还将没有DNA酶处理的对照在37℃暴露于反应缓冲液，并也进行样品制备。
图2提供了在0.5单位时DNA酶处理的结果。图3提供了在0.05单位时DNA酶处理的结果。表4.3提供了处理过的和未处理的靶标之间的Cp的变化(∆Cp)。首先将噬菌体在1 x107个拷贝/mL的浓度处理，并然后在RPC稀释剂+ 0.95%叠氮化钠中稀释30倍，使得Cp在约29个循环时类似于较低浓度的对照噬菌体。
Figure 327733DEST_PATH_IMAGE002
用0.05单位的DNA酶处理过的靶标还在贮存1周和1个月以后重新试验。如果发生针对靶标的任何另外的DNA酶活性，预期所述酶除去任何未保护的靶标，且当通过qPCR扩增时发生Cp转移。进行平行实验，其中将靶标在SM缓冲液中保存(按照实施例1)。
图4显示了DNA酶处理并在RPC稀释剂+ 0.095%叠氮化钠或SM缓冲液(按照实施例1)中贮存1周以后，DNA扩增(根据实施例2中的方案)的结果。在图的顶部显示了Cp的变化(∆)，并总结在下面表4.4中。左边的条是-DNA酶，右边的条是+DNA酶。
表4.4
样品 平均Cp: 无DNA酶处理 平均Cp: DNA酶处理 1周以后Cp的∆
无Cit处理，在SM缓冲液中 29.4 30.8 1.4
无Cit处理，在叠氮化钠缓冲液中 29.4 31.9 2.5
1 M Cit处理，在SM缓冲液中 30.5 31.9 1.4
1 M Cit处理，在叠氮化钠缓冲液中 31.6 34.6 3.0
图5显示了DNA酶处理并在RPC稀释剂+ 0.095%叠氮化钠或SM缓冲液(按照实施例1)中贮存1个月以后，DNA扩增(根据实施例2中的方案)的结果。在图的顶部显示了Cp的变化(∆)，并总结在下面表4.5中。
表4.5
样品 平均Cp: 无DNA酶处理 平均Cp: DNA酶处理 1个月以后Cp的∆
无Cit处理，在SM缓冲液中 29.5 30.2 0.7
无Cit处理，在叠氮化钠缓冲液中 29.6 32.1 2.6
1 M Cit处理，在SM缓冲液中 30.3 31.2 0.9
1 M Cit处理，在叠氮化钠缓冲液中 31.9 34.7 2.9
实施例5：灭活靶标的贮存
将用不同浓度的Cit处理过的细菌噬菌体靶标贮存在不同的缓冲液中，并且然后评价它们的灭活状态。将靶标贮存在10 mM Tris pH 8.3或10 mM三(羟甲基)甲基甘氨酸pH8.3中。表5.1总结了结果，其证实，在>= 11 mM的Cit-处理提供在任一种缓冲液中贮存以后1个月的灭活。
Figure 50839DEST_PATH_IMAGE003

Claims (16)

