JP7476466B2 - 微生物の分離及び検出 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に、試料中の非微生物細胞から微生物を分離する分野、及び試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法に関する。これらの方法は、典型的には、試料中に存在する微生物酵素活性(もしあれば)を測定することに依存し、この場合、試料はまた、酵素活性の非微生物源を含有する。本発明は、酵素活性の微生物源の効果的な単離に依存する。したがって、本発明の方法は、精製されていない血液、血液培養物及び他の体液などの試料中の微生物病原体の不存在及び存在の決定を可能にする。本発明はまた、本方法を行うのに有用な試薬を含むキットに関する。
細胞生存率に関連する特定の分子の存在及びレベルを測定することは、多くの状況において重要である。例えば、ATPのレベルを測定することは、増殖分析及び毒性学の目的で哺乳動物細胞において有用である。少数の細菌を検出するには培養アプローチを用いることができるが、このような技術を完成させるには、特に、少数の細菌を検出しようとする場合、また、増殖の遅い微生物を検出する場合には、数日を要する。
本発明者らは、微生物感染を有する疑いのある対象から採取された試料において、試料の大部分が実際には感染した対象からではないにもかかわらず、以前に想像したよりもはるかに高いレベルの有核血球(白血球)が存在することを認識している。このことは、感染についてスクリーニングされた患者から採取された血液試料において、血液細胞、特に白血球から潜在的な微生物を分離する改良された方法の必要性をもたらした。本発明は、粒子-微生物複合体を形成する、粒子(例えば、磁性粒子)で微生物を選択的に捕捉し、粒子-微生物複合体を非微生物細胞から(例えば、磁場を用いて)分離することによって、試料中の非微生物細胞から微生物を分離することに関する。これは、試料中の微生物の不存在又は存在の検出を可能にする上記される問題に対処する方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、この分離がリガンドで被覆されていない粒子(例えば、磁性粒子)で達成され得ることを見出した。本発明者らは、特定の試薬が、非微生物細胞から、特に血液、ミルク及び尿などの複雑な試料において、微生物を確実に良好に分離する方法において特に有用であることを発見した。
1.サーファクタント/界面活性剤
2.アルブミン(例えば、BSA)などの血清タンパク質
3.緩衝液
4.dNTPなどのヌクレオチド
5.核酸分子(本発明のアッセイにおいて基質として作用する)。
1.46%(w/v)BSA
0.15%のTriton X100
0.15%のTween 20
100mM硫酸アンモニウム
20mM硫酸マグネシウム七水和物
100mM塩化カリウム
200mMTris-HCl[pH8.0]
0.1μMのPTO-ASオリゴ
0.1μMのPTO-S1オリゴ
20mMのTris-HCl[pH8.5]
10mM塩化カリウム
10μMのEDTA
Molecular Beaconシステムでは、Tyagi & Kramer.Molecular beacons-probes that fluoresce upon hybridization.Nat.Biotechnol.14巻、303~308頁(1996年)、及びTyagiら、Multicolor molecular beacons for allele discrimination.Nat.Biotechnol.16巻、49~53頁(1998年)(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。ビーコンは、標的に結合したときに蛍光が回復される内部的にクエンチされたフルオロフォアを有するヘアピン形状のプローブである。これらのプローブは、ヘアピンプローブと呼ばれることがある。
本発明の方法は、潜在的に初期診断を確認する方法として、任意の既に利用可能な診断技術を補完するために使用することができる。或いは、これらの方法は、迅速であり、便利な診断手段を提供するため、それら自体、予備的な診断方法として使用することができる。さらに、本発明の方法は、固有の感度のために、最小限の試料しか必要とせず、したがって、不必要な侵襲的手術を防ぐ。また、本発明の方法に従って、大型であるが濃縮されていない試料を効果的に試験することもできる。
本発明はまた、以下の条項によって定義することができる。
a)試料を磁性粒子とともにインキュベートして、粒子-微生物複合体を形成するステップと;
b)磁場を用いて非微生物細胞から粒子-微生物複合体を分離するステップと
を含み、磁性粒子が、(i)抗体、(ii)炭水化物、(iii)アポリポタンパク質Hタンパク質由来のペプチド、(iv)マンノース結合レクチンタンパク質、(v)ポリアミン、又は(vi)カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有する、方法。
a)試料を磁性粒子とともにインキュベートして、粒子-微生物複合体を形成するステップと;
b)磁場を用いて非微生物細胞から粒子-微生物複合体を分離するステップと;
c)粒子-微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップと
を含み、磁性粒子が、(i)抗体、(ii)炭水化物、(iii)アポリポタンパク質Hタンパク質由来のペプチド、(iv)マンノース結合レクチンタンパク質、(v)ポリアミン、又は(vi)カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有する、方法。
i.粒子-微生物複合体中の微生物を溶解するステップと;
ii.溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップと;
iii.微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子への核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップと
を含む、条項2又は条項3に記載の方法。
a)微生物と複合体を形成することができる磁性粒子であって、磁性粒子が、(i)抗体、(ii)炭水化物、(iii)アポリポタンパク質Hタンパク質由来のペプチド、(iv)マンノース結合レクチンタンパク質、(v)ポリアミン、又は(vi)カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー面を有し;及び
b)粒子-微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み、核酸分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含む、検出手段
を含むキット。
b)中和緩衝液
をさらに含む、条項14~条項18のいずれか1つに記載のキット。
a)DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼ、任意選択で、DNAポリメラーゼはDNAポリメラーゼIである;及び/又は
b)リガーゼ、任意選択で、リガーゼはATP及び/又はNAD依存性リガーゼである
を含む、条項14~20のいずれか1つに記載のキット。
[実験の部]
略語及び定義:
5th% 5%FPRを決定するための5番目のパーセンタイル閾値計算
(式=PERCENTILE.INC(アレイ,0.05))
BO ブロスのみ
BB 血液ブロス
Cfu コロニー形成単位
Confirm グラム状態(グラム陰性、グラム陽性又はカンジダ)に応じて微生物DNAを標的とするPCR多重アッセイ
CPD クエン酸リン酸デキストロース
Ct サイクル閾値
CV 臨界値(cfu):式:試料cfu÷2ΔCtを用いるcfu値及びΔCtに基づく理論検出限界
D1.. 希釈点(10倍系列)
E*cfu 希釈系列中で最高計数可能なTVCを有する希釈点を用いて外挿したcfu値
EC 大腸菌
ETGA 酵素鋳型の生成及び増幅
IPC 内部プロセス対照:ETGA陰性試料の正しい試料処理を実証し、PCR増幅を検証するためにLMに存在するPCR鋳型
LAWN コンフルエントな微生物増殖
LM 界面活性剤と微生物溶解酵素の混合物を含む微生物溶解混合物
MM マスターミックス
NoCt 50サイクル後、閾値蛍光を超える増幅なし
NSC スパイク対照なし
O/n 一晩
PC ポリメラーゼスパイク対照
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
Pt NSC/NC結果から計算された陽性閾値
qPCR 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
RT 室温(+19~+20℃)
s/n 上清
SPS ポリアネトールスルホン酸ナトリウム
TNTC 多すぎて計数することができない
TVC 生菌数合計
WB 洗浄緩衝液(特に断らない限り、Tris-HCl+塩化ナトリウム+Igepal+デオキシコール酸ナトリウム+テルギトールを含有する);又は記載のある場合は全血
ΔCt 2つのCt値(典型的にはNSC Ct-陽性試料Ct)間の差
手動フォーマットでは、2つのビーズタイプ(Merck Bio-Estapor(ストレプトアビジンコンジュゲートした)300nmビーズ(製品-BE-M08/03;「Bio-Estapor」)及びAdemtech Bio-Adembeadsストレプトアビジン+200nmビーズ(製品番号03222;「Bio-Ademtech」))を、ApoH Technologies Peps6ビーズ(参照-MP20006;「ApoH Peps6」)と比較した。
実験2では、カルボキシル化表面を有するApoH Peps6、Bio-Estapor及びEstaporビーズ(製品MI-030/40;「Estapor COOH」)を比較した。蛍光ATPアッセイ(BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay;Promega Corporation、G8230)を用いて、大腸菌をビーズに30分間結合させた後、上清中に残存する生物数を測定した。これは、ビーズ上の生物の存在を直接検出しないという点で間接的な試験であるが、本発明のリガンドベースのビーズ(ApoH Peps6)及び非リガンドビーズ(Bio-Estapor及びEstapor COOH)についての有用な比較試験である。1mLの104CFU/mLの大腸菌をリン酸緩衝生理食塩水から30mL結合させた後、BacTiter-Gloアッセイを用いて、生物含量の測定として、上清のアリコートをATPについてアッセイした。表2の結果は、Peps6ビーズ、Bio-Estapor及びEstapor COOHの上清中の生物レベルの減少が、この技術を用いて測定した場合、それぞれ33%、27%及び24%であったことを示す。
実施例3は、実施例1に記載した磁気分離方法を自動化して実施した希釈系列における大腸菌(EC)、黄色ブドウ球菌(SA)及びカンジダ・アルビカンス(CA)の試験結果を示す。アッセイには、0.25%Tergitolを含有するTTGBの結合緩衝液を有する捕捉媒体として、Bio-Estapor 300nm直径ビーズを使用した。3つの各生物の10倍希釈を行ったため、Ctの連続的変化を記録し、用量反応曲線を作成した。
ETGA:無傷の微生物細胞からの微生物ポリメラーゼの検出
Confirm:グラム状態(グラム陰性、グラム陽性、又はカンジダ)による微生物DNAの検出
磁性ビーズは、単純な緩衝液及び種々の複雑な生物学的な標本タイプから細菌及び真菌を捕捉する
微生物捕捉は、種々の異なるビーズサイズ(直径0.2~1.5μmのビーズ)及び表面被覆(例えば、カルボキシル化、疎水性、アミノ化など)を用いて行う
目的:
大腸菌、黄色ブドウ球菌及びカンジダ・アルビカンスについて、単純なTris+NaCl緩衝液(水中でのみ起こり得る微生物浸透圧ショックを防ぐために、pHを生理的塩濃度で緩衝化した)中で微生物結合性能を評価した。検出が微生物捕捉のための磁性ビーズの存在に依存することを実証するために、「ビーズなし対照」試料セットもこの実験に含まれた。
磁性ビーズの調製:
BacTec PLUS好気性ブロス(寒天プレートから3mLブロスを接種)では、微生物の一晩液体培養物(o/n)を標準として設定した。翌日(約16時間後)に、1.88μLの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を3mLのブロスに添加し、18.75μLのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を3mLのブロスに添加し、2時間の成長を37℃、500rpmで行った。
2時間の成長後、微生物の前培養物を1×Tris+NaCl緩衝液(50mM Tris-HCl[pH8.0]+150mM NaCl)中で希釈(DF10)し、微生物あたり4つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して100μLのTVCを行った
15μLの予備洗浄済みビーズを含有する2mLチューブに1mLの試料を添加した-注記、全ての微生物試料を同じ1×緩衝液で希釈したため、ビーズを入れたチューブに112μLの1×Tris+NaCl緩衝液に添加しなかった(標準プロトコールに従う)。
37℃で30分間、振とうした(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mL洗浄緩衝液(WB)を添加し、RTで2分間、チューブを混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で3分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μL溶解ミックス(LM)をチューブに添加し、磁石を取り出した(5μLのポリメラーゼ対照(PC)を各PC試料チューブに添加した)
ETGA反応:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間行った
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
「(+)BEADS」試料のMagnitor結果は、3つの全ての微生物種について、非常に強い細胞密度特異的なETGA及びConfirmシグナルを示し、広範囲の微生物群(GrNeg、GrPos、カンジダ)のビーズ特異的結合を実証する。