1.一种用于外源灭活病毒的方法，所述方法包括使含有对照核酸序列的传染性病毒与有效量的柠康酸酐外源地接触，由此在保留所述对照核酸序列的完整性的同时灭活所述病毒，其中所述柠康酸酐的有效量是在约5 mM至约25 mM之间的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在接触之前，所述病毒包含含有至少一个伯胺基团的蛋白质外表面。
3.根据权利要求1和2中的任一项所述的方法，其中所述灭活病毒包含蛋白质外表面，所述蛋白质外表面含有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。
4.根据权利要求1和2中的任一项所述的方法，其中所述接触在18℃-30℃的环境温度进行，和/或所述接触进行约1小时。
5.根据权利要求1和2中的任一项所述的方法，其中所述病毒是RNA或DNA病毒。
6.根据权利要求1和2中的任一项所述的方法，其中所述病毒是装甲的核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述病毒是装甲的RNA或DNA。
8.根据权利要求1和2中的任一项所述的方法，其中所述病毒是细菌噬菌体。
9.一种验证试验样品在核酸扩增测定中的检测结果的方法，所述方法包括：
(a) 在包含试验样品和根据权利要求1-8中任一项的方法灭活的灭活病毒的混合物上执行样品制备，其中所述灭活病毒包含(i)对照核酸序列；和(ii)蛋白质外表面，其具有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团，其中所述样品制备从所述试验样品和所述灭活病毒二者释放核酸；
(b) 在释放的核酸上执行核酸扩增；和
(c) 检测所述对照核酸序列，由此验证所述试验样品的检测结果。
10.一种病毒灭活反应混合物，其包含
(a) 具有蛋白质外表面的病毒；
(b) 反应缓冲液；和
(c) 有效量的柠康酸酐，
其中所述柠康酸酐的有效量是在约5 mM至约25 mM之间的浓度。
11.根据权利要求10所述的病毒灭活反应混合物，其中所述病毒是RNA或DNA病毒。
12.根据权利要求10所述的病毒灭活反应混合物，其中所述病毒是装甲的核酸。
13.根据权利要求12所述的病毒灭活反应混合物，其中所述病毒是装甲的RNA或DNA。
14.根据权利要求10所述的病毒灭活反应混合物，其中所述病毒是细菌噬菌体。
15.根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得的灭活病毒，其包含(i)对照核酸序列；和(ii)蛋白质外表面，其具有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。
16.根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得的灭活病毒用作验证来自核酸扩增的检测结果的内部对照试剂的用途，其中所述灭活病毒包含(i)对照核酸序列；和(ii)蛋白质外表面，其具有至少一个被修饰成酰胺键和末端羧酸的伯胺基团。
CN201680030692.1A 2015-05-29 2016-05-24 用柠康酸酐灭活微生物的方法 Active CN107636164B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562168541P 2015-05-29 2015-05-29
US62/168,541 2015-05-29
PCT/EP2016/061705 WO2016193070A1 (en) 2015-05-29 2016-05-24 A method of inactivating microbes by citraconic anhydride

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107636164A CN107636164A (zh) 2018-01-26
CN107636164B true CN107636164B (zh) 2022-02-18

Family

ID=56072327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680030692.1A Active CN107636164B (zh) 2015-05-29 2016-05-24 用柠康酸酐灭活微生物的方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11015217B2 (zh)
EP (1) EP3303611B1 (zh)
JP (1) JP6822974B2 (zh)
CN (1) CN107636164B (zh)
CA (1) CA2985015C (zh)
ES (1) ES2759477T3 (zh)
WO (1) WO2016193070A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016193070A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Roche Diagnostics Gmbh A method of inactivating microbes by citraconic anhydride
AT519931A1 (de) * 2017-05-12 2018-11-15 Kepler Univ Gmbh Herstellung von armierter DNA
KR20230054790A (ko) * 2019-07-16 2023-04-25 멜리오랩스 인코포레이티드 단일-세포 기반 디지털 고해상도 용융을 위한 방법 및 장치
IL296453A (en) * 2020-03-20 2022-11-01 Singlera Health Tech Shanghai Ltd Methods and kits for screening tumors of the large intestine

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1150584A (zh) * 1995-06-21 1997-05-28 罗纳·布朗克化学公司 制备柠康酸酐的方法
WO2001010209A1 (en) * 1999-08-11 2001-02-15 Biomedical Design, Inc. Sterilization of biological tissue
WO2009141739A2 (ja) * 2008-02-12 2009-11-26 ジョンソンディバーシー・インコーポレーテッド 衣料用液体洗浄剤組成物