カンジダ結果は、より良好な細胞密度傾向に従うことができたが、液体培養は、連続希釈の質に影響を与えた可能性がある完全に粒子であったことに留意されたい
微生物細胞のいくつかの証拠は「(-)BEADS」対照において引き継がれるが、単一の洗浄ステップでのみ期待される。
目的:
単純で迅速な「Rapid Magnitor」試験(プロトコールには洗浄ステップが含まれていない)を開発するために、2つの異なる希釈フォーマットの2つの異なる血液溶解緩衝液を比較することである。
2×EBB 1mLの2×EBB+1mL標本
10×EBB 112μLの10×EBB+1mL標本
2×B-BUF 1mLの2×B-BUF+1mL標本
10×B-BUF 112μLの10×B-BUF+1mL標本
10×EBB:500mMのTris-HCl[pH8.0]+2.5%Tergitol
10×B-BUF:500mMのTris-HCl[pH 8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+5%デオキシコール酸ナトリウム+2.5%Tergitol
大腸菌o/n液体培養1E-3希釈液を血液ブロス(1mLあたり6.25μLのo/n:244μLのo/n+39mL血液ブロス)にスパイクし、37℃で500rpmの振とうインキュベーターで60分間の成長を行った
2時間の成長後、1mLの標本を、緩衝液(及びMagビーズ試料セット用に15μLのBioEstaporビーズ(Merck、カタログ番号BE-M 08/0.3))を含有する2mLのチューブに添加することによって試料を生成した:試験条件ごとに3重の大腸菌(EC)及びスパイク対照(NSC)試料
100μLのTVCをNSC及び大腸菌について行った(計数可能なプレートを確実にするために標本の希釈を含む)
上記のように設定された試料は、すぐにスピン又はMagビーズプロトコールに進行した。
試料を3分間、9000×gで遠心分離した(チューブヒンジはペレットトレーサビリティのために外側に面する)
上清を除去した
50μLのLMを試料(ペレットを再懸濁するための約10×ピペットミックス)に添加した
試料を900rpmで5分間、次に、800rpmで55分間(26℃)の振とうインキュベーターに配置した
試料を17000×gで1分間遠心分離後、qPCRを設定した
試料を900rpmで30分間(37℃)、振とうインキュベーターに配置した
試料をDynaMag-2磁気ラック上に5分間配置し、次に上清を除去した
50μLのLMを試料(ペレットを再懸濁するための約10×ピペットミックス)に添加した
試料を5分間、900rpmの振とうインキュベーターに配置し、次に55分間(26℃)、800rpmに配置した
試料を3分間、磁化した後、qPCRを設定した
ETGAマスターミックスのみの手動qPCRを設定した(10μL反応)
磁性ビーズによる微生物結合は、次のように起こる:
単純及び複雑な血液溶解緩衝液(EBB=Tris-HCl+Tergitol;B-BUF=Tris-HCl+塩化ナトリウム+Igepal+デオキシコール酸ナトリウム+Tergitol)であるが、血液由来の試験シグナルは、血液溶解緩衝液の成分によって異なる
希釈(2×緩衝液:1部の標本に1部の血液溶解緩衝液)され、及び濃縮(10×緩衝液:9部の標本に1部の血液溶解緩衝液)された試料フォーマット
さらに、磁性ビーズによる微生物捕捉のための微生物検出シグナルは、遠心分離による捕捉に匹敵する。
目的:
複数のビーズタイプ/サイズが、微生物の連続希釈及びNSCについて同様のMagnitor結果をもたらすという最近の発見を考慮すると、Momentumの結合緩衝液内の成分が、観察されたこの普遍的な微生物結合特性を媒介/促進している可能性があると考えられた。この可能性を調査するために、標準結合緩衝液(B-BUF)とTris-HCl[pH8.0]+NaClのみからなる界面活性剤を含まないB-BUFを比較して、大腸菌の希釈系列を行い、界面活性剤一般が微生物結合に重要であるかどうかを試験した。試料セットは、血液ブロス、ブロスのみ、及び1×結合緩衝液のみについて調製し、異なる標本タイプについての結果を比較した。
新たに調製した100mLの10×結合緩衝液:
B-BUF:500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+5%デオキシコール酸ナトリウム+2.5%Tergitol
Tris+NaCl:500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M塩化ナトリウム
Estaporビーズ(Merck、カタログ番号M1-30/40)を、それぞれの1×緩衝液(希釈された10×B-BUF又は10×Tris+NaCl)中で3×1mL洗浄した:40μLビーズを400μLの1×緩衝液(1%固形分)の最終濃度に再懸濁した。
大腸菌o/n液体培養液をBacTec PLUS好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日(約16時間後)、1.88μL o/nを3mLのブロス(6.25μL/mLでブロスに添加されるEC 1E-1希釈に匹敵する)に添加し、37℃、500rpmで2時間の成長を行った。
2時間の成長後、大腸菌の前培養物は、予め加温された血液-ブロス(BB)、ブロスのみ(BO)又は1×緩衝液(B-BUF若しくはTris+NaCl)のいずれかでEC 1E-6まで連続希釈(DF10)された。
100μLのTVCを全ての大腸菌希釈液及びNSCに対して行った
112μLの結合緩衝液(B-BUF又はTris+NaClのいずれか:BB及びBO試料セットについては10×;及び緩衝液試料セットについては1×)+15μLビーズ(それぞれの緩衝液中で予備洗浄する)を含有する2mLチューブに1mLの試料を添加した
37℃で30分間、振とうした(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、チューブをRTで2分間、混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
チューブに50μLのLMを添加し、磁石を取り出した(5μLのポリメラーゼコントロール(PC)を各PC試料チューブに添加する)
ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
予想通り、Tris+NaClでは血液溶解は観察されなかった
界面活性剤が存在しない場合、ビーズはより粒状/凝結している
界面活性剤は、血液の存在下で良好なETGA結果を得るために重要であるが(「BBを含む10×Tris+NaCl」についての不良なETGA結果によって示される)、微生物捕捉/検出は、血液溶解が存在しない場合においてなおも明白である((「BBを含む10×Tris+NaCl」試料セットの結果によって示される)。
血液が存在しない場合の良好なETGA結果は、結合緩衝液の成分としての界面活性剤が、大腸菌のビーズへの結合に必要でないことを示す
「1×Tris+NaClを含む10×Tris+NaCl」試料セットにおける良好なETGA結果は、血液及び/又はブロス中の生物学的成分が微生物結合に必要でないことを実証する。
興味深いことに、B-BUFは、BO及び1×のB-BUF試料セットを用いた10×B-BUFにおいて、ETGAシグナルに対してわずかに阻害作用を示すようであるが、最近の他の研究では、デオキシコール酸ナトリウムはこのアッセイに対していくぶん阻害作用を示す可能性があることが示されているため、この観察は予想外ではない
Confirmは「1×Tris+NaClを有する10×Tris+NaCl」試料セットにおいて最良に行われる。他の全ての類似した試料セットは、同様のConfirm GrNeg結果を生じた。
予想され得るように、IPCシグナルは血液の存在によっていくぶん阻害された。
これらの結果は、界面活性剤及び生物学的試料のいずれも、大腸菌についての微生物結合のメディエーターではないことを実証する
目的:
微生物結合の媒介におけるMomentumの結合緩衝液の重要性をさらに調べるために、結合におけるpH緩衝化及び塩の効果を、クリーンな系(すなわち、血液又はブロスのいずれも存在しない場合)で調べた。
25mLの各緩衝液を新たに作製した:
BUF-1 500mM Tris-HCl[pH7.4]+1.5M NaCl
BUF-2 500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M NaCl
BUF-3 500mM Tris-HCl[pH8.5]+1.5M NaCl
BUF-4 500mM Tris-HCl[pH8.0]のみ
BUF-5 1.5M NaClのみ
BUF-6 水のみ
大腸菌o/n液体培養物をBacTec PLUS好気性ブロス(SPSを含む)及びニュートリエントブロス(SPSを含まないNB)における標準として設定し、次に、翌日(約16時間後)、1.88μL o/nを、各ブロスタイプ(午前にNB及び午後にPLUSブロス)について3mLブロス(6.25μL/mLでブロスに添加されるEC 1E-1希釈に匹敵する)に添加し、37℃、500rpmで2時間の成長インキュベーションを行った。
各実験(NB及びPLUS)について、1E-1大腸菌の前培養物は、各1×緩衝液(BUF-1~BUF-6)中で大腸菌の1E-6まで希釈(DF10)した
関連するブロス(NB又はPLUSブロス)で行われた別々のEC希釈セットを用いて100μLのTVCを行い、異なる1×緩衝液から生じるプレートの生存率の不一致を防ぐ
112μLのそれぞれ1×緩衝液+15μLビーズ(それぞれの緩衝液中で予備洗浄する)を含有する2mLチューブに1mLの試料を添加した
37℃で30分間、振とうした(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、チューブをRTで2分間、混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
チューブに50μLのLMを添加し、磁石を取り出した
ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
水のみを含む全ての緩衝液は、同様に大腸菌の捕捉を実証した(同様のETGA及びConfirm結果により示される)-しかしながら、水中の低細胞密度のみでは浸透圧微生物溶解が示される場合もあった(BUF-6)
PLUSブロスとNB増殖大腸菌はいずれも、試験した全ての緩衝液について非常に類似したMagnitor結果を生じたが、これは、SPSが大腸菌の微生物結合の媒介において明確な役割を果たさないことを示している
これらの結果は、Estapor(カルボキシル化)ビーズへの大腸菌の結合には緩衝液成分が必須でないことを示している
目的:
代替の血液溶解法を用いる場合に、微生物の捕捉及び検出が起こり得るかどうかを判定すること。
結合緩衝液を以下のように調製した:
E-BUF=500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+2.5%Tergitol
UREA=83mM Tris-HCl[pH8.0]+10M尿素
Tris+NaCl=500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム
黄色ブドウ球菌o/n液体培養物をBacTec PLUS好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日(約16時間後)、3.0μL o/nを3mLの血液ブロス(1E-3希釈)に添加し、37℃、500rpmで4時間の成長を行った。
4時間の成長後、黄色ブドウ球菌の前培養物は、予め加温された血液ブロス中で1E-6まで連続希釈(DF10)された。
全ての黄色ブドウ球菌希釈液及びNSCに対して100μLのTVCを行った
初期設定
尿素を用いた試料について、0.75mLの尿素+15μLビーズを含有する2mLチューブに0.25mLの標本を添加した
凍結する試料について、1mLの標本を2mLチューブに添加し、次に、ドライアイス上で5分間、迅速に凍結させた。標本を37℃で5分間解凍し、次に、112μLのTris+NaCl+15μLビーズを添加した
E-BUF又はTris+NaClを使用する試料について、1mLの標本を、112μLの結合緩衝液(E-BUF又はTris+NaClのいずれか)+15μLのビーズを含有する2mLチューブに添加した
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化する
全てのs/nを除去する
1mLのWBを添加し、チューブを37℃で3分間混合する(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化する
全てのs/nを除去する
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出す
ETGA反応を行う:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCR設定する(10μL反応)
血液溶解は、解凍後の凍結試料で観察された(図1を参照されたい)
尿素ではほぼ瞬時に血液溶解が観察された
いくつかのビーズは、尿素を用いた試料の処理中に喪失するように見えた
Tris+NaCl試料セットでは明らかな血液溶解は観察されなかった(予想通り)
磁性ビーズによる黄色ブドウ球菌の微生物捕捉及び検出は、Confirmによって決定されるように、代替の溶解法に匹敵し、血液溶解はない。
しかしながら、ETGAによる微生物検出は、血液由来ETGAシグナルの減少に影響するため、代替の血液溶解法によって異なる程度に改善される。
目的:
1mLの全血試料を用いて、Magnitor迅速テストに最適なSPS濃度を決定すること。副次的目的は、TVCにより決定した全血中の微生物生存率におけるSPSの効果を評価することであった。
2×5mLの全血又はBacTec PLUS好気性血液ブロス(1:3比)を各試料セット(大腸菌及びNSC試料)に分注した。次に、SPSを次のように添加した:
BB なし
WB0% なし
WB0.01% 5
WB0.02% 10
WB0.04% 20
WB0.06% 30
WB0.08% 40
WB0.10% 50
ニュートリエントブロス(NB)中の1.88μLの正味(neat)o/nを3mLのNBに添加し;2時間、37℃、500rpmでインキュベートした
2時間後、大腸菌の前培養物を温めたNBで10倍に希釈し;次に、5μLを各5mLの標本チューブ(試験条件において示されるように調製される)に添加した