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4851331A (en) 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
WO1990001069A1 (en) 1988-07-20 1990-02-08 Segev Diagnostics, Inc. Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
ATE137269T1 (de) 1990-01-26 1996-05-15 Abbott Lab Verbessertes verfahren zur amplifikation von nuklein säurezielsequenz, einsetzbar für die polymerase und ligasekettenreaktion
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
WO1992008808A1 (en) 1990-11-14 1992-05-29 Siska Diagnostics, Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5386024A (en) 1993-02-10 1995-01-31 Gen-Probe Incorporated Method to prepare nucleic acids from a biological sample using low pH and acid protease
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
US5470723A (en) 1993-05-05 1995-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification
US5773258A (en) 1995-08-25 1998-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme
US5939262A (en) 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5981235A (en) 1996-07-29 1999-11-09 Promega Corporation Methods for isolating nucleic acids using alkaline protease
US6399304B1 (en) 1996-12-20 2002-06-04 Roche Diagnostics Gmbh Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules
US6183998B1 (en) 1998-05-29 2001-02-06 Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 Method for reversible modification of thermostable enzymes
US6235502B1 (en) 1998-09-18 2001-05-22 Molecular Staging Inc. Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification
ATE521718T1 (de) 1998-11-09 2011-09-15 Eiken Chemical Prozess zur synthetisierung von nukleinsäure
GB9920194D0 (en) 1999-08-27 1999-10-27 Advanced Biotech Ltd A heat-stable thermostable DNA polymerase for use in nucleic acid amplification
PT1326963E (pt) 2000-10-17 2008-08-29 Zeptometrix Corp Microorganismos tornados não patogénicos
EP1201753B1 (en) 2000-10-31 2008-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Methods for the analysis of non-proteinaceous components using a protease from a bacillus strain
EP1992706B1 (en) 2002-02-21 2014-11-19 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
EP1539979B1 (en) 2002-09-20 2008-11-19 New England Biolabs, Inc. Helicase dependent amplification of nucleic acids
US7718402B2 (en) 2002-12-13 2010-05-18 Geneohm Sciences Canada Inc. Biological reagents and methods to verify the efficiency of sample preparation and nucleic acid amplification and/or detection
AU2004203649B2 (en) 2003-08-12 2006-01-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Thermostable Taq polymerase fragment
US20060172324A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Roche Molecular Systems, Inc. Methods of genotyping using differences in melting temperature
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
JP2010537637A (ja) 2007-08-27 2010-12-09 アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド Ｐｃｒのための方法および組成物
US8877464B2 (en) 2010-07-29 2014-11-04 Roche Molecular Systems, Inc. Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids
US8609340B2 (en) 2010-07-29 2013-12-17 Roche Molecular Systems, Inc. Control nucleic acids for multiple parameters
US9725754B2 (en) 2010-07-29 2017-08-08 Sean F. Boyle Generic sample preparation
WO2016193070A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Roche Diagnostics Gmbh A method of inactivating microbes by citraconic anhydride

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1150584A (zh) * 1995-06-21 1997-05-28 罗纳·布朗克化学公司 制备柠康酸酐的方法
WO2001010209A1 (en) * 1999-08-11 2001-02-15 Biomedical Design, Inc. Sterilization of biological tissue
WO2009141739A2 (ja) * 2008-02-12 2009-11-26 ジョンソンディバーシー・インコーポレーテッド 衣料用液体洗浄剤組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bacteriophages and their genomes;Graham F Hatfull;《Curr Opin Virol》;20111031(第4期);第298-303页 *
Reversible blocking of amino groups with citraconic anhydride;H B Dixon;《Biochem J》;19680930;第109卷(第2期);第312-314页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3303611B1 (en) 2019-10-02
US11920185B2 (en) 2024-03-05
WO2016193070A1 (en) 2016-12-08
JP2018516072A (ja) 2018-06-21
US20180305735A1 (en) 2018-10-25
US20210238654A1 (en) 2021-08-05
US11015217B2 (en) 2021-05-25
EP3303611A1 (en) 2018-04-11
JP6822974B2 (ja) 2021-01-27
CA2985015A1 (en) 2016-12-08
CN107636164A (zh) 2018-01-26
ES2759477T3 (es) 2020-05-11
CA2985015C (en) 2021-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11920185B2 (en) Method of inactivating microbes by citraconic anhydride
JP7476466B2 (ja) 微生物の分離及び検出
US11746389B2 (en) Method and kit of detecting the absence of micro-organisms
JP6466437B2 (ja) 微生物を複雑な試料から単離する方法
US20100291564A1 (en) Methods for Detection of Micro-Organisms
AU2008245707A1 (en) Compositions, methods, and devices for isolating biological materials
JP2022538010A (ja) ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース診断
US20110212438A1 (en) Kits and Devices for Performing Methods of Detecting Viability-Associated Molecules
US20240210394A1 (en) Microorganism capture from antimicrobial-containing solution
Class et al. Patent application title: Methods for Detection of Micro-Organisms Inventors: Christopher John Stanley (Cambridge, GB) Stuart Wilson (London, GB) Assignees: MICROSEN MEDTECH LIMITED

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TG01 Patent term adjustment
TG01 Patent term adjustment