直ちにMagnitor試験を開始し、以下に詳述されるようにTVCを行った。
112μLのE-BUF(500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+2.5%Tergitol)+15μLビーズ(BioEstapor、Merck、カタログ番号BE-M 08/0.3)を各試料チューブに予め装填し、次に1mLの標本を試料チューブに添加した
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、チューブをRTで3分間混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出した
ETGA反応を行う:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
TVC分析
ゼロ時間でCOLプレートに100μL
試料ビジョウス(約2mLの試料を含有する)を室温(20.4℃)でベンチ上に放置した(静止)
TVCを表に示される時間点で行った:試料を播種前に完全に混合した
SPSは、TVCアッセイに基づいて全血に微生物保護/生存率を提供する利点を示しているが、全血中の大腸菌の生存率に一般的に大きな問題はない
SPSの取り込みは、ETGAとConfirmの読み出しの両方の試料処理効率及び微生物検出性能を改善した
0.06%のSPSは、TVCベースの生存率;ETGA検出(大腸菌及びNSC試料Ctを考慮した最良の結果);及びIPC Ct値で示されるPCR阻害に関して最良の結果をもたらした。Confirm GrNeg結果はまた、全血にSPSを加えることによって改善されたが、SPSの正確な濃度はそれほど重要ではなかった。
目的:
MomentumのMagnitorアッセイを用いて、同サイズの代替のカルボキシル化磁性ビーズを比較すること。
大腸菌及び化膿連鎖球菌o/n液体培養物をそれぞれ3mLブロス及び血液ブロス(BacTec PLUS好気性)における標準として設定し、16~20時間(37℃)インキュベートした
大腸菌の液体培養物を血液ブロスで1E-3に希釈し、次に、血液ブロス(血液ブロス1mLあたり6.25μL)にスパイクし、1時間30分(37℃)プレインキュベートした
化膿連鎖球菌の液体培養物を血液ブロスで1E-1に希釈し、次に、血液ブロス(血液ブロス1mLあたり6.25μL)にスパイクし、2時間30分(37℃)プレインキュベートした
大腸菌の1E-3前培養物を血液ブロスで連続希釈し、5希釈点(1E-3~1E-7)を生成した
試料は、15μlの1%固体ビーズ+112μLの結合緩衝液を予め装填した2mLチューブに1mL標本を添加することにより設定され;及びMagnitor V4.0試験を行った:3つのビーズタイプを有するビーズタイプあたり5希釈点+3つのNSC(8つの試料セット)を各epMotion 5073mで試験した
化膿連鎖球菌の1E-3前培養物を血液ブロスで連続希釈し、5希釈点(1E-1~1E-5)を生成した
試料は、15μlの1%固体ビーズ+112μLの結合緩衝液を予め装填した2mLチューブに1mL標本を添加することにより設定され;及びMagnitor V4.0試験を行った:3つのビーズタイプを有するビーズタイプあたり5希釈点+3つのNSC(8つの試料セット)を各epMotion 5073mで試験した
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
15分間、磁化した
1mLのs/nを除去した
ビーズが磁化されている間に0.82mLのWBをチューブに添加した
1mLのs/nを除去した
ビーズが磁化されている間に50μLのLMをチューブに添加した
磁化をオフにし、ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのためにqPCRを設定した(10μL反応)
内部陽性閾値(Pt)を各ビーズタイプについてNSC(n=6)を用いて計算した:式=PERCENTILE.INC(アレイ,0.05)
ビーズBは、1%固形分に希釈する前に再懸濁することが困難であり、1%固形分に希釈した後、目視でより希釈されているように見えた
処理の終了時に、試料をDynaMag-2磁気ラック上に配置し、全てのビーズタイプC-Gは、重いペレットを有すると思われるビーズA、及び非常に小さなビーズペレットを有するビーズBとは別に、同様に磁化した
ここで試験した全てのカルボキシル化磁性ビーズは、ETGA及びConfirm読み出しによって決定した場合、微生物結合を実証する。しかしながら、微生物検出の感度は、血液由来ETGAシグナル及び/又はアッセイ阻害のレベルに依存して、いくぶん変化する。
目的:
MomentumのMagnitor試験(ETGA及びConfirm技術)を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。自動化(プロトコール1)及び手動(プロトコール2)試料処理のための微生物捕捉を実証するために、2つの実験を行った。重要なことに、プロトコール2は、3つのビーズ再懸濁洗浄を含み、ETGA/Confirmシグナルが試料キャリーオーバーよりもビーズ結合した微生物細胞に特異的であることをより説得力をもって実証する(単一ビーズを磁化した洗浄ステップを含むプロトコール1とは対照的である)。
大腸菌o/n液体培養物を3mLブロス(BacTec PLUS好気性)における標準として設定し、16~20時間(37℃)インキュベートした
翌日、大腸菌の液体培養物を血液ブロスで1E-3に希釈し、2時間の成長インキュベーション(500rpmで37℃)を行った
2時間の成長インキュベーション後、大腸菌の1E-3前培養物を血液ブロスで連続希釈し、3つの希釈点(EC 1E-6~1E-8)を生成した
1mLの標本(3つの大腸菌希釈物及び3つのNSC試料:6つの試料セット)を112μLの10×E-BUF(500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+2.5%Tergitol)+15μLビーズ(1%固体)を予め装填した2mL試料チューブに添加し、次に、プロトコール1又はプロトコール2(下記参照)のいずれかに従ってMagnitor試験を開始した。
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
15分間、磁化した
1mLのs/nを除去した
ビーズが磁化されている間に、0.82mLのWBをチューブに添加した
1mLのs/nを除去した
ビーズが磁化されている間に、50μLのLMをチューブに添加した
磁化をオフにし、ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのためにqPCRを設定した(10μL反応)
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、RTで2分間、チューブを混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、RTで2分間、チューブを混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、RTで2分間、チューブを混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出した
ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ETGA及びConfirm読み出しによって決定した場合に、同等のレベルの微生物結合を生成することを実証する。
目的:
MomentumのMagnitor試験(ETGA及びConfirm技術)を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。大腸菌は、以前に、(ビーズサイズ及び被覆I:供給源実験:20190221_WP7_Bead-Comparison_Analysis及び20190228_WP7_Bead-Comparison-3-wash_Analysis)試験された:この以前の研究を拡大するために、3つの追加微生物種を試験した(黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌及びカンジダ・アルビカンス)。
試料設定:
BacTec PLUS好気性ブロス(寒天プレートから3mLのブロスを接種)における微生物の一晩液体培養物(o/n)の設定。翌日(約16時間後)、3mL血液ブロス(1E-1希釈)に300μLの肺炎連鎖球菌及びカンジダ・アルビカンス液体培養物を接種し、3mL血液ブロス(1E-3希釈)に3μLの黄色ブドウ球菌液体培養物を接種し;2時間の成長を37℃、500rpmで行った。
2時間の成長後、微生物前培養物を血液ブロスで希釈(DF10)し、微生物あたり3つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して100μLのTVCを行った
15μLのビーズ(1%固体)及び112μLのE-BUF(500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+2.5%Tergitol)を予め装填した2mLの試料チューブに1mLの標本(微生物種あたり3希釈、及び3NSC試料:12試料セット)を添加した
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、RTで3分間、チューブを混合する(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出した
ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ETGA及びConfirm読み出しによって決定されるように、同等のレベルの微生物結合を生成することを実証する。
目的:
MomentumのMagnitor試験(ETGA及びConfirm技術)を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。この実験は、標本として単純な緩衝液(50mM Tris-HCl[pH 8.0]+150mM NaCl)及び洗浄緩衝液を用いて行われ、すなわち微生物溶解混合物を添加するまで界面活性剤を使用しなかった。
試料設定:
BacTec PLUS好気性ブロス(寒天プレートから3mLのブロスを接種)では、微生物の一晩液体培養物(o/n)を設定する。翌日(約16時間後)に、3μLの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を3mLのブロス(1E-3希釈)に接種し、300μLのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を3mLのブロス(1E-1希釈)に接種し、2時間の成長を37℃、500rpmで行った。
2時間の成長後、微生物の前培養物を1×Tris+NaCl緩衝液中で希釈(DF10)し、微生物あたり3つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して100μLのTVCを行った
15μLのビーズ(1%固体)を予め装填した2mLの試料チューブに1mLの標本(微生物種あたり3希釈、及び3NSC試料:12試料セット)を添加した
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWB(1×Tris+NaCl)を添加し、RTで3分間、チューブを混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出した
ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
これらの結果は、クリーンな系(すなわち、生物学的標本の代わりに単純なTris+NaCl緩衝液)において、種々の異なるビーズサイズ及び機能性表面(カルボキシル化及び疎水性)が、ETGA及びConfirm読み出しによって決定した場合に、同等レベルの微生物結合を生じさせることを実証する。
興味深いことに、アミノ化ビーズ(NH2-1.5)は、微生物結合がほとんど/全くないことを示す標本タイプの極めて不良なMagnitor結果を生じた。この観察は、アミノ化されたビーズが試験された他のビーズと同等レベルの微生物捕捉を生成した血液ブロス標本の状況とは異なる。
目的:
MomentumのMagnitor試験(ETGA及びConfirm技術)を用いて、血液溶解の不存在下、すなわち結合緩衝液中に界面活性剤を含まない場合、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。
試料設定:
BacTec PLUS好気性ブロス(寒天プレートから3mLのブロスを接種)では、微生物の一晩液体培養物(o/n)を設定する。翌日(約16時間後)に、3μLの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を3mLのブロス(1E-3希釈)に接種し、300μLのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を3mLの血液ブロス(1E-1希釈)に接種し、2時間の成長を37℃、500rpmで行った。
2時間の成長後、微生物の前培養物を血液ブロス中で希釈(DF10)し、微生物あたり3つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して100μLのTVCを行った
15μLのビーズ(1%固体)及び112μLの結合緩衝液(Tris-HCl+塩化ナトリウム)を予め装填した2mLの試料チューブに1mLの標本(微生物種あたり3希釈、及び3NSC試料:12試料セット)を添加した
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、RTで3分間、チューブを混合した(1000rpm)
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出した
ETGA反応を行う:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ETGA及びConfirm読み出しによって決定した場合に、血液溶解の不存在下で、血液から同等レベルの微生物結合を生じさせることを実証する
しかしながら、ETGAによる微生物検出は、微生物結合中の血液溶解に関する以前の実験と比較した場合、血液溶解の不存在下でのNSC ETGAシグナルの増加によって実質的に減少する。
目的:
磁性ビーズを用いた微生物捕捉が、血液に加えて、他の複雑な生物学的流体に対して可能かどうかを調べること。
大腸菌o/n液体培養物をBacTec PLUS好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日(約16時間後)、3μL o/nを3mLのブロス(大腸菌1E-3)に添加し、37℃、500rpmで2時間の成長インキュベーションを行った。
2時間の成長後、大腸菌1E-3の前培養物を各標本タイプにおいて5連続希釈点(大腸菌1E-6~1E-9)に希釈した。COL寒天プレート上で100μLのTVCを行った。
1mLの標本は、112μLの結合緩衝液(500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム+10%Igepal+2.5%Tergitol+0.5%デオキシコール酸ナトリウム)+15μLビーズ(BioEstaporビーズ;Merck #BE-M08/03(1%固体))を予め装填した2mLの試料チューブに添加された-注記、Tris-NaCl試料セットについての試料チューブは、112μLの結合緩衝液を予め装填していない(再増殖アッセイのための微生物増殖を阻害する可能性がある界面活性剤の混入を避けるためである)
37℃で30分間、振とうした(1000rpm)
DynaMag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
1mLのWBを添加し、RTで3分間混合する(1000rpm)-注記、再増殖アッセイのための微生物増殖を阻害する可能性がある界面活性剤の混入を避けるために、Tris+NaCl試料セット用の洗浄緩衝液の代わりに1mLのTris+NaCl緩衝液を添加した
Dynmag-2上で5分間、磁化した
全てのs/nを除去した
50μLのLMをチューブに添加し、磁石を取り出す-注記、再増殖アッセイのために100μLのTris+NaCl緩衝液にビーズを再懸濁した
ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのために手動qPCRを設定した(10μL反応)
1.100μlのTris+NaCl標本を播種/接種した-「標本」
2.100μlの上清を微生物結合ステップ後に播種/接種した-「結合後」
3.100μlの上清を洗浄ステップ後に播種/接種した-「洗浄後」
4.50μLのビーズを100μLのTris+NaCl緩衝液に再懸濁し、播種/接種した(すなわち、50%の材料をプレート上に、及び50%の材料を液体培養物に接種した)-「ビーズ」
これらの結果は、磁性ビーズが、ETGA及びConfirm読み出しによって決定した場合、種々の複雑な生物学的標本タイプから微生物を捕捉するために使用し得ることを実証する。
再増殖アッセイは、大腸菌が磁性ビーズに結合した後、「ビーズ」試料セットの観察可能な増殖によって決定した場合、寒天及び液体培養物上で再増殖し得ることを実証する。
目的:
非溶解性結合緩衝液及び非溶解性洗浄緩衝液を用いて、ミルク及び尿の非血液標本における微生物捕捉及び検出を示すこと。
10×Tris+NaCl結合緩衝液=500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M塩化ナトリウム
1×Tris+NaCl洗浄緩衝液=10×Tris+NaCl結合緩衝液の10分の1希釈
新鮮な(ヒト)尿
半脱脂(低温殺菌)牛乳
BacTec PLUS好気性ブロスにおける標準として大腸菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス及び肺炎連鎖球菌o/n液体培養物を設定した
翌日(約16時間後)、3μLの大腸菌及び黄色ブドウ球菌o/nを使用して、新鮮な3mLのブロス培養物(1E-3希釈)に接種し、300μLのカンジダ・アルビカンス及び肺炎連鎖球菌を使用して、新鮮な3mLのブロス培養物(1E-1希釈)に接種し、2時間の成長を37℃、500rpmで行った。
2時間の成長後、微生物の前培養物を予め温めた新鮮な尿及び新鮮なミルク中で連続希釈(DF10)し、5つの希釈点:大腸菌1E-5~1E-9、黄色ブドウ球菌1E-5~1E-9、カンジダ・アルビカンス1E-2~1E-6、及び肺炎連鎖球菌1E-2~1E-6を生じさせた。
ミルク及び尿中で試験した各微生物希釈について100μLのTVCを行い、ミルク及び尿のNSCを3種類の寒天プレート(SAB、COL及びCBA)上に播種した。
112μLの結合緩衝液+15μLビーズ(1%固体)を予め装填した2mL試料チューブに、1mLの標本(各微生物種の5希釈及び4つのNSC試料:標本タイプあたり24試料)を添加し、次に自動化Magnitor試験を開始した。
37℃で30分間、軌道混合した(1000rpm)
15分間、磁化した
1mLのs/nを除去した
ビーズが磁化されている間に0.82mLのWB(1×Tris+NaCl)をチューブに添加した
1mLのs/nを除去した
ビーズが磁化されている間に50μLのLMをチューブに添加した
磁化をオフにし、ETGA反応を行った:26℃にて1000rpmで5分間、次に800rpmで55分間
ETGA及びConfirmのためにqPCRを設定した(10μL反応)
これらの結果は、ETGA及びConfirm読み出しによって決定した場合に、標本溶解の不存在において、磁性ビーズによる微生物捕捉が血液に代わる標本(特に、尿及びミルク)で可能であることを実証する。
しかしながら、これらの標本タイプ(特に、ミルク)における共生微生物の存在は、ETGA及びConfirm読み出しのバックグラウンドシグナルのレベルに影響を与える。
Claims (31)
- 非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、
a)前記試料を粒子とともにインキュベートして、粒子-微生物複合体を形成させるステップであり、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われるステップと;
b)非微生物細胞から粒子-微生物複合体を分離するステップと
ここで、前記試料は血液含有試料であり、前記試薬が界面活性剤を含み、前記粒子の外面が、
i)カルボン酸基;
ii)アミノ基;
iii)疎水性基;及び
iv)ストレプトアビジン
のうちのいずれか1つ又は複数を含むか又はそれで被覆されている、
を含む方法。 - 前記方法は、非微生物細胞も含有する試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、さらに、c)粒子-微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップを含む請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)が、(i)微生物に関連する核酸分子の酵素活性を検出するステップ、(ii)サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出するステップ、(iii)細胞培養後に微生物を検出するステップ、(iv)核酸増幅により微生物を検出するステップ、又は(v)核酸配列決定により微生物を検出するステップを含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(c)が、
i)粒子-微生物複合体中の微生物を溶解するステップと;
ii)溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップと;
iii)微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子への核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップと
を含む、請求項2に記載の方法。 - ステップ(i)が、基質核酸分子を含有する溶解試薬を添加するステップを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記核酸修飾酵素が、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼを含む、請求項4又は請求項5に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがDNAポリメラーゼIである、請求項6に記載の方法。
- 対象からの血液含有試料に対して請求項2~6のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含む、対象における微生物感染の不存在又は存在を検出する方法。
- 分離された粒子-微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去するステップをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)が、前記粒子-微生物複合体から前記非微生物細胞を除去するステップをさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)が、磁場又は遠心分離を用いて行われる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- a)潜在的に微生物細胞を含む血液含有試料および非微生物細胞を含むもの;
b)微生物と複合体を形成することができるビーズであって、ここで、前記ビーズは外面を有する;
c)ポリアネトールスルホン酸ナトリウム;及び
d)試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも1つの試薬、
ここで、前記少なくとも1つの試薬が界面活性剤を含み、前記ビーズの外面が、
i)カルボン酸基;
ii)アミノ基;
iii)疎水性基;及び
iv)ストレプトアビジン
のうちのいずれか1つ又は複数を含むか又はそれで被覆されている、
を含む組成物。 - 請求項1~11のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
a)微生物と複合体を形成することができるビーズであり、ここで、前記ビーズは外面を有する;
b)ポリアネトールスルホン酸ナトリウム;及び
c)試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも1つの試薬、
ここで、前記少なくとも1つの試薬が界面活性剤を含み、前記ビーズの外面が、
i)カルボン酸基;
ii)アミノ基;
iii)疎水性基;及び
iv)ストレプトアビジン
のうちのいずれか1つ又は複数を含むか又はそれで被覆されている、
を含むキット。 - 請求項2~11のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
ビーズ-微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、前記検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子(DNA)を含み、前記核酸分子(DNA)が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含む、検出手段
を含む請求項13に記載のキット。 - 緩衝液及び/又は塩化ナトリウムをさらに含む、請求項12に記載の組成物、又は請求項13または14に記載のキット。
- 界面活性剤が非イオン性である、及び/又は、界面活性剤が微生物と複合体を形成することができる粒子/ビーズにコンジュゲートしていない、請求項1に記載の方法。
- 粒子が0.1~2.0μmの直径を有する、請求項1~11、16のいずれか一項に記載の方法。
- 粒子/ビーズが磁性または超常磁性である、請求項1~11、16~17のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物と複合体を形成することができる粒子の外面がポリマーを含む、請求項1~11、16~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマーが炭素ベースである、請求項19に記載の方法。
- 微生物が病原性微生物である、請求項1~11、16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 病原性微生物が病原性細菌又は真菌である、請求項21に記載の方法。
- 非微生物細胞が赤血球及び/又は白血球を含む、請求項1~11、16~22のいずれか一項に記載の方法。
- 界面活性剤は非イオン性である、及び/又は、界面活性剤が微生物と複合体を形成することができる粒子/ビーズにコンジュゲートしていない、請求項12に記載の組成物、又は請求項13に記載のキット。
- 粒子が0.1~2.0μmの直径を有する、請求項12又は24に記載の組成物、又は請求項13~15、24のいずれか一項に記載のキット。
- 粒子/ビーズが磁性または超常磁性である、請求項12、24、25のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項13~15、24、25のいずれか一項に記載のキット。
- 微生物と複合体を形成することができる粒子の外面がポリマーを含む、請求項12、24~26のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項13~15、24~26のいずれか一項に記載のキット。
- ポリマーが炭素ベースである、請求項27に記載の組成物、又は請求項27に記載のキット。
- 微生物が病原性微生物である、請求項12、24~28のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項13~15、24~28のいずれか一項に記載のキット。
- 病原性微生物が病原性細菌又は真菌である、請求項29のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項29に記載のキット。
- 非微生物細胞が赤血球及び/又は白血球を含む、請求項12、24~30のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項13~15、24~30のいずれか一項に記載のキット。
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